/. Embryol exp. Morph. Vol. 19, 2, pp. 261-72, April 1968
With 4 plates
Printed in Great Britain
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Metabolisme des acides nucleiques
et des proteines et formation de cytasters dans les
oeufs d'amphibiens sous Faction de Teau lourde
Par S. VAN ASSEL & J. BRACHET 1
Laboratoire de Morphologie Animale, Universite Libre de Bruxelles
INTRODUCTION
L'apparition accidentelle de cytasters s'observe frequemment dans des oeufs
en voie de maturation ou de segmentation. II a ete montre par Gross & Spindel
(1960a, b) dans le cas des oeufs d'oursins et par nous-memes (Van Assel &
Brachet, 1966) dans celui des oeufs d'amphibiens qu'il est possible d'obtenir, de
facon reproductible, la formation de cytasters par l'immersion d'oeufs vierges
ou fraichement fecondes dans de l'eau lourde (D2O) a forte concentration.
Dans notre precedent travail (Van Assel & Brachet, 1966), nous avons montre
que les cytasters se forment au sein de Fhyaloplasme des oeufs vierges ou
fecondes. Dans le cas de ces derniers, l'apparition de cytasters, par addition de
D2O, s'accompagne toujours d'un arret extremement rapide des mitoses: dans
de l'eau lourde a 50 %, l'arret se fait apres une division complete; dans l'eau
lourde pure, le blocage se produit pendant la mitose en cours. Les cytasters
apparaissent tous simultanement; d'abord de tres petite taille, ils grandissent
peu a peu pour atteindre leur taille definitive en 1 h a 1 h 30', suivant l'espece.
Us regressent legerement par report des oeufs dans de l'eau.
Au microscope electronique, les cytasters sont formes de fibres asteriennes
semblables a celles presentes dans les asters mitotiques normaux. A plusieurs
reprises, nous avons observe des centrioles au centre des cytasters.
La presence, dans les cytasters, de fibres asteriennes et de centrioles pose le
probleme de leur origine. Se forment-ils de novo ou a partir d'elements
preexistants dans le cytoplasme des oeufs vierges ou fecondes ? Dans la premiere
hypothese, resultent-ils d'une synthese de proteines dirigee par du DNA
(nucleaire, cytoplasmique ou centriolaire) et des RNA messagers (m-RNA)?
On sait, en effet, que l'appareil mitotique (asters et fuseaux) est forme quasi
totalement de proteines, associees a environ 5 % de RNA (Mazia & Dan, 1952;
Mazia, 1955, 1961; Zimmerman, 1960; Sakai, 1966; Kane, 1967).
Le present travail a eu pour objet d'apporter une reponse, tout au moins
1
Adresse des auteurs: Laboratoire de Morphologie Animale, 67, Rue des Chevaux, RhodeSaint-Genese, Belgique.
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S. VAN ASSEL & J. BRACHET
partielle, a ces diverses questions: nous avons etudie, lors de la formation de
cytasters sous action de l'eau lourde, l'incorporation de precurseurs du DNA
(thymidine) et des proteines (leucine). D'autre part, nous avons etudie les effets
d'inhibiteurs des syntheses proteiques (puromycine, cycloheximide) et des syntheses des acides nucleiques (hydroxyuree, rayons X, actinomycine) sur la
formation des cytasters. Enfin, les effets eventuels du mercaptoethanol qui
empeche la formation de l'appareil mitotique dans les oeufs d'oursins (Mazia,
1958 a, b; Mazia & Zimmerman, 1958) et de Batraciens (Limbosch-Rolin &
Brachet, 1961) ont ete egalement examines.
MATERIEL ET METHODES
Les experiences ont ete realisees sur des oeufs de Pleurodeles waltlii et de
Xenopus laevis. Les stades utilises allaient de l'oeuf indivis au stade 4 blastomeres, qui est particulierement favorable pour les experiences de micro-injections
(les ceufs sont beaucoup plus sensibles aux piqures aux stades plus jeunes).
Apres enlevement de la gangue a la pince, les ceufs etaient repartis en une
serie de lots comprenant des temoins maintenus dans de l'eau de la ville, des
oeufs traites a l'eau lourde pure (D 2 O: Norsk Hydro-Elektrisk Kvaelstofaktieselskab, purete: 99,7 %), des oeufs traites, dans de l'eau de la ville, par les
inhibiteurs ou precurseurs des syntheses d'acides nucleiques ou de proteines et,
enfin, des oeufs soumis a la fois a Faction de l'eau lourde et des divers inhibiteurs
ou precurseurs de ces syntheses.
Les oeufs de Batraciens etant pratiquement impermeables a la puromycine,
l'actinomycine, la thymidine-3H et la leucine-14C, ces diverses substances ont
ete introduites dans l'oeuf par micro-injection a l'aide d'une fine aiguille de
verre fixee sur une seringue commandee par un micromanipulateur. Le volume
de solution injectee etait de l'ordre de 0,1 /A par ceuf. Toutes les experiences de
micro-injections ont ete effectuees sur des oeufs de pleurodele, au stade 4
blastomeres.
Les oeufs injectes de thymidine-3H et de leucine-14C ont ete places, immediatement apres l'injection, soit dans de l'eau de la ville pour les temoins, soit dans
de l'eau lourde pure pour les traites. Les ceufs injectes de thymidine ont ete
fixes a F aldehyde glutarique a 3,25 %, pendant 1 h 30'; ceux injectes de leucine
ont etefixespar congelation-substitution. Tous ont ensuite ete soumis a Fautoradiographie sur coupes, suivant la methode decrite par Ficq (1961).
Les ceufs injectes de puromycine ou d'actinomycine ont ete incubes dans
de l'eau de la ville pendant des temps variables, avant d'etre soumis a Faction
de l'eau lourde.
Les oeufs traites par la cycloheximide, le mercaptoethanol ou Fhydroxyuree
ont ete pretraites (ou non) par une solution aqueuse de ces inhibiteurs avant
d'etre places dans une solution de ces memes inhibiteurs dans le D 2 O.
Enfin, des oeufs irradies aux rayons X dans de l'eau de la ville (doses de
Effets de Veau lourde sur les cytasters
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500, 1.000, 5.000 ou 10.000 roentgens) ont ete subdivises, immediatement
apres l'irradiation, en deux groupes dont Fun etait soumis a l'action de l'eau
lourde.
Les oeufs bloques par l'eau lourde, ainsi que les temoins, ont ete fixes apres un
temps ne depassant jamais 2 h (1 h 30' a 2 h pour les pleurodeles, 1 h 15' a
1 h 30' pour les xenopes) au Zenker acetique. Apres enrobage a la paraffine, les
oeufs ont ete coupes a 10 JLL d'epaisseur et colores a FUnna ou au bleu de toluidine.
RESULTATS EXPERIMENTAUX
Formation de cytasters en presence de precurseurs et d'inhibiteurs
de la synthese des proteines
Incorporation de leucine-uC dans des oeufs de pleurodele traites a Veau lourde
Les oeufs de pleurodele, au stade 4 blastomeres, ont ete injectes de 0,1 fi\ de
leucine-14C a la concentration de 0,04 mg/ml (radioactivite specifique de 165 me/
HIM). Une partie des oeufs injectes a ete maintenue dans de l'eau lourde pure, le
restant se developpant dans de l'eau de la ville. Les oeufs ont ete fixes 1 h 30'
a 2 h apres l'injection; a ce moment, tous les oeufs traites a l'eau lourde etaient
bloques au stade initial (4 blastomeres).
L'examen des autoradiogrammes (planche 1, figs. A, B) montre que, tant
dans les temoins que dans les traites au D2O, il y a un marquage de tout le
cytoplasme et des noyaux; ce marquage n'est neanmoins pas identique d'un
blastomere a l'autre, en raison sans doute d'une diffusion imparfaite de la
leucine injectee.
Une accumulation des traces de grains d'argent se voit nettement au niveau
des noyaux, tant chez les temoins que les traites.
Les cytasters sont visiblement marques; mais il est difficile d'affirmer avec
certitude que la radioactivite y soit plus forte que dans le restant du cytoplasme.
On sait qu'il en va de meme en ce qui concerne l'appareil mitotique des oeufs
d'oursins: il se marque certainement, apres traitement des oeufs par un acide
amine radioactif; mais la question de savoir s'il se marque davantage que le
restant du cytoplasme demeure controversee (Gross & Cousineau, 1963;
Bibring & Cousineau, 1964; Stafford & Iverson, 1964; Mangan, Miki-Noumura
& Gross, 1965; Rinaldi, 1967; Wilt, Sakai & Mazia, 1967).
En tout etat de cause, il est clair que le traitement par l'eau lourde des
oeufs de pleurodele, dans les conditions qui donnent lieu a la formation de
cytasters, n'inhibe pas les syntheses proteiques.
Injections de puromycine dans des ceufs de pleurodele traites par Veau lourde
Legros & Brachet (1965) ont montre que de jeunes oeufs de pleurodele,
apres injection de puromycine, se bloquent apres 6 a 7 h, e'est-a-dire en morula.
L'etude de l'incorporation de leucine-14C leur a montre qu'il y a, au moment du
blocage, une inhibition de la synthese des proteines tant dans le noyau que le
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S. VAN ASSEL & J. BRACHET
cytoplasme. Cet effet inhibiteur de la puromycine sur les syntheses proteiques
commence deja a se faire sentir, au niveau du cytoplasme, 3 h apres l'injection.
En nous basant sur ces resultats, nous avons injecte des ceufs de pleurodele,
au stade 4 blastomeres, avec de la puromycine (200 /*g/ml) et nous les avons
laisses dans l'eau pendant des temps variant de 3 h a 5 h 30'. Apres ces pretraitements, destines a permettre a la puromycine d'inhiber la synthese de
proteines de maniere plus ou moins importante, des lots d'ceufs injectes ont
ete places dans de l'eau lourde pure et fixes 1 h 30' a 2 h plus tard.
Dans toutes ces experiences, quelle que soit la duree du pretraitement, il y a
toujours eu formation de cytasters. Ce resultat indique que la formation de
cytasters ne depend pas d'une synthese de novo de proteines.
Traitement d'ceufs de pleurodele et de xenope par de la cycloheximide et de Veau
lourde
Un autre inhibiteur de la synthese des proteines, la cycloheximide, agit de
facon differente pour empecher la formation des liens peptidiques (Felicetti,
Colombo & Baglioni, 1966). Dans les ceufs de pleurodele, la cycloheximide
(100 a 200 /*g/ml) bloque plus rapidement la synthese de proteines (en 2 a 3 h)
que ne le fait la puromycine; il en resulte un arret beaucoup plus rapide des
mitoses (apres une a deux divisions) (Legros, 1968).
Des ceufs de pleurodele (stade 4 blastomeres) et de xenope (stade 4 et 8
blastomeres) ont ete pretraites par une solution de cycloheximide dans de
l'eau (10 /*g/ml) pendant des temps variant de 0 a 1 h (pleurodeles) et de 0 a
40 min (xenopes). Ces ceufs ont ete ensuite places dans une solution d'eau
lourde contenant 10 /*g/ml de cycloheximide, pendant 1 h 30' dans le cas des
pleurodeles, 1 h a 1 h 15' dans celui des xenopes.
L'examen cytologique des oeufs de pleurodele a montre que, dans le cas d'un
pretraitement a la cycloheximide avant le traitement par le melange d'eau
lourde et de cycloheximide, les cytasters font defaut; par contre, les asters
mitotiques normaux restent visibles. Au contraire, dans les oeufs qui ont ete
traites uniquement par de la cycloheximide dans du D2O, les cytasters subsistent.
Mais ils n'ont pas le meme aspect que dans les oeufs traites par l'eau lourde seule:
ils sont beaucoup plus flous et se distinguent mal du restant du cytoplasme
(planche 2, figs. C, D; planche 3, fig. E).
Mais les resultats sont entierement differents dans le cas des oeufs de xenope:
quelle qu'ait ete la duree du traitement en presence de cycloheximide, on
observe toujours une formation normale de cytasters.
PLANCHE 1
Fig. A. Autoradiographie d'un oeuf de pleurodele temoin, injecte de leucine-14C au stade 4
blastomeres. Cytoplasme et appareil mitotique marques, x 640.
Fig. B. Autoradiographie d'un oeuf de pleurodele injecte de leucine-14C au stade 4 blastomeres et traite par l'eau lourde pure. Cytoplasme et cytasters marques, x 640.
J. Embryol. exp. Morph., Vol. 19, Part 2
S. V A N ASSEL & J. B R A C H E T
PLANCHE 1
facing p. 264
/. Embryol. exp. Morph., Vol. 19, Part 2
S. VAN ASSEL & J. BRACHET
PLANCHE 2
J. Embryo/, exp. Morph., Vol. 19, Part 2
PLANCHE 3
Fig. E. (Euf de pleurodele pretraite pendant 1 h par de la cycloheximide seule (10/tg/ml), au
stade 4 blastomeres, puis traite par un melange de cycloheximide (10/*g/ml) et d'eau lourde.
Les cytasters ont disparu. x 160.
S. VAN ASSEL& J. BRACHET
/. Embryo!, exp. Morph., Vol. 19, Part 2
S. VAN ASSEL& J. BRACHET
PLANCHE 4
Ejfets de Veau lourde sur les cytasters
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Cette difference entre les deux especes ne peut pas etre imputee a une mauvaise
permeabilite de l'oeuf de xenope a la cycloheximide: en effet, des oeufs temoins,
places dans une solution aqueuse de cycloheximide, se sont bloques apres
quelques divisions.
En raison de ces contradictions, il est difficile de tirer une conclusion ferme
des experiences: d'une part, il semble que la formation de cytasters necessite une
synthese de proteines chez le pleurodele; d'autre part, les resultats obtenus, dans
le cas des oeufs de xenope traites par la cycloheximide et ceux obtenus sur des
oeufs de pleurodele soumis a l'action de la puromycine, s'opposent a cette
conclusion.
Formation de cytasters en presence de mercaptoethanol.
Depuis les travaux de Mazia (1958 a, b) et Mazia & Zimmerman (1958), on
sait que le mercaptoethanol reduit les liaisons disulfures (-S-S-) qui interviennent dans I'association structurale des proteines constitutives de l'appareil
mitotique, provoquant une disorganisation profonde de sa structure. Mazia,
Harris & Bibring (1960) ont aussi montre que le mercaptoethanol inhibe la
duplication des centrosomes dans les oeufs d'oursins, bloquant ainsi les mitoses.
Chez les ceufs de Batraciens aussi, le mercaptoethanol provoque un arret
rapide des mitoses avec desintegration de l'appareil mitotique (Limbosch-Rolin
& Brachet, 1961).
Nous avons essaye de savoir si le mercaptoethanol est egalement capable
d'alterer la formation des cytasters.
Les experiences ont ete faites sur des oeufs de pleurodele et de xenope; a
nouveau, les resultats obtenus sur ces deux especes ne concordent pas. Dans les
deux cas, des oeufs (au stade 4 blastomeres) ont ete pretraites (ou non) par une
solution aqueuse de mercaptoethanol M/10 avant d'etre soumis a l'action d'une
solution de mercaptoethanol M/10 dans du D2O. Alors que, chez le xenope, le
mercaptoethanol n'a nullement affecte la formation des cytasters, on observe
chez le pleurodele, meme quand il n'y a pas eu de pretraitement, une alteration
nette de la formation des cytasters. Ceux-ci sont extremement petits et generalement recouverts de pigment; normalement, les cytasters forment des plages
claires exemptes de grains de pigment. Les noyaux sont egalement anormaux
et la fusion des chromosomes telophasiques ne se fait pas. Ces anomalies
s'observent egalement dans les oeufs de xenope traites au mercaptoethanol; elles
sont d'ailleurs caracteristiques de l'action du mercaptoethanol sur les ceufs
d'amphibiens (Limbosch-Rolin & Brachet, 1961).
PLANCHE 2
Fig. C. CEuf de pleurodele (temoin des figs. D et E), traite par l'eau lourde seule au stade
4 blastomeres, presentant de nombreux cytasters au pole animal, x 160.
Fig. D. CEuf de pleurodele traite par un melange de cycloheximide (10 ^g/ml) et d'eau lourde
au stade 4 blastomeres. Les cytasters sont flous et peu visibles. x 160.
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S. VAN ASSEL & J. BRACHET
Une difference de permeabilite entre les oeufs des deux especes ne peut etre
invoquee comme explication puisqu'on retrouve les memes anomalies nucleaires
dans les deux cas. En outre, les oeufs de xenope, comme ceux de pleurodele, se
bloquent, apres une division au maximum, dans une solution aqueuse de
mercaptoethanol M/10.
Les raisons de ces differences demeurent obscures et de nouvelles recherches
seront necessaires pour les elucider; mais il est clair que la formation de cytasters
est beaucoup moins sensible chez le xenope que le pleurodele a l'action
d'inhibiteurs tels que la cycloheximide et le mercaptoethanol.
Formation de cytasters en presence de precurseurs et d'inhibiteurs
de la synthese des acides nucleiques
Incorporation de thymidine-3H dans des ceufs de pleurodele traites par Veau
lourde.
Des oeufs de pleurodele, au stade 4 blastomeres, ont ete injectes de 0,1 //I de
thymidine-3H, a la concentration de 0,048 mg/ml (radioactivite specinque de
5.000 mc/mM). Immediatement apres l'injection, les oeufs ont ete places durant
2 h soit dans de l'eau de la ville, soit dans de l'eau lourde pure; ils ont ete
fixes ensuite. L'etude autoradiographique a montre que, tandis que les noyaux
des oeufs temoins sont tres fortement marques par la thymidine, ceux des ceufs
traites par l'eau lourde ne le sont que fort peu. Tres souvent, les noyaux sont
meme totalement depourvus de grains, si on tient compte de la radioactivite de
fond. En aucun cas, nous n'avons observe de marquage des cytasters (planche 4,
figs. F, G).
Les cytasters peuvent done se former dans des conditions ou l'eau lourde
inhibe fortement la synthese du DNA nucleaire.
Traitement d'eeufs de pleurodele par faction combinee de Vhydroxyuree et de
Veau lourde
Des oeufs de pleurodele (stade 2 blastomeres) ont ete pretraites pendant des
temps variant de 0 a 6 h 30' par une solution d'hydroxyuree dans l'eau a 1 mg/ml,
puis ils ont ete places durant 1 h 30' dans de l'eau lourde contenant 1 mg/ml
d'hydroxyuree. Les coupes pratiquees dans ces oeufs ne montrent aucune
alteration dans la formation des cytasters.
II n'est pas etonnant que l'hydroxyuree, un inhibiteur de la synthese du DNA
et, a haute concentration, de la synthese des RNA (Eisenberg, van Praag,
Rosenkranz & Shemin, 1965) n'exerce pas d'effet sur l'apparition des cytasters,
puisque nous venons de voir qu'ils se forment normalement en l'absence de
toute incorporation de thymidine. L'un de nous (Brachet, 1967) a, d'ailleurs,
montre que l'hydroxyuree n'exerce un effet inhibiteur sur le developpement des
oeufs de Batraciens qu'au stade de la blastula avancee, e'est-a-dire au moment
ou les syntheses de RNA deviennent importantes (Bachvarova & Davidson, 1966;
Bachvarova, Davidson, Allfrey & Mirsky, 1966).
Effets de Veau lourde sur les cytasters
267
Irradiation aux rayons X d'oeufs de pleurodele avant un traitementpar Veau lourde
On sait que les rayons X sont capables d'inhiber la synthese du DNA et
d'alterer le DNA existant. Dans les oeufs de Batraciens, les alterations subies par
le DNA (nucleaire et cytoplasmique) apres irradiation n'empechent pas une
segmentation normale (Alexandre, 1967). C'est au stade blastula avancee ou
jeune gastrula que le developpement s'arrete.
Nous avons constate que des irradiations par les rayons X d'oeufs de pleurodele
indivis par des doses de 500, 1.000, 5.000 et 10.000 roentgens, suivies par un
traitement par l'eau lourde pure, n'affectent pas la formation des cytasters par
l'eau lourde.
Injections d" act inomy cine dans des ceufs de pleurodele traites par Veau lourde
L'actinomycine, inhibiteur des syntheses des RNA, a ete utilisee afin de
preciser si la formation de cytasters necessite la synthese d'un type quelconque de
RNA.
Des oeufs de pleurodele, au stade 4 blastomeres, ont ete injectes d'actinomycine
concentree (1 mg/ml) et places dans l'eau lourde 2 h 30' plus tard. L'examen
cytologique de ces oeufs montre que l'actinomycine n'empeche jamais la
formation des cytasters.
Ce resultat negatif n'est pas etonnant: en effet, Brachet & Denis (1963),
Brachet, Denis & de Vitry (1964) ont montre que l'actinomycine, apres microinjection, n'affecte nullement le clivage des ceufs d'amphibiens; elle ne provoque
des anomalies mitotiques, tout comme l'hydroxyuree, qu'a partir du stade de
blastula avancee, au moment ou les syntheses de RNA deviennent importantes.
DISCUSSION
II ressort clairement de nos experiences que la formation de cytasters, dans
les ceufs d'amphibiens traites par l'eau lourde, est possible en l'absence de toute
synthese de DNA dans le noyau. En effet, ni un traitement par l'hydroxyuree, ni
une irradiation aux rayons X, meme a forte dose, n'empechent la formation de
ces asters. Ce qui est plus frappant encore, c'est l'inhibition totale de l'incorporation de thymidine dans les noyaux des oeufs traites par l'eau lourde. Ce resultat
est a rapprocher de celui obtenu par Gross & Harding (1961), qui ont egalement
observe un blocage de la synthese du DNA dans les oeufs d'oursins traites par
l'eau lourde.
II n'est, d'ailleurs, pas surprenant que le DNA nucleaire n'intervienne pas
PLANCHE 4
Fig. F. Autoradiographie d'un oeuf de pleurodele, temoin, injecte de thymidine-3H au stade
4 blastomeres. Le noyau est tres fortement marque. (Rmg.: les grains noirs visibles dans le
cytoplasme sont du pigment et non du marquage.) x 640.
Fig. G. Autoradiographie d'un oeuf de pleurodele injecte de thymidine-3H et traite par l'eau
lourde pure au stade 4 blastomeres. Le noyau est depourvu de marquage (a part 2 a 3 grains).
x640.
268
S. VAN ASSEL & J. BRACHET
dans la formation des cytasters, puisqu'on sait qu'ils peuvent se produire dans
des fragments anuclees d'ceufs d'oursins (Harvey, 1936, 1940; Lorch, 1952;
Lorch, Danielli & Horstadius, 1953).
Cette non intervention du DNA nucleaire dans la formation de cytasters ne
permet cependant pas d'exclure un role possible du DNA cytoplasmique, dont
on connait bien l'existence dans les oeufs de Batraciens (Brachet & Quertier,
1963; Brachet & Ficq, 1964). Nous avons montre precedemment (Van Assel &
Brachet, 1966) que le cytoplasme des oeufs de xenope traites a l'eau lourde se
'colore' a l'actinomycine radioactive: comme les oeufs normaux, ils contiennent
done du DNA cytoplasmique; mais cette technique ne permet pas de demontrer
une localisation particuliere du DNA au niveau des cytasters.
En ce qui concerne Fintervention possible d'une synthese de RNA messager
lors de 1'apparition de cytasters, nos resultats ne nous permettent pas de tirer
une conclusion nette. Toutefois, le fait que l'actinomycine n'exerce aucun effet
sur la formation de cytasters (meme apres micro-injection dans les oeufs) n'est
pas favorable a l'idee que leur apparition depend d'une neo-synthese de m-RNA.
Rappelons, d'ailleurs, que l'actinomycine n'affecte pas non plus la segmentation
normale des oeufs d'amphibiens (Brachet & Denis, 1963; Brachet et al 1964) ce
qui donne a penser que la production de nouvelles molecules de m-RNA est de
peu d'importance durant la segmentation. On en arrive a penser que les syntheses de proteines qui se font durant cette periode du developpement, qu'il
s'agisse d'oeufs normaux ou d'oeufs traites par l'eau lourde, seraient dirigees
par des m-RNA stables et preexistants deja dans l'oeuf vierge (Brachet, 1965).
Notons, en outre, que Gross, Spindel & Cousineau (1964) ont observe une
diminution de la synthese de RNA dans des oeufs fecondes d'oursins, apres
traitement par l'eau lourde.
La question de savoir si la production de cytasters exige une synthese de
proteines ne trouve pas non plus de reponse absolument satisfaisante. En effet,
les oeufs traites par l'eau lourde incorporent de la leucine radioactive dans le
noyau, dans l'appareil mitotique normal et dans tout le cytoplasme, y compris
les cytasters. Mais cette incorporation ne reflete pas necessairement la synthese
de proteines qui participeraient directement a la formation des cytasters. Le
marquage des cytasters pourrait etre du a Faccumulation de ribosomes a leur
niveau; ces ribosomes seraient engages dans la synthese de proteines (des
enzymes, par exemple) qui pourraient n'avoir rien a voir avec les proteines de
structure constitutives des fibres asteriennes. Rappelons que Gross & Cousineau
(1963) ont egalement observe une incorporation importante de leucine radioactive au niveau des cytasters et de l'appareil mitotique normal dans des oeufs
d'oursins traites par l'eau lourde. Mais, comme on Fa vu plus haut, la question
de savoir si la synthese des proteines, chez l'oursin, est plus importante dans
l'appareil mitotique que dans le restant du cytoplasme demeure controversee
(Gross & Cousineau, 1963; Bibring & Cousineau, 1964; Stafford & Iverson,
1964; Mangan, et al. 1965; Rinaldi, 1967; Wilt et al 1967).
Effets de Veau lourde sur les cytasters
269
Les resultats que nous avons obtenus en utilisant des inhibiteurs des syntheses proteiques sont contradictories d'une espece de Batracien a l'autre et
meme, pour une meme espece, d'un inhibiteur a l'autre. En effet, la cycloheximide inhibe la formation de cytasters dans les oeufs de pleurodele, mais pas
dans ceux de xenope. D'autre part, la puromycine n'affecte leur apparition ni
dans une espece, ni dans l'autre. Mais il est a noter que des contradictions se
rencontrent aussi dans le cas de l'ceuf d'oursin: bien que la puromycine arrete
rapidement sa segmentation (Hultin, 1961), elle n'empeche pas la formation de
cytasters. En outre, la cycloheximide (meme a des concentrations aussi elevees
que 10(Vg/ml) n'exerce aucun effet sur le developpement des oeufs d'oursins
(observations inedites personnelles). La situation, dans le cas de l'oeuf d'oursin,
est done exactement l'inverse de celle observee par Legros (1968) chez les
Batraciens: la cycloheximide y est beaucoup plus efficace, pour bloquer les
mitoses, que la puromycine. De telles differences, quand on compare diverses
especes, interdiront evidemment de tirer toute conclusion generate tant qu'une
etude biochimique soigneuse du mode d'action des inhibiteurs (cycloheximide et
puromycine), dans le cas des oeufs en voie de segmentation n'aura pas ete
effectuee. Mais ce n'est probablement pas un hasard si l'oeuf de pleurodele est
plus sensible tant au mercaptoethanol qu'a la cycloheximide que celui de
xenope: les deux substances agissent de facon totalement differente et on peut se
demander si la difference entre les deux especes n'est pas simplement liee au
developpement beaucoup plus lent du pleurodele.
Quoiqu'il en soit, rien n'exclut pour le moment l'hypothese d'une double
origine des cytasters: association de proteines preexistantes dans l'oeuf et
synthese de novo.
La formation de tres nombreux cytasters requiert probablement une quantite
de proteines plus importante que celle de l'appareil mitotique normal. II se
pourrait que le stock de proteines qui servent de precurseurs aux asters varie
d'importance d'une espece a l'autre. Si les oeufs ne contiennent pas, chez une
espece donnee, une quantite suffisante de proteines preformees pour assurer la
formation d'abondants asters, une synthese de novo de proteines deviendrait
indispensable.
Mais, en se basant exclusivement sur les donnees experimentales dont nous
disposons actuellement, on aboutit a la conclusion que les cytasters se formeraient surtout au depend d'elements preexistants dans le cytoplasme des
oeufs. Cette hypothese est renforcee par un travail recent de Inoue et Sato (1967).
11s ont montre que les fibres asteriennes et fusoriales se forment par association
de molecules proteiques preexistantes dans la cellule. II existe un equilibre entre
ces proteines libres et polymerisees, qui peut etre deplace vers l'une ou l'autre
forme, soit naturellement au cours du cycle mitotique, soit par Faction de divers
facteurs. Ainsi, l'eau lourde favoriserait la polymerisation de ces proteines et la
formation des fibres.
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S. VAN ASSEL & J. BRACHET
RESUME
1. Les oeufs de Batraciens (pleurodeles et xenopes) forment des cytasters
constitues de fibres asteriennes et, semble-t-il, de centrioles apres traitement par
de l'eau lourde concentree.
2. Nous avons recherche si cette production de cytasters est liee a des syntheses d'acides nucleiques et de proteines par l'utilisation de precurseurs et
d'inhibiteurs de ces syntheses.
3. Nous avons constate que l'eau lourde inhibe totalement la synthese du
DNA nucleaire. Un inhibiteur des syntheses de DNA, Fhydroxyuree et des
irradiations aux rayons X n'empechent pas la formation des cytasters. Le DNA
nucleaire ne semble done pas jouer de role dans leur apparition.
4. L'actinomycine, qui inhibe les syntheses de RNA, n'empeche pas non plus
la formation de cytasters.
5. Les oeufs traites par l'eau lourde incorporent de la leucine-14C tant dans le
noyau que dans le cytoplasme, notamment au niveau des cytasters. Cependant,
la puromycine, qui inhibe les syntheses proteiques, n'empeche pas la formation
de cytasters dans les oeufs de pleurodele et de xenope; un autre inhibiteur de ces
syntheses, la cycloheximide, empeche la formation de cytasters dans les oeufs de
pleurodele, mais pas dans ceux de xenope.
6. Le mercaptoethanol affecte l'apparition des cytasters uniquement dans
l'oeuf de pleurodele.
7. Les raisons possibles de ces resultats contradictoires d'une espece a
l'autre et d'un inhibiteur a l'autre, sont discutees.
SUMMARY
The formation of cytasters and the metabolism of nucleic acids and
proteins in amphibian eggs treated with heavy water
1. Amphibian eggs {Pleurodeles and Xenopus) form cytasters, which are made
of astral fibres and probably centrioles, upon treatment with concentrated heavy
water (D2O).
2. A study of the importance of nucleic acid and protein synthesis for the
formation of cytasters was undertaken; both precursors and inhibitors of these
syntheses were used.
3. It was found that D2O completely inhibits the synthesis of nuclear DNA.
Hydroxyurea (an inhibitor of DNA synthesis) and X-rays do not inhibit the
appearance of the cytasters, which is clearly independent of nuclear DNA
replication.
4. Actinomycin D, a classical inhibitor of RNA synthesis, has no effect on
cytaster formation.
5. Eggs treated with D2O incorporate 14C-leucine in the nucleus as well as in
the cytoplasm, including the cytasters. However, puromycin, which inhibits
protein synthesis, has no effect on the formation of cytasters in Pleurodeles and
Effets de Veau lourde sur les cytasters
111
Xenopus eggs. Another inhibitor of protein synthesis, cycloheximide, prevents
the formation of cytasters in the eggs of Pleurodeles but not in those of Xenopus.
6. Mercaptoethanol also blocks the appearance of cytasters in the eggs of
Pleurodeles without affecting those of Xenopus.
7. The possible reasons for the discrepancies in the results obtained with
different species are discussed.
Travail effectue dans le cadre du contrat Euratom-U.L.B. 007-61-10 ABIB.
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