/ . Embryo!. exp. Morph. Vol. 20, 3, pp. 375-89, November 1968
With 6 plates
Printed in Great Britain
375
Ultrastructure et cytochimie
ultrastructurale de la vesicule germinative et du
cytoplasme perinucleaire de Foocyte
mur de Xenopus laevis
Par P. VAN GANSEN & A. SCHRAM 1
Laboratoire de Morphologie animale, Universite libre de Bruxelles
Les oocytes et les ceufs de Batraciens constituent, depuis longtemps, un
material de choix pour les embryologistes. Au cours de ces dernieres annees,
les phenomenes initiaux du developpement embryonnaire ont ete etudies avec
toute la precision que permettent les techniques biochimiques et cytochimiques
actuelles. En particulier, l'etude de la maturation des oocytes de Batraciens a ete
reprise par plusieurs auteurs depuis que ce phenomene peut etre obtenu in vitro
(Dettlaff, Nikitina & Stroeva, 1964; Dettlaff, 1966; Brachet, 1965 a, b, 1967;
Smith, Ecker & Subtelny, 1966). Brachet a mis en evidence l'apparition, au cours
de la maturation, de grains Feulgen-positifs distincts des chromosomes, dans
le sue nucleaire de Rana, de Xenopus et de Bufo ainsi que dans le cytoplasme
perinucleaire des oocytes de Bufo. Ces grains se rassemblent dans le cytoplasme
cortical, puis ils disparaissent (Brachet, 1965 a).
Pour tenter de preciser l'origine du DNA contenu dans ces grains dont le role
dans l'embryogenese des Batraciens pourrait etre important, nous avons repris,
en collaboration avec Brachet, l'etude de la maturation in vitro de l'oocyte de
Xenope a l'aide du microscope electronique.
Le present article decrit l'ultrastructure de la vesicule germinative des oocytes
non traites par les extraits hypophysaires. Un travail ulterieur (Brachet et Van
Gansen) traitera de la maturation des oocytes de Xenopus laevis. Nous avons
porte plus particulierement notre attention sur les nucleoles de la vesicule germinative. La presence de DNA dans les nucleoles de cellules differenciees est
actuellement un fait demontre (voir par exemple Birnstiel & Hyde, 1963;
Maggio, Siekevitz & Palade, 1963; Geuskens & Bernhard, 1966). Mais l'existence
de DNA dans les nucleoles des vesicules germinatives d'Amphibiens revet une
importance singuliere: (1) la vesicule germinative contiendrait environ 300 fois
plus de DNA qu'un noyau somatique (Haggis, 1966); (2) chaque vesicule germinative contient plus d'un millier de nucleoles; (3) ces nucleoles sont separes
1
Adresse des auteurs: Laboratoire de Morphologie animale, Universite Libre de Bruxelles,
(Rhode St-Genese), Bruxelles, Belgium.
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P. VAN GANSEN & A. SCHRAM
des chromosomes dans l'oocyte acheve (MacGregor, 1965); (4) ils disparaissent
dans le cytoplasme oocytaire au moment de la maturation et il n'est done pas
exclu qu'ils soient a l'origine du DNA qui apparait dans le cortex a la fin de ce
phenomene. EfFectivement, des granules colores par le Feulgen ont ete observes
dans des nucleoles d'oocytes (Brachet, 1940, 1965a; Painter & Taylor, 1942;
Guyenot & Danon, 1953). Par contre, Brown & Ris (1959) employant la
coloration de Feulgen, n'ont pu mettre de DNA en evidence dans les nucleoles
d'oocytes de Triton. Plus recemment, Miller a observe la presence d'un filament
contenant du DNA dans des nucleoles isoles et partiellement desagreges (1964,
1966) et Ebstein a montre que les nucleoles isoles de vesicules germinatives de
Triton fixent de l'actinomycine D tritiee (1967).
Les nucleoles isoles par Miller ne sont cependant pas les seuls organites de
type nucleolaire presents dans la vesicule germinative de Batraciens. A cote des
grands nucleoles classiques, il existe un tres grand nombre de petits corpuscules
tres basophiles, souvent nommes 'micronucleoles'. Nous avons done entrepris
la description des differents corps de type nucleolaire observes dans le noyau de
l'oocyte mur, non mature, de Xenopus laevis et nous y avons recherche la
presence eventuelle de DNA a l'aide de techniques de cytochimie ultrastructurale. Par ailleurs, nous avons egalement porte notre attention sur le cytoplasme perinucleaire. Celui-ci est, en effet, tres particulier et, comme nous le
montrerons dans notre travail ulterieur, il participe eflfectivement au phenomene
de la maturation. Rappelons que du DNA cytoplasmique a ete mis en evidence
dans ce cytoplasme perinucleaire chez le Triton (Brachet & Quertier, 1963).
MATERIEL ET METHODES
Materiel
(1) Selon Brown & Littna (1964), les oocytes murs de Xenopus laevis possedent
une bande blanche equatoriale. De tels oocytes sont preleves par dissection dans
des femelles assommees.
(2) Du pancreas de souris a ete utilise comme tissu de reference pour les
techniques de cytochimie ultrastructurale.
Fixation
(1) Des oocytes sont fixes pendant 24 h a 20 °C, par de l'aldehyde glutarique
en solution a 3 % dans un tampon au phosphate a pH 7,4 (= lot 1).
(2) Des oocytes et des fragments de pancreas sont fixes pendant 15 min a
0 °C, par de l'aldehyde glutarique en solution a 3 % dans un tampon au phosphate a pH 7,4 (= lot 2).
(3) D'autres oocytes sont fixes pendant 15 min a 0 °C, par de la formaldehyde
a 3 % dans le meme tampon (= lot 3). Apres les trois types de fixation, les
oocytes sont transferee dans le tampon au phosphate et un petit morceau de
Ultrastructure de Voocyte mur
377
Phemisphere animal contenant la vesicule germinative est disseque. Les fragments du lot 1 sont refixes au tetroxyde d'osmium 1 % dans le tampon au
phosphate a pH 7,4, puis laves pendant une nuit dans ce tampon.
Enrobage
(1) Araldite: les fragments du lot 1 sont deshydrates a Palcool ethylique,
puis enrobes a PAraldite suivant Glauert & Glauert (1958). (2) Glycolmethacrylate (= GMA): les fragments des lots 2 et 3 sont enrobes au GMA suivant
la technique de Leduc & Bernhard (1967).
Coupe
Les coupes sont pratiquees a Paide d'un ultratome LKB type II. Les vesicules
germinatives sont reperees dans les blocs par examen en contraste de phase de
coupes successives de 2 /*.
Digestions enzymatiques
Les digestions se pratiquent sur coupes ultrafines flottantes de blocs de GMA.
La pronase (Calbiochem, B grade, 45.000 PUKg), la ribonuclease (Sigma,
Type 1 -A, 5 x cristallisee) et la desoxyribonuclease (Worthington Biochemical
Corp. D7AB) sont employees dans des conditions inspirees de celles decrites
par Monneron (1966).
Des coupes temoins sont mises a flotter sur les solvants des enzymes: eau
distillee pour la pronase et la ribonuclease, chlorure de magnesium 0,03 M pour
la desoxyribonuclease. Cette operation s'effectue a une temperature (37 °C) et
pendant des durees equivalentes a celles employees pour les digestions. En cas de
digestions doubles ou triples, quatre bains d'eau distillee successifs separent
les differents bains d'enzymes.
Les essais de digestions effectues sont resumes dans la liste suivante ou
RNase = ribonuclease, DNase = desoxyribonuclease, h = heures:
1. RNase
0,1% — l h
2. RNase
0,5 % — 2 h
3. Pronase 0,01% — £ h
4. Pronase 0,01 % — 1 h
5. DNase
0,1% — 3 h
6. Pronase 0,01 % — % h + RNase
0,1 %— 1 h
7. Pronase 0,01 % — \ h + DNase
0,1 % — 3 h
8. DNase
0,1% — 3 h + Pronase 0,01% — l h
9. DNase
0,1 % — 3 h + RNase
0,01 % — 1 h
10. DNase
0 , 1 % — 3 h + Pronase 0,01% — ±h + RNase
0,1%—lh
Les temoins sont des coupes qui suivent ou precedent immediatement les
coupes soumises aux enzymes. Toutes les coupes ont approximativement la
meme epaisseur (coupes dorees).
378
P. VAN GANSEN & A. SCHRAM
Colorations
(1) Des coupes de 2/i pratiquees dans les blocs d'Araldite sont colorees
pendant 24 h a 20 °C par le melange de Unna pour l'observation au microscope
(souvent en contraste de phase).
(2) Les coupes fines pratiquees dans les blocs d'Araldite sont contrastees sur
grille par l'acetate d'uranyle en solution a 0,5 % dans de l'alcool ethylique a
50 %, pendant 30 min a 60 °C; puis par le citrate de plomb suivant Reynolds
(1963) pendant 20 min.
3. Des coupes fines pratiquees dans les blocs d'Araldite sont mises a Hotter
sur de l'acide periodique a 1 % pendant 40 min, puis contrastees sur grille au
citrate de plomb suivant la technique de Perry (1967) pour la mise en evidence
du glycogene.
4. Les coupes fines pratiquees dans les blocs de GMA sont contrastees sur
grille par l'acetate d'uranyle en solution a 2 % dans du tampon au veronalacetate a pH 5, pendant 30 min a 20 °C, puis par le citrate de plomb suivant
Reynolds (1963) pendant 10 s.
Les observations sont faites a l'aide d'un microscope AEI type EM6B. Cet
appareil est nanti d'une chambre a decontamination.
OBSERVATIONS
1. Observations au microscope a lumiere
La vesicule germinative est inseree dans un cytoplasme tres pyroninophile,
depourvu de plaquettes vitellines. Ce cytoplasme s'insinue dans les indentations
profondes de la membrane nucleaire tres circonvoluee. On y observe quelques
spherules denses d'un diametre de l'ordre de 2 /i. Dans le sue nucleaire, on observe trois types de nucleoles: les grands nucleoles classiques d'un diametre de
l'ordre de 10 /t; des micronucleoles d'un diametre de 2/t, sensiblement aussi nombreux que les grands nucleoles; des corps nucleolaires formes d'une masse centrale portant 1 a 4 protuberances. Nous nommerons ces derniers organites
'nucleoles a protuberances'. On observe generalement 1 a 2 de ces nucleoles
a protuberances par coupe de 2 /i d'epaisseur. Remarquons que, dans ces pre-
PLANCHE 1
Fig. A. Bord lobule d'une vesicule germinative (N) d'un oocyte mur non mature de Xenopus
laevis. La membrane nucleaire est partiellement coupee de facon tangentielle, les annelets de
la membrane sont alors particulierement bien visibles (fleches). Le cytoplasme perinucleaire,
finement granuleux, contient de nombreuses mitochondries (M) et quelques petites plaquettes
vitellines (V). Aldehyde glutarique-osmium; Araldite; acetate d'uranyle-citrate de plomb.
x 5000.
Fig. B. Petite plaquette vitelline du cytoplasme perinucleaire montrant la fragmentation du
reseau proteinique. Elle est entouree de granules ribosomaux (R). Aldehyde glutariqueosmium; Araldite; acetate d'uranyle-citrate de plomb. x 50000.
/. Embryol. exp. Morph., Vol. 20, Part 3
P. VAN GANSEN & A. SCHRAM
PLANCHE 1
facing p. 378
/. Embryol. exp. Morph., Vol. 20, Part 3
P. VAN GANSEN & A. SCHRAM
PLANCHE 2
Ultrastructure de Voocyte mur
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parations, les organites de 2/i contenus dans le cytoplasme perinucleaire ont
un aspect tres semblable a celui des micronucleoles de la vesicule germinative.
2. Ultrastructure du cytoplasme perinucleaire
Le cytoplasme perinucleaire contient une foule de mitochondries et de petits
granules de type ribosomal (planche 1, fig. A; planche 5, fig. A). Les mitochondries sont assez polymorphes; la plupart presentent des cretes transversales,
mais certaines ont des cretes disposees parallelement au grand axe; quelquesunes, a section plus ou moins rectangulaire, sont environ deux fois plus larges
que les mitochondries normales.
La plupart des petits granules nous paraissent etre des ribosomes. En effet,
apres l'application de la technique de Perry (1967), seuls de rares petits groupes
de granules presentent Faugmentation de contraste et la granularite typique du
glycogene (planche 2, fig. A). Au contraire, le cytoplasme plus peripherique,
non perinucleaire, contient une population melangee de ribosomes et de glycogene /? (planche 2, fig. B). Les petits granules perinucleaires sont d'ailleurs bien
preserves apres fixation breve a l'aldehyde glutarique et enrobage au GMA
(planche 2,fig.C). Apres 1 h d'action de la ribonuclease a 0,1 %, leur morphologie
est alteree, mais des substances colorables par 1'acetate d'uranyle-citrate de plomb
y sont encore presentes (planche 2, fig. D). Nous avons d'ailleurs obtenu des resultats analogues avec le pancreas de souris. La pronase a 0,01 % agissant pendant
1 h a un effet assez similaire. Par contre, apres une digestion double pronase-
PLANCHE2
Fig. A. Cytoplasme peripherique de l'oocyte mur non mature. Tous les granules presents (R)
sont peu contrasted, de meme que les mitochondries (M). Aldehyde glutarique-osmium;
Araldite; coloration M. Perry (acide periodique 1 %, 40 min—citrate de plomb). x 80000.
Fig. B. Cytoplasme peripherique, meme coupe que figure A. Les ribosomes (R) sont melanges
a des granules (G) presentant le contraste et la granularite typique du glycogene dans ces
conditions techniques. Le glycogene est done present sous forme de granules /? isoles ou
groupes (fleches). Une plaquette vitelline (V) est presente dans le champ. Conditions techniques et grandissement semblables a ceux de la figure A.
Fig. C. Cytoplasme perinucleaire contenant des mitochondries (M) et des amas de granules
bien contrastes (R). Aldehyde glutarique; glycolmethacrylate; coupe flottee pendant 1 h sur
de Teau a 37 CC; acetate d'uranyle-citrate de plomb. x 30000.
Fig. D. Cytoplasme perinucleaire contenant des mitochondries et des amas de materiel
fibrillo-granulaire (fleches). Aldehyde glutarique; glycolmethacrylate; coupe flottee pendant
1 h sur de la ribonuclease 0,1 % a 37 °C; acetate d'uranyle-citrate de plomb. x 30000.
Fig. E. Cytoplasme perinucleaire ne contenant plus guere que des mitochondries (M). Aldehyde glutarique; glycolmethacrylate; coupe flottee pendant 30 min. sur de la pronase 0,01 %
et pendant 2h sur de la ribonuclease 0,5%, a 37 °C; acetate d'uranyle-citrate de plomb.
x 30000.
Fig. F. Cytoplasme perinucleaire contenant des mitochondries tres alterees et des amas
fibrillo-granulaires tres contrastes (fleches). Aldehyde glutarique; glycolmethacrylate; coupe
flottee a 37 °C pendant 1 h sur de la pronase a 0,01 % et pendant 3h sur de la desoxyribonuclease a 0,1 %; acetate d'uranyle-citrate de plomb. x 30000.
380
P. VAN GANSEN & A. SCHRAM
ribonuclease, on ne distingue plus de granules entre les mitochondries (planche
2, fig. E). Enfin, la desoxyribonuclease augmente Pafrinite des petits granules
pour les contrastants. Cet effet est particulierement marque apres une action
prealable de la pronase (planche 2, fig. F).
Les petits organites denses, d'un diametre de Fordre de 2 /i, qui sont epars
dans le cytoplasme perinucleaire (planche 1, fig. A) presentent la structure
en reseau typique des plaquettes vitellines des Batraciens (planche 1, fig. B).
Mais, a la difference des grandes plaquettes, le materiel reticule est presque
toujours subdivise en plusieurs regions separees les unes des autres par du
materiel granulaire en continuite avec la zone corticale. L'orientation du
reseau varie d'une region a l'autre au sein d'une meme plaquette.
3. infrastructure et cytochimie ultrastructurale des nucleoles
Grands nucleoles. Apres fixation double (glutaraldehyde-osmium) et enrobage
a l'Araldite, les grands nucleoles presentent la structure en deux regions concentriques deja classique chez les oocytes murs des Batraciens (planche 3,fig.A).
Les fibrilles de la zone centrale ont une largeur de 1 a 2 m/i. Les granules de la
region corticale, aux contours mal definis, ont un diametre de l'ordre de 20 m//.
Leur structure est heterogene et dans certains d'entre eux, on distingue un alignement de petites fibrilles paralleles de 1 a 2 mpt de large (planche 3, fig. C).
PLANCHE 3
Fig. A. Grand nucleole d'un oocyte mur. On distingue les deux regions concentriques granulaire externe (G) et fibrillaire interne (F). Aldehyde glutarique-osmium; Araldite; acetate
d'uranyle-citrate de plomb. x 10000.
Fig. B. Grand nucleole d'un oocyte mur. L'organite est tres compact; on y distingue cependant une region externe plus granulaire (G) et une region interne plus homogene (F). Aldehyde glutarique; glycolmethacrylate; acetate d'uranyle-citrate de plomb. x 10000.
Fig. C. Bord d'un grand nucleole montrant la presence de petitesfibrillesparalleles entr'elles
au sein des 'granules' de la region nucleolaire externe (fleches). Aldehyde glutarique-osmium;
Araldite; acetate d'uranyle-citrate de plomb. x 100000.
PLANCHE 4
Fig. A a F. Grands nucleoles d'oocytes murs. Glycomethacrylate acetate d'uranyle-citrate
de plomb; x 10.000.
Fig. A. Coupeflotteependant 1 h sur de la ribonuclease 0,1 %. Fixation: aldehyde glutarique.
Fig. B. Coupe flottee sur de la pronase 0,01 % pendant 1 h. Fixation: aldehyde glutarique.
Fig. C. Coupe flotte sur de la desoxyribonuclease 0,1 % pendant 3 h. Fixation: formaldehyde.
Fig. D. Coupe flottee successivement sur de la pronase 0,01 % pendant 30 min. et sur de
la desoxyribonuclease 0,1 % pendant 3 h. Fixation: formaldehyde.
Fig. E. Coupe flottee successivement sur de la desoxyribonuclease 0,1 % pendant 3 h et de la
pronase 0,01 % pendant 30 min. Fixation: formaldehyde.
Fig. F. Coupe flottee successivement sur de la desoxyribonuclease 0,1 % pendant 3 h, la
pronase 0,01 % pendant 30 min. et la ribonuclease 0,1 % pendant 1 h. (Le fond gris homogene est le glycolmethacrylate.) Fixation: formaldehyde.
/. Embryo!, exp. Morph., Vol. 20, Part 3
P. VAN GANSEN & A. SCHRAM
PLANCHE 3
facing p. 380
J. Embryol. exp. Morph., Vol. 20, Part 3
P. VAN GANSEN & A. SCHRAM
PLANCHE 4
/. Embryol. exp. Morph., Vol. 20, Part 3
P. VAN GANSEN & A. SCHRAM
PLANCHE 5
J. Embryol. exp. Morph., Vol. 20, Part 3
P. VAN GANSEN & A. SCHRAM
PLANCHE 6
infrastructure de Voocyte mur
381
Apres fixation breve aux aldehydes et enrobage au GMA, les grands nucleoles
apparaissent comme des corps tres denses, tres contrasted par l'acetate d'uranylecitrate de plomb. On y reconnait les deux regions habituelles centrale et corticale
(planche 3, fig. B) mais les fibrilles intragranulaires ne sont pas discernables.
La RNase a 0,1 % agissant pendant 1 h, diminue l'affinite pour les contrastants
de tout le nucleole; mais son aspect general n'est pas modifie (planche 4, fig. A).
Dans les memes conditions techniques, les nucleoles des fragments de pancreas
presentent l'aspect decrit par Monneron (1966).
Cependant, la RNase a 0,5 % agissant pendant 2 h, diminue de facon sensible
Pepaisseur du cortex granulaire. Les temoins qui ont flotte pendant 2 h sur de
l'eau ne paraissent pas modifies.
La pronase diminue fortement Faffinite de l'organite pour les contrastants
mais elle met en evidence un constituant tres contraste, generalement situe dans
la region centrale du nucleole, mais pouvant deborder dans la zone corticale
(planche 4, fig. B).
La double digestion pronase-RNase donne des images voisines de celles
obtenues par action de la pronase seule.
La DNase, qui n'a pas d'action apres nos fixations a l'aldehyde glutarique,
eclaircit la region centrale des nucleoles fixes a la formaldehyde au point qu'elle
PLANCHE 5
Fig. A. Bord lobule d'une vesicule germinative (A0 contenant un micronucleole (mN). Dans
le cytoplasme perinucleaire on reconnait des mitochondries (M) et des amas de ribosomes (R).
Aldehyde glutarique-osmium; Araldite; acetate d'uranyle-citrate de plomb. x 15000.
Fig. B. Corps nucleolaire a quatre protuberances (P). Aldehyde glutarique-osmium;
Araldite; acetate d'uranyle-citrate de plomb. x 15000.
PLANCHE 6
Fig. A. Micronucleole. Aldehyde glutarique; glycolmethacrylate; coupe flottee sur eau
a 37 °C pendant 1 h; Acetate d'uranyle-citrate de plomb. x 20000.
Fig. B. Micronucleole. Aldehyde glutarique; glycolmethacrylate; coupe flottee a 37 °C successivement sur de la pronase 0,01 % pendant 30 min. et de la ribonuclease 0,1 % pendant
1 h; acetate d'uranyle-citrate de plomb. x 20000.
Fig. C. Micronucleole. Aldehyde glutarique; glycolmethacrylate; coupe flottee a 37 °C
successivement sur de la pronase 0,01 % pendant 30 min. et de la ribonuclease 0,5 % pendant
2 h; acetate d'uranyle-plomb. x 20000.
Fig. D. Constitution fibrillo-granulaire d'un micronucleole. Aldehyde glutarique-osmium;
Araldite; acetate d'uranyle-citrate de plomb. x 70000.
Fig E. Protuberance nucleolaire (P) entierement constitute de materiel fibrillo-granulaire.
Conditions techniques et grandissement semblables a ceux de la figure D.
Fig. F. Corps nucleolaire avec une protuberance (P). Aldehyde glutarique-osmium; Araldite; acetate d'uranyle-plomb. x 20000.
Fig. G. Corps nucleolaire avec une protuberance (P). Formaldehyde; glycolmethacrylate;
coupe flottee successivement, a 37 °C, sur de la desoxyribonuclease 0,1 % pendant 3 h, de la
pronase 0,01 % pendant 30 min. et de la ribonuclease 0,1 % pendant 1 h; acetate d'uranylecitrate de plomb. x 20000.
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JEEM20
382
P. VAN GANSEN & A. SCHRAM
apparait trouee (planche 4, fig. C). La double digestion DNase-pronase fait
disparaitre les nucleoles presque completement (planche 4, fig. E). L'effet de la
double digestion pronase-DNase est moins drastique et la region granulaire est
mieux preservee (planche 4, fig. D). II en va de meme apres double digestion
DNase-RNase.
La triple digestion DNase-pronase-RNase fait disparaitre presque completement les nucleoles (planche 4, fig. F).
Les micronucleoles. Apres fixation double glutaraldehyde-osmium et enrobage a l'Araldite, les micronucleoles apparaissent entierement constitues d'un
materiel compact fibrillo-granulaire dense, tres contraste (planche 5, fig. A).
Apres fixation breve aux aldehydes et fixation au GMA, leur aspect est le meme,
mais les structures sont encore plus compactes (planche 6, fig. A).
La DNase n'a pas d'effet sensible.
La RNase 0,1 %, agissant pendant 1 h, n'a pas d'effet apparent; a 0,5 %,
agissant pendant 2 h, elle semble desagreger les structures de certains micronucleoles, sans qu'un effet net et general puisse etre note.
La pronase augpntnte encore Fafnnite des micronucleoles pour lescontrastants.
Lorsqu'elle est combinee avec la RNase 0,1 % agissant pendant 1 h (planche 6,
fig. B), elle ne modifie pas l'aspect des micronucleoles par rapport aux digestions
a la pronase seule (alors que les grands nucleoles presents sur les memes coupes
presentent les alterations que nous avons decrites). Lorsque la pronase est
combinee a la RNase 0,5 % agissant pendant 2 h, on observe une desagregation
des micronucleoles et leur afnnite pour les contrastants diminue fortement
(planche 6, fig. C).
Les nucleoles a protuberances. Apres fixation double et enrobage a l'Araldite,
ils apparaissent constitues, en majeure partie, d'une masse claire granulofibrillaire presentant par section, de 1 a 4 protuberances denses (planche 5,
fig. B, planche 6, fig. F).
Les granules et fibrilles de la region centrale sont associes en travees d'environ 40 m/i de largeur, separees les unes des autres par des substances de contraste encore moins eleve. La structure des protuberances est tres proche de
celle des micronucleoles (planche 6, fig. D et E). Apres fixation breve aux
aldehydes et enrobage au GMA, la partie centrale reagit aux digestions comme
les grands nucleoles, tandis que les protuberances reagissent comme les micronucleoles (planche 6, fig. G).
DISCUSSION
Cytoplasme perinucleaire
Cette region est caracterisee: (1) par la presence de tres nombreux ribosomes
apparemment non associes entre eux, probablement responsables de la forte
basophilie de cette region; (2) par la quasi-absence de glycogene, tres abondant
dans le cytoplasme plus peripherique sous la forme de glycogene ft; (3) par une
grande abondance de mitochondries; (4) par une distribution particuliere des
Ultrastructure de Voocyte mur
383
plaquettes vitellines; il n'y a pas de grandes plaquettes et les petites plaquettes
que nous observons presentent des reseaux discordants. Leur confusion avec
des micronucleoles extranucleaires, possible au microscope a lumiere, est
exclue par nos micrographies.
De nombreuses analyses ont montre que les plaquettes vitellines sont
constitutes d'un reseau proteinique et d'un cortex de polysaccharides (Ringle
& Gross, 1962; Ward, 1962; Karasaki, 1963 a, b; Wallace, 1963 a, b; Ohno,
Karasaki & Takata, 1964; Lanzavecchia, 1965). Mais la teneur en DNA des
plaquettes vitellines demeure un probleme tres controverse. Deux opinions
s'opposent actuellement. Pour Brachet et ses collaborateurs une part importante
du DNA cytoplasmique serait liee aux plaquettes vitellines (Baltus & Brachet,
1962; Brachet & Ficq, 1965; Brachet & Preumont, 1966; Hanocq-Quertier,
Baltus, Ficq & Brachet, 1968). Pour Dawid (1965, 1966), il n'y aurait pas
de DNA associe aux plaquettes: la majeure partie, sinon la totalite du DNA
cytoplasmique, serait mitochondriale. Remarquons que nous n'avons pas
observe d'action de la DNase sur les plaquettes vitellines, grandes ou petites,
mais ce resultat negatif ne peut evidemment trancher le debat.
Rappelons enfin, que Morgenthaler (1951) distingue deux classes de
plaquettes, grandes et petites, chez le Triton et que Panijel (1950) a isole, dans
trois especes de Batraciens, une population de 'petites plaquettes' qui presentent
des caracteres distinctifs des 'grandes'. En particulier, l'activite de la phosphoproteine phosphatase est beaucoup plus forte dans les petites. II n'est pas exclu
que les petites plaquettes que nous observons dans le cytoplasme perinucleaire
correspondent aux organites analyses par Panijel.
Les trois types de corps nucleolaires de Voocyte mur
11 semble bien que la vesicule germinative de Xenope contienne trois types
de nucleoles differents. Notre description des grands nucleoles correspond a
celles, classiques, de Brown & Ris (1959), Miller (1966) et MacGregor (1967).
Par contre, l'existence des micronucleoles est contestee par les travaux les plus
recents portant sur la vesicule germinative des Batraciens. Leur realite est niee
par Brown & Ris (1959), pour qui il n'existerait qu'un seul type de nucleole
dans les oocytes murs de Triton qu'ils ont examine au microscope electronique.
Cette position negative a ete reprise, de facon implicite, dans Particle de revue
de Wischnitzer (1967) et dans le travail de Miller (1966).
Enfin, a notre connaissance, les nucleoles a protuberances n'ont pas encore
ete decrits dans les vesicules germinatives d'oocytes de Batraciens ayant acheve
leur croissance. Cependent, Miller (1962) a publie la micrographie d'un tel
nucleole dans un jeune oocyte de Rana clamitans.
Les grands nucleoles
Nos observations nous paraissent confirmer l'existence de DNA dans les
nucleoles de l'oocyte acheve de Xenopus laevis. Ce DNA est generalement situe
25-2
384
P. VAN GANSEN & A. SCHRAM
dans la region centrale du nucleole, ce qui est en accord avec les observations
de Miller sur les nucleoles isoles et desagreges.
Les digestions a la RNase confirment la presence de RNA tant dans les
fibrilles que dans les granules peripheriques du nucleole. Les deux regions du
nucleole ne perdent cependant leur morphologie distinctive que si elles sont
attaquees par la pronase. D'autre part, la double digestion la plus efficace est la
combinaison DNase-pronase, ce qui parait indiquer que se sont le DNA et des
proteines qui assurent Parchitecture moleculaire des nucleoles, tout au moins
des nucleoles fixes.
La subdivision en deux zones, granulaire et fibrillaire, a ete decrite dans les
nucleoles de nombreuses cellules: par exemple, dans les glandes salivaires de
Chironomus (Marinozzi & Bernhard, 1963), les racines de Vidafaba (Lafontaine
& Chouinard, 1963), le foie du Cobaye (Maggio, Siekevitz & Palade, 1963) et
d'autres mammiferes (Marinozzi, 1964), le parenchyme des planaires (Krugelis
MacRae, 1964), les petits pois en germination (Hyde, Sankar & Birnstiel, 1965),
l'algue Acetabularia mediterranea (Van Gansen & Boloukhere-Presburg, 1965),
les cellules de HeLa (Penman, 1966).
A notre connaissance, seuls Marinozzi (1964) et Hyde et ah (1965) ont decrit,
comme nous, une structure fibrillaire au sein des granules nucleolaires. Les
mensurations des granules et des fibrilles nucleolaires faites par differents
auteurs sont resumees dans le tableau 1.
Tableau 1
Auteurs
Lafontaine & Chouinard,
1963
Maggio, Siekievitz &
Palade, 1963
Marinozzi, 1964
Krugelis Mac Rae, 1964
Hyde, Sankar & Birnstiel,
1965
Van Gansen &
Boloukhere-Presburg, 1965
Penman, 1966
Van Gansen & Schram
Fibrilles:
region centrale
Granules:
region
corticale
(m/i)
Fibrilles
intragranulaires
Non mesurees
15
Non decrites
Non mesurees
10-15
Non decrites
4-6 m/i
Non mesurees
1,5-2 m/t
Associees en fibres
de 6-10 m/Jb
Non mesurees
15-20
15
12-16
4-6 m/t
Non decrites
1,5-2 m/t
20
Non decrites
Non mesurees
10-20
20
Non decrites
1-2 m/A
1-2 m/t
Si on tient compte du fait qu'il s'agit d'observations portant sur des materiaux
differents, prepares suivant des techniques dissemblables, on peut estimer que ces
mensurations sont relativement homogenes, allant de 1 a 6 m/* pour le diametre
Ultrastructure de Voocyte mur
385
des fibrilles centrales et de 10 a 20 m/i pour celui des granules corticaux. Soulignons que, dans les trois cas ou des fibrilles ont ete observees au sein des
granules, ces fibrilles ont le meme diametre que celles observees dans la zone
fibrillaire des nucleoles.
D'autre part, par cytochimie ultrastructurale, Marinozzi & Bernhard (1963)
et Marinozzi (1964) ont pu montrer que les nucleoles de differents types de
cellules animales contiennent deux types de ribonucleoproteines morphologiquement distinctes, l'une granulaire, l'autre fibrillaire. L'idee d'une continuite dynamique entre les RNA fibrillaire et granulaire des nucleoles a ete
defendue par Grandboulan & Grandboulan (1965) et par Geuskens & Bernhard
(1966). A l'aide de techniques autoradiographiques, ils ont montre une incorporation initiate d'uridine tritiee dans le RNA fibrillaire et un marquage ulterieur du
RNA granulaire. MacGregor (1967) vient de publier des observations analogues, faites a l'aide du microscope a lumiere, sur les nucleoles d'oocytes de
Triton. Rappelons, par ailleurs, qu'il est demontre que le nucleole est un centre
de synthese de RNA ribosomal, plus precisement de RNA macromoleculaires
precurseurs des RNA ribosomaux (voir par exemple Birnstiel & Hyde, 1963;
Penman, 1966; Warner, 1966). Dans le cas particulier de Xenopus laevis, l'etude
des mutants anucleoles a permis de demontrer l'origine nucleolaire des ribosomes cytoplasmiques synthetises au cours de l'embryogenese (Wallace, 1960;
Brown & Gurdon, 1964; Esper & Barr, 1964; Jones, 1965; Hay & Gurdon,
1967).
Relations hypothetiqu.es entre les differents corps nucleolaires
Nous ne pouvons evidemment pas affirmer que les fibrilles de l'ordre de
1 a 2 mjn d'epaisseur que nous observons dans les grands nucleoles sont l'image
d'un seul et meme constituant, un RNA fibrillaire precurseur des RNA ribosomaux, par exemple. En nous appuyant sur nos connaissances actuelles sur les
nucleoles de la vesicule germinative de Xenopus laevis, il nous semble pourtant
permis d'emettre les hypotheses suivantes: (1) le RNA fibrillaire se synthetiserait au contact de DNA situe dans la region centrale des grands nucleoles
(hypothese defendue par MacGregor, 1965, 1967; Miller, 1966; Ebstein, 1967),
(2) les granules de la zone corticale resulteraient de l'embobinement de ces
fibrilles associees a des proteines (travaux de l'ecole de W. Bernhard), (3) les
nucleoles a protuberances montreraient la segregation des substances nucleolaires en ' bourgeons' prets a migrer dans le nucleoplasme ou ils constitueraient
les 'micronucleoles'. L'identite des reactions cytochimiques des protuberances
et des micronucleoles appuie cette hypothese. D'autre part, une etude actuellement en cours de notre collaborateur C. Thomas sur les relations nucleocytoplasmiques au cours de l'oogenese de Xenopus laevis montre que c'est dans
la phase ultime de la croissance de l'oocyte que les micronucleoles apparaissent
en abondance. Leur apparition ne coincide pas avec revolution de la synthese
du RNA ribosomal qui a fortement diminue a ce moment de l'oogenese
(Davidson, Allfrey & Mirsky, 1964; Thomas, 1967).
386
P. VAN GANSEN & A. SCHRAM
Le role des micronucleoles, si abondants dans l'oocyte mur, n'est done pas
actuellement precise. Leur constitution est d'ailleurs mal connue. La cytochimie ultrastructurale nous apporte, en effet, trop peu d'information sur la
nature de leurs constituants; ils sont alteres par la pronase et la ribonuclease,
mais se montrent particulierement resistants a l'action de ces enzymes; la
desoxyribonuclease ne parait pas agir sur eux dans nos conditions techniques.
L'analyse de micronucleoles isoles aiderait a resoudre ces questions, dont
l'importance n'est peut-etre pas negligeable pour la comprehension de la
maturation.
RESUME
1. La localisation des DNA, RNA, proteines et glycogene du cytoplasme
perinucleaire et des nucleoles de l'oocyte mur de Xenopus laevis est etudie par
des techniques de cytochimie ultrastructurale: coloration specifique du glycogene, digestions enzymatiques de coupes flottantes apres enrobage au glycolmethacrylate.
2. Le cytoplasme perinucleaire est caracterise: (a) par la presence de nombreuses mitochondries, (b) par la grande abondance de ribosomes, (c) par la
quasi-absence de glycogene /? tres abondant dans les autres regions du cytoplasme,
(d) par la presence de petites plaquettes a reseau fragmente et l'absence de
grandes plaquettes. Les plaquettes vitellines paraissent insensibles a la desoxyribonuclease.
3. Nous distinguons trois types nucleolaires: les grands nucleoles classiques,
des micronucleoles aussi nombreux que les premiers, des corps nucleolaires a
protuberances relativement peu frequents.
4. Les grands nucleoles presentent la structure en deux zones concentriques
classiques. Les fibrilles centrales ont de 1 a 2 m/i de largeur. Les granules corticaux ont un diametre de l'ordre de 20rn.fiet contiennent des fibrilles de 1 a 2 mju
de largeur. Du RNA et des proteines sont presents dans les deux regions et du
DNA dans la region centrale.
5. Les micronucleoles ont une constitution homogene granulo-fibrillaire. Ils
contiennent du RNA et des proteines; ils sont insensibles a la desoxyribonuclease.
6. Les nucleoles a protuberances sont constitues d'une region centrale et de
1 a 4 protuberances dont l'ultrastructure et la sensibilite aux digestions enzymatiques sont analogues a celles des micronucleoles.
7. Les relations possibles entre les differentes structures nucleolaires sont
discutees.
SUMMARY
The ultrastmcture and ultrastructural cytochemistry of the germinal vesicle
and of the perinuclear cytoplasm of the ripe oocyte of Xenopus laevis
1. The localization of DNA, RNA, proteins and glycogen in the perinuclear
cytoplasm and the nucleoli of ripe Xenopus laevis oocytes has been studied using
Ultrastructure de Voocyte mur
387
specific staining methods for glycogen and enzymic digestion of floating sections
after embedding in glycol methacrylate.
2. The perinuclear cytoplasm contains numerous mitochondria, a great
number of ribosomes, very little /?-glycogen (although this material is very
abundant in the other parts of the cytoplasm) small lattice-fragmented platelets
and no large vitelline platelets. In our experimental conditions, the platelets are
not digested by deoxyribonuclease.
3. Three different types of nucleoli have been observed: the classical large
nucleoli, an equal number of micronucleoli, and a few rare nucleolar bodies
with protuberances.
4. The large nucleoli present the classical structure of fibrillar core surrounded by a granular cortex. The central fibrils are 1-2 m/* in diameter. The
cortical granules have a diameter of about 20 m/* and contain fibrils 1-2 m/i
in diameter. RNA and proteins are present in both regions and DNA in the
central core.
5. Micronucleoli present a homogeneous granulo-fibrillar structure. They
contain RNA and proteins and are not digested by deoxyribonuclease.
6. The third type of nucleolar body presents a central core and one to four
protuberances. The ultrastructure of the latter and their sensitivity to enzymic
digestions are very similar to those of the micronucleoli.
7. Possible relationships between the different nucleolar structures are
discussed.
Ce travail a ete execute dans le cadre du contrat Euratom-U.L.B. 007-61-10 ABIB.
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