/ . Embryol. exp. Morph. Vol. 20, 2, pp. 215-36, September 1968
With 2 plates
Printed in Great Britain
215
Le role de Fepiblaste dans la chondrogenese du
bourgeon de membre chez la Souris
Par J. MILAIRE & J. MULNARD 1
Faculte de Medecine et de Pharmacie, Laboratoire d'Anatomie et
d'Embryologie humaines, Universite Libre de Bruxelles
Les facteurs qui controlent la morphogenese et la croissance des bourgeons
de membres ont suscite un interet considerable au cours de ces vingt dernieres
annees. Tous les travaux qui y ont ete consacres se basent sur des techniques
d'experimentation directe appliquee in vivo aux bourgeons de membres du
poulet, ou, dans une moindre mesure, a ceux du xenope. Leurs resultats ont
fait l'objet de plusieurs articles de synthese qui nous autorisent a n'en rappeler
ici que les points essentiels (Zwilling, 1961; Tschumi, 1962; Amprino, 1965).
Des qu'il prend naissance aux depens de la parietopleure, le mesoblaste presomptif des membres acquiert la faculte d'induire, dans son feuillet de revetement, la formation d'un epaississement marginal connu sous le nom de cape
epiblastique apicale. Aussitot constitute, cette structure stimule a son tour la
croissance du mesoblaste sous-jacent et assure ainsi la mise en place des
materiaux destines a former les segments de plus en plus distaux du membre.
Dans ce jeu d'influences reciproques, c'est le mesoblaste qui detient le role
principal et specifique. Non seulement il induit la formation d'une cape apicale,
mais durant toute la morphogenese il continue d'emettre, vers la peripherie du
bourgeon, un facteur diffusible assurant le maintien de Fintegrite structurale et
fonctionnelle de la crete epiblastique. Les informations dont nous disposons
concernant le role de l'epiblaste sont beaucoup moins precises. II parait bien
s'agir d'une induction non specifique stimulant la proliferation du mesoblaste
sous-jacent, mais on ignore tout des modalites de cette influence et de ses repercussions eventuelles sur les capacites d'histodifferenciation du mesoblaste.
Chez les Mammiferes, l'etude de la genese des membres a ete entreprise par
l'un de nous sous Tangle descriptif et histochimique (Milaire, 1963, 1965 a, b,
1967). Une analyse des modifications morphologiques, histochimiques et histoenzymologiques qui caracterisent la periode de morphogenese des bourgeons de
membres du rat, de la souris et de la taupe a permis de deceler, pour chaque
espece, des signes evidents d'une interaction continue entre le mesoblaste et la
1
Adresse des auteurs: Laboratoire d'Anatomie et d'Embryologie humaines, 97 rue aux
Laines, Bruxelles 1, Belgique.
216
J. MILAIRE & J. MULNARD
zone marginale de son revetement epiblastique. Ces observations permettent de
penser que plusieurs des conceptions fondamentales nees des travaux chez le
poulet ou le xenope s'appliquent aussi aux Mammiferes. II est cependant souhaitable que cette extrapolation soit confirmee par une analyse experimentale.
Chez 1'embryon de Mammifere, dont les stades jeunes sont encore difiicilement
accessibles a l'experimentation in situ, les seules methodes actuellement applicables sont celles de la culture in vitro. Parmi les rares auteurs qui ont tire
parti de ces methodes, la plupart se sont davantage attaches a definir les conditions d'une croissance organotypique des pieces cartilagineuses, plutot qu'a
explorer le determinisme de la differentiation chondrogene du mesoblaste. Chez
le poulet, ce sont les observations deja anciennes de Strangeways & Fell (1926),
puis celles de Fell (1928), qui ont fourni les premieres indications sur le comportement du bourgeon de membre explante entier a deux stades differents de
son developpement. Nous aurons l'occasion de souligner a ce propos l'existence
d'une similitude frappante entre revolution in vitro des jeunes ebauches du
poulet et de la souris. Plus recemment, Zwilling (1964) a signale que le mesoblaste de tres jeunes bourgeons de membres de poulet, explante in vitro sans
son epiblaste, est capable de former un ou plusieurs nodules cartilagineux de
petite taille; en revanche, les memes explants cultives en presence de leur epiblaste donnent naissance a des pieces cartilagineuses articulees dont la forme
rappelle celle des articles squelettiques normaux. A notre connaissance, cette
information est la seule qui suggere une participation active du feuillet de revetement dans l'histodifferenciation du mesoblaste du bourgeon.
D'autres experiences, realisees par Wilde (1950) sur les bourgeons de membres
d'Ambystoma maculatum et par Ghisellini (1964) sur ceux de la souris ont
demontre que la formation d'articles cartilagineux dans les ebauches cultivees
in vitro est d'autant plus complete que l'age des bourgeons explantes est plus
avance. Dans le cas de FAmphibien, Wilde insiste sur le fait que l'epiblaste des
explants doit envelopper entierement le mesoblaste pour que ce dernier puisse
poursuivre, in vitro, une organogenese squelettique normale. On le voit, le role
assigne a l'epiblaste est ici different d'une influence chondrogene: c'est par la
barriere mecanique qu'il represente, ainsi que par ses modalites d'accroissement,
qu'il contribue a maintenir au sein du mesoblaste une distribution cellulaire
ordonnee sans laquelle 1'organogenese deviendrait anarchique.
Cependant, l'obtention d'un developpement organotypique vraiment utilisable
a des fins experimentales pose encore de trop nombreux problemes techniques
et nous nous sommes efforces de repondre a une question plus accessible par les
methodes de culture actuelles: celle du determinisme de la differenciation cartilagineuse du mesoblaste de jeunes bourgeons de membres de la souris. II s'agit
de voir si le mesoblaste indifferencie des jeunes bourgeons est capable de former
spontanement du cartilage, ou bien, comme c'est le cas dans la plupart des
autres territoires squelettogenes du mesoblaste, si cette propriete lui est conferee par une influence inductrice exogene.
Uepiblaste dans la chondrogenese
217
MATERIEL ET TECHNIQUES
Les animaux (Swiss-albinos exclusivement) sont assembles le soir a raison de
deux femelles pour un male et les bouchons de copulation recherches le lendemain matin. Le jour de la decouverte du bouchon est compte comme premier
jour du developpement. Aux lOe et l i e jours, selon les cas, la souris gestante est
tuee par elongation cervicale et l'uterus preleve aseptiquement pour etre lave,
a deux reprises, dans une solution de Hanks sterile. Les embryons sont extraits,
laves au Hanks pour eliminer le plus de sang possible et places dans des recipients
individuels (boites de Petri de 5 cm a concavite centrale, de type Grobstein)
contenant 1 ml de milieu de dissection (serum de cheval, 1 vol.; Hanks, 1 vol.)
et que Ton stocke dans une armoire continuellement alimentee en air contenant
5 % de CO2 et sature d'eau. Un embryon-temoin estfixeau Bouin. Les bourgeons
de membres, anterieurs ou posterieurs selon les cas, sont isoles par une incision
nette faite a leur base au moyen de deux couteaux a cataracte no 2. On prend
bien soin de conserver ensemble les bourgeons gauche et droit d'un meme
embryon, l'un devant, en general, servir de temoin a l'autre. On veille aussi a ne
laisser aucun materiel troncal adherer aux bourgeons.
Separation de Vepiblaste et du mesoblaste
La dissociation des bourgeons en leurs deux constituants epiblastique et
mesoblastique est realisee au moyen de la trypsine ou du versene.
La trypsine est utilisee soit seule, soit de preference en association avec la
pancreatine (Bacto-trypsine DIFCO 3 % , ou 2 % + Pancreatine DIFCO 1 %
dans du Hanks sans calcium ni magnesium). Le versene (Diamino-ethanetetracetate disodique BDH) est employe en solution a 0,1 % dans du Hanks sans
Ca 2+ ni Mg 2+ . La sterilisation de ces solutions est obtenue par filtration sur
amiante (Seitz), apres prefiltrations, pour la trypsine, sur Millipore pour le
versene.
Le traitement au versene dure de 30 a 45 min a 37 °C. La trypsinisation se fait
a temperature de la chambre (25 °C) et sa duree varie assez considerablement
selon l'echantillon enzymatique: les preparations tres actives assurent une dissociation facile apres 2 a 3 min, tandis que d'autres necessitent jusqu'a 15 min
pour un resultat souvent moins bon.
Certains bourgeons sont explantes, apres le traitement, sans subir la dissociation. Pour la plupart cependant, l'epiblaste et le mesoblaste sont separes,
apres elimination de l'agent dissociant par lavage au Hanks et retour au milieu
de dissection. La separation s'obtient par aspiration repetee dans une pipette
rodee dont le diametre interieur est legerement plus petit que la largeur du
bourgeon et elle est, si c'est necessaire, terminee au couteau. Cette manoeuvre
est facile, en general, pour les bourgeons trypsinises; apres le versene, au contraire, la tendance des tissus a se dissocier en cellules isolees rend l'operation
218
J. MILAIRE & J. MULNARD
beaucoup plus malaisee et il faut, dans la plupart des cas, une delicate dissection
au couteau pour parvenir a une separation complete, l'epiblaste s'isolant generalement par lambeaux.
Techniques de culture
Les cultures simples de bourgeons entiers, traites ou non par la trypsine ou le
versene, et de mesoblastes isoles, seuls ou recombines, sont faites en goutte
pendante par la technique classique de la double lamelle de Maximow. Les
explants sont cultives, dans des recipients du type 'saliere', a l'interface du
verre et d'un coagulum compose de parties egales de plasma de coq (non
heparine), d'extrait d'embryon de poulet de 9 jours (le centrifugation) et de
solution de Hanks. Tous les 2 ou 3 jours, les lamelles porte-culture sont
demontees, rincees dans deux bains successifs de Hanks et resuspendues au
couvercle du recipient. Une goutte du melange coagulant frais est ajoutee au
coagulum initial, apres quoi les couvercles sont rescelles a la vaseline-paraffine.
Une goutte de Hanks, deposee dans le fond du recipient, empeche toute evaporation du milieu de culture.
Les cultures transfiltres sont realisees par une methode derivee de la technique originale de Grobstein (1956). Une rondelle est decoupee a l'emportepiece de 7 mm dans une feuille de Millipore de type THWP (porosite: 0,45 /i\
epaisseur: 25 /*). Elle est fixee a la colle cellulosique (obtenue en dissolvant des
dechets de Millipore dans de Pacetone jusqu'a consistance pateuse), et, au
moyen d'une fine pipette a controle buccal, autour de l'orifice d'une plaquette de
plexiglas perforee en son centre (dimensions: 3 0 x 8 x 2 mm; diametre de la
perforation: 5 mm). L'assemblage est sterilise dans l'ethanol 70 °C pendant
1 h minimum, puis subit trois lavages de 30 min dans du Hanks sterile, pour
etre enfin immerge dans le milieu de culture a 37 °C jusqu'a son utilisation.
Les explants sont deposes a la surface du filtre et immobilises par un coagulum forme de plasma de coq et de milieu liquide melanges en parties egales.
Ce dernier, le meme qui constituera la phase liquide de la culture, se compose
de solution de Hanks (2 vol.), serum de cheval ou de veau inactive a 56 °C (2 vol.)
et extrait embryonnaire de poulet de 9 jours (1 vol.). Le mesoblaste isole est
place a la partie inferieure du filtre, c'est a dire du cote de la cavite de la perforation. Dans les recombinaisons, l'epiblaste, ou tout autre explant, est fixe de
l'autre cote du filtre et exactement en face du mesoblaste. Quand la coagulation
est complete et que les explants ne risquent plus de se deplacer, l'assemblage
est pose en pont au dessus de la depression d'un cristallisoir a culture de type
Grobstein (cf. 1956) en orientant vers le bas le puits qui correspond a la perforation et qui contient le mesoblaste. On place enfin 0,5 ml de milieu liquide dans la
depression de telle sorte qu'il baigne completement la face inferieure de l'assemblage. Ce milieu est renouvele tous les deux jours. Comme les cristallisoirs ne
sont pas etanches, les cultures sont placees dans une etuve a 37 °C saturee
d'humidite et continuellement alimentee en air contenant 5 % de CO2. L'infec-
Uepiblaste dans la chondrogenese
219
tion est evitee en dissolvant de la penicilline et de la streptomycine dans le
Hanks pour que leur concentration dans le milieu liquide complet soit de 5 mg %
(chacune). Les cultures sont examinees — et pour certaines experiences, photographiees —journellement.
Techniques histologiques
A la fin de l'experience, habituellement vers le lOe jour, les cultures sont
fixees au Bouin. Les gouttes pendantes sont montees in toto, apres coloration
et deshydratation, ou enrobees a la paraffine et debitees en coupes seriees de 7 ft.
Pour les cultures sur filtre, les rondelles de Millipore sont delicatement detachees
du support de plexiglas en veillant a ne pas en decoller les coagulums, enrobees
a la paraffine et coupees en series. Les preparations in toto, ou les coupes, sont
colorees a Phemalun-eosine ou, de preference, au bleu de toluidine en solution
a 0,05 % dans le tampon phosphate de Sorensen (M/15, pH 4), technique qui
revele le tissu cartilagineux avec la plus grande precision grace a sa coloration
metachromatique que Ton fixe par rincage a l'acide phosphomolybdique a 3 %
avant de deshydrater et de monter au baume synthetique (Harleco).
DESCRIPTION DES RESULTATS
L'etude du comportement in vitro des deux constituants primordiaux du
bourgeon de membre, le mesoblaste et l'epiblaste, a necessite la realisation de
six categories experimentales distinctes. Chacune d'entre elles a pour but
d'explorer quelles sont, dans des conditions donnees, les capacites de croissance
et de differenciation cartilagineuse du mesoblaste. Les differents groupes de
resultats obtenus vont etre presentes et commentes successivement en tenant
compte d'une progression logique dans Interpretation des faits, de facon a
definir graduellement les bases experimentales d'une influence active de
l'epiblaste sur la croissance et la chondrogenese du contingent mesoblastique
des bourgeons de membres.
1. Comportement du bourgeon de membre complet
Soixante et un bourgeons complets, dont 18 intacts (Bi), 38 trypsinises (BT)
et 5 versenises (BV) ont ete cultives en goutte pendante et observes quotidiennement pendant une huitaine de jours (tableau 1). Qu'il y ait eu ou non traitement
prealable des explants a la trypsine ou au versene, le mesoblaste de la majorite
de ces bourgeons (80,3 %) a manifeste une tendance evidente a l'accroissement
et a la differenciation chondrogene, tandis que l'epiblaste qui le recouvrait a
rapidement perdu ses relations initiales avec le mesoblaste pour constituer une
ou plusieurs vesicules epitheliales.
Les fig. la kid (Planche 1) illustrent quelques etapes caracteristiques de cette
evolution dans le cas d'un bourgeon de membre anterieur complet et intact
(Bi). Entre la 24e et la 48e h, l'explant s'entoure d'une nappe mesoblastique
homogene dans laquelle on peut deceler de nombreuses mitoses; le revetement
4
42
5
61
Bourgeons entiers traites par la
trypsine-pancreatine (BT)
Bourgeons entiers traites par le
versene (BV)
Total
MT
MV
Total
Nature
des explants
24
38
Bourgeons entiers intacts (Bi)
Chond.
faible
49
(80,3%)
4
(80%)
16
(88,9%)
29
(76,3%)
Total
Croissance
suivie de
Pas de
Croissance
necrose
croissance
Cas negatifs
(pas de chondrification)
0,05%)
1
5
1
85
10
95
3
8
(8,8%)
Croissance
Cas positifs
(chondrification)
Nombre
de cas
56
2
58
(61 %)
23
5
28
(29,4%)
94
Pas de
croissance
Croissance
puis
necrose
Cas negatifs
(pas de chondrification)
2
(11,1%)
9
(23,7%)
1
(20%)
12
(19,7%)
Total
13 (sur 21)
En presence d'un
tissu embryonnaire
heterologue
65 (66,1%)
v. explications dans le texte
52 (sur 74)
En presence de
l'epiblaste
Nombre de cas oil une chondrification
a ete observee dans la culture des
bourgeons heterolateraux
Tableau 2. Evolution in vitro J« mesoblaste des bourgeons jeunes
14
18
Nature des explants
Chond.
forte
Nombre
de cas
Cas positifs
(croissance et chondrification)
Tableau 1. Evolution in vitro des bourgeons de membres entiers
BP
ffl
to
to
o
Uepiblaste dans la chondrogenese
221
epiblastique du bourgeon devient rapidement indistinct au debut de cette phase
d'accroissement, mais il ne tarde pas a reapparaitre vers la 48e h, sous une forme
vesiculaire (planche 1, fig. \b). Au cours du 3ejour in vitro, les premiers precartilages se forment par condensation cellulaire en divers endroits de la nappe
mesoblastique. Les masses condensees ne tardent pas a entamer leur differenciation cartilagineuse, modification qui se caracterise a l'examen direct par un
accroissement rapide de leur transparence (planche 1, fig. lc). A partir de ce
moment, les jeunes cartilages s'accroissent et prennent forme; ils peuvent constituer soit des masses epaisses et confluentes (planche 1, fig. Id, apres 9 jours
de culture), soit des pieces independantes et articulees, comme on en voit dans
la planche 1, fig. 2. Remarquons enfin que dans la plupart des cas, les cartilages
les plus volumineux se developpent en des endroits eloignes de la vesicule
epitheliale, et que celle-ci est toujours separee des cartilages les plus proches par
une couche de mesenchyme non chondrifie.
Nous pouvons maintenant considerer avec plus d'attention les resultats de
ce premier groupe d'experiences (tableau 1).
Une evolution analogue a celle qui vient d'etre decrite a ete constatee pour 14
explants Bi sur 18, pour 24 explants BT sur 38, et pour 4 explants BV sur 5.
Dans la meme serie de resultats positifs, il convient d'inclure quelques cultures
qui, apres la phase de croissance en nappe du mesoblaste, n'ont donne naissance
qu'a un ou plusieurs petits nodules cartilagineux epars et non articules. Une
telle evolution, qui evoque l'existence d'un controle quantitatif des proprietes
chondrogenes du mesoblaste, a ete observee dans 7 cas sur 6 1 : 2 bourgeons
intacts et 5 autres ayant subi un traitement prealable a la trypsine-pancreatine.
Sous reserve des precisions que pourraient fournir a ce point de vue les resultats
d'une plus grande serie d'experiences, il semble done que le traitement prealable
des bourgeons complets par la trypsine altere legerement les capacites de
differenciation cartilagineuse du mesoblaste.
Cette derniere impression se renforce lorsqu'on tient compte des resultats
negatifs, e'est-a-dire des cultures de bourgeon complet n'ayant manifeste aucun
signe de differenciation cartilagineuse. Parmi les douze explants (sur 61) qui
n'ont pas forme de cartilage in vitro, neuf etaient en effet des bourgeons complets prealablement soumis a la trypsine. Parmi ces douze resultats negatifs, on
peut distinguer trois degres differents dans le comportement du mesoblaste.
Dans les quatre cas les plus favorables, le mesoblaste s'est accru en nappe
et a conserve une vitalite normale jusqu'a la fin de l'experience. Dans deux
autres cas, l'accroissement mesoblastique a ete rapidement interrompu par
l'intervention de phenomenes degeneratifs comportant l'apparition de nombreux
macrophages. Dans les six derniers cas, l'explant n'a manifeste aucune tendance
a s'accroitre et est devenu entierement necrotique apres quelques jours. II
est interessant de noter que cinq bourgeons sur les six qui se sont comportes de
cette facon avaient ete soumis a une solution de trypsine.
Bien que nous nous soyons peu interesses au sort de l'epiblaste dans les
15
JEEM 20
222
J. MILAIRE & J. MULNARD
cultures n'ayant pas forme de cartilage, nous avons neanmoins remarque que
les vesicules epitheliales se differencient tres rarement dans ces conditions et
qu'elles n'apparaissent en tout cas jamais en l'absence de croissance mesoblastique.
2. Le comportement du mesoblaste explante seul
Les resultats de la culture du mesoblaste des bourgeons de membres debarrasses de leur revetement epiblastique au moyen de trypsine (MT) ou de versene
(MV) sont tres differents selon que Ton s'adresse a des bourgeons jeunes,
preleves tot le matin, ou a des bourgeons plus ages, preleves dans le courant
de 1'apres-midi.
Nous considererons tout d'abord le comportement du mesoblaste des bourgeons jeunes preleves au debut du lOe jour lorsqu'il s'agit de bourgeons anterieurs et au debut du l i e dans le cas d'ebauches posterieures (tableau 2). Les
resultats obtenus sont tres significatifs; un seul explant sur 95 a forme des masses
cartilagineuses, les 94 autres ayant manifeste soit une absence totale de croisEXPLICATION DES PLANCHES
bourgeon intact
bi
bt
bourgeon complet traite par
la trypsine
cart. piece cartilagineuse
e
epiblaste
et
epiblaste isole a la trypsine
m
mesoblaste
mo.v.
mt
mv
v.e.
PLANCHE
fragment ventral de tube medullaire
mesoblaste isole a la trypsine
mesoblaste isole au versene
vesicule epidermique
1
Toutes les figures de cette planche sont des photographies de cultures vivantes.
Fig. 1. Evolution in vitro d'un bourgeon de membre anterieur intact preleve au matin du lOe
jour et photographie 2 h apres Pexplantation (a), apres 48 h (b), 4 jours (c), et 9 jours de
culture (d). Importante chondrification.
Fig. 2. Evolution in vitro d'un bourgeon de membre posterieur preleve au matin du lie jour
et prealablement traite pendant 3 min par de la Trypsine 3 %. (a) apres 30 h de culture,
(b) apres 11 jours de culture: meme resultat.
Fig. 3. Evolution in vitro d'un mesoblaste, isole au versene, d'un bourgeon de membre posterieur preleve au matin du lie jour, (a) apres 16 h de culture, (b) apres 3 jours: arret complet de la croissance et debut de necrose (noter les macrophages au centre de l'explant).
Fig. 4. Evolution in vitro d'un mesoblaste isole a la trypsine d'un bourgeon posterieur du
debut du lie jour, (a) apres 5 h de culture, (b) apres 6 jours: degenerescence complete de
l'explant.
Fig. 5. Reassociation d'un mesoblaste et d'un epiblaste de bourgeons posterieurs du debut
du lie jour, tous deux isoles au versene. (a) au moment de l'explantation, (b) apres 8 jours de
culture. Importante chondrification.
Fig. 6. Reassociation d'un mesoblaste isole a la trypsine et d'un epiblaste isole au versene,
tous deux provenant de bourgeons posterieurs du debut du l i e jour, (a) au moment de
l'explantation, (b) apres 7 jours de culture: meme resultat.
Fig. 7. Reassociation in vitro de deux pieces mesoblastiques et de deux epiblastes isoles a la
trypsine de bourgeons posterieurs du debut du lie jour, (a) au moment de l'explantation,
(b) apres 8 jours de culture: meme resultat.
J. Embryo/, exp. Morph., Vol. 20, Part 2
6a
6b
J. M I L A I R E & J. MULNARD
PLANCHE 1
J. Embryol. exp. Morph., Vol. 20, Part 2
PLANCHE 2
J. MILAIRE & J. MULNARD
V epiblaste dans la chondrogenese
223
sance (58 cas), soit une faible ebauche de croissance rapidement suivie de
necrose (28 cas), soit enfin un accroissement en une nappe mesenchymateuse
homogene et indifferenciee (8 cas). La fig. 3 (Planche 1) illustre le comportement d'un explant mesoblastique denude a l'aide de versene et evoluant vers
l'accroissement en nappe. La fig. 4 (Planche 1) illustre 1'evolution rapidement
necrotique d'un explant mesoblastique isole par trypsinisation.
En presence d'une telle homogeneite dans les resultats negatifs, il parait evident
que le mesoblaste des bourgeons de membres est incapable de se chondrifier in
vitro lorsqu'il est debarrasse de son epiblaste. Cette conclusion est d'autant plus
fondee que, dans de nombreux cas, la qualite du tissu explante a pu etre controlee par la culture du mesoblaste des bourgeons heterolateraux en presence
de leur propre epiblaste, ou bien d'un fragment de tissu embryonnaire capable
d'induire la chondrification. Sur un total de 74 bourgeons cultives en presence
de l'epiblaste (6 Bi, 2 BV, 28 BT, 30 cas MT + ET et 8 cas MV + EV), 52 ont
donne naissance a du tissu cartilagineux, la majeure partie des resultats negatifs
de cette serie etant ceux des recombinaisons MT + ET (12 cas sur 22). En outre,
parmi les 21 explants mesoblastiques cultives en presence de tissus embryonnaires heterologues, 13 ont forme du cartilage sous l'influence d'inducteurs
chondrogenes connus (tube neural, otocyste).
II en resulte done que 65 (66,1 %) des bourgeons heterolateraux ont manifeste
leur tendance a la chondrification, alors qu'un seul des explants mesoblastiques
cultives seuls (1,05 %) a forme du cartilage. Si Ton tient compte du fait que cet
PLANCHE 2
Fig. 8. Reassociation in vitro d'un mesoblaste isole au versene et d'un epiblaste isole a la
trypsine de bourgeons posterieurs du debut du lie jour, (a) au moment de l'explantation,
(b) apres 4 jours de culture: degenerescence de l'explant apres une courte periode de
croissance.
Fig. 9. Reassociation in vitro d'un mesoblaste et d'un epiblaste de bourgeons posterieurs du
debut du 1 le jour, tous deux isoles a la trypsine. (a) au moment de l'explantation, (b) 4 jours
apres: meme resultat.
Fig. 10. Association in vitro d'un mesoblaste de bourgeon posterieur du debut du lie jour,
isole a la trypsine, et d'un fragment ventral de tube medullaire preleve au meme stade. (a) 5 h
apres l'explantation, (b) apres 30 h de culture, (c) apres 6 jours de culture. Chondrification
massive et croissance peripherique tres moderee.
Fig. 11. Reassociation de part et d'autre d'une membrane Millipore d'un epiblaste et d'un
mesoblaste isoles a la trypsine-pancreatine de bourgeons posterieurs du debut du lie jour.
Fixation au Bouin apres 8 jours de culture, coupes de 8 /*, coloration a l'hemalun-eosine.
Induction transfiltre d'une volumineuse piece de cartilage.
Fig. 12. Meme type de reassociation, mais coloration au bleu de toluidine a pH 4. La masse
cartilagineuse formee est intensement metachromatique.
Fig. 13. Culture-temoin de mesoblaste isole a la trypsine et cultive seul dans les memes conditions: degenerescence complete de l'explant (coloration a l'hemalun-eosine).
Fig. 14. Culture d'un mesoblaste isole a la trypsine d'un bourgeon posterieur du lie jour,
mais provenant d'un embryon d'aspect plus age que les autres: formation spontanee d'une
importante piece de cartilage. (Coloration au bleu de toluidine acide.)
15-2
224
J. MILAIRE & J. MULNARD
unique cas MT positif provenait d'un embryon legerement plus age que les
autres de la meme portee, on peut done deduire formellement de cette serie
d'experiences que le mesoblaste des bourgeons jeunes est incapable de se
chondrifier in vitro en l'absence de son feuillet de revetement ou d'un fragment
de tissue embryonnaire doue de proprietes inductrices chondrogenes.
Les cultures d'explants mesoblastiques isoles evoluent de facon sensiblement
differente lorsqu'ils proviennent de bourgeons plus ages preleves 6 a 7 h plus
tard. Comme on le voit sur le tableau 3,17 explants de ce type, sur un total de 30,
ont forme du tissu cartilagineux in vitro, soit 56,6 % des cas. Parmi les 13 cas
negatifs de cette serie, quatre peuvent etre imputes a l'apparition de processus
infectieux dans les cultures. Dans un autre cas, le fragment explante provenait
de la portion la plus distale d'un bourgeon posterieur de 10 jours et 7 h dont
le mesoblaste proximal s'est chondrifie spontanement in vitro.
II est done evident qu'au cours des lOe et l i e jours du developpement, le
mesoblaste des bourgeons des membres anterieurs, puis celui des bourgeons
posterieurs, subit une modification decisive qui lui confere la propriete de se
chondrifier spontanement in vitro, modification dont l'accomplissement parait
impliquer la presence du feuillet de revetement.
3. La recombinaison cote a cote des deux constituants des jeunes bourgeons
On ne peut interpreter les resultats qui viennent d'etre relates sans invoquer la
necessite d'une participation active du feuillet d'epiblaste dans 1'acquisition de
proprietes chondrogenes par le mesoblaste de bourgeons jeunes explantes in
vitro. Pour confirmer la validite de cette interpretation, des explants mesoblastiques jeunes, c'est-a-dire encore incapables de se chondrifier spontanement
en culture, ont ete cultives au contact d'un ou plusieurs explants epiblastiques
provenant du meme bourgeon ou du bourgeon heterolateral. Dans la majorite
des cas, rimmaturite du mesoblaste explante a ete controlee par la culture du
mesoblaste isole du bourgeon heterolateral. II est bon de noter ici qu'au stade
ou il est preleve, le revetement epiblastique des bourgeons est encore depourvu
d'une cape apicale morphologiquement distincte; il comporte neanmoins un
vaste territoire ventro-marginal plus epais et deja dote des proprietes histochimiques qui caracteriseront ulterieurement la crete apicale qui en derivera.
Plusieurs types de recombinaisons ont ete realisees selon la nature de l'agent
dissociant utilise. Dans certains cas, les deux constituants d'un meme bourgeon
ont ete recombines in vitro apres avoir ete dissocies soit a la trypsine (MT-ET),
soit au versene (MV-EV). Dans d'autres cas, un explant mesoblastique obtenu
par trypsinisation a ete combine avec un explant epiblastique isole a l'aide de
versene (MT-EV), ou vice-versa (MV-ET).
La pratique de telles recombinaisons croisees a permis de reveler un comportement tres different du mesoblaste explante selon la nature de l'agent dissociant auquel a ete soumis l'explant epiblastique. Lorsqu'on fait le bilan des
resultats (tableau 4), on s'apercoit en effet que 8 explants mesoblastiques sur un
Croissance
Croissance
puis necrose
Pas de
croissance
26
MT-ET ou
MV-ET
MV-EV ou
MT-EV
Total
46
20
Nombre
de cas
8
(30,8%)
19
(95%)
27 (58,69 %)
Cas positifs
(chondrification)
6(13,94%)
6
Croissance
3(6,52%)
1
—
10(21,73%)
2
Pas de
croissance
10
Croissance
puis necrose
Cas negatifs
(pas de chondrification)
Total
13
(43,4%)
Table 4. Evolution du mesoblaste de bourgeons jeunes recombine in vitro avec un
epiblaste isole soit a la trypsine, soit au versene
17
(56,6%)
Cas positifs
(chondrification)
Nature
des explants
30
Nombre de cas
Cas negatifs
(pas de chondrification)
18
(69,2%)
1
(5%)
19(41,31%)
Total
Tableau 3. Evolution in vitro du mesoblaste des bourgeons plus ages
(Bourgeons anterieurs preleves l'apres-midi du lOe jour, bourgeons posterieurs preleves l'apres-midi du lie jour: tous les explants sont
obtenus par trypsinisation.)
to
I
226
J. MILAIRE & J. MULNARD
total de 26 ont forme du cartilage en presence d'un epiblaste trypsinise, alors
que la chondrification s'est manifested dans 19 cas sur 20 lorsque l'epiblaste
avait ete dissocie au versene. Nous trouvons done ici une confirmation de
1'influence defavorable de la trypsine precedemment soup^onnee en examinant le comportement des bourgeons complets explantes apres avoir ete
soumis a cet agent dissociant (cf. p. 221). Les resultats des recombinaisons
montrent que la trypsine affecte essentiellement l'epiblaste, ou sa limitante
basale, car dans chaque groupe d'experiences, le traitement auquel a ete soumis
le mesoblaste lui-meme ne parait pas influencer ses proprietes chondrogenes.
Le pourcentage des cas positifs est aussi eleve dans les associations MT-EV
que dans les combinaisons MV-EV; de meme, revolution cartilagineuse se
produit aussi rarement dans les combinaisons MV-ET que dans les combinaisons MT-ET.
Sur le plan descriptif, la croissance et la differenciation des explants recombines se deroulent de la meme facon et avec la meme chronologie que dans
le cas des cultures de bourgeons complets (planche 1, fig. 5 a 7). Dans les cas
negatifs, l'epiblaste s'accroit generalement en une nappe cellulaire indifferenciee
qui ne tarde pas a se necroser (planche 2, fig. %a et b); dans certaines cultures
cependant nous l'avons vu se differencier en une vesicle epitheliale normalement
constitute (planche 2, fig. 9 b). En l'absence d'evolution cartilagineuse, le mesoblaste indifferencie manifeste le plus souvent un faible accroissement homogene
suivi d'une involution necrotique (planche 2, fig. Sa et b; 9 a et b).
Si nous reconsiderons maintenant le bilan des resultats de la recombinaison
in vitro des deux constituants des bourgeons, deux conclusions interessantes
peuvent etre formulees selon que Ton examine l'ensemble des resultats positifs
ou negatifs. Les resultats positifs demontrent clairement l'existence d'une participation active du feuillet d'epiblaste dans la differenciation cartilagineuse du
mesoblaste explante dans son voisinage immediat. En outre, la grande dispersion topographique des cartilages qui se developpent in vitro nous incite a
penser que 1'influence epiblastique pourrait etre transmise au mesoblaste par
l'intermediaire d'un mediateur chimique tres diffusible. Les experiences actuelles
ne permettent pas de distinguer dans quelle mesure la propriete epiblastique
est uniformement repandue dans la totalite du feuillet de revetement ou si elle
est, au contraire, l'apanage du territoire limite qui, in vivo, se transforme en
cape apicale.
Quant aux resultats negatifs, ils nous apprennent que e'est en alterant l'epiblaste, et non le mesoblaste, qu'un traitement par la trypsine est susceptible de
compromettre la differenciation cartilagineuse des bourgeons explantes. Les
faits suivants nous incitent a penser que l'effet imprevisible de cet agent dissociant pourrait etre le resultat d'une disintegration enzymatique plus ou moins
poussee des materiaux exocellulaires normalement interposes entre l'epiblaste
et le mesoblaste. Au cours de chaque denudation mecanique des bourgeons
consecutive a leur sejour dans la trypsine, nous avons constate la liberation
Uepiblaste dans la chondrogenese
227
d'une substance tres visqueuse et collante dans le milieu de dissection. Examines
sur des coupes microscopiques colorees au P.A.S., les bourgeons traites par la
trypsine montrent des modifications caracteiistiques de la membrane basale sousepiblastique: cette membrane est completement desorganisee ou meme absente
par endroits dans les bourgeons non denudes; elle n'est plus reconnaissable
sur aucun des deux constituants lorsque ceux-ci ont ete dissocies mecaniquement. Apres l'emploi de versene, par contre, aucune substance visqueuse
n'apparait au cours de la denudation des bourgeons et la membrane basale reste
histologiquement decelable dans les lambeaux d'epiblaste enleves, contrairement
aux constatations faites chez le poulet, ou la basale reste adherente au mesoblaste
des bourgeons versenises. II reste toutefois difficile de comprendre pourquoi,
au cours d'une meme experience, la trypsinisation peut alterer irreversiblement le sort de certaines cultures sans affecter celui des autres. Lorsque la
trypsine parait entraver 1'evolution de la majorite des explants traites simultanement, et aussi lorsque cette nocivite se manifeste regulierement au cours de
plusieurs experiences consecutives, on peut attribuer les echecs a l'emploi d'un
meme lot d'extrait enzymatique particulierement actif. De fait, un certain
nombre de nos experiences ont ete totalement vouees a l'echec et n'ont pas ete
prises en consideration ici; tous les bourgeons traites dans ces experiences
avaient ete soumis a une trypsine dont le pouvoir dissociant s'etait avere tres
prononce.
4. Le comportement du mesoblaste du bourgeon de membre
cultive au contact de fragments de tube neural
Afin de pouvoir evaluer le degre de specificite de l'influence chondrogene
emise in vitro par l'epiblaste du bourgeon de membre, quelques explants mesoblastiques indifferencies obtenus par trypsinisation ont ete cultives au contact
de fragments de tube neural. Bien que le nombre de ces associations heterologues soit encore insuffisant pour permettre d'en tirer des conclusions formelles,
leur evolution presente neanmoins quelques aspects interessants a signaler.
Les experiences de Grobstein & Parker (1954), puis celles de Grobstein &
Holtzer (1955), ont clairement demontre que la moitie ventrale du tube neural
de l'embryon de souris exerce une influence chondrogene sur le mesoblaste
somitique explante in vitro. Absente dans la moitie dorsale de la moelle embryonnaire, cette propriete se maintient dans la portion ventrale depuis le 9e
jusqu'au 15e jour du developpement. Toutes nos experiences ont ete realisees
chez l'embryon preleve au debut du lie jour et ont consiste a associer le mesoblaste encore indetermine du bourgeon de membre posterieur avec des fragments
dorsaux ou ventraux de l'ebauche medullaire troncale. Les huit explants mesoblastiques cultives en presence de fragments de moelle ventrale se sont comportes de la meme facon: 24 h apres la mise en culture, une croissance p6ripherique en couronne s'amorce autour du mesoblaste (planche 2, fig. 10a et b).
Cet accroissement initial s'attenue rapidement et n'atteint en tout cas jamais
228
J. MILAIRE & J. MULNARD
l'ampleur qui le caracterise dans les cultures de bourgeons complets ou recombines. L'explant mesoblastique conserve done pratiquement la meme
densite tout au long de l'experience et e'est toujours en son sein que Ton voit
se former, vers les 5e et 6e jours, un ou plusieurs nodules cartilagineux (planche
2, fig. 10 c). Une evolution comparable a ete observee dans une seule des cinq
cultures reunissant in vitro le mesoblaste d'un bourgeon de patte et un fragment
de moelle dorsale. Dans les quatre autres cas, le mesoblaste s'est moderement
accru avant de se necroser completement.
Ces quelques resultats montrent que le mesoblaste des bourgeons est capable
de repondre a Finfluence chondrogene exercee par la moitie ventrale du tube
neural; le seul cas positif observe en presence de moelle dorsale resulte sans
doute d'une exerese trop large du fragment neural utilise. On peut done en
conclure que le facteur epiblastique demontre par ailleurs est depourvu de
specificite. On comprend encore difficilement pourquoi le mesoblaste combine
a un fragment medullaire ne manifeste qu'une tres faible tendance a s'accroitre
en peripherie. Peut-etre s'agit-il d'une differentiation en masse due a l'effet plus
precoce et plus puissant d'un inducteur plus volumineux que l'epiblaste normal
du bourgeon?
5. La culture des deux constituants du bourgeon de mernbre
de part et d'autre d'un filtre Millipore
Apres avoir demontre l'existence d'un facteur epiblastique capable de
stimuler la croissance et la chondrogenese du mesoblaste de bourgeon de membre
explante in vitro, nous avons tente de savoir si cette influence se transmettait par
contact cellulaire ou par l'intermediaire d'une substance chimique diffusible.
La localisation tres frequente des sites de chondrogenese en des endroits eloignes
de l'explant epiblastique plaidait fortement en faveur de la seconde hypothese.
Pour pouvoir la confirmer de facon formelle, nous avons tire parti de la technique de culture sur filtre Millipore, qui permet d'interposer entre les explants
epiblastique et mesoblastique, une membrane a la fois permeable aux molecules
en solution et infranchissable par les elements cellulaires.
Comme la realisation de ces assemblages implique quelques modifications
mineures des conditions de culture par rapport a celles de la methode en goutte
pendante (cf. p. 218), quelques bourgeons complets (BT et BV) ont d'abord ete
explantes sur la face inferieure d'un filtre. Dans chaque cas, leur comportement
in vitro a ete absolument identique a celui des bourgeons etudies en culture
simple: l'epiblaste a forme une ou plusieurs vesicules epitheliales et la chondrification du mesoblaste s'est deroulee dans les delais normaux.
Treize explants mesoblastiques provenant de bourgeons posterieurs preleves
au debut du l i e jour ont ete cultives en association transfiltre avec des explants
epiblastiques de la meme origine; la denudation des bourgeons a ete realisee
dans chaque cas a l'aide d'une solution de trypsine-pancreatine. Dans chaque
assemblage, le mesoblaste se trouvait a la face inferieure du filtre et l'epiblaste
Uepiblaste dans la chondrogenese
229
lui etait exactement superpose a la face superieure. Dix de ces cultures se sont
soldees par la formation de volumineuses pieces cartilagineuses aux depens du
mesoblaste ainsi que d'une nappe d'epiderme keratinise aux depens de l'epiblaste (planche 2, fig. 11 et 12). Dans les trois autres, le mesoblaste et l'epiblaste
ont tous deux subi une degenerescence precoce et complete.
Pour chacune de ces experiences, le mesoblaste du bourgeon heterolateral
a ete explante seul a la face inferieure d'un filtre Millipore et cultive dans les
memes conditions. Dans 12 cas sur 13, l'explant a manifest© une tentative
abortive d'accroissement avant de se necroser de fagon massive apres un sejour
de trois a 14 jours in vitro (planche 2, fig. 13). Dans un seul cas, le fragment
mesoblastique s'est differencie en une volumineuse piece de cartilage (planche 2,
fig. 14); cet unique cas positif a pu etre attribue a un developpement plus avance
de l'embryon donneur. II convient done de reduire de dix a neuf (69,2 %) le
nombre des resultats significatifs obtenus dans les combinaisons transfiltre.
Si Ton compare le bilan des associations transfiltre et celui des recombinaisons
en goutte pendante, on est frappe par le haut pourcentage de chondrifications
observees sur filtre Milh'pore (69,2 % contre 30,8 %). A moins qu'il ne s'agisse
la que d'un simple fait du hasard, on pourrait y voir la consequence de l'utilisation d'une trypsine moins nocive, ou peut-etre des meilleurs conditions nutritives
que procure la culture sur filtre Millipore.
Quoiqu'il en soit, ces resultats confirment l'existence d'une intervention indispensable de l'epiblaste dans la chondrogenese du mesoblaste explante et
demontrent surtout clairement que cette influence epiblastique est transmise
par un facteur chimique diffusible.
DISCUSSION ET CONCLUSIONS
Les resultats qui viennent d'etre presentes concourrent a demontrer que, dans
le developpement des membres de la souris, la chondrogenese depend d'une
action inductrice exercee sur le mesoblaste par le revetement epiblastique du
bourgeon. Mais ils soulevent egalement un certain nombre de problemes concernant la nature et la modalite de cet effet inducteur.
II convient tout d'abord de bien definir le systeme morphogenetique sur
lequel notre analyse a porte: dans les conditions techniques que nous avons
choisies, en effet, le developpement in vitro du bourgeon de membre est tres
different de ce qu'il est in utero. Comme celui du poulet (Strangeways & Fell,
1926; Fell, 1928), le jeune bourgeon de souris, explante a l'interface d'un support
(verre ou membrane Millipore) et d'un coagulum nutritif, donne naissance, en
quelques jours, a un systeme relativement simple constitue d'une vesicule epidermique et de cartilage disposes cote a cote. Le cartilage se differencie aux
depens de la zone centrale d'un mesoblaste qui tend a s'accroitre et a se disperser
a la peripherie (planche 1, fig. l a a d). II se forme presque toujours plusieurs
pieces cartilagineuses articulees entre elles et dont certaines peuvent rappeler,
230
J. MILAIRE & J. MULNARD
d'assez loin toutefois, la forme d'un constituant du squelette normal. Exceptionnellement, on a observe des mouvements au sein de la culture, temoins
d'une certaine differentiation musculaire. La morphogenese n'est done que
que vaguement ebauchee et, d'apres ce que Ton sait des mecanismes entrevus
chez le poulet et le xenope, on peut penser que cette absence d'organisation
tient a la perte precoce des relations normales entre l'epiblaste et le mesoblaste
dont les interactions sont pratiquement limitees aux facteurs de l'histodifferenciation du cartilage.
Les agents dissociants, employes dans les memes conditions que pour separer
l'epiblaste du mesoblaste, n'alterent que rarement le comportement du bourgeon
intact. Tout au plus peut-on constater une legere diminution du rendement
global des explants traites au versene et surtout a trypsine (cf. tableau 1), effet
d'ailleurs peu significatif et attribuable peut-etre a une toxicite fortuite de l'agent
dissociant. Nous aurons a revenir sur ce point.
1. La notion de seuil de determination
Pour que les recombinaisons soient significatives, il faut evidemment s'assurer
qu'au moment du prelevement, le mesoblaste n'est pas capable de se chondrifier
de maniere autonome. II est malaise de fixer avec precision le moment oil le
seuil de determination est franchi: preleve au bout du lOe jour (bourgeon anterieur) ou du lie (bourgeon posterieur), le mesoblaste isole a la trypsine ou au
versene n'a pratiquement jamais forme de cartilage (cf. tableau 2). En revanche,
isole dans l'apres-midi des memes jours, il ne s'est chondrifie que dans un peu plus
de la moitie des cas (cf. tableau 3). La determination se situe done a un moment
variable a partir du milieu du lOe jour pour le bourgeon anterieur, du lie pour
le posterieur. Cette imprecision peut s'expliquer par les differences de stade, parfois
importantes, qui existent entre les embryons de portees differentes et aussi,
presque toujours entre ceux d'une meme portee. La position du mesoblaste au
sein du bourgeon peut aussi influencer les resultats. On sait, en effet, que le
bourgeon de membre s'accroit par son extremite apicale et se differencie en sens
proximo-distal. II est possible que, dans certaines experiences, le prelevement
ait porte sur le mesoblaste distal, encore indetermine. II serait d'ailleurs interessant d'explorer systematiquement les capacites chondrogenes de fragments de
mesoblaste en fonction de leur position par rapport aux axes fondamentaux
(proximo-distal, cephalo-caudal) du bourgeon. Les conditions de culture constituent un autre facteur susceptible d'influencer la determination chondrogene.
Chez le poulet, qui presente l'avantage de se preter aux experiences in situ,
Strudel (1963) a montre que lorsqu'on utilise un milieu 'normal', le mesenchyme
somitique isole se chondrifie in vitro a partir du meme stade qu'm situ. Mais si
Ton enrichit le milieu en extrait embryonnaire et qu'on assure la cohesion de
1'explant, en l'enrobant de membrane vitelline par exemple, la chondrification
autonome se produit a partir de stades notablement plus precoces qu'm situ.
On peut se demander si une telle influence n'explique pas le fait, mentionne par
L'epiblaste dans la chondrogenese
231
Zwilling (1964), que chez le poulet, le mesoblaste du bourgeon de membre se
montre capable de se chondrifier in vitro de facon autonome, quel que soit l'age
de l'ebauche. II ne se forme toutefois que des nodules cartilagineux isoles, la
production d'articulations paraissant exiger la presence d'epiblaste.
Chez la souris, en operant au debut du lOe jour pour le bourgeon anterieur,
du lie pour le posterieur, on est a peu pres certain de prelever du mesoblaste
encore indetermine. Mais en raison des causes d'erreur possibles, les recombinaisons ont ete systematiquement controlees par l'explantation de mesoblaste
isole du bourgeon contra-lateral du meme embryon, toutes conditions de prelevement, de dissociation et de culture etant identiques pour le bourgeon
experimental et son temoin.
Insistons encore sur le fait que le seuil de chondrification ne s'identifie pas au
seuil de determination regionale de la piece squelettique. Celle-ci requiert,
d'apres ce qu'on en sait chez le poulet et lexenope, l'integrite des relations entre le
mesoblaste et son revetement epiblastique et echappe, de ce fait, a l'analyse experimentale chez le Mammifere, dans l'etat actuel de nos methodes tout au moins.
Dualite de Veffet inducteur
Nous pouvons, a present, examiner les problemes que soulevent les resultats obtenus par la reassociation des deux constituants du bourgeon. Si nous
faisons momentanement abstraction des differences constatees selon que l'epiblaste avait ete obtenu par la trypsine ou par le versene, on peut dire que les
experiences de recombinaison demontrent clairement que l'epiblaste exerce une
double influence sur le mesoblaste cultive dans son voisinage immediat. La
premiere controle la capacite de survie et la croissance du mesoblaste explante.
Dans 71 % des experiences de recombinaison, en effet (tableau 4), la vitalite du
mesoblaste se traduit par une abondante proliferation prealable a la chondrification, alors que 90 % des explants mesoblastiques isoles, apres une courte
periode initiale de proliferation moderee, cessent de s'accroitre et se necrosent
en masse (tableau 2). Ces resultats confirment entierement ceux qui ont ete
obtenus chez le poulet par des interventions in situ, en ce qui concerne le role de
la cape epiblastique. La seconde influence de l'epiblaste est celle qui induit la
differenciation cartilagineuse au sein du mesoblaste en voie d'accroissement.
Ici, 58 %x des mesoblastes ont presente une chondrification en presence d'epiblaste, alors qu'un seul explant mesoblastique, provenant d'ailleurs d'un embryon d'age plus avance que les autres de la meme portee, s'est chondrifie en
l'absence d'epiblaste.
Si la croissance et la vitalite paraissent bien etre liees, en sorte qu'un mesoblaste qui ne s'accroit pas est voue a la necrose, on peut se demander s'il en est
de meme pour la croissance et la chondrogenese. En d'autres termes, la differenciation cartilagineuse traduit-elle revolution spontanee d'un mesoblaste en voie
1
Le nombre assez eleve d'echecs etant imputable, dans une grande mesure, a une influence
toxique de la trypsine qui sera discutee plus loin.
232
J. MILAIRE & J. MULNARD
de croissance, auquel cas l'influence de l'epiblaste se resumerait a stimuler cette
croissance, ou bien existe-t-il deux facteurs epiblastiques controlant l'un la
croissance et l'autre la chondrogenese ? C'est la seconde eventualite qui nous
parait la plus vraisemblable. En comparant le comportement des mesoblastes
explantes en presence ou en 1'absence d'epiblaste, on constate en effet que 8 %
des explants isoles manifestent une croissance continue sans necrose ni chondrification, alors que cette eventualite caracterise 13 % des explants cultives en
association avec l'epiblaste. Si Ton tient compte du fait qu'il s'agissait, dans
chaque cas, d'epiblaste obtenu par trypsinisation, on peut supposer que l'agent
dissociant a pu alterer les proprietes d'induction chondrogene du feuillet, sans
modifier son aptitude a stimuler la croissance. II se pourrait, d' autre part, que
les 8 % de mesoblastes explantes seuls aient beneficie, in vivo, d'une stimulation
epiblastique leur permettant un accroissement spontane, mais qu'ils n'aient pas
encore ete soumis a une influence chondrogene suffisante, ou assez prolongee.
Cette suggestion, qui evoque la possibilite d'une chronologie differente des deux
actions presumees, meriterait de faire l'objet d'une nouvelle analyse
experimentale.
Role de la membrane basale
Avant de considerer les resultats qui montrent le caractere diffusible de
l'inducteur chondrogene, il nous faut encore reserver quelques commentaires
a l'un des aspects les plus inattendus et aussi les plus deroutants des experiences
de recombinaison des deux constituants de bourgeon de membre: l'action
nocive de la trypsine vis a vis du pouvoir inducteur des explants epiblastiques.
On ne peut, en effet, interpreter autrement les donnees du tableau 4, qui nous
montrent que la chondrification ne survient que dans 30 % des cas lorsque
l'epiblaste a ete obtenu par Faction de la trypsine, alors qu'elle se produit dans
95 % des cas en presence de l'epiblaste isole au versene et ce, quelque soit l'agent
utilise pour obtenir le mesoblaste. A notre tentative d'interpretation, deja
exposee plus haut a ce point de vue (cf. p. 226), nous voudrions ajouter ici deux
remarques qui sont peut-etre susceptibles d'eclairer le probleme. La premiere
est que, sur les 13 cultures transfiltre, associant un mesoblaste et un epiblaste
obtenus tous deux par trypsinisation, 10 (76,9 %) se sont soldees par la chondrification du composant mesoblastique. Or, il s'agit la de nos experiences les plus
recentes, pour lesquelles nous avons adopte le procede de dissociation par le
melange trypsine 2 % - pancreatine 1 %, au lieu de la solution simple de trypsine a 3 % utilisee precedemment. II se pourrait done que l'emploi d'une trypsine
moins concentree agissant en synergie avec une autre enzyme proteolytique
soit plus favorable au maintien de l'integrite fonctionnelle de l'epiblaste ou de
sa membrane basale. La seconde remarque nous est suggeree par le maintien
d'une vitalite et d'un pouvoir inducteur etonnants dans les lambeaux d'epiblaste
obtenus par la dissociation au versene, en depit du fait qu'une grande quantite de
cellules se liberent de ce feuillet pendant son immersion dans l'agent dissociant.
L'epiblaste dans la chondrogenese
233
Les quelques observations histologiques que nous avons pu recueillir a l'examen
de bourgeons traites par le versene montrent en effet que le revetement epiblastique n'y est plus represents que par quelques cellules eparses de la couche
profonde, maintenues en place grace a leur adherence a la membrane basale.
Celle-ci a, par ailleurs, conserve une integrite structurale parfaite, comme
l'indique une colorabilite inchangee par la methode au P.A.S. Observe dans
les memes conditions, l'epiblaste des bourgeons traites par la trypsine presente
par contre une morphologie cellulaire intacte, mais la membrane basale y est
soit completement desintegree soit extremement amincie. A la lumiere de ces
constatations, il semble done que la fonction inductrice de l'epiblaste des
bourgeons exige Pintegrite des materiaux de la membrane basale et Fintervention
des seules cellules qui se trouvent a son contact immediat. Ces conclusions
trouvent un appui supplemental dans les resultats de l'analyse histochimique,
et elles etendent en outre a un Mammifere des notions deja demontrees en ce
qui concerne la cape apicale des bourgeons de membres du poulet. C'est en effet
la strate cellulaire basale de l'epiblaste ventro-marginal des bourgeons de divers
Mammiferes qui se distingue histochimiquement par une teneur elevee en ARN
et une activite prononcee des phosphatases alcaline et acide; ces proprietes
caracterisent uniquement le pole profond des cellules, celui qui repose sur la
membrane basale (Milaire, 1963). D'autre part, dans une etude detaillee de
l'action du versene sur la cape apicale des bourgeons du poulet, Bell, Gasseling,
Saunders & Zwilling (1962) ont montre qu'un certain pourcentage de bourgeons
traites par ces agents conservaient, a la surface du mesoblaste, une couche d'un
materiel refringent comprenant la membrane basale et quelques residus cellulaires qui lui etaient restes adherents. Lorsque de tels bourgeons sont greffes sur
un embryon-hote, 50 % d'entre eux reconstituent une cape apicale normale a
partir de ces cellules residuelles, et ils manifestent ensuite une morphogenese
quasi normale. II convient toutefois de remarquer que, dans nos propres
experiences de recombinaison du type MV + EV ou MT + EV, la membrane
basale reste adherente aux lambeaux epiblastiques preleves apres Faction du
versene; ceux-ci sont done associes in vitro avec des fragments de mesoblaste
depourvus de toute membrane basale.
Caractere diffusible de Vinducteur
II a ete demontre a diverses reprises et par des techniques differentes que la
differenciation de certains cartilages est evoquee par un facteur diffusible. Lash,
Holtzer & Holtzer (1957) ont obtenu, chez le poulet, la chondrification de mesoblaste somitique separe de son inducteur normal (moelle et notochorde) par
l'epaisseur d'un filtre Millipore. Strudel (1963) a montre que ce meme mesoblaste somitique isole se chondrifie sur un milieu de culture additionne d'extrait
d'inducteur. Benoit (1960), toujours chez le poulet, a obtenu un resultat identique avec le mesenchyme de la capsule otique cultive en presence d'extrait
d'otocyste.
234
J. MILAIRE & J. MULNARD
Chez la souris, revolution in vitro d'un bourgeon de membre intact ou
recombine apres dissociation suggere deja l'intervention d'un facteur diffusible.
II n'y a, entre l'epiblaste inducteur et le cartilage induit, qu'un point de contact
tres limite. Les plus grandes pieces cartilagineuses se differencient, en general,
a une certaine distance de l'epiblaste et non a son contact (planche 1, fig. 1,5,
6 et 7). La demonstration formelle du caractere diffusible du facteur chondrogene est apportee par nos experiences transfiltre. Celles-ci presentent une
particularity qui n'est pas sans rappeler les observations de Cooper (1965).
Cet auteur a montre que le mesoblaste somitique (de souris ou de poulet)
se chondrifie quand il est cultive en presence d'un inducteur dont il est
separe par une membrane Millipore. Mais la localisation du cartilage induit
varie selon la nature de l'inducteur: s'il s'agit de l'inducteur normal (portion
ventrale du tube medullaire), le cartilage est toujours separe du filtre par une
couche de mesenchyme non chondrifie. S'il s'agit de cartilage hypertrophique
ou de notochorde a cellules vacuolisees, le cartilage se forme au contact du
filtre. Les deux effets peuvent s'observer dans nos recombinaisons: parfois le
cartilage est contre la membrane Millipore (planche 1, fig. 12), parfois au contraire, une epaisseur de mesenchyme indifferencie s'interpose entre le filtre et le
cartilage induit (planche 2, fig. 11). Nous ne sommes pas en mesure d'expliquer
cette variation de comportement. Notons qu'on retrouve, dans les cultures
transfiltre, le meme caractere de dispersion du facteur inducteur que dans les
recombinaisons cote a cote puisque la chondrification ne se produit pas seulement en face de l'epiblaste, mais deborde largement les limites de celui-ci
(planche 2, fig. 11 et 12). Faut-il admettre qu'apres avoir traverse le filtre
localement, l'inducteur diffuse largement dans tout le mesenchyme ou doit-on
postuler un effet de contagion metabolique qui gagnerait la totalite de l'explant
mesoblastique a partir d'un foyer limite d'induction? De nouvelles experiences
permettront peut-etre d'en decider.
RESUME
Les bourgeons de membres de la souris ont ete etudies in vitro dans diverses
conditions experimentales, avec les principaux resultats suivants:
1. Le mesoblaste isole ne peut se chondrifier de facon autonome qu'a partir
d'un certain stade qui se situe vers le milieu du lOe jour pour le bourgeon anterieur, du lie pour le posterieur. Explante avant ce seuil de determination, il
n'est capable ni de se differencier ni de s'accroitre et il degenere apres une courte
survie.
2. La recombinaison cote a cote des deux constituants du bourgeon, preleves
avant le seuil de determination, montre que l'epiblaste exerce une double
influence sur son mesoblaste: il en stimule la croissance et il y induit la differenciation de pieces cartilagineuses articulees.
3. Les resultats des recombinaisons peuvent cependant dependre de la nature
de l'agent dissociant utilise pour isoler l'epiblaste: avec le versene, l'induction
L'epiblaste dans la chondrogenese
235
est la regie; mais certains echantillons de trypsine, particulierement actifs,
suppriment ou reduisent les proprietes inductrices de l'epiblaste. On constate,
dans ces cas, la disparition, ou une profonde alteration de la membrane basale.
Le mesoblaste, en revanche, n'est influence par aucun des deux agents dissociants.
4. L'effet inducteur demontre n'est pas strictement specifique de l'epiblaste de
revetement du bourgeon: on l'obtient egalement avec des fragments ventraux de
tube medullaire.
5. La recombinaison de l'epiblaste et du mesoblaste du bourgeon de membre,
de part et d'autre d'une membrane Millipore, montre que l'inducteur en cause
est diffusible et capable d'exercer son effet en dehors de tout contact direct entre
les tissus inducteur et reacteur.
6. La discussion porte principalement sur les modalites de cette induction
chondrogene et en particulier sur l'eventuelle dualite de l'agent inducteur.
SUMMARY
The role of the ectoderm in chondrogenesis in the mouse limb-bud
Mouse limb-buds were studied under a variety of experimental conditions
in vitro with the following results:
1. Autonomous chondrification of isolated mesoderm only occurs if explantation takes place later than the middle of the 10th day or the 11th day for the
forelimbs and hind limbs respectively. If explanted earlier, tissue neither grows
nor differentiates, but survives briefly and then disintegrates.
2. A side-by-side recombination of ectoderm and mesoderm separated before
the onset of determination shows that the ectoderm exercises a double influence
on its mesoderm: it stimulates growth and induces the formation of articulated
cartilaginous elements.
3. The results of recombination experiments depend, however, upon the
agent used to dissociate the ectoderm. When versene is used induction is the rule,
but certain particularly active trypsin preparations suppress the induction
properties of the ectoderm. In these cases the basement membrane is much
altered or disappears. The mesoderm, on the other hand, is not affected.
4. The induction effect is not strictly specific to the limb-bud ectoderm since
it can be obtained with ventral fragments of the spinal cord.
5. The inductor in question can exercise its effect when ectoderm and mesoderm are separated by a Millipore filter.
6. The modes of this chondrogenic induction and in particular the duality
of the inductor are discussed.
Ce travail a ete realise avec l'appuifinancierdu Fonds National de la Recherche Scientifique
et du Fonds de la Recherche Scientifique Medicale.
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J. MILAIRE & J. MULNARD
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