/. Embryol. exp. Morph., Vol. 17, 1, pp. 247-261, February 1967
With 5 plates
Printed in Great Britain
247
Etude sur la differenciation
in vitro de F epithelium oesophagien embryonnaire
de Souris. Action de la vitamine A et de
Fhydrocortisone
Par LUIS SORIANO 1
Institut d'Embryologie et Teratologie experimentales du CNRS
et du College de France (Directeur: Prof. Etienne Wolff)
INTRODUCTION
L'epithelium oesophagien d'embryon de Souris preleve a 12 jours de gestation
et cultive in vitro, presente une differenciation acceleree par rapport a celle qu'on
observe dans l'cesophage pendant le developpement normal in vivo (Soriano,
Saxen, Vainio et Toivonen, 1964). Ce resultat a pu etre confirme par la methode
de culture d'organes mise au point par Wolff et Haffen (1952). Par ailleurs, dans
le meme travail (Soriano, 1965) nous avons pu demontrer par la technique
de dissociations et reassociations des ebauches embryonnaires que la destinee
originale des epitheliums digestifs de l'embryon de Souris (oesophage, estomac
anterieur et intestin) n'a pu etre modiflee par le contact avec des mesenchymes
heterologues. Nous avons conclu que la determination de ces epitheliums
embryonnaires se fait avant le 13eme jour de la gestation. L'ensemble de
tous ces resultats a demontre qu'il n'y avait pas de phenomenes d'induction
dans le cas de nos associations heterologues. En effet, ces associations representent des vraies chimeres experimentales telles qu'elles ont ete decrites par
Wolff (1954), Wolff et Bresch (1955) et Bresch (1955). Ainsi la differenciation
de l'epithelium d'estomac anterieur preleve a 13 jours de gestation et associe
avec le foie ou le poumon d'embryon de Souris du meme age ou bien du
mesonephros d'embryon de Poulet, est toujours de type pluristratifie. Ces
organes si differents ont done fourni les elements trophiques et nutritifs necessaires a l'epithelium pour accomplir sa differenciation selon le modele prealablement determine.
Dans le present travail nous etudions l'action de la vitamine A et de l'hydrocortisone sur la differenciation de l'epithelium oesophagien d'embryon de Souris
de 18 jours de gestation. Nous savons depuis les travaux de Fell et Mellanby
1
Adresse de Vauteur: 49 bis, Av. de la Belle Gabrielle, 94 Nogent-sur-Marne, France.
16-3
248
L. SORIANO
(1953) et Fell (1957) que la peau d'embryon de Poulet est capable de subir une
metaplasie muqueuse quand elle est cultivee en presence de la vitamine A. Les
recherches ulterieures ont demontre qu'une variete tres large de tissus keratinises
appartenant a differentes especes, sont sensibles a Faction de la vitamine A, meme
quand la reponse n'est pas toujours la meme (Lasnitzki, 1958, 1961, 1963;
Aydelotte, 1963; New, 1963, 1965).
D'autre part, les hormones corticoides, telles la cortisone et Fhydrocortisone,
ont ete largement utilisees isolement ou en association avec la vitamine A, pour
leurs effets sur la differenciation des organes embryonnaires in vitro aussi bien
qu'm vivo. C'est ainsi qu'un antagonisme et quelques fois un synergisme entre
1'hormone et la vitamine ont ete signales a plusieurs reprises, en ce qui concerne
leurs actions biologiques (Serve, 1958; Fell et Thomas, 1961; Weissmann, 1961;
Fell, 1962; Thomas, McCluskey, Li et Weissmann, 1963; Weissmann et Thomas,
1963; Barker, Cruickshank et Webb, 1964; Dingle, Fell et Lucy, 1966).
II nous a done paru interessant de savoir si F epithelium oesophagien dont la
differenciation n'avait pas ete modifiee par le contact avec des mesenchymes
heterologues, etait sensible a Faction de la vitamine A, etant donne qu'il se
keratinise in vitro, comme nous l'avions prealablement demontre.
Nous avons aussi essaye Faction d'un corticoide, soit isolement, soit associe
avec la vitamine A.
Enfin, nous avons termine notre etude en utilisant successivement la vitamine
A et Fhydrocortisone sur F epithelium oesophagien.
MATERIEL ET METHODES
Les explants d'oesophage ont ete preleves sur des embryons de Souris de
18 jours de gestation; ils ont ete coupes en fragments avant d'etre cultives.
Nous avons utilise la vitamine A — alcool 100 mg (Nutritional Biochemicals
Corporation). Les 100 mg de vitamine A sont dissous dans 10 cc d'alcool absolu
dans un flacon en verre brun a bouchon emeri, ou nous faisons barbotter un
courant d'azote a travers une pipette capillaire pendant 2 ou 3 minutes. Le
flacon ferme est ensuite introduit dans un bocal noir ou on a fait passer de
Fazote avant de le fermer hermetiquement. L'ensemble est garde au refrigerateur
( + 5°C). Ces precautions sont necessaires pour eviter Finactivation de la
vitamine A, qui peut se produire au contact de Fair et de la lumiere et elles
doivent etre prises chaque fois que nous preparons les solutions diluees.
Les explants sont parfois incubes a 37 °C pendant 3 heures dans des solutions
d'incubation diverses avant de les cultiver, d'apres une technique decrite par
Lasnitzki (1963); d'autres fois ils sont directement cultives sur les milieux
enrichis par les differentes substances (vitamine A, alcool absolu et hydrocortisone).
La vitamine A a ete utilisee a la dose de 66 u.i./cc dans la solution d'incubation,
tandis que le milieu de culture n'avait que 6,6 u.i./cc.
/. Embryol. exp. Morph., Vol. 17, Part 1
PLANCHE 1
V
w ' _. <• M
B
Fig. A. CEsophage cultive pendant 8 jours sur un milieu standard qui montre le premier
degre de keratinisation (K +). k., Epithelium keratinise. x 240.
Fig. B. Plus fort grossissement de la figure A. c.a., Cellules aplaties. x 1050.
L. SORIANO
facing p. 248
/. Embryo/, exp. Morph., Vol. 17, Part 1
PLANCHE 2
D
Fig. C. CEsophage cultive pendant 8 jours sur un milieu enrichi par l'alcool absolu (0,13 mg/
cc) qui montre le 3eme degre de keratinisation (K+ + +). k., Epithelium keratinise. x 135.
Fig. D. Plus fort grossissement de la figure C. l.k., Lamelles de keratine. x 788.
Fig. E. CEsophage cultive pendant 8 jours sur un milieu enrichi par la vitamine A (6,6 u.i./cc)
qui montre un epithelium pluristratifie (E.P.). e.p., Epithelium pluristratifie. x 169.
Fig. F. Plus fort grossissement de la figure E. e.p., Epithelium pluristratifie. x 788.
L. SORIANO
facing p. 249
La differentiation de Vepithelium embryonnaire
249
L'alcool absolu a ete utilise aux memes doses que la quantite introduite avec
la vitamine A (0,13 mg/cc de milieu).
L'hydrocortisone est utilisee sous la forme d'hemisuccinate liophylise (Roussel)
en flacons de 100 mg, avec un solvant compose d'une solution glucosee de
17,5 mg/cc tamponee au phosphate.
L'hydrocortisone a ete essayee a des doses tres differentes qui vont de 0,01
a 22 /*g/cc de milieu de culture.
Des experiences paralleles ont ete faites en ajoutant dans le milieu de culture
simultanement ou successivement la vitamine A et l'hydrocortisone.
En general, les explants ont ete enveloppes dans la membrane vitelline (Wolff,
1960), sauf quelques-uns qui ont ete cultives sur des nitres millipores (TA) etales
directement sur le milieu de culture.
Les periodes de culture ont ete de 8 a 10 jours, et exceptionnellement de
15 jours.
Les explants ont ete fixes au liquide de Carnoy, et les coupes histologiques
de 5 /i d'epaisseur ont ete colores a l'hematoxyline — P.A.S.
Par ailleurs, nous avons etudie la presence de proteines sulfurees dans la
keratine oesophagienne, a l'aide de la technique histochimique de Barrnett &
Seligman (1952) specifique des groupes SH. Les details concernant cette technique se trouvent ailleurs (Beaupain & Soriano, 1966).
RESULTATS
Le processus de keratinisation normale de l'oesophage cultive in vitro comprend quatre etapes dont la connaissance nous permettra de mieux interpreter
nos resultats.
(1) Epithelium pluristratifie. Au moment de l'explantation a 18 jours de
gestation, l'epithelium oesophagien est forme d'une couche de cellules cylindriques
basales et d'une ou deux couches de cellules cubiques.
(2) Premier degre de keratinisation (K+). L'epithelium montre deux ou trois
couches de cellules cubiques avec quelques cellules aplaties.
(3) Deuxieme degre de keratinisation (K+ +). Dans cette etape on observe
une grande quantite de cellules aplaties et les premieres lamelles de keratine.
(4) Troisieme degre de keratinisation (K+ + +). L'epithelium est forme de
trois ou quatre couches de cellules cubiques ou aplaties et d'une abondante
quantite de lamelles de keratine.
I. Resultats de la culture des explants sur differents milieux
Les fragments d'oesophage qui ont ete cultives pendant 8 a 9 jours, montrent
un aspect different selon la nature du milieu ou ils etaient cultives.
(A) Explants cultives sur un milieu standard. L'image histologique observee
d'habitude montre que pendant les 8 premiers jours de culture, l'epithelium
a atteint le premier degre de keratinisation (voir Tableau 1 et Planche 1, figs. A,
250
L. SORIANO
B). Ce n'est qu'apres 13 a 14 jours de culture en milieu standard que l'epithelium
oesophagien devient completement keratinise (K+ + + ) .
(B) Explants cultives sur un milieu enrichi par Valcool absolu. Les explants de
ce groupe montrent un aspect tres different de ceux du groupe precedent. En
Tableau 1
Type d'experience
T 1
J- L
1 1
S. temoin
1
1
()
iI
()
iI
|
1 1Vitamine A
|
1 1Vitamine A
|
Vitamine A
|
11
E.P.
4
WoWoWoWoWoWoWoV
0
\
O 0 0 0 0 0 0 0 0
o o o o 0 o o o 0 ° 0 0 o 0 o 0 0 0 0 0 o 0 ol
0
6
|
1 1Vitamine A
|
1
2
29
43
80
20
5
—
29
0
Is
i
7
4
4
12
27
3
4
8
1
5
X
iI
0 o o o
o O o o°o|
()
Total
de
cas
8
0
o o o o o°o 0 o 0 o 0 o c |
4
K+ + K+ + +
J5
O 0 0 0 0
()
1 1 Vitamine A
1U
K+
1
J
~>
185
E.P.: epithelium pluristratifie. K + , K + + et K + + + : premier,
deuxieme et troisieme degre de keratinisation. 0-8 periode de culture de 8 jours.
•_z*_y : Incubation dans une solution 1/1 de Tyrode et de sdrum de cheval + 1,3 mg/cc
d'alcool absolu. Culture sur un milieu enrichi par l'alcool absolu (0,13 mg/cc).
J_ |S. tem.|
_L 1 Vit. A |
|
| : Incubation dans une solution 1/1 de Tyrode et de serum de cheval.
Culture sur un milieu standard.
|°ooooo° 1 : Incubation dans une solution 1/1 de Tyrode et de serum de cheval+66 u.i. cc
de vitamine A. Culture sur un milieu enrichi par la vitamine A (6,6 u.i./cc).
effet, une periode de 8 a 9 jours suffit pour que la plupart d'entre eux atteignent
le deuxieme et le troisieme degre de keratinisation ( K + + e t K + + +) (voir
Tableau 1; Planche 2, figs. C, D; Planche 3,figs.G, H, I, J).
(C) Explants cultives sur un milieu enrichi par la vitamine A. Ces ebauches
montrent une absence complete de keratine dans la plupart des cas, qui restent
/. Embryo/, exp. Morph., Vol. 17, Part 1
PLANCHE 3
H
Fig. G. OEsophage cultive pendant 8 jours sur un milieu enrichi par Palcool absolu (0-13 mg/
cc) qui montre le 3eme degre de keratinisation (K.+ + +). Bloquage des coupes histologiques
par l'iode. Reaction D.D.D. negative, k., Lamelles de keratine. x 135.
Fig. H. Plus fort grossissement de la figure G. x 788.
Fig. I. GEsophage cultive pendant 8 jours sur un milieu enrichi par 1'alcool absolu (0,13 mg/cc)
qui montre le 3eme degre de keratinisation (K+ + +). Reaction positive des lamelles de
keratine au D.D.D. k., lamelles de keratine. x 135.
Fig. J. Plus fort grossissement de la figure I. x 788.
L. SORIANO
facing p. 250
/ . Embryo/, exp. Morph., Vol. 17, Part 1
PLANCHE 4
Fig. K. (Esophage cultive pendant 9 jours sur un milieu enrichi par une dose faible d'hydrocortisone (0,5 /*g/cc), qui montre le 3eme degre de keratinisation (K-f- + +). k., Epithelium
keratinise. x 135.
Fig. L. Plus fort grossissement de la figure K. l.k., Lamelles de keratine. x 788.
Fig. M. (Esophage cultive pendant 9 jours sur un milieu enrichi par une dose moyenne
d'hydrocortisone (1,1 /tg/cc) qui montre un epithelium pluristratifie (E.P.) et une zone de
degenerescence vacuolaire. e.p., Epithelium pluristratifie. x 126.
Fig. N. Plus fort grossissement de la figure M. d.v., Cellules en degenerescence vacuolaire.
x788.
L. SORIANO
facing p. 251
La differentiation de Vepithelium embryonnaire
251
a Tetat d'epithelium pluristratifie (E.P.) qu'on observe au moment de l'explantation. D'autres cas montrent le premier degre de keratinisation (K + ) (voir
Tableau 1 et Planche 2, figs. E, F).
(D) Explants cultives sur un milieu contenant le solvant de Vhydrocortisone.
Ces explants montrent toujours une image histologique tout a fait semblable
a celle observee avec des ebauches cultives 8 a 9 jours sur le milieu standard.
(E) Explants cultives sur un milieu enrichipar une dosefaible d'hydrocortisone
(0,5 /ig/cc). L'hydrocortisone stimule la keratinisation normale, car tous les cas
etudies montrent apres 8 a 9 jours de culture, le deuxieme et le troisieme degre
de keratinisation ( K + + et K + + +) (voir Tableau 2 et Planche 4, figs. K, L).
(F) Explants cultives sur un milieu enrichi par des doses moyennes et fortes
d'hydrocortisone (1,1 a 10 ju>glcc). Avec des doses moyennes de l'hormone on
trouve un effet d'inhibition de la keratinisation semblable a celui observe avec
la vitamine A. Cependant, on a pu observer dans certains cas la presence dans
la basale de Pepithelium d'une degenerescence vacuolaire localisee que nous
n'avons jamais observe ni avec la vitamine A, ni avec l'alcool absolu (voir
Tableau 2 et Planche 4, figs. M, N). Les doses fortes montrent tres souvent une
action toxique tres nette.
II. Resultats des experiences sur lefacteur 'temps'1 dans
faction de la vitamine A
Dans ces series d'experiences, nous avons voulu savoir quel est le temps
minimum indispensable a la vitamine A, pour qu'elle puisse produire un effet
d'inhibition de la keratinisation de l'epithelium oesophagien.
Pour cela, nous avons prevu des experiences ou la periode de culture de 8 jours
a ete divisee en deux sous-periodes de temps variables. Dans la lere de ces
sous-periodes, les explants sont incubes et cultives en presence de la vitamine A,
tandis que dans la 2eme sous-periode les explants sont transferes sur un milieu
standard (voir Tableau 1).
Apres 6 jours de culture sur milieu enrichi par la vitamine A (4eme ligne du
Tableau 1), 14 explants sur 15 montrent une inhibition de la keratinisation.
Apres 4 jours de culture sur milieu enrichi par la vitamine A (5eme ligne du
Tableau 1) 11 explants sur 27 montrent une inhibition de la keratinisation, tandis
que 16 atteignent le 2eme et 3eme degre de keratinisation ( K + + e t K + + +).
Enfin, apres 2 jours de culture sur milieu enrichi par la vitamine A (6eme
ligne du Tableau 1), 7 explants sur 8 montrent le 2eme et le 3eme degre de
keratinisation ( K + + e t K + + +).
De cette facon, il nous a ete possible de prouver que Feffet d'inhibition de la
keratinisation produit par la vitamine A depend du temps que la vitamine A
est restee dans le milieu de culture.
252
L. SORIANO
III. Resultats des experiences sur Vaction simultanee ou successive
de Vhydrocortisone et de la vitamine A
(a) Action simultanee
Dans les experiences ou les explants ont ete incubes dans une solution contenant a la fois la vitamine et 1'hormone, et puis cultives sur un milieu enrichi
par les deux substances, les resultats ont ete un peu decevants. En effet une partie
des explants traites de cette facon montrent des signes de toxicite (18 cas). II faut
souligner que dans ces series, nous avons utilise de telles substances a des doses
non toxiques (vitamine A, 6,6 u.i./ cc de milieu de culture; hydrocortisone,
0,5 /^g/cc de milieu de culture). La toxicite est done le resultat de l'introduction
conjointe de deux substances dans le milieu de culture, car individuellement
chacune d'elles est active mais non toxique. Dans les cas qui ne montrent pas de
signes de toxicite (44 cas), il y en a 39 qui montrent un effet d'inhibition de la
keratinisation semblable a celui observe avec la vitamine A isolement ou bien
avec des doses moyennes d'hydrocortisone. Pour supprimer la toxicite, nous
avons essaye de varier les doses sans cependant aboutir a des resultats positifs.
(b) Action successive
Comme consequence des resultats precedents, nous avons eu l'idee de faire
agir une de deux substances pendant la premiere partie de la periode de culture,
et ensuite faire agir l'autre substance.
Avec ce nouveau schema, nous avons voulu d'une part epargner aux explants
l'action simultanee de la vitamine A et de l'hydrocortisone et d'autre part etudier
l'antagonisme possible entre la vitamine et 1'hormone.
Pour ces series d'experiences, la periode de culture etait de 9 jours avec deux
sous-periodes de 5 et 4 jours (voir Tableau 2).
Dans le premier groupe de series (lere a 4eme ligne) l'hydrocortisone est
PLANCHE 5
Fig. O. CEsophage cultive pendant 5 jours dans un milieu enrichi par l'hydrocortisone
(0,5 /ig/cc) et ensuite transfere sur un milieu enrichi par la vitamine A (6,6 u.i./cc) et cultive
4 jours. On voit a gauche, sur l'epithelium, une zone de degenerescence vacuolaire et la
presence de lamelles de keratine dans la lumiere de l'organe. A droite, on voit sur l'epithelium des cellules muqueuses et dans la lumiere un amas de secretion muqueuse. l.k.t
Lamelles de keratine; s.m., secretion muqueuse. x 144.
Fig. P. Plus fort grossissement de la zone gauche de la figure O. d.v., Degenerescence vacuolaire; l.k., lamelles de keratine. x 252.
Fig. Q. Plus fort grossissement de la zone gauche de la figure O. d.v., Degenerescence vacuolaire. x630.
Fig. R. Plus fort grossissement de la zone droite de la figure O. cm., Cellule muqueuse;
s.m., secretion muqueuse. x 252.
Fig. S. Plus fort grossissement de la zone droite de la figure O. cm., Cellule muqueuse;
c.v., cils vibratiles. x 630.
/. Embryol. exp. Morph., Vol. 17, Part 1
L. SORIANO
PL'ANCHE 5
facing p. 252
253
La differenciation de Vepithelium embryonnaire
Tableau 2
ErTet
toxique
Type d'experience
E.P.
*
D.V.
2
K.+
de
cas
v K+ +
D.V.
6
—
2
10
H (0,5/^g'cc)
0
8
16
4
11
3
46
9
H (0,5 //gee)
Alcool (0,13 mg/cc)
0
5
—
—
4
21
—
1
6
9
Vit. A (6,6 u.i./cc)
0
5
II
5
Vit. A (6,6 u.i./cc)
-
Vit. A (6,6 u.i./cc) M. standard
i
*
|& o o o oWo c o°o o o o o|
"|
0
5
9
1
8
— 7
—
—
4
22
1
3
11
6
32
Vit. A (6,6 u.i./cc) H (0,5 //g/cc)
|o 0 o 0 o 0 o 0 o 0 o 0 o 0 o 0 o 0 o 0 0
1
7
—
18
0
148
E.P.: epithelium pluristratifie. K + , K. + + et K + + + : premier, deuxieme et
troisieme degre de keratinisation. D.V.: degenerescence vacuolaire. 0-5-9:
periode de culture de 9 jours divisee en deux sous-periodes de 5 et 4 jours.
Culture en milieu enrichi par I'hydrocortisone. Entre parentheses la dose utilisee.
|r._p.^£| Culture en milieu enrichi par I'alcool absolu. Entre parentheses la dose utilisee.
Culture en milieu enrichi par |a vitamine A. Entre parentheses la dose utilisee.
Culture en milieu standard.
254
L. SORIANO
introduite en premier lieu. Dans le deuxieme groupe de series (5eme a 7eme
ligne) la vitamine A est introduite d'abord.
Nous ferons maintenant une analyse du tableau 2. On peut voir que la
premiere ligne concerne les explants traites avec une dose moyenne d'hydrocortisone (1,1 /*g/cc) pendant 9 jours. L'effet obtenu est l'inhibition de la
keratinisation (E.P. et K + ). Par contre, dans la 2eme ligne, on observe que
les explants traites avec une dose faible d'hydrocortisone (0,5 /*g/cc) montrent
une keratinisation avancee si on les compare avec les temoins cultives 9 jours
sur le milieu normal.
Sur la 3eme ligne, on observe que les explants traites avec la dose faible
d'hydrocortisone (0,5 /*g/cc) pendant les 5 premiers jours, puis transferes sur un
milieu enrichi par l'alcool, montrent aussi une keratinisation acceleree (K + +
e t K + + +).
Sur la 4eme ligne, on voit les resultats de l'experience cruciale de ce groupe, car
nous avons enrichi le milieu de culture avec l'hydrocortisone pendant les
5 premiers jours de culture, et puis les explants ont ete transferes sur un milieu
avec la vitamine A. La majorite des cas montrent une inhibition de la keratinisation (E.P. et K + ) . (Voir Planche 5, figs. O-S.)
En ce qui concerne les experiences du 2eme groupe, sur la 5eme ligne figurent
les resultats de la culture des explants sur un milieu enrichi par la vitamine A
pendant 9 jours.
Sur la 6eme ligne, on voit les resultats des explants cultives sur un milieu
enrichi par la vitamine pendant les 5 premiers jours de culture, et transferes
ensuite sur un milieu standard. Bien que le milieu standard soit capable de
provoquer la keratinisation dans quelques cas, la plupart d'entre eux conserve
l'effet d'inhibition de la keratinisation produit par la vitamine A.
Enfin, sur la 7eme ligne, figurent les resultats de la 2eme experience cruciale.
La vitamine A a agi pendant les 5 premiers jours de culture et puis, c'est
l'hydrocortisone qui a agi. Ces resultats prouvent qu'une majorite des explants
est keratinisee au 2eme et au 3eme degre (K+ + et K + + +). Neanmoins,
certains subissent une inhibition de la keratinisation (E.P.).
DISCUSSION
Vitamine A
La reaction in vitro des tissus embryonnaires de Mammiferes a l'exces de
vitamine A varie enormement d'une espece a l'autre et meme d'une region
particuliere d'un tissu a une autre, dans la meme espece. C'est ainsi que New
(1963, 1965) a pu demontrer que la peau de la region dorsale d'embryon de
Souris ou de Rat se keratinise toujours en presence de la vitamine A meme quand
Pexplantation de la peau a ete faite a 13 jours de gestation, avec utilisation d'une
dose elevee de vitamine A. Par ailleurs, il observe que la peau de la queue
d'embryon de rongeur montre une inhibition de la keratinisation au lieu d'une
La differentiation de Vepithelium embryonnaire
255
metaplasie muqueuse lorsque ce tissu est cultive en presence de la vitamine A.
D'autre part, nous avons un autre exemple de reactivite variee d'un tissu a
l'action de la vitamine A, dans les experiences de Lasnitzki (1963) et les notres.
Cet auteur a demontre que l'cesophage embryonnaire de Rat est capable de
subir une vraie metaplasie muqueuse quand il est cultive en contact avec la
vitamine A. D'apres nos experiences, la vitamine A n'a produit qu'une inhibition de la keratinisation normale de l'epithelium oesophagien, et nous n'avons
pu deceler que tres rarement la presence de cellules muqueuses. Cette difference
de resultats pourrait s'expliquer simplement par Putilisation de methodes de
culture differentes.
Le fait que la vitamine A doit rester dans le milieu de culture au moins 6 jours
pour inhiber la keratinisation, prouve que la vitamine arrete la synthese de
keratine d'une fagon transitoire, car il suffit de transferor les explants traites sur
un milieu standard pendant quelques jours, pour que la formation de keratine
reprenne. Un fait semblable a ete signale par Fell et Rinaldini (1965) et Bern et
Lawrence (1962), dans le cas de la peau d'embryon de Poulet cultivee pendant
8 a 10 jours sur un milieu enrichi par la vitamine A.
On connait mal le mecanisme d'action de la vitamine A sur les epitheliums.
Nous savons d'apres Fitton-Jackson et Fell (1963) que le materiel filamenteux
trouve dans le cytoplasme des cellules basales non traitees par la vitamine est
absent des memes cellules de la peau traitee.
Par ailleurs, Pelc et Fell (1960) ont montre qu'il n'existe pas de difference
significative entre la peau traitee par la vitamine A et la peau temoin, en ce qui
concerne l'incorporation de 14C-leucine et 35S-methionine, mais que l'incorporation de 35S-cystine a ete beaucoup plus importante chez les temoins que chez
les experimentes. D'apres ces resultats, les auteurs ont conclu que les cellules
epidermiques sont capables de synthetiser des mucopolysaccharides acides, mais
que cette synthese est arretee au niveau des cellules superficielles par le processus
de keratinisation normale. Comme la vitamine A empeche la keratinisation, la
synthese peut done continuer a tous les niveaux de l'epiderme. Cette incorporation accrue de sulfate inorganique (35SO42~) par les explants traites par la
vitamine A, a ete confirmee recemment par Barker et al. (1964) qui demontrent
en outre que cette augmentation precede les lesions histologiques produites par
la vitamine A.
D'autre part, Dingle et al. (1966) ont demontre dans le cas du cartilage, que
l'hexosamine et l'hydroxyproline, qui sont en relation avec la synthese de mucopolysaccharides, sont liberees dans le milieu de culture en proportion beaucoup
plus grande chez les explants cultives avec un exces de retinol (vitamine A) que
chez les temoins.
Nous voyons done que nous sommes loin de comprendre le mecanisme d'action
de la vitamine A sur les epitheliums, bien qu'il y ait des arguments en faveur de
la perturbation possible de la permeabilite des membranes cellulaires (action sur
la matrice intercellulaire du cartilage; action hemolytique, Dingle & Lucy, 1962).
256
L. SORIANO
Hydrocortiso ne
En ce qui concerne nos resultats sur l'action de Phydrocortisone, ils sont tout
a fait en accord avec ceux rapportes par d'autres auteurs. En effet, il semble que
l'action de l'hormone depende dans une grande mesure de la dose utilisee.
C'est ainsi que les doses faibles sont capables de provoquer une acceleration de
la keratinisation normale de Pepithelium oesophagien, tandis que les doses
moyennes et fortes ont un effet inverse, c'est-a-dire, inhibent la keratinisation.
Fell et Thomas (1961) ont demontre que les doses fortes d'hydrocortisone
sont capables d'inhiber la croissance du cartilage de Poulet in vitro. Ce resultat
a ete dernierement confirme par Schryver (1965) et par Reynolds (1966). Par
ailleurs, Fell (1962) et Weissmann et Fell (1962) demontrent que Phydrocortisone accelere la differentiation de la peau embryonnaire de Poulet aussi bien que
celle de Rat.
Un fait qui merite certains commentaires c'est la presence de cellules vacuolaires dans P epithelium oesophagien cultive sur un milieu enrichi par Phydrocortisone. Bien qu'il s'agisse d'un phenomene d'apparition sporadique, il a ete
seulement observe lorsqu'un explant a subi Pinfluence de Phydrocortisone
pendant une partie ou la totalite de la periode de culture.
Un fait qui nous semble important a souligner c'est que cette degenerescence
vacuolaire n'apparait jamais dans les epitheliums des explants cultives avec la
vitamine A ou avec Palcool ou meme cultives sur un milieu standard. C'est done
bien le steroiide qui est responsable de ce phenomene dont la vraie nature
echappe a notre connaissance.
Une vacuolisation semblable a ete observee par Fell (1962): le periderme
cultive en presence d'hydrocortisone montre des dilatations kystiques comparables a la degenerescence vacuolaire que nous observons.
Enfin, Phydrocortisone a ete signalee comme un facteur stabilisant de lysosomes. Elle retarderait la liberation d'enzyme hydrolytiques produite par divers
facteurs dont la papame, la vitamine A, les rayons u.v., et d'autres (De Duve,
Wattiaux et Wibo, 1962; Weissmann et Fell, 1962; Weissmann et Thomas,
1963).
Hydrocortisone et vitamine A
Nos resultats concernant l'action simultanee de Phydrocortisone et de la
vitamine A montrent que les phenomenes toxiques dus a cette association jouent
un role important. Neanmoins, il faut remarquer que la plupart des cas etudies
montrent une inhibition de la keratinisation. Cet effet est caracteristique de
l'action de la vitamine A et de Phydrocortisone a des doses moyennes et fortes
quand chacune de ces substances est utilisee isolement. On pourrait interpreter
l'effet des deux substances utilisees ensemble comme le resultat de l'action
synergique entre la vitamine et Phydrocortisone. Des recherches de Selye (1958)
et Weissmann (1961) aboutissent a des resultats analogues.
La differenciation de Vepithelium embryonnaire
257
Par contre, la plupart des experiences de differents auteurs, soit in vivo ou
in vitro, demontre un antagonisme tres net entre l'hormone et la vitamine quand
les deux substances agissent ensemble. Cet antagonisme est explique par
Faction protectrice de l'hydrocortisone sur les membranes des lysosomes,
contraire a celle de la vitamine A qui produirait une augmentation de la permeabilite de ces organites (Fell et Thomas, 1961; Weissmann, 1961; Weissmann et
Thomas, 1963; Barker et al. 1964).
Schema
Vitamine A
Hydrocortisone
75%
K++-
65%
35%
Schema hypothetique base sur les resultats presences, et certaines donnees
connues sur I'action de la vitamine A sur les membranes (foie et cartilage).
Q : lysosomes non alteres.
Qf^ : lysosomes alteres.
0^ : lysosomes proteges.
O • lysosomes eventuellement neoformes.
E.P: epith6lium pluristratifie — K + , K + + et K + + + : 1er, 2eme, et
3eme degres de keratinisation. %: resultats exprimes en pourcentage.
Dans les experiences ou la vitamine et l'hormone ont ete appliquees successivement, on utilise l'hydrocortisone a une dose qui stimule la keratinisation de
l'cesophage in vitro, et la vitamine A a une dose qui inhibe la keratinisation
normale de cet organe. Ce sont des conditions ideales pour etudier leur
antagonisme.
Si les explants sont traites prealablement par l'hydrocortisone et apres par la
vitamine A, l'effet predominant est celui de la vitamine A, c'est-a-dire, l'inhibition de la keratinisation. Cependant, il existe dans ces series un tiers de cas qui
montre un effet d'hydrocortisone ( K + + e t K + + +). Ceci prouverait que dans
258
L. SORIANO
notre systeme, ou bien Faction stabilisante de l'hydrocortisone sur les membranes des lysosomes est plus faible que dans ceux d'autres auteurs, ou bien, ce
qui est plus probable, qu'il y a neoformation de lysosomes qui echappent a
l'action protectrice du steroide.
Par ailleurs, quand la vitamine A agit prealablement a l'hydrocortisone, c'est
l'effet de l'hormone qui predomine et la plupart des cas montrent de la keratinisation avancee ( K + + e t K + + +).
Si on accepte la deuxieme des possibility mentionnees auparavant, c'est-adire, la neoformation de lysosomes, il est evident que la keratinisation observee
dans ces series est due a l'action protectrice de l'hydrocortisone sur les lysosomes
neoformes. En faveur de ce point de vue, on peut noter que la keratinisation
reprend sous l'effet de l'hormone, des que la vitamine n'exerce plus son
influence. Si par contre, il n'y avait pas de neoformation de lysosomes, la
vitamine A aurait altere la permeabilite des lysosomes preexistants, et dans
ce cas-la, l'hydrocortisone n'aurait eu aucun effet, et le resultat devrait etre
l'inhibition de la keratinisation (voir schema, page 257).
L'ensemble de ces resultats confirme ceux de Fell (1962) sur l'effet successif
des deux substances sur la peau d'embryon de Poulet.
Dans le cas des experiences ou les lysosomes sont isoles in vitro, l'action
stabilisante de l'hydrocortisone et, par consequent, l'antagonisme entre la
vitamine et l'hormone sont mis en evidence plus facilement, car dans ces
systemes il n'existe pas la possibilite de neoformation de lysosomes (Weissmann
et Dingle, 1961; De Duve et al. 1962; Weissmann et Thomas, 1963).
Quel que soit le mecanisme d'action des deux substances utilisees successivement, il est evident que la substance qui agit la derniere est celle qui determine
l'etat final de differenciation de l'epithelium cesophagien. Ainsi, cet epithelium
conserve un certain degre de reactivite variee vis-a-vis des substances qui
peuvent intervenir dans la synthese de ses proteines specifiques.
RESUME
L'action de la vitamine A et de l'hydrocortisone sur la differenciation de
Pcesophage embryonnaire de Souris de 18 jours de gestation permet de tirer les
conclusions suivantes:
1. La culture de fragments d'cesophage embryonnaire sur un milieu standard
pendant 8 jours determine un debut de keratinisation (K + ).
2. L'alcool absolu a des doses convenables stimule la keratinisation normale
de l'epithelium cesophagien (2eme et 3eme degres de keratinisation — K + + et
K + + +) apres 8 jours de culture.
3. La vitamine A inhibe la keratinisation normale de l'epithelium cesophagien
apres 8 jours de culture (epithelium pluristratifie — E.P., ler degre de keratinisation—K+).
4. L'effet d'inhibition de la keratinisation produit par la vitamine A depend
La differentiation de Vepithelium embryonnaire
259
de la duree de la presence de celle-ci dans le milieu de culture, avec un minimum
de 6 jours sur 8 jours de culture.
5. L'hydrocortisone a des doses moyennes et fortes (1,1 a 10/*g/cc) inhibe
la keratinisation normale de l'epithelium cesophagien de facon semblable a la
vitamine A, avec la difference que dans certains cas 1'epithelium cultive avec
l'hormone montre des cellules en degenerescence vacuolaire.
6. L'hydrocortisone a des doses faibles (0,5 /*g/cc) stimule la keratinisation
normale de 1'epithelium cesophagien de telle facon qu'apres 9 jours de culture,
les explants montrent le 2eme et 3emedegre de keratinisation (K+ + e t K + + +).
7. La presence simultanee dans le milieu de culture de la vitamine A et de
l'hydrocortisone determine l'apparition dans certains cas, des phenomenes
toxiques, tandis que la plupart d'entre eux montrent une inhibition de la
keratinisation semblable a celle produite par la vitamine A isolement, ou a celle
produite par des doses moyennes d'hydrocortisone. On peut conclure done de
ces experiences, qu'il existe entre la vitamine et l'hormone un certain synergisme.
8. Les experiences ou les explants ont ete traites d'abord par l'hydrocortisone
(0,5 /*g/cc) et ensuite par la vitamine A (6,6 u.i./ cc ) montrent que l'effet predominant est celui de la vitamine, e'est-a-dire, inhibition de la keratinisation.
Par contre, lorsque les explants sont traites d'abord par la vitamine A et apres
par l'hydrocortisone, e'est l'effet de cette derniere qui predomine et la plupart
de cas montrent le 2eme et 3eme degre de keratinisation (K+ + et K + + +).
Ces resultats prouvent que dans l'utilisation successive de deux substances a
effet oppose, l'effet de la derniere predomine sur la differentiation de 1'epithelium cesophagien embryonnaire de Souris, cultive in vitro.
SUMMARY
A study of the differentiation in vitro of the mouse embryonic oesophageal
epithelium. The effects of vitamin A and of hydrocortisone
1. Fragments of embryonic (18 days) oesophagus cultured in standard
medium for 8 days achieved a minimum degree of keratinization.
2. Appropriate doses of absolute alcohol administered over the same period
enhanced normal keratinization.
3. Vitamin A inhibited keratinization, and differentiation into multistratified epithelium or into a minimally keratinized epithelium took place.
4. The effect of vitamin A depends upon the duration of its administration.
5. Hydrocortisone in concentrations of between 1-1/tg/ml and 10/tg/cc
inhibits keratinization in a similar way but with the difference that vacuolated
and degenerating cells are found in some of the epithelial cultures.
6. Low concentrations of hydrocortisone (0-5 /*g/ml) stimulate keratinization after 9 days of culture.
7. Vitamin A and hydrocortisone in combination appear to be toxic in some
cases though they usually together inhibit keratinization in a manner similar
260
L. SORIANO
to their separate effects. However, there is some evidence of synergistic
activity.
8. When explants are treated first with hydrocortisone (0-5 /*g/ml) and later
with vitamin A (6-6 i.u./ml) they show predominantly the influence of the vitamin,
i.e. inhibition of keratinization. When the reverse treatment occurs, i.e. vitamin A
followed by hydrocortisone, most explants show full keratinization.
These results show that it is the last-acting of two opposing influences that is
effective in controlling the differentiation of cultured mouse oesophageal
epithelium.
Cet article represente la deuxieme partie d'une these soutenue a l'Universite de Paris dont
la premiere partie a ete deja publiee dans le /. Embryol. exp. Morph. 14, 119-28 (1965).
L'auteur tient a remercier tres vivement Monsieur le Professeur Etienne Wolff, chez qui
ces etudes ont ete poursuivies et pour 1'encouragement permanent qu'il lui a manifeste.
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