/. Embryol. exp. Morph., Vol. 16, 3, pp. 439-453, December 1966
With 1 plate
Printed in Great Britain
439
Influence de la
puromycine sur la morphogenese et la synthese
des macromolecules chez Fembryon de poulet
Par P. MALPOIX 1 & S. LIMBOSCH 1
Laboratoire de Morphologie Animale, Universite Libre de Bruxelles
L'inhibition des syntheses proteiques par la puromycine confere a cette
substance un interet particulier pour l'etude precise du mecanisme de la
synthese d'une proteine specifique au cours de la morphogenese. Les etudes
deja effectuees dans notre laboratoire sur les effets de la puromycine chez les
ceufs de Batraciens et chez Acetabularia (Legros, 1965; Brachet, 1963; Brachet,
Denis & De Vitry, 1964), ainsi que sur les racines d'oignons (Bosseler, Six &
Simic, 1964) permettent de faire des comparaisons utiles.
Nous avons etudie les effets morphostatiques de la puromycine sur de jeunes
embryons de poulet cultives in vitro, et suivi par autoradiographie, l'incorporation de divers precurseurs des proteines et des acides nucleiques. Ces resultats
ont ete compares a ceux obtenus par des methodes biochimiques, dans le but de
preciser Faction de la puromycine sur la synthese des proteines (de l'hemoglobine en particulier) et des acides ribonucleiques. Enfin, nous avons essaye
d'etablir la sequence selon laquelle les inhibitions observees ont lieu et d'analyser
les repercussions eventuelles d'un arret brutal des syntheses proteiques provoque
par la puromycine sur d'autres syntheses essentielles a la morphogenese et a la
differenciation.
MATERIELS ET METHODES
Observations morphologiques
Des embryons de poulet aux stades jeunes (stades 6 a 12 — Hamburger &
Hamilton (1951)) ont ete cultives sur un milieu agar selon la formule de Britt &
Hermann (1959) et observes au binoculaire pendant des periodes variant de
1 a 24 h. Apres avoir ete fixes par un melange ethanol-acetique (95-5) les
embryons ont ete enrobes dans de la paraffine et coupes a 5 ou 10 fi. La methode
autoradiographique (Ficq, 1961) a ete utilisee pour comparer l'incorporation
de precurseurs radioactifs des proteines (leucine-3H) et des acides nucleiques
(thymidine-3H, uridine-3H, cytidine-3H) dans les embryons temoins et dans
ceux traites a la puromycine.
x
Adresse des auteurs: Laboratoire de Morphologie animale, rue des Chevaux, Rhode St.
Genese, Bruxelles, Belgique.
440
P. MALPOIX & S. LIMBOSCH
Aires vasculaires cultivees in vitro
La culture in vitro pendant 24 h d'aires vasculaires d'embryons de poulet
desembryonnes aux stades 1 a 12 somites a permis d'etudier les effets de la
puromycine sur la synthese de l'hemoglobine, des proteines globales et de l'acide
ribonucleique. La methode de culture a ete decrite par Hell (1964).
Nous avons suivi aussi l'incorporation du 59Fe dans Theme de l'hemoglobine,
en utilisant la technique d'extraction de Goldwasser (1963). Une legere modification de cette methode a permis Tetude simultanee de l'incorporation du
59
Fe dans d'autres molecules; apres addition d'HCl, Theme acide est extrait par
la methylethylcetone; les proteines residuelles, precipitees a Talcool, sont laves
deux fois a l'acide trichloracetique (TCA 10 %), delipidees par trois lavages
successifs a Talcool, a Talcool-ether 3:1 et enfin a Tether. Les comptages ont ete
effectues avec un compteur a scintillation 'well-type'.
Etude biochimique des effets de la puromycine sur les cellules de la lignee
definitive du sang d'embryons de poulet ages de 5 a 14 jours
Une methode permettant d'etudier in vitro les cellules de la lignee definitive
du sang d'embryons de poulet a ete mise au point en s'inspirant du travail
de Fraser (1964).
Le sang, preleve des embryons ages de 5 a 14 jours, a ete mis a incuber,
pendant des temps variables, en presence ou non de puromycine (0,5 a 2 /^g/ml),
avec divers precurseurs radioactifs des proteines et des acides nucleiques.
L'incorporation de ces precurseurs a ete suivie par autoradiographie sur des
frottis de sang.
Les resultats obtenus ont ete compares avec des mesures de l'incorporation
de ribonucleosides et d'acides amines radioactifs faites au compteur a scintillation (Nuclear Chicago) (cf. Erslev, 1964; Wilt, 1965). Voici la methode utilisee:
on lave les cellules a l'acide trichloracetique deux fois (5 % pour les acides
nucleiques, 10 % pour les proteines); on delipide ensuite le culot avec un melange
ethanol-ether 3:1 pendant 10' a 60° et on dissout le residu nucleoproteique dans
0,5 ml d'hyamine que Ton ajoute au liquide a scintillation (4 g PPO (2,5-diphenyloxazole); 100 mg POPOP (l,4-Di[2-(5-phenyloxazolyl)]-benzene); 1000 ml
Toluol).
Nous avons recherche aussi les effets de la puromycine, a la concentration de
1, 1,5 et 2/*g/ml, sur la synthese des differents types d'acides ribonucleiques
(ARNs). Les acides ribonucleiques ont ete extraits deux fois au phenol (en
presence de 0,1 % hydroxyquinoleine): une fois a la temperature du laboratoire
et une fois a 60° C dans du tampon Tris-HCl, pH 7,4 (contenant NaCl 0,14 M;
SDS (sodium dodecylsulfate) — 5 % ; NDS (naphthalene-1,5-disulfonate) et
EDTA (ethylenediaminetetraacetate) 10~3 M). Les surnageants ont ete laves, a
froid, deux fois au chloroforme-octanol (9/1) et une fois a Tether. L'acide
ribonucleique total a ete ensuite precipite, apres addition d'acetate de sodium
/. Embryol. exp. Morph., Vol. 16, Part 3
PLANCHE 1
A
B
Fig. A. Embryon de poulet traite par la puromycine (10 /*g/ml) a partir du stade 7 + (2 somites).
Duree de traitement: 8 h.
Fig. B. Embryon de poulet traite par la puromycine (8 /tg/ml) a partir du stade 5 (prolongement cephalique). Duree de traitement: 8 h. Les effets de la puromycine sont beaucoup plus
marques et plus rapides lorsque le traitement debute aux jeunes stades.
P. MALPOIX & S. LIMBOSCH
facing p. 440
La puromycine et la morphogenese
441
3M (1 goutte par ml de solution d'ARN), par de l'alcool absolu glacial. Le
lendemain, un petit volume du precipite etait repris dans du tampon (tris-HCl
pH 7,4; NaCl 0,14M avec NDS a la concentration de 25 /^g/ml), depose sur un
gradient de saccharose (5-20 %, dans le meme tampon) et centrifuge pendant
4 h a 37.500 r.p.m. dans une Spinco S.W. 39.
Les spectres d'absorption des differents acides ribonucleiques ont ete mesures
au Beckman a 260 m/i; chaque fraction etait ensuite diluee dans 5 ml de la solution de Bray (1960) et la radioactivite etait mesuree au compteur a scintillation.
RESULTATS
Effets morphogenetiques et etude autoradiographique
Les effets de la puromycine varient tres fort selon le stade auquel le traitement
debute et selon la concentration utilisee. A une concentration de 5 /£g/ml, on
n'observe qu'un leger ralentissement de la croissance: les embryons ont la taille
reduite mais ils ne presentent pas de malformation. II en est de meme avec 6 /*g/ml.
Apres de longs traitements par la puromycine a la concentration de 8 /*g/ml,
on observe une lyse preferentielle de la region posterieure des somites. Ce meme
effet apparait plus tot si des embryons tres jeunes (prolongement cephalique)
sont traites par la meme dose: l'inhibition du developpement se manifeste
d'abord au niveau des derniers somites: elle n'atteint que plus tard le systeme
nerveux central, ou on observe alors des anomalies diverses: cerveau trilobe,
chorde ondulee, par exemple.
Malgre ces diverses anomalies, il est visible que meme en presence de doses
relativement elevees (10 ju,gjm\), la synthese de l'hemoglobine n'est que partiellement inhibee, sauf aux tres jeunes stades.
Dans certaines conditions une baisse de la basophilie est apparente dans le
cytoplasme des cellules d'embryons traites par la puromycine (par exemple,
apres un traitement fort mais de courte duree: 15/*g/ml pendant 6 h). Le
nucleole reste toutefois intensement colore par la pyronine. Un leger prolongement du traitement provoque alors de nombreuses pycnoses, et on peut done
le considerer comme un phenomene precedant de peu la cytolyse, qui influence
differentiellement les differentes regions, dans l'ordre citee ci-dessus.
L'inhibition de la synthese proteique globale ne parait pas etre complete et
immediate, ainsi que le montrent les etudes autoradiographiques: l'incorporation de la leucine n'est inhibee que partiellement (cf. Fig. 1).
II est a noter que des doses de 10/Ag/ml de puromycine diminuent deja
l'incorporation de la cytidine-3H dans l'ARN, apres 6 h de traitement, d'environ
18 a 30%. De longues periodes de traitement (24 h) par la puromycine a
10/ig/ml inhibent l'incorporation de la thymidine dans l'ARN; mais a cette
dose on observe deja un certain nombre de cellules pyenotiques (environ 30 %).
442
P. MALPOIX & S. LIMBOSCH
Aires vasculaires cultivees in vitro {etude biochimique)
Nous avons exprime quelques uns des resultats des dosages biochimiqu.es sous
la forme d'un figure (Fig. 2): si, avec 5 /*g/ml, on obtient deja une inhibition de
la synthese de Themoglobine apres 24 h (environ 40 %) sans que la synthese des
acides ribonucleiques soit fortement influencee, il suffit d'augmenter de peu
(a 6/^g/ml) la concentration de puromycine dans le milieu pour obtenir un
effet, secondaire probablement, sur la synthese des acides ribonucleiques.
100
c
.2 60
20
5 6 12 15
Concentration de puromycine (/tg/ml)
Fig. 1. Pourcentage d'inhibition de l'incorporation de leucine-3H en
presence de puromycine.
Cependant, l'inhibition de la synthese de 1'hemoglobine ou des autres proteines
n'est pas complete dans ces conditions (Fig. 2, 7 /*g/ml de puromycine). De
plus fortes doses accentuent ce meme phenomene: il semble qu'il soit impossible
d'inhiber completement les syntheses proteiques sans diminuer la teneur des
blastodisques en acides ribonucleiques.
L'incorporation de 59Fe dans Theme est egalement diminuee en presence de
puromycine, bien que le taux d'inhibition soit moindre que celui observe pour
1'hemoglobine totale. Une inhibition comparable est obtenue en ce qui concerne
le 59Fe 'non-heme', contenu dans le residu proteique apres extraction de Theme
(cf. Goldwasser, 1963).
Fig. 3 illustre quelques uns des resultats ainsi obtenus.
443
La puromycine et la morphogenese
100 -
8
Stades
100 >66
m
oo<
io6
>oo
60 -
I
m
Rx>
Soo
$00
20
C
10
Stades
Fig. 2. Pourcentage d'inhibition de la synthese de l'hemoglobine, des autres proteines et des acides ribonucleiques dans l'aire vasculaire cultive in vitro pendant
24 h a partir des stades 7, 8, 9 et 10 du developpement en presence de puromycine.
0, Hemoglobine; D, autres proteines; • , RNA. A, Concentration de puromycine,
6/<g/ml; B, concentration de puromycine, 7/^g/ml; C, concentration de puromycine, 10/ig/ml.
444
P. MALPOIX & S. LIMBOSCH
Etude biochimique des effets de la puromycine sur les cellules
sanguines cultivees in vitro
Donnees generates concemant le metabolisme des cellules sanguines
Au cinquieme jour du developpement, les erythroblastes incorporent les
precurseurs des acides nucleiques: thymidine-3H, cytidine-3H et uridine-3H. Des
le debut du 6eme jour, la maturation de ces cellules en erythrocytes s'accompagne d'un arret quasi total de ces incorporations, done de la synthese des
acides nucleiques. Par contre, l'incorporation d'acides amines radioactifs
(glycine-3H, valine-3H, leucine-3H, lysine-14H, arginine-3H) temoignent d'une
continuation des syntheses proteiques, du 5eme au 14eme jour, au moins, du
developpement.
100
60
20
9
10
11
10
Stades
Fig. 3. Pourcentage d'inhibition de l'incorporation de 59Fe dans Theme et dans les
proteines de l'aire vasculaire a differentes stades. A, Concentration de puromycine,
8/^g/ml; B, concentration de puromycine, 10/4g/ml. 0 , Inhibition de l'incorporation de s9Fe dans l'heme; • , inhibition de l'incorporation dans les proteines.
Ce net decalage observe entre la periode de synthese des acides nucleiques
et celle des proteines nous a permis d'agir selectivement sur l'une ou l'autre de
ces syntheses lors du traitement par la puromycine.
Effets de la puromycine
Les erythroblastes cultives in vitro se sont averes beaucoup plus sensibles a
la puromycine que l'embryon entier. En effet, pour des doses superieures a
2/tg/ml, nous avons observe des phenomenes de toxicite, notamment des
pyenoses. C'est pourquoi les concentrations de 0,5; 0,75; 1,5 et 2/tg de puromycine/ml ont ete choisies pour etudier les effets de cette substance sur Tincorporation des divers precurseurs.
Resultats autoradiographiques et mesures de la radioactivite globale au compteur
a scintillation. La puromycine a ete utilisee aux concentrations de 0,5; 0,75 et
la duree du traitement allait de 1 h a 4 h.
La puromycine et la morphogenese
445
Incorporation d'acides amines. Nous avons etudie l'incorporation de trois
acides amines neutres: la leucine-3H, la valine-3H et la glycine-3H (10 /tc/ml) et
deux acides amines basiques: la lysine-14C et l'arginine-3H (20/jc/ml). Les
resultats, qui sont resumes dans les Figs. 4 et 5, sont exprimes en pourcentage
d'inhibition de l'incorporation d'un acide amine par rapport au temoin; la
radioactivite de l'extrait proteique etait mesuree au compteur a scintillation.
100
:S
50
20
3h3Omin
3 h 30 min
3 h 30 min
2h
3 h 30 min
2h
3 h 30 min
Duree du traitement
Fig. 4. Pourcentage d'inhibition de l'incorporation des acides amines neutres:
A, leucine-3H; B, valine-3H; C, glycine-3H. CD, 0,5 fig de puromycine/ml;
0 , 0,75 fig de puromycine/ml; • , 1 fig de puromycine/ml.
100
Oeufs de 13 j
B
Oeufs de 7 i
I
20
1 h
4 h 30 min
1h
3 h 30 min
Duree du traitement
Fig. 5. Pourcentage d'inhibition de l'incorporation des acides amines basiques.
A, Lysine-14C, sang d'embryons de 13 jours; B, arginine-3H, sang d'embryons de
7 jours. ED, 0,5 fig de puromycine/ml; 0 , 0,75 fig de puromycine/ml; H , 1 fig de
puromycine/ml.
Ces resultats montrent que la synthese proteique est active dans des cellules
d'age different; l'effet inhibiteur de la puromycine est le meme quel que soit
le jour du prelevement du sang, entre le 5eme et le 14eme jour. L'incorporation
des acides amines basiques est inhibee autant sinon plus que celle des acides
amines neutres.
28
JEEM l 6
446
P. MALPOIX & S. LIMBOSCH
L'effet de la puromycine est proportionel a sa concentration dans le milieu
dans le cas des acides amines neutres; par contre, le taux d'inhibition de Tincorporation des acides amines basiques est sensiblement le meme aux concentrations de 0,5 et de 1 /*g/ml.
Des controles autoradiographiques paralleles a ces experiences ont permis de
demontrer l'absence de cytotoxicite et de confirmer les effets inhibiteurs de la
puromycine; ils ne semblent pas etre plus intense dans le noyau que dans le
cytoplasme. Signalons que nous avons constate que le noyau incorpore particulierement bien certains acides amines (notamment la lysine) dans les cellules
100
20
1h
2 h 30 min
Duree du traitement
Fig. 6. Pourcentage d'inhibition de l'incorporation d'uridine-3H dans le sang
d'embryons de 5 j 17 h. CD, 0,5/fg depuromycine/ml; 0 , 0,75 /Jg de puromycine/
ml; • , 1 /ig de puromycine/ml.
sanguines d'embryons de 5 j 17 h; c'est le moment ou le noyau est egalement le
site d'une intense activite de synthese des acides nucleiques. Des le 6eme jour,
Tintensite de l'incorporation de la lysine dans le noyau devient comparable a
celle que Ton observe dans le cytoplasme.
Incorporations de nucleosides. Les memes concentrations de puromycine que
dans les experiences precedentes ont ete utilisees, les durees de traitement
variant de 45 min a 4 h. Le sang a ete preleve a des embryons qui avaient ete
incubes pendant 5 j 17 h. Trois nucleosides ont ete utilises comme precurseurs,
en utilisant une radioactivite de 20/*c/ml: la cytidine-3H, l'urdine-3H et la
thymidine-3H. Si l'incorporation globale de la cytidine ne parait pas etre
inhibee, on observe (apres 1 h et 4 h) une legere diminution (environ 20 %) de
l'incorporation de l'uridine, tant dans le DNA que le RNA, quand 0,75 /^g/ml de
puromycine sont additionnes au milieu d'incubation (Fig. 6).
On observe aussi une legere inhibition (17 %) de l'incorporation de la thy-
447
La puromycine et la morphogenese
700
500
500 £
o
•3
a
Pi
100
100
10
30
20
No. des fractions
Fig. 7. Effets de 1 /tg/ml de puromycine sur les differents types d'ARN cellulaires
extraits au phenol et separes en gradient de sucrose 5 a 20%. Densite optique
(absorption a 260 m/i): A
A, puromycine; •
• , temoin. Radioactivite
(mesure de l'incorporation de l'uridine-3H) exprimee en coups per minute: x
x,
puromycine; O
O, temoin.
Tableau 1. Pourcentage d'inhibition de la radioactivite specifique de
chaque pic d'ARN separe par centrifugation en gradient de sucrose
28 S, ARN ribosomial lourd; 16S, ARN ribosomial leger; 4S, ARN de transfert.
Concentration
puromycine
(/ig/ml)
1
1,5
2
Pourcentage inhibition correspondant aux pics
A
28 S
16S
44
50
74
36
43,5
3,2
4S
Pas d'effet
23
90
28-2
448
P. MALPOIX & S. LIMBOSCH
midine, pour une dose de puromycine de 0,5 /*g/ml pendant 4 h; cette inhibition
atteint 50 % si la concentration en puromycine utilisee est de 1 /*g/ml.
Separation des differents types d'ARN cellulaires et mesure de lew radioactivite specifique au compteur a scintillation. Les resultats sont illustres par
Figs. 7, 8 et 9 et par le Tableau 1. La courbe de densite optique a 260 m//
900 h
s
4
500
500 -tJ
o
a
•3
Q
Pi
100
100
10
20
30
No. des fractions
Fig. 8. Effets de 1,5 /^g/ml de puromycine sur les differents types d'ARN cellulaires
extraits au phenol et separes en gradients de sucrose 5 a 20 %. Conventions comme
a la Fig. 7.
n'est generalement pas modifiee par une dose de puromycine de 1 /6g/ml
(Fig. 7); tout au plus, observe-t-on occasionnellement une legere augmentation du pic 16 S aux depens du pic 28 S. La radioactivite totale ne subit qu'une
tres legere inhibition (environ 8 a 20 %); par contre, si on considere la radioactivite specifique, calculee pour chaque pic d'ARN (cf. Tableau 1), on observe
une inhibition d'environ 50 % au niveau de l'ARN ribosomial 28 S et d'environ
30 % au niveau de l'ARN ribosomial 16 S. La radioactivite du pic 4S n'est pas
modifiee par cette concentration de puromycine.
La puromycine et la morphogenese
449
L'augmentation de la concentration en puromycine (a 1,5/tg/ml) dans le
milieu de culture accentue, comme on pouvait s'y attendre, le pourcentage
d'inhibition de l'incorporation d'uridine dans les differents ARN (28 S, 16S et
4S) bien que l'existence d'une incorporation residuelle demontre que l'inhibition est loin d'etre complete. L'augmentation du pic 16 S par rapport au pic
1.200 -
1.000
O
500
500
100
100
30
20
No. des fractions.
Fig. 9. Effets de 2 /tg/ml de puromycine sur les differents types d'ARN cellulaires
extraits au phenol et separes en gradients de sucrose 5 a 20 %. Conventions comme
a la Fig. 7.
10
28 S est plus marquee et plus constante qu'avec 1 ^g/ml; le pic 4S n'est toutefois
pas sensiblement modifie (cf. Fig. 8). On peut en conclure que l'inhibition de
l'incorporation de l'uridine-3H s'effectue sans qu'il se produise une denaturation considerable de l'ARN ribosomial en ARNs de poids moleculaires plus
faibles.
450
P. MALPOIX & S. LIMBOSCH
II n'en va plus de meme lorsqu'on augmente la dose de puromycine a 2 //g/ml:
si la proportion entre les pics 28 S et 16 S est retablie (Fig. 9), la forte augmentation du pic 4S temoigne probablement d'une degradation d'ARN ribosomial
en ARN leger; en effet, elle ne s'accompagne pas d'une augmentation parallele
de la radioactivite specifique du pic 4S. Le niveau extremement bas de Incorporation de l'uridine-3H, comparativement au temoin, resulte probablement d'une
inhibition de la synthese des differents ARN.
DISCUSSION
Le mecanisme d'action de la puromycine est actuellement bien connu: se
substituant a l'amino-acyl s-ARN, la puromycine s'accroche aux chaines polypeptidiques en formation, provoquant la liberation prematuree de petits polypeptides inacheves; la synthese proteique est ainsi interrompue. II etait toutefois
interessant de voir si d'une part il y avait un effet specifique de la puromycine
au niveau des differentes proteines et d'autre part, s'il existait d'autres effets
secondaires.
Meme de fortes doses de puromycine n'inhibent pas completement la synthese
de l'hemoglobine, si ce n'est qu'aux tres jeunes stades; cela semble indiquer que
la synthese des enzymes et des precurseurs de l'hemoglobine (la globine en
particulier) debute a un stade precoce. L'inhibition plus forte de l'hemoglobine
par rapport a celle des autres proteines temoigne de sa synthese intense.
La puromycine inhibe l'incorporation de 59Fe dans l'heme; puisque cette
substance exerce son effet specifique au niveau des proteines, on peut considerer l'inhibition de la synthese de l'heme comme un effet secondaire resultant
soit de l'inhibition de la synthese de la globine, soit de celle des enzymes de
synthese de l'heme. Le travail de Bruns & London (1965) montrait que l'heme
pouvait servir de stimulant pour la synthese de la globine; ici, nous observons
un effet inverse: le niveau de synthese de l'heme dependrait done en partie du
niveau de synthese de la globine.
La legere incorporation de 59Fe dans des molecules non-heme et insolubles
dans le TCA s'explique vraisemblablement par une synthese de ferritine. A
titre de comparaison, signalons que Grasso et al. (1962) ont observe, par microscopie electronique, l'existence de vesicules contenant de la ferritine dans des
erythroblastes de foie de foetus humain et de lapin.
Certains auteurs ont suggere que les voies de synthese pour les proteines
basiques seraient tres differentes de celles des autres proteines (Busch, 1965);
nos experiences avec la puromycine n'ont pas permis de deceler une telle
difference. En effet, l'incorporation des acides amines basiques est inhibee par
la puromycine autant, sinon plus, que celle des acides amines neutres.
L'importance de la synthese proteique pour la morphogenese pourrait seule
expliquer les effets morphostatiques de la puromycine. Toutefois, les dosages
biochimiques effectues au niveau de l'aire vasculaire demontrent que si la
La puromycine et la morphogenese
451
synthese des proteines et d'une proteine en particulier, l'hemoglobine, est
inhibee par la puromycine, cette inhibition s'accompagne souvent d'un effet au
niveau des acides nucleiques, meme a de faibles doses (6 /*g/ml).
L'analyse biochimique de ce processus a ete effectuee sur des erythroblastes de
sang d'embryons de 5 j 17 h; ces cellules se pretaient effectivement tres bien a
des etudes de l'incorporation de divers precurseurs, ainsi qu'a l'extraction des
acides ribonucleiques radioactifs au phenol.
Les experiences ont montre qu'une dose tres faible de puromycine (1 /*g/ml)
suffit pour inhiber de fa?on preferentielle la synthese des acides ribonucleiques
ribosomiaux. L'inhibition est de l'ordre de 50 % pour l'ARN 28 S et de 30 %
pour l'ARN 16S; elle est nulle pour les ARN legers (4S). Lorsqu'on double la
concentration de la puromycine (2 /*g/ml), l'inhibition touche toutes les formes
de l'ARN et elle devient quantitativement plus importante; dans ces conditions,
on assiste egalement a une degradation progressive des ARN ribosomiaux en
ARNs de petit poids moleculaire.
On peut se demander pourquoi 1'inhibition des syntheses proteiques dans le
tissu hematopoietique de l'embryon de poulet est suivie d'une inhibition de la
synthese de l'ARN ribosomial. L'ARN des ribosomes ne pourrait-il se synthetiser
sans une synthese parallele et peut etre simultanee des proteines ribosomiales?
Les travaux de Perry (1965) soulignent l'importance de l'addition de la partie
proteique aux acides ribonucleiques constituant les ribosomes. Une fois que
le 'pool' de proteines preexistantes est epuise, la synthese des ARNs se
ralentirait peut-etre? II est interessant a cet egard de citer un travail de Bosseleer
et al. (1964): dans les racines d'Allium cepa, on observe, en presence de puromycine (60 /<g/ml), une inhibition de 50 % de l'incorporation de deux acides
amines (la phenylalanine et la lysine) dans la fraction des ribosomes et polysomes.
De toute maniere, il semble que l'arret de la synthese de l'ARN ribosomial
serait lie, par un mecanisme encore inconnu, a l'arret de la synthese des
proteines. Notons simplement a cet egard que dans les erythrocytes, des que la
synthese de l'hemoglobine commence, on assiste a une dilution apparente du
nombre de ribosomes dans le cytoplasme (Grasso et al. 1962): en meme temps
que le nucleole se fragmente et disparait, la synthese des ribosomes s'arrete.
II est vraisemblable qu'en empechant la synthese de l'hemoglobine, la puromycine accelere ce processus normal. Un meme type d'effet a toutefois ete
observe dans des cellules ou le noyau ne perd pas son activite metabolique au
cours du cycle normal de la cellule. Tamaoki & Mueller (1965) signalent en
effet une inhibition selective par la puromycine de la synthese des ARN
ribosomiaux 28 S et 16 S dans les cellules Hela.
Concluons en signalant une information d'ordre plus general, qui est apparue
au cours de ce travail: la synthese de l'ARN dans les erythroblastes peripheriques
de la deuxieme lignee primitive s'arrete completement a la fin du 5eme jour;
cependant, pendant les dernieres heures de synthese, des ARN ribosomiaux se
synthetisent encore. Nos experiences d'incorporation de divers acides amines
452
P. MALPOIX & S. LIMBOSCH
mettent en evidence, par contre, que la synthese de l'hemoglobine continue dans
ces memes cellules jusqu'au 13eme jour: l'ARN portant l'information pour
1'hemoglobine serait done stable pendant 8 jours au moins.
RESUME
Une etude des effets morphostatiques de la puromycine chez l'embryon de
poulet a demontre qu'il existe un effet differentiel de la puromycine selon le
stade auquel le traitement debute, et selon les tissus en voie de differentiation.
Une etude autoradiographique et biochimique chez l'embryon de poulet de
2 jours, dans l'aire vasculaire desembryonne, et dans les erythroblastes du sang
d'embryons ages de 5 a 14 jours, a permis de mettre en evidence l'inhibition par
la puromycine non seulement de la synthese des proteines, et notamment de
l'hemoglobine, mais aussi celle des acides ribonucleiques.
Un effet secondaire au niveau de l'heme, dont la synthese est reduite, a ete
constate.
L'incorporation des acides amines basiques est inhibee par la puromycine
autant, sinon plus, que l'incorporation des acides amines neutres.
Une analyse plus detaillee au niveau des acides ribonucleiques a montre
qu'une dose tres faible de puromycine (1 /*g/ml) suffit pour inhiber de facon
preferentielle la synthese des acides ribonucleiques ribosomiaux. L'inhibition est
de l'ordre de 50 % pour l'ARN 28S et de 30 % pour l'ARN 16S; elle est nulle
pour les ARN legers (4S). Lorsqu'on double la concentration de la puromycine
(2/Ag/ml), l'inhibition touche toutes les formes de l'ARN (28 S, 16 S et 4 S) et
elle devient quantitativement plus importante.
La signification de l'ensemble de ces resultats a ete discutee.
SUMMARY
The influence of puromycin on the morphogenesis and the synthesis of the
macromolecules in the chicken embryo
The morphostatic effects of puromycin have been studied in chick embryos.
Effects vary with the stage at which the treatment starts and from tissue to tissue.
Autoradiographic and biochemical studies on 2-day chick embryos, on the
de-embryonated vascular area, and on the erythroblasts of 5- to 14-day chick
embryos, have shown that puromycin not only inhibits the synthesis of proteins,
notably haemaglobin, but also that of nucleic acids.
A secondary inhibitory effect has been observed on haem synthesis.
The incorporation of basic amino acids is inhibited as much as, or more than,
that of the neutral amino acids.
More detailed analysis of ribonucleic acid synthesis in the presence of puromycin has revealed that a very low dose of puromycin (1 /^g/ml) inhibits
ribosomal RNA synthesis selectively. An inhibition of the order of 50 % is
La puromycine et la morphogenese
453
observed for 28 S RNA, and of 30% for 16 S RNA; low molecular weight
RNAs (4S) are unaffected. When the concentration of puromycin is doubled
(2 /*g/ml), the synthesis of all types of RNA studied is inhibited, and overall
inhibition of RNA synthesis is much greater.
Ce travail a ete effectue dans le cadre du Contrat d'association Euratom, Universite Libre
de Bruxelles 016-61-ABIB. Le compteur a scintillation 'well-type' a ete aimablement mis a
notre disposition par le Dr Naets (Laboratoire de Medecine Experimental, Fondation
Reine Elisabeth, Bruxelles). Un des auteurs (S.L.) est une Chargee de Recherches au F.N.R.S.
TRAVAUX CITES
F., Six, N. & SIMIC, D. (1964). Effets in vivo de la ribonuclease et de la puromycine
sur l'incorporation de divers acides amines dans les proteines de racines d'Allium cepa.
Bull. Acad. r. Belg. Cl. Sci. 10, 1183.
BRACHET, J. (1963). The effects of puromycin on morphogenesis in amphibian eggs and
Acetabularia mediterranea. Nature, Lond. 199, 714-15.
BRACHET, J., DENIS, H. & DE VITRY, F. (1964). The effects of actinomycin D and puromycin
on morphogenesis in amphibian eggs and Acetabularia mediterranea. Devi Biol. 9, 398-434.
BRAY, G. A. (1960). A simple efficient liquid scintillator for counting aqueous solutions in a
liquid scintillation counter. Analyt. Biochem. 1, 279.
BRITT, L. G. & HERMANN, H. (1959). Protein accumulation in early chick embryos grown
under different conditions of explantation. /. Embryol. exp. Morph. 7, 66-72.
BRUNS, G. & LONDON, I. M. (1965). The effects of hemin on the synthesis of globin. Biochem.
biophys. Res. Commun. 18, 236-42.
BUSCH, H. (1965). In Histones and other Nuclear Proteins, New York and London: Academic
Press.
ERSLEV, A. J. (1964). Erythropoietin in vitro. II. Effects on 'stem cells'. Blood 24, 331.
FICQ, A. (1961). Contribution a Vetude du metabolisme cellulaire au moyen de la methode autoradiographique. Monographie 9, Inst. Interuniv. des Sciences Nucleaires.
FRASER, R. C. (1964). Hemoglobin formation in the chick embryo. Expl Cell Res. 25, 418-27.
GOLDWASSER, E. (1963). The effect of erythropoietin upon heme synthesis by marrow cells
in vitro. J. biol. Chem. 238, 4085.
GRASSO, J. A., SWIFT, H. & ACKERMAN, G. A. (1962). Observations on the development of
erythrocytes in mammalian fetal liver. 7. Cell. Biol. 14, 235.
HAMBURGER, V. & HAMILTON, H. J. (1951). A series of normal stages in the development of
the chick embryo. /. Morph. 88, 49-92.
HELL, A. (1964). The initial synthesis of haemoglobin in de-embryonated chick blastoderm.
I. Metabolism of the blastodisc cultured in vitro. /. Embryol. exp. Morph. 12, 609-19.
LEGROS, F. & BRACHET, J. (1965). Effets de la puromycine sur la mitose, la synthese des
proteines et celle du DNA au cours de la segmentation de l'oeuf de Batracien. /. Embryol.
exp. Morph. 13, 195-206.
PERRY, R. P. (1965). The nucleolus and the synthesis of ribosomes. Natn. Cancer Inst.
Monogr. 18, 325-40.
TAMAOKI, T. & MUELLER, G. C. (1965). The effects of actinomycin D and puromycin on the
formation of ribosomes in HeLa cells. Biochim. biophys. Ada 108, 73-80.
WILT, F. H. (1965). Regulation of the initiation of chick embryo hemoglobin synthesis.
/. Molec. Biol. 12, 331-41.
BOSSELEER,
(Manuscrit regu le 8 Avril 1966)