/. Embryo/, exp. Morph. Vol. 21, 1, pp. 165-76, February 1969
Printed in Great Britain
j (55
Etude cytochimique,
an microscope electronique, des structures a ARN
et du glycogene dans le cytoplasme des oocytes
de Xenopus laevis
Par CHRISTIAN THOMAS 1
Laboratoire de Morphologie animale,
Universite Libre de Bruxelles, Belgique
Ayant entrepris une etude de revolution des structures ribosomales au cours
de l'oogenese chez Xenopus laevis, nous avons montre, dans un precedent travail
(Thomas, 1967), qu'un constituant fibrillo-granulaire est present dans le cytoplasme des oocytes tout au long de leur croissance:
(1) Le cytoplasme des oocytes de moins de 300 JLI ne contient pas, ou peu, de
ribosomes typiques; il montre un materiel fibrillaire et granulaire, d'environ
10 a 20 A de diametre, plus ou moins disperse suivant le stade, frequemment
agence en travees.
(2) De nombreux corpuscules d'aspect ribosomal, relies entre eux par des
travees, apparaissent au debut de la vitellogenese. Ces corpuscules et les travees
qui les relient sont constitues de fibrilles et de granules identiques au materiel
trouve dans les oocytes de moins de 300 JLI.
(3) Des corpuscules d'aspect ribosomal, non reunis par des travees et dont la
structure est formee de fibrilles et de granules de 10 a 20 A de diametre, sont
presents dans les oocytes de 700 et de 1000 JLL US sont dissemines dans le
cytoplasme parmi les granules ft de glycogene. Cet ensemble d'observations
nous a conduit a Fidee que les ribosomes s'edifieraient progressivement, dans
le cytoplasme oocytaire, par la condensation d'unites elementaires presentes
dans les jeunes oocytes de Xenopus laevis. Le present travail a pour but d'apporter
des arguments cytochimiques, a l'echelle de l'ultrastructure, en faveur de cette
hypothese, en employant des techniques mettant specifiquement en evidence
les structures a ARN, soit par une coloration selective, soit par une digestion
enzymatique specifique. Ce travail a ete complete par une etude cytochimique
du glycogene dans les gros oocytes (1000 ja).
1
Adresse de Vauteur: Laboratoire de Morphologie animale, Universite Libre de Bruxelles,
67, rue des Chevaux, Rhode Saint Genese, Belgique.
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C. THOMAS
MATERIEL ET METHODES
Des fragments d'ovaires de Xenopus laevis, preleves par dissection, ont ete
places, pendant 1 ou 24 h, a 20 °C, dans de l'aldehyde glutarique a 6 % dans
un tampon au phosphate 0,1 M a pH 7,4. Certaines pieces ont ete surfixees avec
du tetroxyde d'osmium a 1 % dans ce meme tampon, durant 1 h a 20 CC. Les
oocytes ont ete classes, suivant leur diametre, en petits oocytes (inferieurs a
250 JLL), moyens oocytes (300 a 600 /i) et gros oocytes (1000 /t). Les pieces ont
ete incluses a l'Araldite. Les coupes, realisees avec un microtome Porter-Blum,
ont ete contrastees par divers reactifs:
plomb (Millonig, 1961; Reynolds, 1963).
acetate d'uranyle aqueux (Watson, 1958).
acetate d'uranyle ethylique 0,5 %.
acide phosphotungstique aqueux 0,5% durant 2min (Marinozzi, 1967).
acide phosphotungstique ethylique 1 %.
acetate d'uranyle aqueux apres une double oxydation (J. P. Revel & M. J.
Karnovsky, communication personelle).
Nous avons egalement effectue un enrobage de fragments d'ovaires au glycol
methacrylate (Leduc & Bernhard, 1967), apres fixation a l'aldehyde glutarique
a 2,5 % dans un tampon au phosphate, pendant 20 min a 4 °C. Les coupes ont
ete soumises a Faction de divers enzymes a 37 °C:
pepsine 0,1 a 0,5 % dans du HC1 0,1 N pendant 30 min a 1 h.
pronase 0,01 % dans l'eau distillee a pH 7,4 pendant 30 min (Monneron,
1966).
ribonuclease 0,1 % dans l'eau distillee a pH 6,8 pendant 30 min a 1 h.
La specificite de l'attaque enzymatique a ete testee par flottage de coupes sur
des solutions temoins, a la meme temperature et pendant un temps egal a la
digestion de l'enzyme correspondant.
L'observation des coupes a ete effectuee a l'aide d'un microscope AEI EM 6B.
PLANCHE 1
Fig. A. Region cytoplasmique d'un petit oocyte et cellule folliculeuse bordante (CF). Fixation:
aldehyde glutarique. Coloration: plomb. x 30.000.
Fig. B. Region cytoplasmique d'un oocyte en debut de vitellogenese et cellule folliculeuse
bordante (CF). Fixation: aldehyde glutarique. Coloration: plomb. x 30.000.
Figs. C, E. Le cytoplasme des petits oocytes est constitue par des travees (77?) formees de
fibrilles (F) et de granules (G). Fixation: aldehyde glutarique. Coloration: plomb. C,
x 100.000. E, x 200.000.
Figs. D, F. De nombreux corpuscules ribosomaux (R) dont la structure fibrillo-granulaire
est visible a grossissement eleve (fleches) et des travees (77?) formees de fibrilles (F) et de
granules (G) sont visibles dans le cytoplasme des oocytes en debut de vitellogenese. Fixation:
aldehyde glutarique. Coloration: plomb. D, x 100.000. F, x400.000.
ARN et glycogene de Xenopus
v. . •
CF
L_
V
^'*.
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C. THOMAS
ARN et glycogene de Xenopus
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OBSERVATIONS
1. Petits oocytes
Leur cytoplasme est constitue par un materiel finement fibrillaire et granulaire.
(a) Apres enrobage a VAraldite
La coloration au plomb, apres fixation a l'aldehyde glutarique, qui est specifique des structures a ARN (Marinozzi, 1963; Sabatini, Bensch & Barrnett,
1963), revele une difference importante entre les structures contrastees du
cytoplasme oocytaire et celui des cellules folliculeuses bordantes (planche 1,
fig. A). Ces dernieres montrent des ribosomes fortement contrasted, alors que
le cytoplasme oocytaire ne renferme pas de structures similaires. Observe a plus
fort grossissement (planche 1, figs. C, E), ce cytoplasme presente un materiel
fibrillaire et granulaire d'environ 10 a 20 A de diametre, colorable par le plomb
et agence en travees.
La coloration par l'acetate d'uranyle, apres fixation a l'aldehyde glutarique,
revele les memes differences de contraste entre les ribosomes des cellules folliculeuses et le materiel oocytaire.
(b) Apres enrobage au glycol methacrylate
Les oocytes montrent des travees fortement contrastees apres double coloration par l'acetate d'uranyle et le plomb (planche 2, fig. A).
La digestion a la ribonuclease supprime ce contraste ou fait disparaitre les
structures visibles dans les coupes temoins (planche 2, fig. B).
Les travees sont particulierement visibles apres action de la pepsine qui digere
l'hyaloplasme environnant (planche 2, fig. C). De plus, elles subissent une
deformation plus ou moins profonde, pouvant aller jusqu'a leur transformation
en granules d'aspect ribosomal.
La pronase donne des resultats semblables a la pepsine (augmentation du
contraste des travees), mais sans deformation.
Apres une double digestion (pepsine ou pronase plus ribonuclease), les travees
fibrillo-granulaires ont completement disparu (planche 2, fig. D).
PLANCHE 2
Inclusion au glycol methacrylate. Fixation: aldehyde glutarique. Coloration: acetate
d'uranyle et plomb. x 45.000.
Figs. A-D. Region cytoplasmique d'un jeune oocyte. A, coupe temoin; B, coupe traitee 1 h
par la ribonuclease 0,1 %. C, coupe traitee 1 h par la pepsine 0,3 %. D, coupe traitee 1 h
par la pepsine 0,3 % et 1 h par la ribonuclease 0,1 %.
Figs. E, F. Region cytoplasmique d'un oocyte en debut de vitellogenese. E, coupe temoin.
F, coupe traitee I h par la ribonuclease 0,1 %.
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C. THOMAS
2. Moyens oocytes
Ces oocytes montrent de nombreux corpuscules ribosomaux reunis entre eux
par des travees.
(a) Apres enrobage a VAraldite
La coloration au plomb, apres fixation a l'aldehyde glutarique, revele de
nombreux corpuscules intensement colores, dans le cytoplasme oocytaire; ils
sont semblables aux ribosomes presents dans les cellules folliculeuses (planche
1, fig. B). A un grossissement plus eleve (planche J, figs. D, F), on constate que
ces corpuscules de structure fibrillo-granulaire sont reunis entre eux par des
travees semblables a celles qui etaient presentes dans les petits oocytes.
La coloration a l'acetate d'uranyle donne des resultats semblables.
(b) Apres inclusion dans le glycol me'thacrylate
Par rapport au temoin (planche 2, fig. E), Faction de la ribonuclease (planche
2, fig. F) ou la double digestion par la pepsine (ou la pronase) et la ribonuclease
(planche 3, fig. B), entraine une suppression du contraste ou une disparition des
corpuscules ribosomaux et des travees qui les unissent.
La digestion pepsique (planche 3, fig. A) augmente le contraste de ces memes
structures, en les deformant plus ou moins fortement.
L'effet de la pronase est identique, mais sans provoquer de deformation.
3.
Gros oocytes
Ils presentent de nombreux corpuscules d'aspect ribosomal dissemines dans
le cytoplasme (planche 4, fig. A).
(a) Apres enrobage a VAraldite
Des mensurations des corpuscules observes aucours de l'oogenese nous avaient
conduit a l'idee d'une augmentation du diametre des ribosomes en fin d'oogenese
(Van Gansen, 1966; Thomas, 1967). Mais, des colorations specifiques du
glycogene nous ont montre que celui-ci est present sous forme de particules /?,
dans les oocytes de Xenopus. Apres la coloration de Revel et Karnovsky (specifique du glycogene), le cytoplasme oocytaire montre de nombreuses particules
PLANCHE 3
Figs. A, B. Region cytoplasmique d'un oocyte en debut de vitellogenese. A, coupe traitee
1 h par la pepsine 0,3 %. B, coupe traitee 1 h par la pepsine 0,3 % et 1 h par la ribonuclease
0,1 %.
• d'un oocyte de 1000 /t. C, coupe temoin. D, coupe traitee
coupe traitee 1 h par la pepsine 0,3 %. F, coupe traitee
par la ribonuclease 0,1 %.
ARN et glycogene de Xenopus
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C. THOMAS
ARN et glycogene de Xenopus
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contrastees (planche 4, fig. B). Nous avons pu obtenir une coloration preferentielle
du glycogene ou des ribosomes, en employant l'acide phosphotungstique en
solution dans l'eau ou dans l'alcool, apres une double fixation aldehyde glutarique-osmium. L'acide phosphotungstique a ete utilise sans oxydation
prealable des coupes, afin d'eviter toute deformation possible des structures.
Une coloration de 2 min a l'acide phosphotungstique 0,5 % aqueux contraste
preferentiellement les corpuscules de glycogene d'environ 300 A, qui apparaissent
groupes au sein de regions non osmiophiles (planche 4, fig. C). L'acide phosphotungstique a 1 % dans l'alcool colore l'ensemble des structures cytoplasmiques,
tout en laissant les particules de glycogene sans contraste, alors que les ribosomes
sont bien visibles sous forme de corpuscules d'environ 200 a 250 A (planche 4,
fig. D). Les particules de glycogene /? des oocytes, apres double fixation et
coloration par l'acetate d'uranyle aqueux, seul ou suivi d'une coloration au
plomb, apparaissent plus fortement contrastees que les ribosomes. Elles sont
tres deformees et se colorent par l'acide phosphotungstique aqueux lorsque la
fixation a l'aldehyde glutarique n'est pas suivie d'une postfixation osmique
(planche 4, fig. E). Dans ces conditions, les autres colorants (acetate d'uranyle
aqueux ou ethylique, plomb, acide phosphotungstique ethylique) rendent
visibles les ribosomes et non le glycogene (planche 4, fig. F).
(b) Apres enrobage au glycol methacrylate
Cet enrobage, apres fixation par l'aldehyde glutarique, extrait le glycogene:
les zones qu'il occupait apparaissent depourvues de tout contraste. De nombreux
ribosomes sont dissemines dans le cytoplasme (planche 3, fig. C). Us disparaissent
apres action de la ribonuclease (planche 3, fig. D) ou apres une double digestion
(pepsine ou pronase et ribonuclease) (planche 3, fig. F). Une digestion par la
pepsine (planche 3, fig. E) ou la pronase les met tres nettement en evidence, en
eliminant une partie du hyaloplasme.
PLANCHE 4
Mise en evidence des ribosomes et du glycogene dans les oocytes de 1000 /*. x 30.000
Figs. A-D. Fixation a l'aldehyde glutarique-osmium. A, coloration a l'acetate d'uranyle
ethylique et plomb. B, Revel-Karnovsky, mise en evidence du glycogene. C, acide phosphotungstique aqueux 0,5 %, mise en evidence du glycogene. D, acide phosphotungstique
ethylique: les plages de glycogene ne sont pas contrastees (GL), tandis que les ribosomes sont
bien visibles (7?).
Figs. E, F. Fixation a l'aldehyde glutarique. E, acide phosphotungstique aqueux: seul le
glycogene deforme est contraste. F, acetate d'uranyle aqueux 5 %: mise en evidence des
ribosomes.
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C. THOMAS
4. Recherche du glycogene dans les oocytes en vitellogenese
Des tests de mise en evidence du glycogene, analogues a ceux que nous venons
de decrire, ont permis de constater que le cytoplasme des oocytes en debut de
vitellogenese ne contient pas de particules de glycogene. Les oocytes de 700 JLI
en possedent quelques unes, disseminees parmi les ribosomes cytoplasmiques.
DISCUSSION
1. Travees fibrillo-granulaires et ribosomes
Nous pouvons conclure de nos observations que les travees fibrillo-granulaires,
que nous observons dans les petits et moyens oocytes, contiennent de l'ARN
et que des constituants fibrillo-granulaires se retrouvent dans les ribosomes des
moyens et gros oocytes.
(a) Les differences entre le materiel cytoplasmique des petits oocytes et les
ribosomes des cellules folliculeuses se manifestent de facon frappante apres la
coloration au plomb pratiquee sur des coupes fixees a l'aldehyde glutarique. Ce
contrastant specifique, dans ces conditions, des structures a ARN se fixe sur des
fibrilles et des granules d'environ 10 a 20 A, agences en travees qui disparaissent
apres action de la ribonuclease. La majorite, ou la totalite, de l'ARN cytoplasmique visible dans ces jeunes oocytes ne se trouve done pas sous la forme de
ribosomes, mais fait partie de travees fibrillo-granulaires. Les fibrilles et granules
d'environ 10 a 20 A de diametre sont-ils formes tous deux d'ARN, probablement
sous forme ribonucleoproteique ? Une separation et une identification de ces
deux constituants, par voie biochimique, permettraient de repondre a ces
questions.
(b) Les oocytes en debut de vitellogenese montrent, par opposition aux petits
oocytes, de nombreux corpuscules se contrastant par le plomb de la meme
facon que les ribosomes des cellules folliculeuses et disparaissant apres action
de la ribonuclease. II s'agit done probablement de ribosomes. Ceux-ci montrent
une structure heterogene formee par des fibrilles et des granules semblables a
ceux qu'on observe dans les travees qui les unissent et a ceux qui sont presents
dans les petits oocytes.
Ces faits suggerent que l'edification des ribosomes se ferait dans le cytoplasme,
a partir des fibrilles et des granules qui forment les travees a ARN des petits et
moyens oocytes. Ces travees ne sont plus visibles dans les oocytes de 700 et de
1000 jit, qui possedent de nombreux ribosomes de structure fibrillo-granulaire.
Les colorations specifiques des structures a ARN et les digestions enzymatiques
sont done en faveur de l'hypothese d'une edification des ribosomes, dans le
cytoplasme des oocytes en debut de vitellogenese, a la suite d'une condensation
de precurseurs ribosomaux.
ARN et glycogene de Xenopus
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2. Glycogene
Le glycogene des oocytes d'amphibiens est present sous forme de particules /?
(Thomas, 1967; Van Gansen & Schram, 1968) de diametre superieur a celui
des ribosomes. On peut Je mettre en evidence grace a de nombreuses techniques
contrastantes (Drochmans, 1960; Marinozzi, 1963; Perry, 1967; Thiery, 1967;
Revel & Karnovsky, commun. person.). La coloration a l'acide phosphotungstique aqueux (Marinozzi, 1967) ou ethylique permet egalement de differencier tres clairement le glycogene des ribosomes sur des coupes voisines, dans
de tres bonnes conditions de preservation (fixation a l'aldehyde glutarique,
postfixation a l'osmium et enrobage a l'araldite) et sans oxydation prealable.
RESUME
La coloration au plomb et les digestions enzymatiques montrent que les
structures a ARN, presentes dans le cytoplasme des petits oocytes de Xenopus
laevis, sont differentes des ribosomes des oocytes en vitellogenese et qu'elles
pourraient etre des precurseurs de ribosomes.
Le glycogene est present dans les oocytes sous forme de particules /? de
dimension superieure a celle des ribosomes. Differents tests cytochimiques
permettent de les distinguer.
SUMMARY
A cytochemical study using the electron microscope of RNA andglycogen containing
bodies in the oocyte cytoplasm of Xenopus laevis.
Lead staining and enzymic digestions show that the RNA-containing structures found in the cytoplasm of small oocytes of Xenopus laevis are different
from the ribosomes of oocytes undergoing vitellogenesis. It is possible that these
structures are ribosomal precursors.
The glycogen is present in oocytes in the form of/? particles which are larger
than ribosomes. A variety of cytochemical tests could distinguish between them.
L'auteur est un aspirant du Fonds National de la Recherche Scientifique Beige. Travail
effectue dans le cadre du contrat Euratom-U.L.B. 007.61.10 ABIB.
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