J. Embryol. exp. Morph. Vol. 22,1, pp. 127-43, August 1969
Printed in Great Britain
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Formation et role des nucleoles des
ovocytes de Triturus helveticus Raz — Etude
autoradiographique et ultramicroscopique
ParSIMONE SANCHEZ1
La presence d'un tres grand nombre de nucleoles dans la vesicule germinative
des Amphibiens, et revolution de cette population nucleolaire au cours de
l'ovogenese est un phenomene particulier qui a deja suscite de nombreux
travaux. MacGregor (1965) a resume les resultats obtenus par differents auteurs
et rapportes ses propres observations sur la formation des nucleoles chez les
Amphibiens de differentes especes. 11 ressort de l'analyse faite par cet auteur
que deux mecanismes generaux determinent l'etat multinucleole des ovocytes
d'Amphibiens, soit que les chromosomes plumeux elaborent des corps nucleolaires qui viennent grossir la population des nucleoles d'origine, soit que la
fragmentation des nucleoles d'origine conduise a une multiplication de ces
derniers, sans qu'une elaboration nouvelle intervienne. Mais, quelle qu'en soit
l'origine, les nucleoles neoformes apparaissent, aux yeux de cet auteur, parfaitement identiques aux nucleoles originels. Par contre, Gall (1968) montre que
l'apparition des organisateurs nucleolaires et de l'ADN qui constitue ces
organisateurs, a lieu au cours du stade pachytene de la meiose, et la multiplication nucleolaire qui suit, s'effectue en liaison avec ces organisateurs. Ces
observations suggerent que la population des nucleoles typiques est flxee des
les premiers stades de la meiose. Cependant, de tres nombreux corps nucleolaires apparaissent au stade diplotene suivant, dans les ovocytes d'Amphibiens.
Chez Xenopus laevis, Van Gansen & Schram (1968) distingue, a la fin de ce
stade, trois types de nucleoles: des nucleoles typiques, des micronucleoles, et des
nucleoles a protuberances a partir desquels se formeraient les seconds. Nucleoles
typiques et micronucleoles se caracterisent differemment par les techniques
cytochimiques. Des examens ultrastructuraux et cytochimiques pousses ont
permis d'etablir d'une maniere sure la constitution et la fonction metabolique
des nucleoles (Miller, 1962, 1964, 1966; MacGregor, 1967; Lane, 1967; Van
Gansen & Schram, 1968). Deux zones distinctes composent tout nucleole
typique: l'une est fibreuse, l'autre granulaire. Les precurseurs trities de l'ARN
apparaissent d'abord dans le materiel fibreux ou s'effectuerait la synthese d'une
partie de l'ARN au contact de l'ADN de l'organisateur nucleolaire. L'ARN
1
Adresse de I*auteur: Laboratoire d'Histologie et d'Embryologie, Faculte de Medecine
2, rue Ecole de Medecine, 34 Montpellier, France.
128
S. SANCHEZ
synthetise serait ensuite transfere dans le cortex granulaire. Par contre, les
micron ucleoles non basophiles decrits par Van Gansen & Schram (1968) sont
constitues d'un materiel compact fibrillo-granulaire dense.
En abordant Fetude de l'ovogenese de Triturus helveticus, nous avons
observe que le metabolisme nucleaire etait fortement marque par l'activite d'une
population nucleolaire heterogene dans son ultrastructure, et dont la densite
est variable au cours de la maturation de l'ovocyte. D'etroites relations s'etablissent entre les nucleoles et les chromosomes plumeux au cours de la phase
terminale de l'ovogenese, qui sont le signe d'une activite biosynthetique intense:
les observations autoradiographiques decrites ci-dessus en apportent la
demonstration.
MATERIEL ET TECHNIQUES
La plupart des observations decoulent de l'examen d'autoradiogrammes
executes selon la technique de Ficq (1962).
Des animaux femelles de Triturus helveticus Raz recoltes a differentes epoques
de l'annee dans la region des Causses, ont recu une injection intraperitoneale
de 100/tc de precurseur radioactif: acide orotique 5-T, act. spec. 750 mc/mM; Llysine-4-5-T monohydrochlorure, act. spec. 302 mc/mM; L-phenylaline-T, act.
spec. 750 mc/mM, provenant d'Amersham (Angleterre). Les ovaires ont ete
preleves apres des temps variables et fixes dans l'alcool (9)-acetique (1).
L'ovaire d'un animal qui avait recu une injection de lysine pendant 24 h, a
ete conserve en chambre sterile, dans une solution froide, un jour entier, avant
d'etre fixe. Des tests enzymatiques a la ribonuclease et a la desoxyribonuclease,
ont ete pratiques sur lame, avant la pose de l'emulsion.
La technique de Bloch et Hew (1950), au bleu de bromophenol apres hydrolyse
dans l'acide picrique avec et sans acetylation, a permis une bonne visualisation
des proteines basiques.
Pour les observations en microscopie electronique, les ovocytes ont ete fixes
pendant 4 h a la glutaraldehyde tamponnee, en solution a 5 %, et post-osmies
pendant 1 h. Us ont ete inclus dans de l'Araldite.
Les preparations ont ete examinees au microscope electronique Philips
EM 200.
RESULTATS
I. Mecanisme de la formation des corps nucle'olaires
(a) Etude cytochimique
Parmi les nombreuses donnees que Ton possede sur l'ovogenese des Amphibiens, rappelons, tout d'abord, celles qui permettent de situer les problemes que
nous avons abordes.
Le developpement de l'ovocyte se deroule en deux temps: d'abord, I'elaboration du vitellus, ensuite la maturation cytoplasmique suivie, au moment de la
ponte, de la maturation nucleaire.
Nucleoles des ovocytes
Fig. 1. Evolution de l'appareil nucleolaire au cours du developpement de l'ovocyte
de Triturus helveticus (coloration: bleu de bromophenol, acide picrique pH = 2,3).
A, B. Debut de la phase d'accroissement. x 3.000.
C. Vitellogenese primaire. x 1.200.
D-G. Vesicules germinatives d'ovocytes prematures montrant l'ascension des
nucleoles au centre du noyau (D), la formation de tres nombreux micronucleoles
(E), le retour des nucleoles a la peripherie (F), et disparition des ramifications des
chromosomes plumeux (G). x 750.
9
J E E M 22
130
S. SANCHEZ
Chez Triturus, la vitellogenese se deroule egalement en deux temps. La
vitellogenese precoce, qui s'effectue dans la zone corticale, tandis que la vitellogenese tardive s'effectue dans la zone peri nucleaire. Brachet (1947) met en
evidence dans Foeuf non feconde d'Amphibien, l'existence d'un cortex basophile
contenant des granules ribonucleiques. Dans le cytoplasme, ces granules
ribonucleiques se repartissent selon un gradient animal-vegetatif. Par contre, la
localisation de certains acides amines tels que 1'arginine affecte une disposition
inverse. Witteck (1952) confirme les observations precedentes en montrant que
la vitellogenese etait marquee des le debut et tout au long de son deroulement
par une polarisation qui prepare les localisations biochimiques ulterieures.
Sur le plan nucleaire, la presence de chromosomes longs et ramifies, les
chromosomes plumeux, ainsi que celle de nombreux nucleoles accusent l'originalite marquee de la vesicule germinative d'Amphibien.
La coloration au bleu de bromophenol-acide picrique a bas pH, specifique
des proteines basiques (fig. 1), souligne avec une particuliere nettete, la structure
morphologique des constituants nucleaires, chromosomes et nucleoles. Cette
technique montre: chez les tres jeunes ovocytes dont le noyau atteint 5 a 6 /* de
diametre, de nombreux nucleoles spheriques et de structure homogene, se
repartissant a la peripherie du noyau. A ce stade, seuls les nucleoles sont colores.
Les chromosomes et le nucleoplasme demeurent incolores. A un stade plus
avance (diametre nucleaire 25 JLO), l'aspect de la vesicule germinative change
totalement. Nucleoles spheriques, chromosomes leptotenes et nucleoplasmes
sont intensement colores en bleu. L'apparition de cette coloration est, probablement, la manifestation d'une synthese nouvelle de proteines basiques. Certains
nucleoles se trouvant pris entre les mailles du reseau chromatique, recueillent
des fragments chromatiques qu'ils entrainent contre la membrane nucleaire,
tandis que les chromosomes perdent leur colorabilite premiere. Et c'est ainsi
que jusqu'a la vitellogenese, nous voyons, appliques contre la membrane
nucleaire, des nucleoles qui s'entourent d'un materiel spumeux.
Au cours de la vitellogenese, de nombreuses extrusions nucleaires debarrassent
les nucleoles de ce materiel spumeux; les nucleoles redeviennent alors
spheriques.
Fig. 2. Formation et ultrastructure des micronucleoles de l'ovocyte premature de
Triturus helveticus.
A. Fragment de chromosome. La zone indiquee par la fleche pourrait etre l'axe
du chromosome, x 15.200.
B, C. Corps micronucleolaires en formation sur les ramifications chromosomiques.
x 21.600 et 11.600.
D. Corps micronucleolaire (m.n.) accole a la zone granulaire du nucleole (N).
E. Detail grossi 103.200 de C montrant Pintegration des particules de 500 A environ
dans le corps micronucleolaire.
F. Structure particulaire d'une ramification chromosomique. x 44.800.
Nucleoles des ovocytes
131
9-2
132
S. SANCHEZ
Vers la fin de la vitellogenese, des phenomenes analogues aux premiers se
deroulent a nouveau dans la vesicule germinative. La selectivite de la coloration
au bleu de bromophenol a permis de les suivre avec beaucoup de nettete, au
cours des differents stades prophasiques. Les 'lampbrush chromosomes' occupent, durant la vitellogenese, toute la vesicule germinative; les nucleoles sont
localises dans les cryptes de la membrane nucleaire. Ensuite, les uns et les autres
se groupent au centre de la vesicule germinative, et une multitude de granulations apparaissent au contact des chromosomes. Ces granulations deviennent
coalescentes et donnent naissance a un nombre tres important de micronucleoles.
Certains d'entre eux vont se greffer sur les macronucleoles qui se trouvent a
proximite. Les macronucleoles piques de micronucleoles, et les micronucleoles
libres retournent a la peripherie du noyau, laissant au centre les chromosomes
depouilles de leurs boucles.
Ces observations cytochimiques preliminaries suggerent l'existence de relations directes entre les 'lampbrush chromosomes' et certains nucleoles ou parties
de nucleoles. L'etude ultrastructurale viendra confirmer cette hypothese.
(b) Etude ultrastructurale
Nous avons effectue des examens ultramicroscopiques dans la region des
chromosomes d'ovocytes ages. A ces stades avances de la vitellogenese, les
vesicules germinatives contiennent, effectivement, trois types de corps nucleolaires comme l'observent Van Gansen & Schram (1968) chez Xenopus laevis.
(1) Des nucleoles typiques, composes d'une region fibrillaire plus ou moins
entierement enfermee dans une cape de materiel granulaire. Ces nucleoles
typiques prennent des formes diverses, spheriques ou en ruban.
(2) Des micronucleoles d'un type different des premiers et (3) des nucleoles
a protuberances, formes par la juxtaposition de nucleoles typiques et de micronucleoles. C'est preferentiellement au contact de la region fibreuse que viennent
s'accoler les micronucleoles.
Si sur le plan cytochimique, les reactions des uns et des autres sont identiques
ou presque, par contre, leur structure est differente.
Les micronucleoles ont une constitution homogene, ou apparaissent, essentiellement, des elements granulaires plus denses aux electrons que ceux des
nucleoles typiques et d'un diametre plus grand (120 A). Mais c'est leur mode
de formation qui permet de les caracteriser surement. Dans les ovocytes ages,
ou ils sont les plus nombreux, certains d'entre eux sont rattaches aux chromosomes, ou, plus precisement, aux boucles chromosomiques qui leur donnent
naissance. Parmi le materiel heterogene que constitue ces boucles, se trouve un
tres grand nombre de particules de l'ordre de 500 A qui se groupent et forment
des amas de 2 a 3 /t de diametre. Dans cette masse, qui constitue le micronucleole
en formation, les particules de 500 A sont heterogenes. Elles paraissent formees
d'une chaine de particules plus fines de 120 A environ, enroulee sur elle meme.
Elles se deroulent ensuite, rendant plus nette la structure finement particulaire.
Nucleoles des ovocytes
133
La population nucleolaire des ovocytes agee, est done composee de corps
nucleolaires different essentiellement par leur constitution ultrastructurale. Les
uns sont composites, les elements fibrillaires et les elements finement granulaires
etant localises dans deux regions distinctes. Les autres sont de constitution
homogene et formes de particules de l'ordre de 120 A derivant de particules plus
grosses de 500 A environ. La presence de fibrilles melees aux particules de 120 A
n'est pas exclue. Ces derniers nucleoles se greffent momentanement sur les
premiers et donnent naissance aux nucleoles a protuberance; mais ils s'en
detachent ensuite en emportant souvent des fragments du nucleole hote. La
nature des echanges entre les deux types de nucleoles nous echappe encore.
11 semble, cependant, que ces processus soient lies au transfert de ribonucleoproteines elaborees par les chromosomes. En effet, a cote des micronucleoles,
le nucleoplasme transporte des fragments, de tailles variables, d'un materiel qui
leur ressemble. Ces fragments, comme les micronucleoles, entrent en contact
avec les nucleoles typiques.
II. Metabolisme de Vovocyte au cours de son developpement:
syntheses de FARN et des proteines
(1) Cinetique d'incorporation de Vacide orotique-H3
Ce precurseur a ete injecte dans la cavite generale des animaux et les ovaires
ont ete preleves 3 h et 24 h apres l'injection.
L'incorporation de l'acide orotique dans l'ARN synthetise s'effectue des les
premieres heures, a un taux eleve (fig. 3 A, B).
D'une maniere generale, le marquage est essentiellement chromosomique.
Les nucleoles n'apparaissent que legerement marques. Un transfert du materiel
radioactif dans le cytoplasme intervient au cours des 24 h qui suivent l'injection
du traceur. Le marquage cytoplasmique est localise aux regions basophiles
(fig. 3D).
Un examen plus precis permet d'observer des variations dans le marquage,
au cours du developpement de l'ovocyte. Lors de la phase preparatoire a la
vitellogenese, les tres jeunes ovocytes, dont le cytoplasme montre le plus haut
degre de basophilie, presentent le marquage nucleaire le plus intense. Cette
intensite s'estompe aux stades suivants, ce qui rend vraisemblable une diminution du taux des syntheses de l'ARN au cours de la vitellogenese proprement
dite. La synthese reprend avec une nouvelle intensite au cours de l'ascension
des nucleoles au centre de la vesicule germinative, stade qui marque la fin de la
vitellogenese et annonce la maturation.
La localisation du marquage nucleaire au cours des premieres heures de
l'incorporation d'acide orotique-H3 se superpose avec le trace des chromosomes. Les nucleoles peripheriques ne sont pas marques d'une maniere significative. Par contre, les nucleoles qui, en fin de developpement, se rassemblent
au centre de la vesicule germinative presentent un marquage net. Lane (1967)
134
S. SANCHEZ
a montre qu'il s'agit d'une synthese d'ARN qui s'effectue au contact de l'ADN
nucleolaire. Mais, la majeure partie de FARN synthetise Test, sans nu] doute,
a partir des chromosomes.
Au cours des 24 h qui suivent, les ribonucleoproteines marquees se detachent
des chromosomes et sont transportees a la peripherie du noyau; elles passent,
ensuite, dans le cytoplasme juxtanucleaire. II n'est pas exclu que les nucleoles
contribuent au transfert des ribonucleoproteines vers la membrane nucleaire.
(2) Cinetique ^incorporation de la lysine-H3
La coloration massive des nucleoles et des micronucleoles par les techniques
precedemment decrites, suggere la presence, dans ces organites nucleaires,
d'une forte teneur en proteines basiques. C'est la raison pour laquelle nous
avons utilise la lysine-H3 comme traceur radioactif, afin de preciser la signification des phenomenes decrits dans le chapitre precedent. Mais la localisation de
la coloration des proteines basiques ne se limite pas aux seules regions nucleaires.
Une quantite importante de proteines basiques cytoplasmiques a ete trouvee, en
effet, dans l'ovocyte de Triton (Horn, 1962). Les colorations cytochimiques que
nous avons employees permettent de les situer dans les ilots de vitellus en
formation, en bordure des plaquettes vitellines.
La biosynthese de ces proteines basiques et leur comportement au cours du
developpement de l'ovocyte ont ete analyses par la technique autoradiographique
apres incorporation de la lysine-H3 qui a ete injectee dans la cavite generale de
l'animal, a raison d'une injection de 100/tc. Les ovaires ont ete preleves 7,18,24 h
apres l'injection. Dans ce dernier cas, un fragment de l'ovaire a ete conserve
pendant 24 h apres Fablation, dans une solution physiologique contenant un exces
de lysine non radioactive, avant d'etre introduit dans le fixateur.
La distribution du precurseur dans les ovocytes varie en fonction de la duree
du 'pulse', ce qui permet de suivre la migration des proteines qui ont incorpore
l'acide amine durant leur synthese. Elle varie egalement en fonction du stade du
developpement de l'ovocyte. Enfin, un marquage effectue a diverses periodes
de l'annee permet de constater une variation saisonniere, comme l'a signale
Geuskens, chez Asterias rubens (1965). Le marquage est en effet plus intense au
printemps. D'une maniere generale, a la 7e h, les vesicules germinatives sont
uniformement marquees, tandis que les cytoplasmes ne le sont qu'en certaines
Fig. 3. Incorporation d'acide orotique-H3 dans les ovocytes de Triturus heheticus.
x 1.200.
A. Marquage nucleaire des ovocytes au stade previtellogenetique (duree de l'incorporation 3 h).
B. Vesicule germinative d'un ovocyte premature apres 3 h d'incorporation du
precurseur.
C. Meme stade apres 24 h d'incorporation.
D. Ovocyte en fin de vitellogenese primaire ayant incorpore l'acide orotique-H3
dans la zone basophile perinucleaire (24 h).
135
Nucleoles des ovocytes
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Nucleoles des ovocytes
137
regions privilegiees. En effet, la densite du marquage cytoplasmique presente
un gradient centripete qui suggere un deplacement des proteines de la peripherie vers le noyau. La synthese parait s'efTectuer surtout dans le cortex, ou
Ton observe des ilots de proteines marquees sur tout le pourtour de l'ovocyte.
Par contre, la membrane folliculaire n'a pas retenu le precurseur d'une maniere
significative.
Lorsque les glandes sont prelevees un jour apres l'injection, des variations se
manifestent dans la localisation et la densite du marquage, entre les differentes
categories d'ovocytes. L'incorporation reste moderee dans les ovocytes tres
jeunes ou tres ages; elle augmente considerablement durant la vitellogenese
secondaire.
Dans le premier cas, on constate une accumulation renforcee de proteines
dans la vesicule germinative et les nucleoles (fig. 4A). Le second cas est caracterise par une abondante accumulation dans les centres actifs de vitellosynthese
qui entourent la vesicule germinative, et autour des plaquettes vitellines (fig. 4B).
I l y a done une correspondance parfaite entre les localisations indiquees par les
colorations cytochimiques et par l'autoradiographie.
L'analyse du marquage est surtout significative apres une chasse du precurseur
durant 24 h.
Chez les jeunes ovocytes, le marquage est alors presque uniquement nucleaire.
Dans les ovocytes en cours de vitellogenese, le marquage des regions basophiles
diminue au profit des centres actifs de vitellogenese. C'est dans les ovocytes
les plus ages que la distribution des proteines oflfre le plus d'interet en raison de
la polarisation qu'elle presente. Leur repartition cytoplasmique s'eflfectue selon
un gradient qui prefigure le gradient animal-vegetatif; d'autre part, les proteines
basiques paraissent suivre la polarite de la vitellogenese tardive et la symetrisation de l'ovocyte de la meme maniere que les proteines sulfhydrilees suivant les
observations de Brachet (1947), rapportees par Dalcq (1941). 11 faut preciser qu'a
ce stade du developpement de l'ovocyte, la vesicule germinative s'est rapprochee
du pole animal. Elle a une position laterale par rapport a l'axe de symetrie
passant par le centre de la calotte pigmentee (Fig. 4C, D). Les proteines basiques,
en majeure partie cytoplasmiques, coiffent exterieurement le pole animal de la
Fig. 4. Incorporation de lysine-H3 dans les ovocytes de Tritunts helveticus.
A. Incorporation pendant 18 h dans un ovocyte en cours de vitellogenese primaire.
x600.
B. Idem, dans un ovocyte en cours de vitellogenese secondaire. x 480.
C. D. Ovocyte age ( x 300) et sa vesicule germinative fortement grossie, apres une
chasse du precurseur durant 24 h (x 3.000). On note la polarisation du marquage
du cote du pole animal (p.a.).
E. Incorporation de precurseur dans le nucleole et la membrane nucleaire. x 3.000.
F. Marquage cortical au cours des 7 premieres heures dans un ovocyte age.
x 3.000.
138
S. SANCHEZ
vesicule germinative. Le regroupement des nucleoles, dans cette meme region
de la vesicule germinative, suggere qu'ils sont l'un des agents de transfert des
proteines basiques, de la vesicule germinative dans le cytoplasme. En effet, un
examen optique a fort grossissement revele de nombreux grains d'argent precipites sur la face externe de certains nucleoles peripheriques. De meme, les
nucleoles groupes au centre des vesicules germinatives sont porteurs de proteines basiques, comme ils etaient porteurs d'acide ribonucleique marque par
l'acide orotique.
Par ailleurs, un lisere cortical de proteines basiques radioactives ceint l'oeuf,
tandis que le centre n'est pas marque.
La lysine-H 3 apparait done comme un precurseur signaletique de la synthese
et du comportement de certaines proteines basiques presentes dans l'ovocyte
de Triton.
Ces syntheses proteiques sont correlatives de la vitellosynthese, puisque les
proteines marquees apparaissent d'une maniere importante, dans les zones
corticales au niveau du cortex basophile decrit par Brachet (1947) et les zones
perinucleaires de proliferation de plaquettes vitellines. Mais, anterieurement a
la formation du vitellus, elles sont liees aux regions les plus basophiles contenant
une forte proportion d'ARN. L'apparition des plaquettes vitellines primaires
a la peripherie de l'ovocyte repousse vers le noyau en le reduisant, ce cytoplasme
basophile ainsi que le marquage qui lui est associe. Le marquage nucleaire suit
une evolution parallele: il diminue progressivement au cours de la vitellogenese
primaire. Une incorporation accrue du precurseur dans les vesicules germinatives
et, surtout, dans les nucleoles, precede l'amorce de la vitellogenese secondaire.
II apparait done que les proteines basiques dont la synthese est associee a
F elaboration du vitellus, sont liees aux constituants cytoplasmiques riches en
acide ribonucleique qui composent les noyaux vitellins. La chasse du precurseur
pendant 24 h suggere une premiere migration des proteines basiques cytoplasmiques dans les vesicules germinatives. Ce premier transfert serait suivi d'un
second transfert nucleocytoplasmique. Au cours de cette derniere phase, les
images des nucleoles et des extrusions nucleaires, donnees par les autoradiographies apres incorporation de la lysine-H 3 (fig. 4) et de l'acide orotique-H3
(fig. 3) sont identiques. Ces relations tout au moins apparentes, entre ARN et
proteines basiques, conferent a ces dernieres une importance sur le plan embryonnaire, qu'accentue leur localisation tres particuliere dans les ovocytes
atteignant leur maturite.
(3) Cinetique d'incorporation de la phenylalanine-H3
Merriam (1966) a cite de nombreux travaux rapportant des observations sur
les deux types de syntheses proteiques qui interviennent au cours de l'ovogenese
d'Amphibiens. Certaines proteines seraient synthetisees dans l'ovocyte;
d'autres, de source extraovocytaire, seraient transferees dans l'ovocyte. Le
marquage intense de la membrane folliculaire (Ficq, 1962) parait en temoigner.
Nucleoles des ovocytes
139
Les proteines marquees par la phenylalanine-H 3 doivent se rapporter a
cette deuxieme categoric L'incorporation du precurseur est rapide. Le marquage
de l'ovaire est aussitot general et uniforme, tant en ce qui concerne les noyaux
que les cytoplasmes. Certes, l'incorporation du precurseur est accentuee dans
les regions basophiles. Mais on ne note pas une accumulation aussi dense, dans
des regions privilegiees comme avec la lysine. D'autre part, les membranes
folliculaires presentent toujours une radioactivite remarquable.
On est d'autant plus frappe de voir, au milieu d'un marquage general et
intense de l'ovocyte, les aires restreintes des centres actifs de vitellosynthese
demeurer depourvues de grains d'argent. Pourtant, c'est dans ces ilots de
vitellus naissant que la lysine-H3 s'incorpore, temoignant d'une synthese proteique quantitativement tres importante. La phenylalanine ne s'y incorpore pas,
ofFrant un contraste frappant avec les autres regions cytoplasmiques.
Les differences extremement nettes qui se manifestent dans la repartition des
deux precurseurs, incitent a penser qu'il s'agit bien des syntheses de deux classes
distinctes de proteines qui s'opposent sur plusieurs points.
D'abord par leur origine vraisemblablement exogene pour les proteines riches
en phenylalanine, endogene pour les autres. Ensuite, par les modalites de leur
synthese qui s'effectue concurremment dans le noyau et le cytoplasme pour les
premieres alors que le transfert cyto-nucleoplasmique des secondes est probable.
Mais le trait le plus caracteristique est sans doute la tres forte accumulation des
proteines riches en lysine dans les noyaux vitellins qui sont depourvus de proteines de la seconde categoric
Et jamais nous n'avons observe une repartition privilegiee des proteines
marquees par la phenylalanine, selon un gradient de polarite, ce qui renforce le
caractere singulier des proteines basiques a cet egard.
DISCUSSION
Ces observations permettent d'etablir le mode de formation, au cours du
stade chromosome plumeux (et a partir de ceux-ci), de nucleoles d'un type
different des nucleoles d'origine. L'existence, dans les vesicules germinatives
d'Amphibiens, de differents types nucleolaires a ete meconnue par la plupart
des auteurs. MacGregor (1965) admet la poursuite de l'activite de l'organisateur
nucleolaire au stade diplotene, chez Thturus cristatus seulement, sans modification apparente de la structure des nucleoles nouvellement formes. Les observations de Gall (1968) chez Xenopus suggerent egalement que la multiplication
nucleolaire correlative de l'apparition des organisateurs nucleolaires s'effectue
durant le stade pachytene seulement. Comment expliquer la presence dans les
ovocytes murs de Xenopus des trois types de nucleoles que nous observons
egalement chez Triturus helveticus, a savoir, les nucleoles classiques decrits par
tousles auteurs (Brown&Ris, 1959; Miller, 1966; MacGregor, 1967; Lane, 1967),
les micronucleoles et des nucleoles composites ou se trouvent associes les deux
140
S. SANCHEZ
types precedents. Van Gansen & Schram (1968), qui n'ont suivi qu'une partie
du processus de la formation des micronucleoles, n'envisagent qu'une filliation
possible avec les nucleoles d'origine. Chez Triturus helveticus, les micronucleoles
derivent d'un materiel forme au contact des chromosomes diplotenes; leur
texture est identique a celle qui compose les boucles chromosomiques dont ils
sont issus. Elle est faite de grains de 500 A qui rappellent les grains perichromatiniens decrits par Degekel & Govaerts (1968). La conversion de ces grains en
particules plus petites de l'ordre de 120 A, a l'interieur des micronucleoles,
rapprochent egalement, ces organites des 'puffs' des chromosomes polytenes
de Dipteres. Quoiqu'il en soit de ces analogies, ces nucleoles sont structuralement differents des nucleoles classiques definis par leur materiel fibrillaire
associe a une masse finement granulaire. C'est secondairement que les micronucleoles vont se greffer sur les nucleoles d'origine pour permettre des echanges
de materiel avec ces derniers; il s'en detachent ensuite. Ils constituent ainsi, les
agents de transfert nucleocytoplasmiques du materiel chromosomique dont
l'elaboration est particulierement active au cours de la prophase meiotique
precedant la maturation. La nature des echanges qui interviennent entre les
deux types nucleolaires nous echappe. Elle peut etre partiellement expliquee par
les observations concernant l'analyse du metabolisme des acides ribonucleiques
et des proteines basiques.
En effet, la majeure partie des syntheses de l'ARN nucleaire s'effectue au
contact des chromosomes plumeux et sans doute des boucles granuleuses de
Callan. Ces observations conflrment les nombreuses donnees rapportees dans la
litterature de ces dernieres annees (Gall & Callan, 1962; lzawa, Allfrey &
Mirsky, 1963a, b; Edstrom & Gall, 1963; Davidson, Allfrey & Mirsky, 1964).
Cet ARN est transports par des granulations nucleoplasmiques. 11 n'est pas
exclu que les micronucleoles soient impliques, egalement, dans ce transfert, et
ceci en liaison avec les proteines basiques qui viennent s'accumuler dans les
vesicules germinatives. Les images autoradiographiques donnees par l'incorporation des deux precurseurs utilises sont parfaitement superposables. Les nucleoles
de type classique n'incorporent l'acide orotique-H3 que lorsqu'ils se trouvent au
contact des chromosomes. Les nucleoles peripheriques ne sont generalement pas
marques, ce qui incite a penser qu'il s'agit, pour la majeure partie, d'une accumulation d'ARN sur les nucleoles centraux plus que d'une synthese in situ. Et
l'amalgame entre materiel nucleolaire normal et corps micronucleolaires ou
granulations nucleoplasmiques pourraient justifier cette derniere hypothese.
Si la majeure partie de 1'ARN parait etre synthetisee au contact des chromosomes, il est cependant indeniable, comme Ton montre MacGregor (1967) et
Lane (1967) qu'une fraction d'ARN est synthetisee dans les nucleoles centraux.
Deux sortes d'ARN sont ainsi mis en evidence: un ARN chromosomique et un
ARN nucleolaire.
La formation des micronucleoles, le changement qui s'opere dans les structures nucleolaires par le passage de formes spheriques a des formes en ruban ou
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protuberantes, joints a l'activite elaboratrice des chromosomes plumeux sont
le signe d'un metabolisme nucleaire intense lie a la maturation de l'ovocyte.
Ce metabolisme aux processus complexes, concerne particulierement la formation d'un stock d'ARN destine a transmettre des informations d'origine maternelle au cours des premiers stades embryonnaires (Brown & Ris, 1959; Davidson
et al. 1964).
La participation des proteines basiques aux mecanismes de la transmission
genetique est suggeree par le comportement particulier des proteines fortement
marquees par la lysine-H3. Dans l'ovocyte de Triton, ces proteines se repartissent dans le cytoplasme selon un gradient de polarite bien net surtout dans la
derniere phase de maturation cytoplasmique. Dans le noyau, elles sont associees
aux nucleoles et aux nucleoplasmes riches en ARN et sont distinctes des histones
chromosomiques synthetisees, comme l'ADN, au cours de la phase postovogoniale; dans les stades plus jeunes, elles sont dans le cytoplasme et le noyau,
localisees, preferentiellement, aux regions les plus basophiles. Shepherd &
Nolan (1968) ont souligne le fait que les proteines basiques seraient liees aux
structures qui interviennent dans les mecanismes du transfert de 1'information
genetique, dans les cellules de l'ovaire du Hamster, ce qui Concorde avec nos
propres observations. 11 faudrait, cependant, completer ces observations par
une analyse autoradiographique en microscopie electronique pour obtenir une
localisation precise des traceurs sur les ultrastructures.
RESUME
Nos observations decoulent d'examens d'autoradiogrammes apres incorporation d'acide orotique-H3 et de lysine-H3, dans l'ovocyte de Triturus helveticus.
II y a ete joint des colorations cytochimiques au bleu de bromophenol-acide
picrique, et une etude ultrastructurale des vesicules germinatives.
Ces deux dernieres techniques revelent, avec une particuliere nettete, la
formation de 'micronucleoles' a partir des 'lampbrush chromosomes'. L'ultrastructure des micronucleoles est differente de celle des nucleoles d'origine. 11s
sont constitues de particules de 500 A qui se transforment lorsqu'elles s'agregent
les unes aux autres.
La phase 'lampbrush chromosomes' se caracterise par une activite biosynthetique intense, dont temoignent l'incorporation de l'acide orotique et la
formation des micronucleoles.
La lysine-H3 revele une synthese proteique, qui prend un caractere particulier
par la disposition qu'affecte ces proteines basiques dans l'ovocyte age, selon un
gradient rappelant le gradient animal-vegetatif.
142
S. SANCHEZ
SUMMARY
The formation and role of nucleoli in the oocytes 0/Triturus helveticus:
an autoradiographic and ultrastructural study
The data concern autoradiographic examination of the incorporation of
[3H]orotic acid and [3H]lysine into oocytes of Triturus helveticus.
Cytochemical staining with bromophenol blue-picric acid, and ultrastructural
studies have been done.
These techniques clearly show the formation of micronucleoli produced by
the lampbrush chromosomes. The ultrastructure of the micronucleoli differs
from that of the original nucleoli.
The incorporation of [3H]orotic acid in the chromosomes and the formation of
micronucleoli provide a morphological basis for the biochemical events taking
place during the lampbrush chromosome phase.
The incorporation of [3H]lysine follows a particular distribution in the older
oocytes, reflecting the gradient between animal and vegetative poles.
Mes remerciements s'adressent a Monsieur le Professeur Brachet pour les critiques et
suggestions qu'il a formulees au cours de la redaction de ce texte.
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