/ . Embryol. exp. Morph. Vol. 18, 2, pp. 227-57, October 1967
With 1 plate
Printed in Great Britain
227
Etude cytologique des
premiers stades du developpement de quelques
hybrides letaux d'Amphibiens Urodeles
Par VINCENT FERRIER1
Laboratoire de Biologie generate, Faculte des Sciences, Toulouse
INTRODUCTION
L'hybridation interspecifique chez les Urodeles du genre Triturus a. donne
lieu depuis longtemps a de nombreux travaux qui ont etabli la viabilite de
plusieurs types d'hybrides, meme si leur morphologie et leur differentiation
sexuelle presentent ulterieurement des anomalies (Pariser, 1932,1936; Fischberg,
1948; Benazzi, 1956, 1957). Au contraire, des oeufs de Triturus fecondes par du
sperme de Salamandra ne se sont pas developpes au-dela du stade de la blastula
agee ou de la tres jeune gastrula (Schonmann, 1938; Baltzer & Schonmann,
1951). Cependant, des greffons preleves sur ces blastulas letales et transplants
sur des germes normaux de Triturus ont survecu assez longtemps pour se
differencier en organes fonctionnels, bien que des necroses aient elimine une
partie des cellules hybrides.
D'autres exemples d'hybridation intergenerique letale accompagnee d'aneuploidie et de polyploidie ont ete signales chez des hybrides entre les genres
americains et japonais Triturus, Taricha et Diemyctilus autrefois reunis sous
le meme vocable Triturus (Brandom, 1962).
Comme le remarque Brandom (1960), le nombre tres faible de caracteres
mendeliens simples complique les experiences sur la balance genique chez
les Urodeles. L'hybridation par fecondation artificielle, combinee avec l'heteroploiidie experimentale, constitue cependant une bonne methode d'approche du
probleme des roles respectifs du noyau et du cytoplasme dans le developpement
et la differentiation cellulaire.
La transplantation de tissus letaux hybrides sur des germes normaux contribue d'autre part a circonscrire le stade et le niveau d'apparition de la letalite
des hybrides non viables. Dans cette perspective nous avons realise de nouvelles
combinaisons intergeneriques chez les Urodeles. Les oeufs etaient fournis par
Pleurodeles waltlii Michah.; le sperme heterologue provenait des genres suivants
dont les individus ont ete recueillis dans la region de Toulouse: Euproctus asper
1
Adresse de Vauteur: Laboratoire de Biologie g&ierale, Faculte des Sciences, 118, route
de Narbonne, 31-Toulouse, France.
228
V. FERRIER
Duges, Triturus helveticus Raz., Salamandra saJamandra L. La combinaison
Pleurodeles $ x Ambystoma mexicanum $ a ete egalement realisee. L'interet de
ces experiences est renforce par la diversite remarquable de certains caracteres
phenotypiques du genre Pleurodeles d'une part, et des genres paternels d'autre
part.
Le travail ci-dessous a pour objet l'etude du developpement embryonnaire
des hybrides realises, deja mentionnes dans une note preliminaire (Beetschen &
Ferrier, 1964).
METHODES
1. Technique operatoire
Les oeufs vierges de Pleurodeles waltlii sont obtenus en grand nombre sans
qu'il soit necessaire de tuer les femelles, dont la ponte est obtenue en moyenne
36 h apres une injection intramusculaire de 200 UI d'hormone gonadotrope
hypophysaire (Choay). Les cordons muqueux renfermant les ceufs sont recueillis
a sec et enduits d'une suspension spermatique plus ou moins concentree selon
les cas, obtenue a partir des canaux deferents dilaceres dans de l'eau de puits.
II n'est pas necessaire de bromurer le sperme (Bataillon & Tchou-Su, 1929), ni
meme de faire la suspension spermatique dans un liquide physiologique. Meme
sans ces conditions le sperme conserve son pouvoir de penetration 2 h apres
son prelevement dans les canaux deferents. Les oeufs sont rinces et recouverts
d'eau quand apparaissent les points de penetration des spermatozoides dans
la calotte pigmentaire, apres un temps variable selon l'espece paternelle consideree (5 a 20 min).
Des fecondations-temoins realisees avec le sperme de Pleurodele ont permis
d'obtenir des developpements tout a fait normaux, mais le pourcentage des
oeufs insemines n'atteint pas 100 %.
Les observations ont ete faites a 18-20 °C. La chronologie de la fecondation et
de la segmentation chez les differents hybrides realises est comparee aux donnees
de Labrousse (1959) chez le Pleurodele. Chez cet animal, a 18 °C, remission
du second globule polaire marquant l'achevement de la deuxieme division de
maturation intervient 1 h a 1 h 15 apres la penetration spermatique. Les deux
pronuclei entrent en contact vers la troisieme heure. L'amphiaster s'individualise vers 3 h 15. La formation du fuseau et la fusion des deux pronuclei se
produisent entre 5 h et 5 h 15. La premiere division de segmentation se deroule
entre 5 h 20 et 5 h 45. Le premier clivage est termine vers 6 h.
2. Techniques histologiques
Les oeufs et embryons sont fixes au melange de Zenker acetique pendant une
heure environ. Apres inclusion dans la paraffine, ils sont debites en coupes
minces de 7 a 10 /* d'epaisseur. L'etude cytologique est faite apres coloration
systematique au vert de methyle-pyronine, precedee eventuellement d'un
traitement a la RNase. Quelques preparations ont ete colorees selon la technique
de Biondi (Romeis, 1948).
Hybrides letaux d'amphibiens
229
RESULTATS EXPERIMENTAUX
A. Pleurodeles waltlii $ x Euproctus asper $
(1) Aspect exterieur des germes. Rythme de developpement
Le pouvoir fecondant des spermatozoides est assez faible, d'apres la duree
necessaire a leur penetration, en petit nombre, meme avec du sperme concentre.
L'adjonction a la suspension spermatique de NaBr a 3 % selon la technique de
Bataillon & Tchou-Su (1929) n'ameliore pas ce pouvoir fecondant. Les premiers
points de penetration marquant l'insemination apparaissent dans les vingt
a trente minutes suivant l'application de sperme sur les oeufs. Le retard peut
atteindre une heure a une heure et demie. L'insemination s'accompagne d'une
reaction pigmentaire de l'oeuf tres accentuee autour des points d'entree, marques
par des taches tres foncees, aureolees, visibles a l'oeil nu et qui se creusent au
bout de quelques minutes d'une profonde depression. Ces taches se retractent
ensuite et s'estompent dans un delai de quatre a cinq heures, au debut de la
segmentation, mais la repartition du pigment a la surface des germes demeure
bouleversee et souvent anarchique.
Les premiers clivages apparaissent souvent en retard par rapport a la table
de developpement de Gallien & Durocher (1957); ils sont tous d'emblee
irreguliers. La segmentation progresse anarchiquement. Elle conduit souvent
a des blastulas partielles, a blastomeres geants, notamment dans l'hemisphere
vegetatif. Dans quelques cas la cytodieresenefaitque s'ebaucherpour s'estomper
rapidement; l'oeuf est active, mais il demeure alors indivis.
Le developpement se bloque dans la plupart des cas au stade de la blastula
agee: les embryons survivent ainsi une vingtaine d'heures puis se cytolysent.
Certains germes parviennent a gastruler, sans depasser toutefois le stade de la
formation de l'encoche blastoporale.
(2) Etude histologique
(a) De Vinsemination a Vamphimixie. L'oeuf reagit rapidement et violemment
a la penetration des spermatozoides. Autour du point de penetration se produisent de violents remaniements pigmentaires decelables sur coupe: le pigment
s'enfonce irregulierement dans les couches plus profondes du cortex pour y
subsister en trainees grossierement paralleles a la surface pendant deux heures.
A leur niveau on peut aussi observer des flaques ribonucleiques intensement
pyroninophiles, traduisant des perturbations dans le gradient ribonucleoproteique de l'oeuf. En meme temps, autour des points de penetration, une substance
pyroninophile d'epaisseur variable (10 a 50 fi) s'etale a la surface de l'oeuf,
y compris dans 1'hemisphere vegetatif si des spermatozoides ont penetre a ce
niveau. Elle y subsiste 2 a 3 h apres l'insemination pour disparaitre ensuite.
Apres action de la ribonuclease, cette substance conserve sa pyroninophilie:
il ne s'agit done pas d'ARN, mais plus probablement de polysaccharides.
15
JEEM l8
230
V. FERRIER
Ces reactions sont temporaires; peu a peu le cortex ovulaire retrouve un
aspect normal. Au stade de Pamphimixie, qui survient dans un delai de 5 a 6 h,
il y a regulation des perturbations affectant les gradients vitellin, ribonucleoproteique et pigmentaire.
Dans la premiere heure qui suit l'insemination effective, traduite par l'apparition des taches de penetration, aucune anomalie apparente n'affecte l'aspect
Fig. 1. Pleurodeles ? x Euproctus $. 3 h. Pronucleus c? et sa trainee spermatique.
D6doublement precoce du spermaster.
Fig. 2 A et B. Pleurodeles ? x Euproctus S. 6 h. Rapprochement des pronuclei ? et <?.
Multiplication anarchique de l'amphiaster.
•et le cheminement des tetes spermatiques. Leur transformation en pronuclei
males intervient a partir de la deuxieme heure. A partir de ce stade, les spermasters ont une tendance au dedoublement precoce. Entre 2 et 5 h, la plupart
des pronuclei $, y compris les pronuclei surnumeraires, possedent un spermaster
Hybrides letaux cTamphibiens
231
en voie de division ou deja dedouble, meme lorsqu'ils sont encore tres eloignds
du pronucleus $. Les asters issus de cette bipartition anticipee sont generalement
vigoureux et demeurent longtemps reunis l'un a l'autre par une desmose
intensement pyroninophile (Fig. 1).
D'autre part, on peut observer frequemment a partir de la quatrieme heure,
dans certains pronuclei <J, de nombreuses granulations pyroninophiles; dans
AS/t
Fig. 3
Fig. 4
Fig. 3. Pleurodeles ? x Euproctus $. 8 h. lere division de segmentation aberrante
(s.: ebauche du ler sillon de segmentation).
Fig. 4. Pleurodeles ? x Euproctus <?. 6 h. Mitose spermatique pluricentrique.
de tels pronuclei, la chromatine se concentre souvent au pole voisin du spermaster. II s'agit d'une accumulation pathologique ribonucleique comme le
prouve la disparition de la pyroninophilie apres action de la ribonuclease.
(b) De Vamphimixie au debut de la segmentation. Pendant que se rapprochent
les pronuclei dans des delais correspondant a ceux de la chronologie de Labrousse
(1959), le rythme de division des spermasters s'accelere. Au lieu de l'amphiaster
15-2
232
V. FERRIER
habituel, les pronuclei accoles, puis le noyau de fecondation s'entourent de
systemes asteriens, multiples et complexes, qui compromettent le deroulement
normal de la premiere division de segmentation (Figs. 2, 3). Tirailles entre les
trois, quatre ou cinq poles asteriens, ou meme davantage, les chromosomes se
repartissent anarchiquement; ils constituent ensuite de multiples caryomeres
plus ou moins etires entre les asters.
\ ^
Fig. 5. Pleurodeles ? x Euproctus 3. 8 h. Germe insegmente.
Systeme asterien complexe, multiples caryomeres.
Si certains pronuclei S surnumeraires degenerent rapidement, d'autres,
nombreux, s'engagent au contraire dans des cycles de division perturbes par
la meme activite anarchique de leurs spermasters qui conduit a des mitoses
multipolaires complexes (Fig. 4).
La multiplication aberrante des centres et Farythmie des cycles asteriens
et chromosomiques perturbent la formation du premier sillon de segmentation,
souvent retardee. Sur 10 ceufs analyses en coupes seriees, 5 etaient encore
insegmentes 8 heures apres la penetration spermatique bien qu'ils fussent le
siege d'une intense activite asterienne (Fig. 5). Sur les 5 autres, 3 presentaient
233
Hybrides letaux d'amphibiens
8A
8C
Fig. 6. Pleurodeles %x Euproctus <?. 17 h. A. Blastula atypique. B. Detail d'un
blastomere animal: chromosomes metaphasiques et noyau quiescent geant au sein
d'un reseau asterien complexe.
Fig. 7. Pleurodeles $ x Euproctus $. 21 h 30. Noyau geant de blastula atypique.
Asters multiples.
Fig. 8. Pleurodeles ?x Euproctus $. Noyaux contenant des granulations ribonucl&ques. A. Noyau de blastula agee de 17 h. B. Noyau de blastula agee de 21 h.
C. Noyau geant de blastula agee de 22 h; nucleoles multiples (GR: granulations
ribonucl6iques; iV: nucleoles).
234
V. FERRIER
au meme moment des clivages aberrants, isolant des blastomeres anuclees
dont certains comportaient des systemes asteriens sans chromosomes.
(c) Blastulation. La cytodierese progresse de plus en plus irregulierement
pendant la blastulation. Tant dans l'hemisphere animal que dans Fhemisphere
vegetatif, des macromeres voisinent avec des micromeres. De vastes territoires
ou meme la totalite de l'hemisphere vegetatif demeurent parfois insegmentes.
Comme pour les premiers stades, cette anarchie de la cytodierese est liee
a une hyperactivite des centres cellulaires. De nombreux blastomeres contiennent des systemes asteriens complexes en chainettes ou fermes sur eux-memes
(Fig. 6). Les mitoses multipolaires sont frequentes et les fuseaux de division
souvent malformes et tordus, notamment dans Fhemisphere vegetatif. Dans
ces conditions, la montee anaphasique des chromosomes est atypique; de
frequents collages et des ponts chromatiques tres etires entre les poles sont
observables.
La taille tres variable des noyaux traduit une aneuploidie secondaire consecutive aux troubles de la centrodierese. Certains blastomeres contiennent
de multiples micronoyaux; d'autres au contraire, et surtout les territoires
insegmentes, possedent des noyaux geants atteignant 100 a 120 fi de diametre.
De tres nombreux asters flanquent souvent ces noyaux geants endopolyploides
(Fig. 7). Nous avons note une anomalie rappelant celle qu'a observee Brachet
(1954) dans les noyaux de blastulas hybrides letales chez les Anoures. Certains
noyaux de blastulas agees d'une quinzaine d'heures ou plus contiennent des
granulations intensement pyroninophiles, de nature ribonucleique car elles
disparaissent apres action de la RNase; elles apparaissent plus precocement,
sont plus volumineuses et de forme plus irreguliere que les nucleoles normaux
(Fig. 8). Cette accumulation precoce intranucleaire d'ARN traduit vraisemblablement une perturbation du metabolisme des acides nucleiques chez ces
embryons hybrides, comme dans le cas etudie par Brachet (1954). La plupart
des embryons ne depassent pas le stade de la blastula agee. Le blocage intervient
generalement a partir de la vingt-cinquieme heure, mais la cytolyse ne s'empare
que progressivement du germe (Planche 1, fig. D). Dans plusieurs cas, quarantecinq heures apres 1'insemination, des signes d'activite mitotique sont encore
visibles, sans qu'aucun symptome de gastrulation n'apparaisse.
Des regions entieres, notamment rhemisphere vegetatif, se chargent anormalement en ARN. De nombreux blastomeres se detachent de la voute et des
parois blastoceliennes et comblent partiellement la cavite de segmentation. Les
premieres vacuoles de cytolyse apparaissent de preference dans la region
animale, puis se generalised a tout l'embryon. II est remarquable cependant
que la division anarchique des centres se poursuit tres tardivement: certains
noyaux degenerescents de blastulas bloquees agees de quarante-cinq heures sont
encore pourvus de multiples asters.
Quelques germes seulement parviennent a ebaucher la levre dorsale du
blastopore, mais le materiel invagine ne s'organise pas en feuillet. Seules
Hybrides letaux d'amphibiens
235
quelques trainees pigmentaires suggerent les mouvements d'invagination.
Aucun germe ne franchit ce stade.
(3) Discussion
Les spermatozoiides d'Euprocte exercent un certain pouvoir lytique sur le
cytoplasme de l'ceuf de Pleurodele, qui se manifeste par de profonds bouleversements des gradients pigmentaire et ribonucleoproteique. Ces bouleversements
sont apparemment reversibles mais ils ne sont peut-etre pas sans consequences
sur la suite du developpement.
La multiplication exuberante des centres cellulaires est cependant la cause
essentielle du blocage du developpement par les perturbations qu'elle entraine
dans le clivage et la repartition des chromosomes lors des cycles mitotiques.
L'origine spermasterienne des asters multiples observes au cours de la segmentation est certaine.
Bataillon (1929 a, b) a decrit dans ses experiences de parthenogenese traumatique sur les oeufs d'Anoures la formation de cytasters secondaires issus de
monasters d'activation et exceptionnellement d'amphiasters synthetiques mais
asymetriques, lors de l'effacement de la membrane nucleaire du pronucleus
femelle. Mais dans ces cas c'est precisement la caryocinese qui anticipe sur la
centrodierese.
Nous n'avons jamais observe de telles images. Au contraire, dans la combinaison presente, les asters se multiplient de maniere anarchique des le debut
de raccolement des pronuclei, avant meme leur fusion. La presence de complexes
asteriens autour de certains pronuclei <$ surnumeraires confirme l'origine
spermasterienne de ces centres.
Dans les conditions normales de polyspermie, comme c'est le cas chez
la majorite des Urodeles, les pronuclei surnumeraires degenerent des l'amphimixie. Tout au plus parviennent-ils a individualiser des chromosomes prophasiques, mais leur aster ne se divise jamais. Ceci se produit cependant dans
certaines conditions experimentales, par exemple dans des fragments andromerogones de Toeuf de Triton (Fankhauser, 1934), ou encore dans des oeufs
d'Axolotl normalement fecondes mais ayant subi un traitement thermique qui
elimine le pronucleus $ (Rott, 1965). Dans ces deux cas, les pronuclei $ individualisent des chromosomes qui se repartissent le plus souvent sur des appareils
cinetiques aberrants (mitoses pluripolaires, monasters, mitoses anastrales).
Selon Fankhauser, le noyau amphimixique aurait un pouvoir inhibiteur sur
Factivite mitotique potentielle des pronuclei surnumeraires (1934). Selon Rott
(1965), c'est la presence d'un pronucleus $ qui conditionne le comportement
normal de ces pronuclei surnumeraires bien qu'elle ne precise pas si leur
degenerescehce intervient ou non dans les germes d'Axolotl ayant subi un
traitement thermique et chez lesquels le noyau d'amphimixie diploide provient
de la fusion de 2 pronuclei <$.
D'autre part, il a ete amplement demontre (Fankhauser, 1948; Bataillon,
236
V. FERRIER
19296) que l'etat du cytoplasme ovulaire, notamment son degre de maturite,
conditionne etroitement revolution des pronuclei 3 et de leur spermaster. Dans
le cas du croisement Pleurodeles x Euproctus, l'activite anarchique des centres
suggere la suppression d'une double regulation qui existerait dans l'oeuf a l'etat
normal. La premiere entrainerait normalement le spermaster du pronucleus
S fecondant sur la voie de l'amphiaster regulier; la seconde conduirait au
contraire les pronuclei surnumeraires sur la voie de la regression. II est actuellement impossible de savoir par quels effecteurs cette regulation s'exercerait:
s'agit-il d'une influence du pronucleus $ sur l'ensemble des pronuclei, de celle
du noyau de fecondation sur les pronuclei surnumeraires, ou encore de rinfluence
directe du cytoplasme sur les centrosomes ou indirecte par l'intermediaire du
pronucleus <J? L'elimination ou l'inactivation du pronucleus $ des germes
hybrides Pleurodeles x Euproctus peraiettrait de preciser la place de celui-ci
dans cette regulation. Quant au role du noyau de fecondation, on peut constater
que l'arythmie se manifeste souvent avant l'accolement des pronuclei et qu'elle
se prolonge tout au long du developpement jusqu'a son blocage, y compris
d'ailleurs dans les territoires deja atteints par la cytolyse et ou toute activite
nucleaire a deja cesse.
Ces faits evoquent vraisemblablement une inadequation entre les spermasters
et les generations successives d'asters d'Euprocte d'une part, et le cytoplasme
de Pleurodele d'autre part: celui-ci n'exerce plus d'action inhibitrice sur les
systemes asteriens etrangers, que cette action soit due au cytoplasme ovulaire
lui-meme ou au fait qu'il ne transmet plus les influences emanant du noyau
ovulaire ou du syncaryon. Toutes les images d'amphimixie observees montrent
sans exception des appareils cinetiques aberrants. II reste cependant que ce
dereglement asterien n'est plus generalise par la suite a toutes les cellules du
germe. Plusieurs blastulas contiennent des mitoses normales, ce qui laisse
supposer que des facteurs de regulation interviennent ulterieurement.
Quoiqu'il en soit, l'activite irreguliere des centres perturbe profondement
la cytodierese des le debut du developpement. Le clivage normal depend des
rapports multiples liant les differents constituants de l'oeuf feconde et de leur
evolution: le pronucleus & le pronucleus $, le noyau de fecondation, l'emplacementet la forme de 1'amphiaster (Willier, Weiss & Hamburger, 1956). L'introduction des spermatozoides etrangers dans le cytoplasme de l'oeuf perturbe ces
rapports. En particulier les systemes asteriens complexes exercent vraisemblablement sur le cortex de l'oeuf des tensions anarchiques qui compromettent la
regularity du clivage. Par ailleurs les bouleversements provoques dans le cortex
animal par la penetration spermatique, bien qu'apparemment reversibles,
peuvent compromettre l'aptitude a la gelification du cytoplasme, necessaire a
la formation des sillons de division.
La repartition anarchique des chromosomes sur les appareils cinetiques
aberrants entraine une aneuploidie diversified selon les blastomeres. On sait
qu'une telle aneuploidie est un facteur de letalite plus ou moins precoce
Hybrides letaux d'amphibiens
237
(Beetschen, 1960; Briggs, Signoret & Humphrey, 1964). Une formule chromosomique relativement equilibree est indispensable au developpement normal.
Une telle aneuploidie compromet vraisemblablement le metabolisme normal
des acides nucleiques ainsi que le suggere l'accumulation anormale et precoce
d'ARN dans certains noyaux. Dans ces conditions on concoit que la letalite
survienne lors de la gastrulation, stade critique dans la synthese des proteines.
II n'est pas demontre que des noyaux hybrides diploiides et equilibres ne pourraient pas assurer un developpement plus pousse dans le cas de ce croisement.
B. Pleurodeles wait Hi $ x Triturus helveticus <$
(1) Aspect exterieur des embryons. Rythme de developpement
Le sperme de Triton palme presente in vitro vis-a-vis des oeufs de Pleurodele
un pouvoir fecondant tres eleve, superieur a celui du sperme de Pleurodele
lui-meme. Les spermatozoiides criblent les oeufs en quelques minutes si le
sperme n'est pas tres dime, leur penetration est rapidement suivie de reactions
pigmentaires violentes, accompagnees souvent d'extrusions cytoplasmiques,
notamment dans le region du pole animal.
Une heure apres la penetration spermatique la plupart des oeufs montrent
une reaction pigmentaire bouleversee. Variable selon les pontes, le pourcentage
de clivages est cependant a l'inverse du degre de polyspermie, en raison de la
toxicite probable du sperme de Triton palme a l'egard de l'oeuf de Pleurodele.
Beaucoup d'oeufs se lysent avant le premier clivage ou au cours des suivants.
La segmentation est toujours anarchique et un tout petit nombre de germes
(0,5 %) parviennent seuls a gastruler partiellement (Tableau 1).
Tableau 1. Developpement des hybrides Pleurodeles waltlii $ x Triturus
helveticus $
No.
CEufs (;lives
CEufs pondus CEufs actives
des r
1
i
r
series nombre % nombre 0/
nombre %
/o
I
IIA
IIB
III
Total
119
89
33
146
387
100
100
100
100
100
102
74
27
125
328
Blastulas
A
A
A
85,7
83,1
81,8
85,6
84,7
98
6
15
31
150
82,3
6,7
45,4
21,2
38,7
Gastrulas
A
A
r
nombre
%
nombre
%
4
0
4
15
23
3,4
0
12,1
10,3
5,9
0
0
0
2
2
0
0
0
1,4
0,5
Les lots IIA et IIB proviennent d'oeufs fecondes avec des spermes differemment concentres,
le sperme IIA 6tant plus concentre que le sperme IIB.
(2) Etude histologique
Dans les premieres minutes qui suivent la penetration des spermatozoiides,
de vastes entonnoirs bouleversent la structure du cytoplasme cortical jusqu'a
238
V. FERRIER
300 ju, de profondeur et marquent leur trajet (Planche 1, fig. C). Le pigment
a tendance a s'effondrer irregulierement dans les couches plus profondes de
l'ceuf. Dans les zones s'etendant autour des points de penetration, la membrane
cytoplasmique devient imprecise; les plaquettes vitelhnes abandonnent le cytoplasme cortical pendant que la charge en ARN augmente au depens des couches
sous-jacentes; la pyroninophilie de celles-ci s'estompe en effet. De frequentes
extrusions cytoplasmiques et vitellines, non limitees aux points de penetration
des spermatozoides, s'epanchent sous le chorion; elles suggerent une modification de la structure du 'coat', notamment une diminution de sa rigidite
(Planche 1, fig. A).
Dans plusieurs cas, apres une heure de developpement, aucun gradient
ribonucleique ni vitellin n'est plus reconnaissable (Planche 1, fig. B). La repartition des plaquettes vitelhnes est anarchique. Des plages cytoplasmiques bourrees
de volumineuses granulations ribonucleiques de plusieurs microns d'epaisseur
voisinent avec d'autres plages totalement depourvues d'ARN. Ces oeufs ont
ete manifestement le siege de brassages cytoplasmiques profonds et de reactions
chimiques pathologiques, suggerees par la presence de nombreuses vacuoles de
cytolyse apparaissant des la premiere heure dans le cytoplasme cortical. De tels
oeufs ne se seraient vraisemblablement pas segmentes.
Tous les oeufs ne reagissent pas aussi violemment a la penetration spermatique;
3 a 5 h apres celle-ci, ces bouleversements structuraux peuvent s'estomper s'ils
n'ont pas ete trop violents au depart. Les rares embryons qui parviennent
a ebaucher leur gastrulation proviennent probablement de tels oeufs. L'intensite
variable de ces reactions depend a la fois du lieu de penetration des spermatozoides et du degre de polyspermie: les oeufs les plus alteres sont en effet ceux
dans lesquels un ou plusieurs spermatozoiides ont penetre par la tache de
maturation ou a proximite.
Nous n'avons pas observe d'anomalie nucleaire significative. La deuxieme
PLANCHE 1
Fig. A. Pleurodeles $ x Triturus <?. 1 h. Penetration d'un spermatozoiide dans la region
du pole animal. Volumineuse extrusion vitelline. (JSP: tete spermatique; EV: extrusion
vitelline; CH: chorion.)
Fig. B. Pleurodeles $ x Triturus 3-1 h 30. Disorganisation des gradients vitellin et ribonucl&que
dans la zone de maturation. Concentration ribonucleique en flaques intens&nent pyroninophiles (R). Vacuolisation du cortex.
Fig. C. Pleurodeles $ x Triturus <$. 1 h. Bouleversement de la region du pole animal. Vaste
entonnoir de penetration d'un spermatozoiide.
Fig. D. Pleurodeles QxEuproctus <?. 45 h. Blastula bloque'e. (V: vacuoles de cytolyse; N:
noyau geant.)
Fig. E. Pleurodeles $ x Salamandra 3. 8 jours. Embryons hypomorphes. Deficience somitique
unilaterale droite. 1: coupe transversale au niveau abdominal. 2: coupe transversale au
niveau troncal. (TN: tube neural; CH: chorde; S: somite; TD: tube digestif; A: anus lateral;
O: oedeme.)
/. Embryol. exp. Morph., Vol. 18, Part 2
V. FERRIER
PLANCHE 1
facing p. 238
Hybrides letaux d'amphibiens
239
division de maturation, la migration des pronuclei $ et $ et Tamphimixie se
deroulent dans les delais normaux du developpement du Pleurodele.
Les spermasters et l'amphiaster ne manifestent pas l'hyperactivite anarchique
decrite dans la combinaison precedente; la premiere division de segmentation
est normale. Par la suite les aberrations de clivage ne sont pas accompagnees
d'anomalies chromosomiques telles que les eliminations a la plaque ou les
ponts anaphasiques. Nous ne mentionnerons que la presence de quelques
noyaux polyploides geants, pourvus de multiples nucleoles et situes dans des
territoires insegmentes de quelques blastulas bloquees.
(3) Discussion
La soudainete et la violence des reactions cytoplasmiques a la penetration
spermatique suggerent un pouvoir lytique du spermatozoide de Triton palme
sur l'oeuf de Pleurodele, et plus particulierement sur le cortex. L'effondrement
du pigment en profondeur, les extrusions vitellines, les brassages cytoplasmiques
perturbent sumsamment l'organisation generale de l'oeuf pour inhiber le clivage,
sinon son deroulement normal. En outre, les bouleversements du gradient
ribonucleoproteique ne sont certainement pas sans influence sur l'apparition
du pouvoir inducteur et de la competence a la gastrulation. Une analyse du
metabolisme de ces oeufs peraiettrait de mieux situer le pouvoir toxique que
manifeste le sperme du Triton palme sur les oeufs du Pleurodele.
C. Pleurodeles waltlii $ x Ambystoma mexicanum $
Le sperme d'Axolotl manifeste a l'egard des oeufs de Pleurodele un pouvoir
de fecondation eleve: dans le quart-d'heure qui suit l'application de la suspension
spermatique, 85 a 90 % des oeufs selon les series sont penetres. Cette penetration
se manifeste par des bouleversements pigmentaires et cytoplasmiques semblables
a ceux que provoque le sperme de Triton palme: larges aureoles, depressions
plus ou moins profondes, extrusions cytoplasmiques plus ou moins volumineuses.
Ces phenomenes s'estompent dans la deuxieme heure qui suit. Mais le developpement se bloque extremement vite: aucun ceuf ne se clive, excepte quelques
rares cas d'amorce de clivage, d'ailleurs atypique. Six a sept heures apres la
penetration spermatique, la cytolyse est generale.
L'etude histologique ne revele pas d'anomalie significative quant a l'achevement de la deuxieme division de maturation et la formation des pronuclei
a Tissue de la premiere heure. L'accolement des pronuclei $ et S se realise vers
3 h 30 et les images d'amphimixie sont observees a partir de 4 h 30. Nous
n'avons vu qu'une seule fois un amphiaster typique: celui-ci ne se forme
generalement pas, ni le fuseau de premiere division de segmentation. Dans
aucun des oeufs analyses de 4 h a 7 h 30, le noyau de fecondation n'avait
individualise ses chromosomes, ce que realisent par contre plusieurs pronuclei
<£ vers 5 h sans toutefois s'engager plus avant dans un cycle mitotique. Leurs
spermasters ne se divisent pas. Tous les oeufs arretent la leur evolution. Les
240
V. FERRIER
premieres vacuoles de cytolyse apparaissent des 5 h, d'abord dans le cortex
animal, pour se generaliser ensuite rapidement.
Le sperme d'Axolotl exerce done une action toxique sur les ceufs de Pleurodele,
encore plus violente que celle du sperme de Triton palme, suffisante pour
bloquer tres precocement le developpement et qui se manifeste notamment
par l'inhibition du clivage et de la premiere division de segmentation.
D. Pleurodeles waltlii $ x Salamandra salamandra <$
(1) Phenomenes externes et rythme de developpement
Environ 90 % des ceufs sont penetres par le sperme etranger dans des delais
variant de 15 a 30min. Les spermatozoiides sont actifs et si la dilution du
sperme n'est pas suffisante, la polyspermie devient excessive: jusqu'a vingt
spermatozoiides peuvent alors penetrer dans un seul oeuf. De larges taches
circulaires aureolees marquent les points de penetration; elles s'estompent
en cours de la deuxieme heure. Les reactions lytiques observees dans les trois
croisements precedents ne se produisent pas avec la meme intensite si la polyspermie n'est pas trop elevee. Le tableau 2 indique les pourcentages de developpement calcules sur 12 series realisees a partir des pontes de 12 femelles differentes.
— 91 % des ceufs en moyenne sont insemines.
— 72 % en moyenne (de 47,2 a 91,4 % selon les series) se clivent; les premiers
clivages apparaissent dans un delai normal, mais 30 a 50 % d'entre eux selon
les series sont irreguliers.
— 47% en moyenne (de 10,3 a 75,7% selon les series) blastulent; la segmentation est souvent anarchique et de nombreuses blastulas presentent des
territoires insegmentes notamment dans l'hemisphere vegetatif.
— 33 % en moyenne (de 5,6 a 69,6 % selon les series) parviennent au stade
gastrula avec une forte tendance a l'exogastrulation suivie generalement du
blocage du developpement et de la cytolyse de l'embryon.
— 15 % en moyenne (de 0 a 39,3 % selon les series) neurulent ou presentent
des ebauches de neurulation atypique limitees a la formation de la plaque
medullaire ou des bourrelets neuraux.
— 5 % en moyenne (de 0 a 34,6 % selon les series) parviennent a un age plus
avance evoquant les stades du bourgeon caudal. De tels embryons d'aspect
tres vegetalise, sont microcephales, microphtalmes, tres hypomorphes. Leur
developpement est toujours fortement retarde par rapport a la table chronologique du Pleurodele et ils n'atteignent jamais le stade morphologique de
l'eclosion.
Cependant, pour 3 des series actuellement realisees dans cette combinaison
intergenerique, le developpement s'est poursuivi bien au-dela des stades
habituellement atteints par les hybrides letaux, atteignant les stades larvaires.
Plusieurs des 30 individus appartenant a cette categorie se sont meme metamorphoses ; ceux de la serie V ont atteint la maturite sexuelle et presentent les
3379
Totaux
xrv
XV
XVI a
b
XVII
XVIII
No.
j
100
/o
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
0/
CEufs pondus
109
280
161
95
135
41
534
681
444
320
257
162
160
II
V
VI
VII
VIII
IX
XI
No.
des
series
2422
93
256
98
80
112
33
402
432
379
151
135
133
118
71,8
85,3
91,4
60,8
84,2
83
80,5
75,3
63,4
85,4
47,2
52,5
82,1
73,7
(Eufs clives
-»
v
,
o/
No.
/o
1487
72
212
57
20
99
28
213
359
169
33
90
91
44
No.
A
47,6
/o
66
75,7
35,4
21
73,3
68,3
39,9
52,7
38,1
10,3
35
56,2
27,5
0/
Blastulas
1105
20
195
47
16
76
21
135
253
149
18
87
60
28
No.
A
32,7
18,3
69,6
29,2
16,8
56,2
51,2
25,3
37,1
33,5
5,6
33,8
37
17,5
/o
Gastrulas
505
0
110
14
2
20
9
59
115
117
0
25
24
6
No.
A
14,9
/o
0
39,3
8,7
2,1
14,8
21,9
11,1
16,9
26,3
0
9,7
14,8
3,7
0/
Neurulas
* Ces 30 individus sont en fait de faux hybrides gynogenetiques (voir texte).
91,4
3090
o/
/o
97,2
96
86,9
91,6
91,8
87,8
99
97,2
90,3
80,3
76,3
91,9
83,7
No.
A
106
269
140
87
124
36
529
662
401
257
156
149
134
t
(Eufs fecondes
159
0
97
0
0
6
6
15
17
18
0
0
0
0
No.
f
A
5
0
34,6
0
0
4,4
14,6
2,8
2,5
4
0
0
0
0
%
Embryons:
stades 22 a 28
Tableau 2. Developpement des hybrides Pleurodeles waltlii $ x Salamandra salamandra
t
30
0
6
0
0
0
0
15
9
0
0
0
0
0
No.
A
0,9
0
2,1
0
0
0
0
2,8
1,3
0
0
0
0
0
/o
Larves:
stade 45 et
au dela*
\
4
to
<S*
S
3r-1
g
242
V. FERRIER
caracteres sexuels secondaries. Leur phenotype est purement maternel. Ce sont
en fait de faux hybrides a degre de ploidie variable et dont l'origine gynogenetique a ete discutee dans une precedente publication (Ferrier, 1966).
Le tableau 2 fait apparaitre de profondes inegalites dans le developpement
des embryons letaux selon les series et pour une meme serie, telle que la serie
XVI: la ponte de la femelle ayant fourni les oeufs de cette serie avait ete repartie
en deux lots qui ont ete fecondes par du sperme preleve sur deux salamandres
males differentes.
D'autre part, le degre de neurulation n'est pas directement fonction du
degre de gastrulation, ainsi que le montrent les series IX et XV. Ces faits
refletent vraisemblablement des differences genetiques entre les parents.
(2) Etude histologique des premiers stades
(a) De la penetration spermatique a Vamphimixie. Les points de penetration
sont marques par des depressions circulaires de 150 a 200 ju> de diametre et d'une
trentaine de /i de profondeur. Si la polyspermie est importante, elles peuvent se
chevaucher et bouleverser ainsi dans quelques cas la totalite de Phemisphere
animal. Elles sont remplies d'une substance tres pyroninophile, exsudee par le
cytoplasme de nature non ribonucleique ainsi que le prouve le test negatif a la
ribonuclease, mais polysaccharidique car PAS-positive. A leur niveau la surface
de l'ceuf devient imprecise, se vacuolise, le pigment cortical s'y concentre tout en
s'effondrant irregulierement en de vastes nappes dans les couches plus profondes
accom pagnant la trainee spermatique. Au niveau de telles taches, le gradient vitellin
est frequemment bouleverse par l'irruption de grosses plaquettes vitellines isues des
couches cytoplasmiques plus profondes de l'hemispherevegetatif,et qui se substituent aux petites plaquettes vitellines dupole animal. Ces anomalies pigmentaires
et vitellines refletent des brassages cytoplasmiques d'autant plus complexes
que la polyspermie est intense, et qui peuvent affecter notamment la structure
de la zone de maturation elle-meme si un spermatozoide a penetre son niveau
ou a proximite. Generalement, ces alterations diverses tendent a s'estomper
3 h environ apres la penetration spermatique. La surface du cortex de l'oeuf
se regularise et le pigment retrouve sa repartition normale.
Cependant dans quelques oeufs, ces troubles, et particulierement les anomalies
du gradient vitellin, persistent longtemps, jusqu'a Pamphimixie et au debut
de la segmentation. Ce fait n'est peut-etre pas sans importance pour la suite du
developpement de ces oeufs.
La deuxieme division de maturation, debloquee par la penetration spermatique, s'acheve dans des conditions normales pour la plupart des oeufs. Le
deuxieme globule polaire est emis dans un delai d'une heure environ et le
pronucleus $, constitue au debut de la deuxieme heure, engage sa migration
vers le pronucleus 6* le plus proche. Mais il arrive que la penetration d'un
spermatozoide dans la tache polaire ou a sa proximite perturbe l'achevement
de la deuxieme division de maturation. Ainsi dans l'ceuf X-4, age d'une heure,
Hybrides letaux cTamphibiens
243
le fuseau de division, correctement oriente, est cependant anormalement profond. II s'agit d'une telophase. Alors qu'a ce stade le lot de chromosomes
destine a constituer le deuxieme globule polaire se trouve habituellement
Fig. 9
Fig. 10
Fig. 9. Pleurodeles $ x Salamandra <?. 1 h. Telophase de 2eme division de maturation.
Position anormale du fuseau (C/i: chorion).
Fig. 10. Pleurodeles 9 x Salamandra #. 2 h. Retention du 2eme globule polaire. Les deux
pronuclei 9 migrent vers le pronucleus tf (GP: ler globule polaire; F: emplacement
du fuseau de deuxieme division de maturation; PR: pronucleus<Jet sonspermaster).
immediatement sous la surface de roeuf, il est ici a une quarantaine de microns
de celle-ci. Dans 1'oeuf X-3, du meme age, c'est l'orientation du fuseau qui est
modifiee: celui-ci est en effet presque parallele a la surface de Toeuf (Fig. 9).
244
V. FERRIER
Dans les deux cas, l'architecture du pole animal est bouleversee et presente
l'aspect decrit plus haut. II est vraisemblable que dans ces deux cas remission
du deuxieme globule polaire n'aurait pu s'effectuer.
Cette supposition est confirmee par les observations suivantes. L'ceuf X-9
presente une zone de maturation tres pyroninophile, le pigment s'est largement
repandu en profondeur tout en menageant une plage spherique sous-corticale
d'environ 100 fi de diametre, emplacement probable du fuseau de deuxieme
division de maturation, compte-tenu de la proximite immediate du seul globule
polaire observable. Un spermatozoiide a penetre au pole animal: le pronucleus
$ est visible a plus de 300 [i de la surface; il est de forme ovalaire (42 /i et
27 /*). Or dans l'axe de la trainee spermatique, deux pronuclei presque accoles
sont visibles: spheriques, de taille identique (25 /i) ils proviennent vraisemblablement d'une retention du 2eme globule polaire dans les conditions decrites
precedemment (Fig. 10).
De telles images ont ete observees a plusieurs reprises. Ainsi dans le lot
VIII, 6 des 10 oeufs ages de 2 h et analyses presentaient deux pronuclei ?.
II faut noter egalement que dans tous les cas, les deux pronuclei $ migrent
simultanement dans la direction du meme pronucleus $, a quelque distance
l'un de l'autre.
Les tetes spermatiques se transforment en pronuclei 1 h a 1 h 30 apres leur
penetration et developpent toutes leur spermaster.
(b) Vamphimixie et la premiere division de segmentation. Les premieres
images d'accolement des pronuclei $ et $ apparaissent au cours de la troisieme
heure. Cet accolement ne se realise pas systematiquement dans le plan de
symetrie bilaterale de l'ceuf, ce qui est alors a l'origine de certains des nombreux
clivages aberrants. Pour de nombreux oeufs, le deroulement de l'amphimixie, la
constitution du fuseau et la premiere division de segmentation sont normaux
et engagent l'ceuf dans un processus de segmentation regulier. Dans d'autres
cas au contraire, d'interessantes anomalies ont ete observees.
— Dans l'ceuf X-35, age de 5 h 30, les deux pronuclei sont bien accoles.
Mais alors que les cinq autres ceufs etudies, du meme age et du meme lot, sont
en metaphase ou en anaphase de premiere division de segmentation, les deux
pronuclei de cet ceuf n'ont pas encore fusionne (Fig. 11). Supportes par un
amphiaster normalement oriente et vigoureux, ils ont l'un et l'autre un aspect
different: l'un presente un reticulum chromatique normalement vert; mais
l'autre ne contient qu'une masse de granulations intensement pyroninophiles,
evoquant ainsi Failure des pronuclei S surnumeraires decrits ci-apres. L'aspect
general de Fceuf est normal; les troubles corticaux provoques par la penetration
de deux spermatozoides se sont estompes. Deux globules polaires sont observables.
— Une autre serie d'anomalies est constitute par l'orientation anormale
du fuseau de premiere division de segmentation. L'oeuf X-36, age de 5 h 30,
en telophase de cette premiere division, montre un fuseau anormalement proche
Hybrides letaux d'amphibiens
245
du pole animal (200 /*), oriente selon l'axe animal-vegetatif. Un premier sillon
de segmentation aberrant, en formation, detachera un micromere animal
(Fig. 12).
— Dans d'autres cas, certaines images suggerent une segregation precoce
des deux lots chromosomiques decelable parfois a Tissue de 1'amphimixie mais
plus evidente a la metaphase qui suit. Les chromosomes apparaissent alors
groupes en deux lots nettement distincts dans le plan equatorial. Ainsi dans
20/t
Fig. 11. Pleurodeles $ x Salamandra $. 5 h 30. Accolement des pronuclei ? et <?. Pronucleus $
charg6 de granulations pyroninophiles ribonucleiques (GR). (PR: pronuclei).
Fceuf X-25, age de 4 h 30, Fun des deux lots est normalement etale sur la
plaque equatoriale, mais l'autre est rejete a la peripherie du fuseau dont sont
expulses plusieurs chromosomes. De telles eliminations sont frequentes (Fig.
13 A). L'anaphase presente des anomalies analogues. Dans l'ceuf VI-46, age de
5 h 30, les chromosomes sont egalement repartis en deux lots; dans l'un d'entre
eux ils sont agglomeres en une masse compacte etiree entre les deux poles
du fuseau; dans l'autre, la disjonction des chromatides a commence mais tres
irregulierement (Fig. 13B). Des ponts anaphasiques, des collages sont observables. Dans Pceuf VI-54, age de 5 h 45, en fin de telophase, les deux noyaux-fils
sont encore reunis par un long et mince filament chromatique perpendiculaire
au plan du premier clivage (Fig. 13C).
— Nous avons enfin observe a plusieurs reprises des images d'accolement
concernant trois pronuclei de nature variable selon les cas.
L'oeuf X-12, age de 3 h, comporte sur un amphiaster en formation trois
l6
JEEM
l8
246
V. FERRIER
r«ftO&j
13C
13A
Fig. 12. Pleurodeles ? x Salamandra <$. 5 h 30. Orientation anormale du fuseau de
1 ere division de segmentation. Ebauche de clivage aberrant (PA: pole animal).
Fig. 13. Pleurodeles $ x Salamandra 3. 5 h 45. Premieres divisions de segmentation
anormales. A. Metaphase; elimination chromosomique massive. B. Anaphase;
segregation des chromosomes en deux lots; chromosomes adhesifs. C. T61ophase;
pont chromatique.
Hybrides letaux d'amphibiens
247
pronuclei accoles; deux d'entre eux sont semblables, d'un diametre de 33/t,
spheriques; le troisieme est ovalaire, de forme moins reguliere et plus volumineux que les precedents (environ 42 fi). Un seul globule polaire est observable.
L'oeuf VI-8, age de 3 h, presente le meme aspect (Fig. 14A, B). II s'agit done
vraisemblablement de deux cas de retention de deuxieme globule polaire
analogues a ceux decrits plus haut. Les deux pronuclei $ s'accolent avec un
pronucleus $. Un noyau de fecondation hybride triploide est constitue (2n
Pleurodeles + n Salamandra).
Fig. 14. Pleurodeles ? x Salamandra $. 3 h. Amphimixies atypiques. A et B. Accolement de deux pronuclei $ et d'un pronucleus <J (retention du 2eme globule polaire).
C. Accolement de deux pronuclei $ et d'un pronucleus ?.
L'oeuf X-14, age de 3 h, montre trois pronuclei accoles munis d'un amphiaster
en formation, et de tailles toutes trois differentes. Deux globules polaires sont
visibles. Bien qu'il ne soit pas possible de distinguer nettement les deux trainees
spermatiques, deja trop diffuses, on peut affirmer que deux des pronuclei sont
males, le troisieme femelle (Fig. 14C). II en resulte la encore un noyau de
fecondation hybride triploide, mais de constitution genetique differente (2n
Salamandra + n Pleurodeles).
(c) Comportement des pronuclei $ surnumeraires. 4 h a 4 h 30 apres la penetration spermatique, de nombreux pronuclei $ se chargent de granulations
pyroninophiles qui n'apparaissent plus sur les coupes traitees a la ribonuclease
et qui sont par consequent de nature ribonucleique. Dans de tels pronuclei,
toujours pourvus d'asters vigoureux, on observe aussi des mottes chromatiniennes qui se localisent a la peripherie du pronucleus, de preference a
proximite du spermaster (Fig. 15 A). Simultanement, celui-ci se dedouble et un
grand nombre de pronuclei surnumeraires, y compris ceux qui contenaient
des granulations ribonucleiques, individualisent leurs chromosomes et entrent
en division. Les differentes phases de mitoses haploides normales ou peu
16-2
248
V. FERRIER
anormales ont eteobservees(Fig. 15B-D). Le tableau 3 suggereque la proportion
des pronuclei $ en division depend probablement dans une certaine mesure
du degre de polyspermie pour une serie donnee. Mais l'etat du cytoplasme
de Fceuf commande lui aussi probablement leur evolution: ainsi l'ceuf X-38,
age de 6 h, contient 10 pronuclei surnumeraires dont 4 sont en anaphase et
4 en fin de telophase donnant naissance a 8 petits noyaux-fils haploides de
20 a 30 /A de diametre; mais dans l'ceuf X-39, du meme age, sur les 10 pronuclei
<J observes, 9 sont en prometaphase, le dixieme est degeneratif. Les deux
oeufs en sont au meme stade (debut du premier clivage). En outre, lorsque
le degre de polyspermie est eleve, des fusions entre pronuclei $ peuvent intervenir et deboucher sur un cycle mitotique complet aboutissant a la constitution
de noyaux fils diploides androgenetiques susceptibles de participer a la segmentation.
Tableau 3. Croisement Pleurodeles waltlii ? x Salamandra salamandra <$,
comportement des pronuclei $ surnumeraires
Nombre total
de pronuclei
Pronuclei
quiescents
Pronuclei en
division
n-26
24
12
11
7
25
20
13
5
9
6
3
1
11
7
2
1
22
19
11-27
11-28
11-29
X-26
X-27
X-28
X-31
X-32
X-33
X-34
X-35
X-36
X-37
X-38
X-39
X-40
X-41
X-42
8
5
3
25
1
5
4
10
3
1
3
1
0
1
4
10
10
12
8
11
3
1
3
4
9
1
1
3
1
0
1
3
1
1
8
0
6
22
0
2
0
1
2
0
0
0
0
0
1
9
9
4
8
5
Temps.
OEufs
4hl5
II-2
II-l
4h30
5h
5h30
6h
11-24
II-3
11-25
(d) Segmentation et gastrulation. Quelques blastulas et gastrulas se developpent tout a fait normalement: elles auraient probablement constitue les embryons
et les larves dont la nature gynogenetique et le degre de ploidie ont ete discutes
par ailleurs (Ferrier, 1966).
Hybrides letaux d'amphibiens
249
Dans la plupart des autres germes, les anomalies mitotiques apparues des
la premiere division de segmentation se poursuivent a des degres divers. On
observe frequemment dans l'ensemble du germe des figures d'elimination
chromosomique d'importance variable (Fig. 16). II n'est naturellement pas
Or*
Fig. 15. Pleurodeles ? x Salamandra $. A. 4 h 30. Pronucleus $ surnum6raire charg6
de granulations pyroninophiles ribonucl&ques (GR); d6but d'individualisation des
chromosomes spermatiques a proximite du spermaster (CH). B. 4 h 30. Pronucleus
o surnumeraire en prophase. C. 6h. Pronucleus 3 surnumeraire en m&aphase
anormale. D. 6 h. Pronucleus <? surnumeraire en anaphase.
possible de savoir s'il s'agit d'une progressive elimination systematique ou
anarchique du genome paternel. Cette elimination donne naissance a des
micronoyaux multiples voisinant dans un meme blastomere avec les noyaux
de taille habituelle (Fig. 16). Par ailleurs la segmentation, irreguliere, epargne
souvent de vastes territoires, y compris dans l'hemisphere animal, comportant
des noyaux geants hautement polyploides ainsi que l'indiquent les mitoses
complexes, generalement pluricentriques, que Ton observe parfois dans de
tels territoires.
250
V. FERRIER
Ces anomalies sont les plus frequentes parmi les gastrulas les plus precocement letales, celles qui ne parviennent qu'a l'ebauche de la levre dorsale du
blastopore, et parmi les exogastrulas. D'autres germes poursuivent cependant
leur developpement, parviennent a neuruler et atteignent parfois, avec beaucoup
de retard, des stades evoquant le bourgeon caudal (tableau 2).
(e) Neurulas et embryons hypomorphes. Us presentent tous le meme syndrome
apres un developpement atteignant parfois 6 a 10 jours. La microcephalie est
Fig. 16. Pleurodeles $ x Salamandra $. A. Blastula agee de 23 h; m^taphase anormale,
Elimination chromosomique. B. Gastrula bloquee agee de 46 h; blastomeres du toit
blastocelien; multiples micronoyaux.
de regie. L'encephale se reduit souvent a un tube; le mesencephale, les capsules
otiques en sont souvent les seules parties differenciees. Le tube nerveux est
to uj ours sinueux, d'epaisseur irreguliere, quelquefois reduit a un massif allonge
de cellules indifferenciees s'interrompant de place en place.
La corde dorsale est tout aussi sinueuse et peut ne pas atteindre anterieurement le niveau de la courbure mesencephalique. Le materiel somitique est
frequemment mal organise, desagrege par places; il fait parfois totalement
Hybrides letaux cTamphibiens
251
defaut sur l'un des flancs de l'einbryon qui est alors fortement concave sur ce
cote (Planche 1, fig. E). La differentiation du mesonephros est de meme souvent
deficiente. Les plages de necrose apparaissent d'abord dans la masse endodermique vitelline et dans le mesenchyme cephalique, mais une certaine activite
mitotique se manifeste longtemps encore, pendant plusieurs jours, jusqu'a
l'arret total du developpement, dans le materiel nerveux: de nombreuses
mitoses pluricentriques et anaphases adhesives sont observees.
o.
40/t
%I
Q
C
Fig. 17. Pleurodeles ? x Salamandra $. Embryon hypomorphe et microcephale age
de huit jours. Polyploidie complexe. A. Noyaux d'ectoderme de balancier. B. Noyau
d'ectoderme ventral de la region troncale. C. Embryon de Pleurodele temoin de
meme age (stade 32); noyaux d'ectoderme de balancier.
La ploidie de ces embryons anormaux est toujours difficile a determiner.
D'une part leur materiel ne se prete pas aisement a la technique de l'ecrasement
a de tels stades. D'autre part les anomalies nucleaires, notamment les eliminations chromosomiques, qui interviennent des la premiere division de segmentation, entrainent une aneuploidie secondaire complexe. L'elimination probablement anarchique d'organisateurs nucleolaires au cours de ces processus, fait du
nombre de nucleoles un critere incertain de la ploidie de ces embryons.
On sait que le nombre maximum de nucleoles des noyaux diploides de
Pleurodele est de quatre (Duprat, Jaylet & Beetschen, 1964); d'apres nos
observations sur divers tissus de larve de Salamandre, il est de deux. Pour dix
252
V. FERRIER
des quatorze embryons anormaux analyses, ce nombre maximum est le plus
frequemment egal a cinq. Compte tenu des reserves precedentes il s'agit la
probablement d'individus triploides possedant deux genomes 'Pleurodele' pour
un genome' Salamandre' et resultant de la retention du deuxieme globule polaire
dont la frequence a ete decrite ci-dessus. Trois autres embryons chez lesquels le
nombre maximum de nucleoles est de trois, etaient probablement diploides.
Un quatorzieme etait d'une ploiidie plus complexe et plus elevee (Fig. 17).
Conclusion. L'introduction du sperme de Salamandre dans l'oeuf de Pleurodele
provoque de profonds bouleversements cytoplasmiques, perturbe frequemment
l'achevement de la deuxieme division de maturation et conduit alors a des
amphimixies complexes.
Des anomalies nucleaires interviennent des la premiere division de segmentation, caracterisees surtout par des eliminations chromosomiques massives qui
peuvent se poursuivre au cours des cycles mitotiques ulterieurs. Les pronuclei
(J surnumeraires participent souvent a la segmentation. Celle-ci est generalement
irreguliere. La majorite des germes ne franchit pas la gastrulation. Quelques-uns
poursuivent un developpement anormal jusqu'a des stades evoquant le bourgeon
caudal. Les seuls individus ayant atteint la vie larvaire etaient gynogenetiques.
(3) Discussion
Le blocage du developpement intervient a des stades divers selon les series.
Si dans l'ensemble la gastrula agee est le stade le plus difficile a franchir par
les embryons hybrides, le taux de mortalite est maximum pour certaines series
au cours de la segmentation, pour d'autres lors de la gastrulation. Le croisement
Pleurodeles $ x Salamandra <$ differe done, par la variability de sa letalite, de
nombreuses autres combinaisons entre Anoures (Moore, 1946) ou entre
Urodeles, telle que la combinaison Triton palme $ x Salamandre $ caracterisee
par un blocage absolu au stade de la gastrula moyenne (Schonmann, 1938).
Ces deux croisements divergent par une autre caracteristique: les anomalies
nucleaires et mitotiques decrites par Schonmann et Baltzer chez l'hybride
Triton palme x Salamandre sont semblables a celles que nous avons decrites,
mais elles caracterisent une phase critique precise du developpement, la blastula
agee, pour diminuer lors de la gastrulation; les premiers stades sont tout
a fait normaux. Au contraire, dans la combinaison Pleurodele ? x Salamandre
S, l'incompatibilite entre le genome paternel et les constituants maternels se
manifeste tres tot, des ramphimixie. Frequentes chez les Echinodermes (Baltzer,
1952), les eliminations chromosomiques des la premiere division de segmentation
sont rares chez les hybrides de Batraciens, telle la combinaison Bufo $ x Hyla <$
(Tchou-Su, 1931). Ces anomalies se poursuivent avec la meme intensite tout
au long du developpement de notre hybride Pleurodele $ x Salamandre #.
L'elimination partielle et anarchique des chromosomes probablement paternels
peut s'expliquer, peut-etre, par une dysharmonie entre leur rythme de division
et le rythme fusorial du Pleurodele. Mais on sait par ailleurs que la duplication
Hybrides letaux (Pamphibiens
253
de chromosomes dans un cytoplasme etranger peut a la longue leur infliger
des lesions irreversibles (King & Briggs, 1953; Moore, 1958). Or nous avons
decrit raccumulation anormale et frequente de granulations ribonucleiques
dans les pronuclei $ surnumeraires. Ce fait original souleve plusieurs questions
auxquelles il est impossible de repondre pour l'instant: d'ou provient cet ARN?
Est-il normal? Que traduit cette synthese surprenante? Brachet, Bieliavsky &
Tencer (1962) ont analyse chez des hybrides letaux d'Anoures l'inhibition de la
synthese ou raccumulation pathologique intranucleaire d'un ARN probablement messager, de composition anormale. Mais les noyaux 'bicolores' decrits
par ces auteurs n'apparaissaient qu'au cours de la segmentation. La participation
frequente des pronuclei $ surnumeraires a la segmentation montre que cette
accumulation anormale ribonucleique chez plusieurs d'entre eux n'est pas
incompatible avec la duplication de leurs chromosomes. Mais elle suggere des
perturbations tres precoces du metabolisme des acides nucleiques chez cet
hybride et par consequence de la synthese ulterieure de certaines des substances
necessaires a la differenciation cellulaire.
A ceci s'ajoutent d'autres facteurs tels que les bouleversements corticaux
provoques par la penetration spermatique qui perturbent au moins temporairement les gradients vitellin et ribonucleique, et dus probablement a un effet
toxique des spermatozoides de Salamandre, le developpement androgenetique
de certains territoires du germe, la polyploidie resultant d'amphimixies complexes.
On conc.oit que la combinaison de l'un ou de plusieurs de ces elements, selon
les embryons, avec ce facteur de desequilibre metabolique qu'est l'aneuploidie
complexe resultant secondairement des eliminations chromosomiques anarchiques, rende la letalite plus ou moins precoce, plus ou moins partielle,
autonome ou secondaire selon la terminologie de Baltzer (1952).
II n'en reste pas moins que le developpement peut se poursuivre au-dela
du stade critique de la gastrulation. Liithi (1938) a pu obtenir une differenciation
poussee de transplants, sur un hote normal Triton palme, de l'hybride Triton
palme $ x Salamandre S pourtant plus precocement letal et appartenant a des
territoires presomptifs varies. De meme une telle differenciation a pu etre obtenue
in vitro a partir d'un autre materiel hybride letal chez les Anoures (Barth &
Barth, 1965). Aussi peut-on esperer de la combinaison Pleurodele $ x Salamandre
3 qu'elle puisse se preter a de semblables analyses experimentales, dans la
mesure ou Ton aura pu eliminer les complications secondaires rappelees
ci-dessus, notamment par la selection des oeufs monospermiques. Les premieres
experiences de greffes de fragments de gastrulas hybrides sur un hote Pleurodele
n'ont cependant pas donne de resultats significatifs.
254
V. FERRIER
CONCLUSION
Les combinaisons intergeneriques faisant l'objet de ce travail sont toutes
letales. Elles comportent cependant une grande variabilite dans le niveau
auquel se manifeste l'incompatibilite entre les constituants paternels etmaternels.
Les spermatozoiides de Triturus helveticus et Ambystoma mexicanum manifestent un fort pouvoir lytique sur le cytoplasme de Pleurodeles waltlii, capable
meme pour le second d'entre eux d'inhiber le clivage. Dans le cas de la combinaison Pleurodeles waltlii $ x Euproctus asper <£, la letalite du developpement
semble liee a une aneuploidie secondaire complexe provoquee par l'activite
anarchique des centres cellulaires. La combinaison Pleurodeles waltlii $ x Salamandra salamandra $ est la moins letale, bien que des eliminations chromosomiques massives, traduisant l'incompatibilite entre les chromosomes de
Salamandre et le cytoplasme et les chromosomes de Pleurodele, se produisent
tres precocement.
Un fait original est mis en evidence dans les deux combinaisons precedentes:
l'accumulation anormaled'ARNdans les pronuclei <?quatre heures environ apres
la penetration spermatique. Cette accumulation pose plusieurs questions interessantes quant a Forigine et a la nature de cet ARN, c'est-a-dire quant a l'activite
genique des pronuclei.
On sait que les noyaux de l'ovule et du spermatozoide sont le siege d'une
intense synthese d'ADN quelques minutes apres la fecondation et Gurdon
a montre que cette synthese est sous rinfluence du cytoplasme de l'ceuf: des
noyaux de globules sanguins ou de cerveau de grenouille adulte injectes dans
des ceufs enuclees incorporent de la thymidine-3H dans l'heure qui suit leur
injection, alors qu'ils ont perdu normalement in situ ce pourvoir de synthese en
dehors des periodes de division. (Graham, Arms & Gurdon, 1966). L'apparition
d'ARN dans les pronuclei S d'Euprocte et de Salamandre en presence d'un
cytoplasme etranger confirme rinfluence cytoplasmique sur l'activite genique
des pronuclei. S'agit-il d'une activation precoce ou au contraire de la levee
d'inhibition de certains genes places dans des conditions anormales? L'analyse
de ce metabolisme anormal des acides nucleiques chez ces hybrides letaux
devrait contribuer a resoudre ce probleme.
RESUME
1. De nouvelles combinaisons intergeneriques chez les Amphibiens Urodeles
sont realisees par la technique de la fecondation artificielle in vitro.
2. Des hybrides Pleurodeles waltlii $x Euproctus asper $ ne depassent
generalement pas le stade de la blastula agee. II sont caracterises par une
hyperactivite anarchique des spermasters puis des asters tout au long du
developpement jusqu'a son blocage. Cette hyperactivite provoque des aberrations de clivage et une aneuploidie secondaire complexe, cause directe de la
Hybrides letaux d'amphibiens
255
letalite. II n'est pas demontre que des noyaux diploides et equilibres ne pourraient pas assurer un developpement plus pousse de cet hybride.
3. La combinaison Pleurodeles wait Hi $ x Triturus helveticus $ est letale. Les
hybrides ne parviennent generalement pas a gastruler. Le sperme manifeste
une activite lytique bouleversant parfois irreversiblement les gradients vitellin
et ribonucleoproteique.
4. La combinaison Pleurodeles waltlii QxAmbystoma mexicanum $ est la
plus letale; le sperme exerce un violent pouvoir toxique sur le cytoplasme
ovulaire. Le fuseau de premiere division de segmentation ne s'edifie pas. Le
clivage est inhibe.
5. Les hybrides Pleurodeles waltlii $ x Salamandra salamandra $ parviennent
souvent a gastruler et peuvent atteindre des stades evoquant celui du bourgeon
caudal. Des anomalies chromosomiques, notamment des eliminations de chromosomes, se manifestent des le debut du developpement qui est compromis par
une aneuploidie secondaire. Des cas de polyploidie et de gynogenese sont
signales.
6. Un fait original est mis en evidence dans les deux combinaisons Pleurodeles
waltlii $ x Euproctus asper $ et Pleurodeles waltlii $ x Salamandra salamandra $:
l'accumulation d'ARN dans les pronuclei $.
SUMMARY
A cytological study of the first stages of development
of some lethal hybrids ofurodele amphibians
1. Some new urodele intergeneric hybrids were obtained by artificial fertilization in vitro.
2. Hybrids of Pleurodeles waltlii $ x Euproctus asper $ do not generally
survive beyond the late blastula stage. They show a disorderly hyperactivity of
the sperm asters and of all asters for as long as they live. This hyperactivity
causes aberrant cell division and complex aneuploidies which are the direct
cause of death. It has not been shown that balanced diploid nuclei of this
hybrid could not support further development.
3. The combination P. waltlii $ x Triturus helveticus $ is lethal, the hybrids
do not normally gastrulate. The sperm shows a lytic activity which disturbs
the yolk and ribonucleoprotein gradients of the egg.
4. The combination P. waltlii QxAmbystoma mexicanum $ dies soonest.
The sperm shows extreme toxicity to the egg cytoplasm. The first cleavage
spindle is not formed and cleavage does not occur.
5. Hybrids from the cross P. waltlii $ x Salamandra salamandra S often
succeed in gastrulating and may reach the equivalent of a tail-bud stage.
Chromosomal anomalies, notably elimination leading to aneuploidy, are seen
from the onset of development. Cases of polyploidy and gynogenesis were seen.
6. In the two crosses P. waltlii $ x E. asper <$ and P. waltlii $ x S. salamandra
3 it was found that RNA accumulates in the male pronuclei.
256
V. FERRIER
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