/. Embryol. exp. Morph. Vol. 19, 2, pp. 145-55, April 1968
Printed in Great Britain
145
Observations sur la differenciation in vitro des
cellules myeloi'des d'embryons de poulet
Par GERMANO SALVATORELLI,1 CARLO CALLEGARINI,1
ANNA MARIA GULINATP & GIUSEPPE GARDENGHI1
Institut d'Embryologie experimentale du College de France et du C.N.R.S.
{Directeur: Professeur Etienne Wolff)
et Institute di Anatomia Comparata delVUniversita di Ferrara
{Directeur \ Professeur Leo Raunich)
INTRODUCTION
L'association de fragments de foie embryonnaire a des cultures organotypiques
de moelle osseuse d'embryons de poulet s'est montree tres favorable au maintien,
pendant une periode de culture de 15 jours, d'une activite erythropoietique
comparable a celle qui se deroule in vivo (Salvatorelli, 1966, 1967b).
Ce resultat experimental nous a permis de conclure, comme hypothese de
travail, que le foie embryonnaire du poulet est le lieu de production d'un ou de
plusieurs facteurs erythropoietiques qui stimulent, soit la proliferation des hemocytoblastes, soit leur differenciation en elements de la serie rouge.
II nous a ete ensuite possible de demontrer que ce ou ces facteurs erythropoietiques hypothetiques presents dans le foie embryonnaire sont capables
d'expliquer aussi leur action sur d'autres organes erythropoietiques embryonnaires telle la rate de poulet (Salvatorelli & Gulinati, 1967).
Meme l'adjonction d'extraits acellulaires de foie au milieu de culture a montre
une action favorable au maintien de l'erythropoiese et cette action est tout a fait
comparable a celle qui est produite par le foie vivant.
II ne nous a pas ete encore possible d'identifier la nature de cette ou de ces
substances erythropoietiquement actives, mais la technique de preparation de
nos extraits de foie semble indiquer que leur poids moleculaire doit etre inferieur a 15.000 (Salvatorelli, 1967a).
Le tableau hematologique presente par nos explants semble, a premiere vue,
comparable a celui qu'on observe in vivo; cependant, nous avons essaye
d'analyser, d'une fagon plus approfondie, la morphologie et la cytochimie des
elements differencies in vitro.
Nous avons done etudie soit la biometrie des erythrocytes, soit leur contenu
1
Adresse des auteurs: Laboratoire d'Embryologie Experimentale, College de France,
49 bis avenue de la Belle Gabrielle, 94-Nogent-sur-Marne, France.
146
G. SALVATORELLI ET D'AUTRES
en ARN et en hemoglobine, soit le comportement electrophoretique de l'hemoglobine synthetisee in vitro.
MATERIEL ET METHODES
(a) La methode de culture
Nous avons explante des fragments de moelle osseuse preleves sur le tibia
ou le femur d'embryons de poulet de 18 a 19 jours d'incubation, en association
avec des fragments de foie embryonnaire de 8 a 9 jours d'incubation, sur le
milieu de Wolff et Haffen (1952) enrichi en serum de cheval et recouvert de la
membrane vitelline (Wolff, 1961).
La periode de culture variait entre 5 et 15 jours.
(b) Determination de quelques valeurs biometriques des erythrocytes
La determination des aires cellulaires et du rapport nucleoplasmique correspondant a ete faite sur des photographies au grossissement 1000 de frottis
d'erythrocytes de nos explants et par comparaison d'erythrocytes de sang
peripherique et medullaire, sur lames en verre, colores au May GrunwaldGiemsa.
Sur ces photographies nous avons calcule l'aire cellulaire, le noyau et ensuite
le rapport N/P.
Nous avons analyse avec ces methodes une centaine d'erythrocytes pour
chaque serie d'explants apres une periode variable de culture (4, 7 et 15 jours)
et par comparaison une centaine d'erythrocytes de sang peripherique et medullaire pour chaque temoin d'age correspondant (19 jours d'incubation, 2, 3, 7,
13 jours apres l'eclosion).
(c) Determination de la quantite d'hemoglobine presente dans chaque erythrocyte
Dans ce cas les frottis ont ete faits sur des lames en quartz, fixes ensuite avec
du methanol pur pendant 10 min.
Apres inclusion a la glycerine anhydre, le cytoplasme de quelques erythrocytes a ete photographie en lumiere monochromatique a differentes longueurs
d'onde (de 250 m/i jusqu'a 420 m/i) pour avoir un spectre d'absorption continu;
mais, comme l'absorption a certaines longueurs d'onde presentait un interet
particulier, nous avons etudie, pour le cytoplasme de la plus part des erythrocytes, seulement les spectres d'absorption, dans l'u.v., a 260 et 280 ny* (ARN et
globine) et, dans le visible, a 415 mju, (heme).
Les appareils utilises pour cette etude ont ete une lampe au xenon X BO 150
Philips, un monochromateur Zeiss MPQII, un microscope Zeiss avec opttque
Ultrafluar Zeiss, une camera verticale a soufflet avec secteur tournant pour le
calibrage de la densite de la plaque photographique.
La densite optique de chaque plaque a ete evaluee a l'aide d'un densitometre
a cellule au sulfure de Cadmium et d'un enregistreur electronique.
Differentiation des cellules myelo'ides
147
(d) Preparation et electrophorese de Vhemoglobine
Le sang a ete preleve de nos explants et des temoins a l'aide d'une micropipette en verre.
Les erythrocytes ont ete laves plusieurs fois avec du Tyrode, separes par
centrifugation et hemolyses par adjonction d'une egale quantite d'eau distil lee
suivie de congelation.
L'electrophorese de la solution d'hemoglobine ainsi obtenue a ete faite sur
gel d'amidon, avec la methode du tampon discontinu selon Poulik, a pH 8,6.
Le temps de migration etait d'environ une heure a 300 V, 40 mA. Chaque
plaque a ete coloree a la benzidine et ensuite au Noir d'Amido.
La determination quantitative de chaque fraction a ete faite avec le Chromoscan a reflexion Joyce.
RESULTATS
(a) Variation des aires cellulaires et du rapport NjP des erythrocytes des explants
de differents ages de culture et des temoins d'dge correspondant
II est bien connu que les dimensions moyennes des erythrocytes du sang peripherique (et par consequent leur aire erythrocytaire moyenne) diminuent apres
l'eclosion (Sandreuter, 1951), et notre analyse biometrique sur les erythrocytes
d'embryons et de poussins de differents ages ne fait que confirmer ces resultats.
Les erythrocytes de la moelle osseuse montrent, en ce qui concerne leur aire,
un comportement exactement analogue a celui des erythrocytes du sang
peripherique.
Au contraire, il y a des differences sensibles entre les aires erythrocytaires des
explants et celles des temoins (moelle osseuse et sang peripherique) d'age
correspondant (Tableau 1, Fig. 1).
La comparaison des valeurs de l'aire erythrocytaire et du rapport N/P montre
qu'il y a une certain correspondance entre faibles valeurs de l'aire cellulaire et
hautes valeurs du rapport N\P.
Meme dans la valeur du rapport NjP il y a des differences sensibles entre les
erythrocytes des explants et ceux des temoins comme on voit dans le tableau 2
et la fig. 2.
(b) Determination, du point de vue quantitatif, de la valeur de la biosynthese de
Vhemoglobine in vitro
Nous avons aussi etudie du point de vue quantitatif le processus de la biosynthese de l'hemoglobine dans les cellules sanguines des explants et des temoins.
II est bien connu que, dans le cytoplasme des elements de la serie rouge en train
de se differencier de l'erythroblaste basophile a l'erythrocyte mur, la quantite
de TARN diminue jusqu'a disparaitre tandis que la quantite de l'hemoglobine
cytoplasmique s'accroit progressivement.
II est possible d'evaluer ces variations des substances presentes dans le cyto-
—
68,30 ±0,80
68,66±1,18
7emej. de culture
4eme j . de culture
7emej. apres
l'eclosion
50,105 + 1,37
3eme j . apres
l'eclosion
58,51+0-64
51,09 ±0,58
66,88 + 1,40
51,60 ±0,70
66,80 ±1,50
2eme j . apres
l'eclosion
Sang peripherique
Moelle osseuse in vivo
Moelle osseuse cultivee
in vitro
—
0,234 ±0,005
0,211 ±0,043
7eme j. de culture
4eme j . de culture
7eme j . apres
l'eclosion
0,296 ±0,016
3erne j . apres
l'eclosion
0,181 ± 0,006
0,259 ± 0,006
0,246 ±0,013
0,321 ±0,013
0,275 ±0,013
2emej. apres
l'eclosion
0,174 ±0,004
0,306 ±0,018
0,305 ±0,008
13emej. apres
l'eclosion
lOeme j . de culture 15eme j . de culture
0,234 ±0,07
8emej. apres
l'eclosion
H
H
>
c!
3RELLI ET D
19emej.
d'incubation
de la moelle osseuse in vivo et cultivee in vitro
60,35 ±0,87
62,46 ±1,38
52,70 ±0,97
13eme j . apres
l'eclosion
lOemej. de culture 15emej. de culture
56,88 ±0,87
8eme j . apres
l'eclosion
Tableau 2. Valeurs moyennes du rapport NIP dans les erythrocytes du sang peripherique,
Sang peripherique
Moelle osseuse in vivo
Moelle osseuse cultivee
in vitro
19eme j .
d'incubation
Tableau 1. Valeurs moyennes de Vaire erythrocytaire dans le sang peripherique, la moelle osseuse in vivo et cultivee in vitro
4
oo
G. SALV/
RES
Differenciation des cellules myeloides
149
plasme a l'aide des techniques cytospectrophotometrique de l'absorption en
lumiere monochromatique a diflferentes longueurs d'onde (ARN a 260
globine a 280 m/i, heme a 415 m/i).
Eclos
o
1
1
70-
I
m.o.
*x.
60 -
i
50 -
Expl.
v
i
k
1
19
1
1
1
1
1
1
1
1
15
10
21
Jours
Fig. 1. Variations de l'aire erythrocytaire dans le sang peripherique (s.p.), la moelle
osseuse in vivo (m.o.) et la moelle osseuse cultivee in vitro (Expl.).
0,350
0,300
0,250
0,200
0,150
I
1
19
I
I
I
I
I
21
10
15
5
Jours
Fig. 2. Variations du rapport N/P dans les erythrocytes du sang peripherique (s.p.)
de la moelle osseuse in vivo (m.o.) et de la moelle osseuse cultivee in vitro (Expl.).
Le courbe des valeurs moyennes d'absorption a differentes longueurs d'onde
de trois erythrocytes cultives 4 jours est represented dans la fig. 3: on reconnait
bien le spectre typique de l'hemoglobine avec une courbe du type proteique
150
G. SALVATORELLI ET D'AUTRES
dans l'u.v. qui atteint son maximum a 270 mju, un faible pic vers 350 m/f et une
forte absorption entre 400 et 420 m/t (Soret).
La presence de l'ARN cytoplasmique produit, selon sa quantite, ou bien un
pic net a 260 m/i (abondance d'ARN) ou bien un plateau entre 260 et 280 m/t
(ARN peu abondant). II est done possible de reveler la presence d'ARN cytoplasmique par le rapport E 260/E 280.
400
0,300
270
0,200
0,100
I I I I I I I I I I
I J I
240 50 60 70 80 90 300 10 20 30 40 50 60 70 80 90 400 10 20
m/4
Fig. 3. Spectre d'absorption du cytoplasme de trois erythrocytes
differencies in vitro apres 4 jours de culture.
Tableau 3. Absorption cytoplasmique des erythrocytes de la moelle osseuse in vivo
et des explants cultives 4 et 14 jours, a dijferentes longueurs d'onde (A = 260, 280
et 415 mpi)
Nombre
d'erythrocytes
examines
Moelle osseuse
A = 260 m,u A = 280 m/t E260/E280 A = 415 m/t
13
0,203 ±0011 0,228 ±0,008
0,89
0,294 ±0,008
16
0,181 ±0,009 0,181 ±0,012
1,00
0,190 ±0,019
8
6
0,115 ±0,007 0,115 ±0,006
0,186
0,114
1,00
1,63
0,117 ±0,009
0,064
in vivo
Moelle osseuse
cultivee 4j.
Moelle osseuse
cultivee 14 j .
Dans le tableau 3 nous exposons les valeurs moyennes d'extinction cytoplasmique des erythrocytes de la moelle osseuse d'embryons de poulet de 19 jours
d'incubation (temoins) et des erythrocytes qui se sont differencies in vitro a
partir d'explants medullaires cultives 4 et 14 jours.
II est possible de voir que les erythrocytes temoins montrent deux pics: dans
le visible a 415 m/i (heme), dans l'u.v. a 280 m/£ (globine).
Dans les erythrocytes qui se sont differencies in vitro la valeur moyenne de
l'absorption a 415 m/i, apres 4 jours de culture, est moins elevee que dans les
temoins, tandis que dans l'u.v. les valeurs moyennes d'absorption a 260 et
280 m/.i sont plus ou moins correspondantes.
Differentiation des cellules myelo'ides
151
Apres 14 jours de culture le pic a 415 baisse encore tandis que, dans l'u.v.,
une partie des cellules presente un comportement analogue a celui des temoins,
et une partie montre au contraire un pic tres net a 260 m/i (ARN) (Fig. 4).
Dans ce dernier cas meme le rapport N/P montre que les elements sanguins
de la serie rouge ne sont pas tout a fait murs, ce qui explique la presence d'ARN
dans leur cytoplasme.
0,300
0,200
0,100
A = 2 6 0 m fi
A = 2 8 0 m fi
X = 4 1 5 m//
Fig. 4. Valeurs moyennes d'absorption du cytoplasme erythrocytaire des temoins
et des explants apres 4 jours de culture a differentes longueurs d'onde. • , temoins;
D, explants 4 jours de culture; %%, explants 14 jours de culture.
[c) La qualite de Vhemoglobine synthetisee in vitro
Meme si beaucoup de details sont encore mal connus il est possible d'afnrmer
que vers la fin du developpement embryonnaire, au stade ou l'erythropoiese se
localise exclusivement dans la moelle osseuse le comportement electrophoretique
de l'hemoglobine devient egal a celui de l'adulte avec en plus la presence de
faibles quantites de fractions electrophoretiquement lentes qui sont d'ailleurs
destinees a disparaitre deux mois apres l'eclosion (Raunich, Callegarini &
Cucchi, 1966).
Un tableau electrophoretique typique d'un embryon de 19 jours est represente
dans la Fig. 5; on peut voir clairement trois fractions qui presentent une vitesse
differente de migration; la fraction migrant vers l'anode est celle destinee a
disparaitre graduellement pendant le developpement postembryonnaire; les deux
autres fractions qui migrent vers la cathode semblent correspondre aux deux
fractions definitives de l'adulte. En realite, on peut noter la presence de deux
fractions electrophoretiquement lentes mais, dans la plaque etudiee, a cause
de la faible quantite d'hemoglobine presente dans nos explants, nous avons ete
obliges de reduire le temps de migration, ce qui nous a empeches de separer
entre elles ces deux fractions.
L'hemoglobine extraite soit de la moelle osseuse in vivo soit des explants
cultives in vitro, montre le meme comportement electrophoretique que l'hemo-
152
G. SALVATORELLI ET D AUTRES
globine du sang peripherique des temoins d'age correspondant (Fig. 5). Les
valeurs du dosage quantitatif des differentes hemoglobines examinees ont donne
les resultats suivants (Tableau 4). II n'y a done pas de differences significatives
entre le sang peripherique, le sang medullaire des temoins et le sang differencie
dans nos explants; seulement apres 7 jours de culture, on voit une faible
augmentation de la fraction A et une reduction de la fraction B. On ne connait
d'ailleurs pas la vraie signification fonctionelle de cette fraction hemoglobinique
lente qui caracterise la periode fetale (Raunich et ah 1966; Manwell, Baker &
Betz, 1966).
s.p. 19 j .
m.o. 19 j .
expl.
m.o. 19 j .
s.p. 9 j .
Fig. 5. Photographie d'une plaque electrophoretique (coloration au Noir d'Amido
de l'hemoglobine du sang peripherique (s.p.) d'embryons de 9 et de 19 jours
d'incubation, de moelle osseuse de 19 jours d'incubation (m.o.) et d'explants cultives
in vitro pendant 7 jours (expl.). A,B,C, fractions hemoglobiniques separees; o, origine.
Tableau 4. Dosage quantitatif des differentes fractions hemoglobiniques presentes
dans le sang peripherique et la moelle osseuse in vivo et dans les explants cultives
4 et 7 jours
Fractions hemoglobiniques
r
Sang peripherique
Moelle osseuse in vivo
Moelle osseuse cultivee 4 j .
Moelle osseuse cultivee 7 j .
A
11,5%
n,o%
10,0%
14,0%
B
C
52,0%
52,0%
51,0%
47,5%
36,5%
37,0%
39,0%
38,5%
CONCLUSION
Les premiers resultats de la culture organotypique de la moelle osseuse
embryonnaire de poulet ont demontre que l'association du foie embryonnaire
est tres favorable au maintien, in vitro, d'une erythropo'iese comparable a celle
qui se deroule in vivo.
Differentiation des cellules myeloides
153
Les resultats actuels ont mis au point quelques particularities sur le deroulement de l'erythropoiese dans des conditions experimentales.
Dans le poussin nouveau ne, il est bien connu qu'il y a une reduction des
dimensions des erythrocytes par rapport aux erythrocytes embryonnaires, a
cause de l'entree dans la circulation generate d'hematies de dimensions differents
(Sandreuter, 1951). Cette diminution se verifie in vivo soit dans les erythrocytes
du sang peripherique, soit dans les erythrocytes medullaires.
La comparaison entre les aires erythrocytaires in vivo et in vitro montre que
l'aire des erythrocytes des explants et leur valeur N/P sont presque toujours
sensiblement differentes de celles des temoins d'age correspondant.
II n'est d'ailleurs pas possible d'interpreter ces differences car on ne connait
pas encore bien certains details de l'hematopoiese postembryonnaire. En ce qui
concerne la qualite de l'hemoglobine synthetisee in vitro elle est, du point de vue
electrophoretique, equivalente a celle qu'on retrouve in vivo, soit dans le sang
peripherique, soit dans la moelle osseuse.
Chaque fraction montre le meme comportement du point du vue qualitatif
(meme vitesse de migration) et quantitatif (memes valeurs au dosage photoelectrique). Ce n'est que dans les explants cultives pendant plus d'une semaine
qu'on peut voir une legere augmentation de la fraction electrophoretiquement
lente.
Les dosages cytospectrophotometriques de l'hemoglobine et de VARN feraient
croire que la synthese hemoglobinique, du point de vue quantitatif, est ralentie
in vitro.
En effet, si on fait la comparaison entre la densite optique a 260, 280, 415 m/i
du cytoplasme des erythrocytes des explants et des temoins, on voit qu'apres
4 jours de culture, les valeurs d'absorption de Theme (a 415 m/i) dans les erythrocytes des explants sont inferieures a celles des temoins.
Meme dans l'u.v. Fabsorption cytoplasmique des explants est inferieure a
celle des temoins, ce qui est en correlation avec une quantite correspondante
inferieure de globine.
Apres deux semaines de culture ces valeurs baissent encore soit dans le visible
(heme), soit dans l'u.v. (globine).
Le rapport E 260/E 280 est egal ou superieur a 1,0, ce qui nous fait supposer
la presence de faibles quantites d'ARN.
La biosynthese de l'hemoglobine semble ralentie dans nos conditions experimentales, surtout en cultures de longue duree; des observations analogues ont
ete faites sur des erythrocytes qui se sont differencies in vitro dans des explants
d'aire vasculaire de poulet (Raunich & Manelli, 1965 a, b).
Les resultats exposes ne nous permettent pas encore de tirer des conclusions
d'ordre general, mais il nous semble possible de conclure que les techniques
employees dans ces recherches pourront donner prochainement des resultats,
en particulier sur les aspects qualitatif et quantitatif de la differentiation des
elements rouges in vitro.
154
G. SALVATORELLI ET D'AUTRES
RESUME
1. Les erythrocytes differencies in vitro d'explants de moelle osseuse embryonnaire de poulet cultives, en association avec des fragments de foie embryonnaire,
selon la technique de Wolff et Haffen montrent, en comparaison avec les
erythrocytes du sang peripherique et de la moelle osseuse certains particularites
en ce qui concerne leur differentiation morphologique et biochimique.
2. Les valeurs moyennes de l'aire cellulaire et du rapport N/P des erythrocytes des explants sont differentes de celles des temoins (moelle osseuse et sang
peripherique d'age correspondant).
3. La quantite de globine et d'heme presente dans les erythrocytes des explants
est inferieure a celle des temoins in vivo; la presence de faibles quantites d'ARN
dans le cytoplasme des erythrocytes des explants est probablement en relation
avec un ralentissement du process de la maturation erythrocytaire.
4. L'hemoglobine synthetisee in vitro montre le meme comportement electrophoretique que celle des temoins in vivo.
SUMMARY
Observations on the differentiation in vitro of erythropoietic cells
of the chick embryo
1. Erythrocytes differentiated from explants of bone marrow cultured in
association with embryonic chick liver by the technique of Wolff & Haffen show
certain morphological and biochemical differences from those found in peripheral blood or normal bone marrow.
2. The mean values of cell size and N/P ratio of the erythrocytes from explants
are different from those of controls of corresponding age.
3. The globin and haem content of erythrocytes from explants is less than that
of controls. The presence of small quantities of RNA in the cytoplasm of explant erythrocytes is probably related to a retarded maturation process.
4. Haemoglobin synthesised in vitro shows the same electrophoretic behaviour
as that of in vivo controls.
REFERENCES
C , BAKER, C. M. A. & BETZ, T. W. (1966). Ontogeny of hemoglobin in the
chicken. J. Embryol. exp. Morph. 16, 65-81.
RAUNICH, L., CALLEGARINI, C. & Cuccm, C. (1966). Ricerche sopra le emoglobine elettroforeticamente lente durante lo sviluppo embrionale del polio. Ricerca scient. 36 (II-6), 203-6.
RAUNICH, L. & MANELLI, H. (1965a). Le proprieta elettroforetiche delle emoglobine sintetizzate in espianti di area vascolare dell'embrione di polio. Ricerca scient. 35 (ll-b), 31-8.
RAUNICH, L. & MANELLI, H. (19656). Ulteriore contributo allo studio delle propieta elettroforetiche dell'emoglobina sintetizzata in espianti di area vascolare di embrione di polloi.
Ricerca scient. 35 (II-Z>), 277-83.
SALVATORELLI, G. (1966). Observations sur l'hematopo'iese in vitro dans la moelle osseuse
embryonnaire de poulet. C. r. hebd. Seanc. Acad. Sci.. Paris, 262, 666-8.
MANWELL,
Differenciation des cellules myeloides
155
G. (1967 a). Action des extraits de levure et de foie sur l'erythropoiiese medullaire in vitro chez l'embryon de Poulet. C. r. hebd. Seanc. Acad. Sci., Paris 264, 344-7.
SALVATORELLI, G. (19676). L'influence favorable du foie embryonnaire sur l'erythropoiiese
in vitro dans la moelle osseuse de l'embryon de poulet. /. Embryol. exp. Morph. 17, 359-65.
SALVATORELLI, G. & GULINATI, A. (1967). Osservazioni sulla eritropoiesi in cultura organotipica di milza embrionale de polio. Accad. Naz. Lincei. serie VIII, 42, 447-51.
SANDREUTER, A. (1951). Vergleichende Untersuchungen iiber die Blutbildung in der Ontogenese von Haushuhn (Gallus gallus L.) und Star (Sturnus vulgaris L.). Ada anatomica, 11,
1-72.
WOLFF, Et. (1961). Utilisation de la membrane vitelline de l'oeuf de poule en culture organotypique. Devi. Biol. Med. 10, 463-72.
WOLFF, Et. & Haffen, K. (1952). Sur une methode de culture d'organes embryonnaires in
vitro. Texas Rep. Biol. Med. 10, 463-72.
SALVATORELLI,
(Manuscrit regu le 20 juillet 1967)