/. Embryol. exp. Morph. Vol. 19, 3, pp. 433-8, May 1968
With 4 plates
Printed in Great Britain
433
Etude autoradiographique
de la synthese des ADN, ARN et proteines dans
l'oesophage embryonnaire de Souris a
Faide de Factinomycine D
Par LUIS SORIANO1
Institut d' Embryologie et Teratologie experimentales du C.N.R.S. et du
College de France {Directeur: Professeur Etienne Wolff)
L'actinomycine D est capable a des doses moderees d'inhiber la synthese
d'ARN dependant du ADN, et a des doses plus fortes elle peut affecter la
synthese des ARN et proteines cytoplasmiques dans les cellules animales
(Goldberg & Rabinovitz, 1962; Caspersson, Farber, Foley & Killander, 1963;
Franklin, 1963). D'autre part, ces resultats ont ete confirmes en culture de
cellules et d'organes par 1'utilisation des methodes autoradiographiques
(Wessells, 1964; Yaffe & Feldman, 1964; Yaffe & Fuchs, 1967).
Dans un travail preliminaire, nous avons demontre que l'actinomycine D est
capable d'inhiber la synthese de keratine cesophagienne in vitro, lorsque cet
inhibiteur est utilise a des doses convenables et au moment opportun. C'est
ainsi que, si l'actinomycine est ajoutee dans le milieu de culture a la dose de
0,05 figjvol pendant les premieres 24 h d'une culture de 9 jours, l'oesophage
montre a la fin de la culture une inhibition de la keratinisation sans que l'epithelium montre des signes de degenerescence (Soriano, 1967).
Dans le present travail nous avons etudie quelle est l'influence de l'actinomycine sur la synthese des ARN, ADN et proteines dans l'oesophage embryonnaire de Souris, au moyen de techniques autoradiographiques.
MATERIEL ET METHODES
Les explants d'oesophage sont preleves sur l'embryon de Souris a 15 jours
de gestation et cultives pendant 24 h soit sur un milieu standard de Wolff &
Haffen (1952) soit sur un milieu additionne de l'actinomycine D a la dose de
0,05 /ig/ml (l'actinomycine D a ete offerte gracieusement par Merck, Sharp et
Dohme, Rahway, New Jersey).
Comme precurseurs marques, nous avons utilise le 3H-uridine-5 (activite
1
Adresse de Vauteur: 49 bis, Avenue de la Belle Gabrielle, 94 Nogent-sur-Marne, France.
28-3
434
L. SORIANO
specifique: 4 Ci/mM) a la dose de 25 /*Ci/ml; la 3H-thymidine-methyle (activite
specifique: 8,5 Ci/mM) a la dose de 25 ^Ci/ml; et la 3H-DL-leucine-4-5 (activite
specifique: 10 Ci/mM) a la dose de 12 ^Ci/ml.
Le temps d'incorporation est de 30 min pour tous les precurseurs, et les
preparations histologiques ont ete exposees pendant 13 jours avec une emulsion
K5 (Ilford). Les coupes histologiques de 5 /i des explants temoins et experimented sont montes sur la meme lame pour assurer exactement le meme
traitement aux uns et aux autres. La coloration de fond se fait a l'hemalun
eosine.
RESULTATS
Nous avons fait deux sortes d'experiences: dans la premiere nous avons
cultive les explants d'cesophage 24 h, soit sur un milieu standard, soit sur un
milieu avec actinomycine, avant d'incorporer les precurseurs marques pendant
30 min; dans la deuxieme nous avons incorpore les precurseurs pendant 30 min
dans les explants avant de les cultiver pendant 24 h sur un milieu standard ou
sur un milieu avec actinomycine.
I. Culture des explants avant incorporation de precurseurs
(a) H-Uridine. La culture des cesophages sur milieu standard pendant 24 h,
suivie de l'incorporation de l'uridine tritiee, determine un marquage intense
localise principalement dans les noyaux des cellules basales et intermediaires de
Pepithelium cesophagien. Par contre, si les explants sont cultives sur un milieu
enrichi par l'actinomycine et mis ensuite en contact avec l'uridine tritiee, on
observe que le marquage est beaucoup plus faible (3 a 4 fois moins intense)
que dans le cas precedent (voir planche 1, fig. A, B).
(b) ZH-Thymidine. Si apres culture sur milieu standard pendant 24 h, on
incorpore la thymidine tritiee, on observe un certain nombre de noyaux de
cellules basales fortement marques. Par contre, si l'incorporation de la thymidine
se fait apres une culture de 24 h sur milieu avec actinomycine, il y a moins de
noyaux de cellules basales marques et ils le sont plus faiblement que dans le cas
precedent (voir planche 2, fig. C, D).
(c) 3H-Leucine. Si on incorpore la leucine tritiee apres une culture de 24 h
soit sur milieu standard, soit sur milieu avec actinomycine, on observe que
l'incorporation du precurseur des proteines est exactement la meme chez les
explants temoins que chez les experimentes, et que la radioactivite se localise
aussi bien dans les noyaux que dans les cytoplasmes de toutes les cellules de
l'epithelium oesophagien (voir planche 3, fig. E, F).
S
II. Incorporation de precurseurs avant la culture des explants
3
(a) H-Uridine. Quand l'uridine est incorporee pendant 30 min dans les
explants d'oesophage qui sont ensuite cultives pendant 24 h sur milieu standard,
on observe que le marquage se localise de preference dans le cytoplasme de
toutes les cellules epitheliales et tres peu dans les noyaux. D'autre part, si apres
J. Embryol. exp. Morph., Vol. 19, Part 3
PLANCHE 1
v
Milieu standard
\
Fix
30 minutes
24 heures
Milieu actinomycine (0,05 /<g/cc)
\
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
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O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
o o o o o o o o o o o o
24 heures.
O
O
Fix
O
oo
30 minutes
Fig. A. Radioactivite localisee de preference dans les noyaux des cellules epitheliales (fleches).
xlOOO.
Fig. B. Absence presque complete de radioactivite dans les noyaux des cellules epitheliales.
Inhibition de la synthese des ARN au niveau nucleaire. x 1000.
L. SORIANO
facing p. 434
PLANCHE 2
/ . Embryo I. exp. Morph., Vol. 19, Part 3
3
Milieu standard
H-Thymidine
\
Fix
30 minutes
24 heures
Milieu actinomycine (0,05//g/cc)
3
H-Thymidine
\
\
o o o o o o o o o o o o o o
o o o o o o
o o o o o o o
o o o o o o o o o o o o o
oK\
24 heures
Fix
30 minutes
Fig. C. Radioactivite localisee dans certains noyaux des cellules basales (fleches). Sur 75 a 80
noyaux vus sur la photo 20 a 23 sont marques, x 1000.
Fig. D. Radioactivite localisee dans quelques noyaux des cellules basales. Sur 85 a 88 noyaux
de l'epithelium environ 4 a 5 sont marques. Inhibition de la synthese des ADN. x 1000.
L. SORIANO
PLANCHE 3
/. Embryol. exp. Morph., Vol. 19, Part 3
Fix
30 minutes
24 heures
3
H-Leucine
Milieu actinomycine (0,05 //g/cc)
\
\
o
O
O
O
O
O
O
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O
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O
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O
O
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O
Q
O
24 heures
O
P O
O
O
->- Fix
O
30 minutes
Fig. E. Radioactivite localisee de preference dans le cytoplasme des cellules epitheliales
(fleches). x 1000.
Fig. F. Radioactivite localisee de preference dans le cytoplasme des cellules epitheliales
(fleches). Absence d'action inhibitrice de l'actinomycine sur la synthese de proteines. x 1000.
L. SORIANO
PLANCHE 4
J. Embryo/, exp. Morph., Vol. 19, Part 3
3
H-Uridine
Milieu standard
Fix
24 heures
30 minutes
Milieu actinomycine (0,05/igjcc)
\
o
O
O
30 minutes
O
O
O
O
O
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O
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O
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o o o o o o o o o o o o o
O
O
O
O
O
O
Fix
24 heures
Fig. G. Radioactivite localisee de preference dans le cytoplasme des cellules epitheliales
(fleches). Passage de la radioactivite de noyau au cytoplasme (comparer avec la fig. A,
planche 1). x 1000.
Fig. H. Radioactivite localisee de preference dans le cytoplasme des cellules epitheliales
(fleches). Passage de la radioactivite du noyau au cytoplasme. Absence d'action inhibitrice
de l'actinomycine sur le transfert de radioactivite du noyau au cytoplasme. x 1000.
L. SORIANO
Synthese dans Vcesophage embryonnaire
435
l'incorporation de l'uridine durant 30 min, les explants sont cultives 24 h sur
milieu avec actinomycine, on observe que la plus grande partie de la radioactivite
a passe des noyaux vers les cytoplasmes, mais qu'il reste quand meme un certain
marquage sur les noyaux (voir planche 4, fig. G, H).
(b) ZH-Thymidine. L'incorporation de la thymidine avant la culture des
explants pendant 24 h montre que la quantite des noyaux marques aussi bien
que la quantite de grains par noyau est a peu pres la meme que dans le cas ou
l'incorporation du precurseur a suivi une culture des explants de 24 h sur milieu
standard. La seule difference entre les deux experiences, c'est que dans le
premier cas la plupart des noyaux marques correspondent a des cellules
intermediaries, tandis que dans le cas ou la thymidine est incorporee apres la
culture ce sont les noyaux des cellules basales qui montrent la radioactivite.
(c) ZH-Leucine. Comme dans le cas ou la leucine avait ete utilisee apres une
culture des explants pendant 24 h, soit sur milieu standard, soit sur milieu avec
actinomycine, l'incorporation de la leucine avant la culture n'est pas modifi.ee
par l'actinomycine. L'intensite du marquage est done la meme chez les temoins
que chez les experimentes et la radioactivite se trouve aussi bien dans les
cytoplasmes que dans les noyaux de toutes les cellules epitheliales.
DISCUSSION
3
H-Uridine. Lorsque l'oesophage est cultive pendant 24 h sur milieu standard
avant incorporation d'uridine tritiee, on observe un marquage presque exclusivement nucleaire, qui pourrait s'expliquer par une duree de marquage
assez courte (30 min). En effet, certaines experiences paralleles nous ont montre
que la prolongation du temps d'incorporation au dela de 2 h, determine un
marquage uniforme des noyaux et des cytoplasmes. Une observation semblable
a ete faite par Yaffe & Fuchs (1967) dans le cas de cellules et fibres musculaires
cultivees in vitro. D'autre part, l'oesophage cultive 24 h sur milieu avec actinomycine et traite ensuite par l'uridine tritiee pendant 30 min, montre une absence
presque complete de marquage. Ceci confirme le pouvoir inhibiteur de l'actinomycine sur la synthese d'ARN a localisation nucleaire (Caspersson et al. 1963;
Yaffe & Feldman, 1964; Geuskens, 1965; Fraccaroe* al. 1966).
Nous avons en outre observe un transfert de la radioactivite du noyau au
cytoplasme grace a l'experience ou l'incorporation de l'uridine tritiee precede
la culture de Pexplant sur milieu standard. Par contre, si dans cette derniere
experience on remplace le milieu standard par un milieu avec actinomycine, on
observe un marquage dans les noyaux et les cytoplasmes tout a fait comparable
chez les experimentes et chez les temoins. Ceci prouve que l'actinomycine
n'empeche pas le passage de la radioactivite du noyau vers le cytoplasme, et
que son action inhibitrice porte exclusivement sur les syntheses nucleaires
d'ARN. Ce phenomene a ete observe par Wessells (1964) dans l'epithelium
pancreatique et par Geuskens (1965) dans l'oocyte d'Asterie.
3
H-Thymidine. L'incorporation de la thymidine tritiee par l'epithelium ceso-
436
L. SORIANO
phagien montre que seulement un certain nombre de cellules basales et intermediaries se marquent tandis que le reste des cellules epitheliales ne le font
pas. Ce resultat a un interet particulier du fait que l'epithelium de l'cesophage
est un exemple de tissu en constant renouvellement et que la synthese finale
de keratine depend beaucoup du metabolisme des cellules basales (Greulich,
1964). Sharav & Massler (1967) ont fait une constation comparable dans le
cas de l'epithelium bucal de rat.
En ce qui concerne l'action de l'actinomycine sur l'incorporation de thymidine
tritiee, on observe une nette inhibition du marquage dans le cas ou la culture
sur milieu avec actinomycine precede l'incorporation du precurseur. Baserga
et al. (1965) ont aussi observe une inhibition de la synthese de l'ADN de la
tumeur ascitique d'Ehrlich par l'actinomycine; Rothstein et al. (1966) l'ont vue
dans les cellules epitheliales du crystallin de Rana catesbiana, et Wessells (1964)
dans les cellules pancreatiques exocrines.
3
H-Leucine. Le fait que l'actinomycine n'empeche l'incorporation de leucine
marquee ni avant ni apres la culture confirme les resultats d'autres auteurs. En
effet, Wessells (1964) et Yaffe & Feidman (1964) observent que l'incorporation
de leucine tritiee n'est pas modifiee par l'actinomycine dans leurs systemes
respectifs. Par contre, Yaffe & Fuchs (1967) dans un recent travail ont observe
que des doses fortes inhibent l'incorporation de 3H-leucine par les cellules
mononuclees indifferenciees du tissu musculaire. D'autre part, Caspersson et al.
(1963) demontrent que le pouvoir inhibiteur de l'actinomycine sur la synthese
de proteines depend de la dose utilisee.
Enfin, nous avons constate que la synthese de proteines n'est pas inhibee par
l'actinomycine a la dose que nous utilisons d'habitude (0,05 /*g/ml). Le marquage
qu'on observe chez les temoins est tout a fait comparable a celui qu'on observe
chez les explants traites. II faut rappeler que cette dose nous a permis de
demontrer le pouvoir inhibiteur de l'actinomycine sur les syntheses des ARN
et ADN, sans que pourtant la structure cellulaire de l'epithelium oesophagien soit
alteree. C'est done que cette dose n'altere pas la vitalite de l'epithelium et que
l'inhibition obtenue sur les syntheses des acides nucleiques correspond bien a un
phenomene selectif et non a une degenerescence generate.
RESUME
1. L'epithelium oesophagien d'embryon de Souris constitue un systeme
organotypique convenant a l'etude des inhibiteurs de synthese au moyen de
l'autoradiographie.
2. L'incorporation d'uridine tritiee 30 min dans une culture d'oesophage de
24 h, determine un marquage nucleaire important; celui-ci est inhibe si l'actinomycine (0,05 /£g/ml) est ajoutee dans le milieu de culture. Mais l'actinomycine
n'empeche pas le passage de la radioactivite du noyau vers le cytoplasme si le
precurseur est incorpore avant la culture.
Synthese dans Vcesophage embryonnaire
437
3. L'incorporation de la thymidine tritiee 30 min dans une culture d'cesophage
de 24 h, determine dans les noyaux de certaines cellules basales un marquage
qui est inhibe par l'actinomycine (0,05 /*g/ml).
4. La synthese de proteines n'est pas modifiee par la culture en presence
d'actinomycine (0,05
SUMMARY
An autoradiographic study of the synthesis of DNA, RNA and proteins
in the embryonic mouse oesophagus using actinomycin D
1. The epithelium of mouse embryonic oesophagus in organ culture is a
convenient system for studying the effects of inhibitors by autoradiography.
2. The incorporation of tritiated uridine in a period of 30 min by an oesophagus
previously cultured for 24 h gives a nuclear labelling which is inhibited if
actinomycin is present in the culture medium at a concentration of 0-05 /tg/ml.
However, actinomycin does not prevent the passage of radioactivity from
nucleus to cytoplasm if the precursor is incorporated before the culture
period.
3. The nuclei of some basal cells are labelled after 30 min exposure to
3
H-thymidine during a 24 h culture. Such incorporation is inhibited by
0-05 /4g/ml actinomycin.
4. Protein synthesis is unaffected by the presence of 0-05 /*g/ml actinomycin
in the culture medium.
TRAVAUX CITES
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