/ . Embryol. exp. Morph., Vol. 16, 2, pp. 301-310, October 1966
With 2 plates
Printed in Great Britain
301
Les corps multivesiculaires de Foeuf de Barnea
Candida (Mollusque Bivalve) etudies
au microscope electronique
Activite phosphatasique acide et accumulation
de rouge neutre
Par JEAN J. PASTEELS1
Laboratoire d''Embryologie et Laboratoire de Microscopie Electronique,
Faculte de Medecine, Universite de Bruxelles
INTRODUCTION
Le present travail se situe dans le cadre de l'etude des granules metachromatiques in vivo des ceufs ('meta-granules' au sens de Dalcq, 1962). Depuis leur
decouverte dans les ceufs de Mammiferes en 1952 (Dalcq, 1952), l'etude de ces
organites a ete poursuivie chez diverses especes. Parmi les Invertebres marins,
c'est surtout chez le Mollusque Bivalve Barnea Candida que l'analyse a pu etre
le mieux approfondie. C'est ainsi que Pasteels & Mulnard (1963) ont pu aboutir
aux conclusions suivantes: les meta-granules a, directement colorables, sont
constitues par des plaquettes vitellines; les granules /? (indirectement colorables)
sont les corps multivesiculaires (c.m.v.) provenant de la transformation de ces
plaquettes (Pasteels & de Harven, 1963).
Le role eventuel de ces corps multivesiculaires, accumulant selectivement le
colorant sous sa forme metachromatique, presentant des activites enzymatiques
variees (phosphatase acide, Pasteels & Mulnard, 1957; enzymes dephosphorylant
diverses nucleotides, Dalcq & Pasteels, 1963) a ete envisage des 1963 et discute
de facon plus approfondie depuis lors (Pasteels, 1965a). En bref, nous avons
considere ces corps multivesiculaires de l'ceuf comme ayant certaines proprietes
communes aux lysosomes et aux phagosomes, sans pouvoir etre exactement
assimiles a ces organites.
Toutefois, par certains points, notre demonstration pouvait sembler indirecte.
C'est pourquoi nous nous sommes efforce d'etablir, par les methodes de la
microscopie electronique, les deux conclusions-cles: (1) le colorant est effectivement fixe au niveau des corps multivesiculaires; (2) l'activite phosphatasique
acide se situe bien au niveau de certaines plaquettes ainsi qu'au niveau des
1
Adresse de Vauteur: Laboratoire d'Anatomie et d'Embryologie humaines, Faculte de
Medecine, 97 rue aux Laines, Bruxelles 1, Belgique.
302
J. J. PASTEELS
c.m.v. C'est cette double demonstration qui est apportee dans le present travail.
On y trouvera de plus certaines constatations sur l'activite phosphatasique acide
du cortex ovulaire.
TECHNIQUE
(1) Pour la coloration vitale, nous avons procede comme dans nos travaux
precedents. Les oeufs ont ete places dans le colorant 5 minutes apres la fecondation, laves ensuite plusieurs fois dans de l'eau de mer fraiche. La solution
utilisee a ete du rouge neutre a 1/5000. Apres une heure de developpement,
c'est a dire au moment ou les metagranules /? etaient bien apparents, les oeufs
ont ete fixes par une solution a 2 % de tetroxyde d'Osmium, tamponne a pH 7-2
et additionne de 45 mg par ml de sucrose. Inclusion au methacrylate de butyle
et de methyle (8/2). Les coupes ont ete 'colorees' a Facetate d'uranyle et
examinees au microscope Siemens 'Elmiskop I'.
(2) En ce qui concerne la recherche de Yactivite phosphatasique acide, nous
avonsfixeles oeufs (vierges ou fecondes a des stades divers avant la segmentation)
dans la solution suivante: 3 parties de glutaraldehyde (solution commerciale a
25 %) et 22 parties de NaCl 3-2 % dans un tampon au veronal au pH 7-4. Le
fixateur avait ete maintenu a plus ou moins 2 °C et toutes les manipulations
subsequentes avant l'incubation ont ete effectuees a cette temperature. Duree
de fixation d'une heure suivie de 2 a 3 lavages dans une solution de NaCl 3-2
tamponnee a 7-4. Ensuite, incubation dans un bain constitue par un melange
de 10 parties de solution A et de 1 partie de solution B. Solution A: 1000 cc
NaCl 3-2 % dans un tampon acetate 0,05 M + 1,2 g Nitrate de Pb. Solution B:
glycerophosphate 3 % dans NaCl 3-2 %. Le melange etait place dans une etuve
a 37 °C pendant une nuit et filtre avant l'emploi, ensuite ramene au pH 5.
Des essais prealables avec revelation au sulfure d'ammonium et montage
in to to nous ont montre que la duree d'incubation minimale revelant un debut
de reaction etait d'une heure. Nous nous sommes systematiquement limite a
cette duree pour des raisons qui seront exposees plus loin. Apres l'incubation,
les oeufs destines a la microscopie electronique ont ete laves dans une solution
de NaCl 3-2 % et tamponnee a 7-4 puis immediatement surfixes (sans revelation)
dans une solution d'OsO4. Inclusion au Vestopal.
Nous avons procede de plus a des incubations-temoins en l'absence de
glycerophosphate.
PLANCHE 1
CEuf soumis 5 minutes apres fecondation, pendant 5 minutes, a une solution de rouge neutre
1/5000 dans l'eau de mer; reporte ensuite dans de l'eau de mer normale et fixe apres 1 heure
(stade des pronuclei). c.m.v.o., Corps multivesiculaires 'ouverts' dilates par l'accumulation
du rouge neutre. Les amas de vesicules, tres reconnaissables, sont refoules a la peripherie.
c.m.v.j., Corps multivesiculaires 'jeunes', c'est a dire vitellus en voie de transformation
multivesiculaire; pas d'accumulation de rouge neutre. g., Amas golgien.
/. Embryol. exp. Morph., Vol. 16, Part 2
J. J. PASTEELS
PLANCHE 1
facing p. 302
/. Embryol. exp. Morph., Vol. 16, Part 2
PLANCHE 2
PLANCHE 2
Fig. 1. Phosphatase acide (1 heure d'incubation) sur un ceuf vierge. Multiples foyers de
reaction dans certaines plaquettes vitellines (v.) et dans des corps multivesiculaires (m.v.b.).
Fig. 2. Phosphatase acide (1 heure d'incubation) sur un ceuf vierge. Reaction au sommet des
microvillosites corticales. Pas de reaction dans les alveoles corticaux (a.c).
J. J. PASTEELS
facing p. 303
Corps multivesiculaires de Voeuf
303
RESULTATS
(a) Microscopie electronique des ceufs colores au rouge neutre {Planche 1)
Precisons le but de cette experience: nos observations anterieures faites en
collaboration avec Mulnard (1963) nous avaient montre que, parmi tous les
colorants basiques utilises, le rouge neutre est certainement le moins toxique,
et qu'il est possible d'en utiliser des concentrations relativement fortes (1/5000)
sans affecter le rythme des premieres divisions de segmentation. De telles concentrations nous avaient permis d'observer sur le vivant, au stade des pronuclei
ou de la premiere mitose, des granules /? de taille considerable (cf. Pasteels &
Mulnard, 1963, fig. 11). II etait done a presumer que de tels granules auraient
ete facilement decelables au microscope electronique.
Nous avons done colore des ceufs apres la fecondation pendant 5 minutes, les
avons laves ensuite, puis nous avons laisse evoluer jusqu'au stade des pronuclei
et les avons fixes a ce dernier stade.
Les resultats peuvent se voir sur la figure de la Planche 1. L'alteration generate
du cytoplasme est mineure. Les mitochondries et les ribosomes sont intacts de
raeme que l'appareil de Golgi, dont les citernes ne sont nullement dilatees, les
vesicules ne Petant que faiblement (fig. 1, g). La plupart des corps lipidiques
sont intacts egalement bien qu'on puisse observer de ci de la quelques figures
myeliniques. Les vesicules du reticulum sont legerement dilatees et les plaquettes
vitellines montrent des densifications locales, plus accentuees dans les ceufs
normaux. En regard de ce tableau normal ou subnormal, ce qui frappe immediatement e'est Penorme dilatation des c.m.v. dont le diametre peut atteindre
4 /i. Leur contenu ne presente en general pas d'opacite aux electrons; les vesicules
sont presentes mais refoulees a la peripherie; on a nettement l'impression que
les vesicules sont tassees par l'accumulation d'une substance qui a dilate Pensemble du c.m.v. Cette dilatation concerne non seulement des c.m.v. encore
fermes mais aussi des c.m.v. ouverts, dont la membrane est rompue. Dans ce
dernier cas, le materiel non opaque aux electrons vient au contact direct du
cytoplasme ambiant mais sans s'y meler; il reste coherent et retient les vesicules,
empechant celles-ci de se deverser dans le cytoplasme (cf. Planche 1, c.m.v.o.).
Nous observons de plus que seuls les c.m.v. ayant atteint une certaine
'maturite' sont affectes par cette dilatation. Les residus du vitellus n'y apparaissent que de facon exceptionnelle. D'autre part, nous voyons de nombreux
exemples de c.m.v. jeunes ou les vesicules se trouvent encore dans un fonds
vitellin (c.m.v.j. sur la Planche 1) et qui ne sont nullement dilates.
Comme nous Pavons vu precedemment, au stade des pronuclei, le rouge
neutre (ainsi que les autres colorants basiques) s'accumule dans des granules /?
qui se situent aux environs immediats des noyaux. Lorsque la concentration
est forte (1/5000) ces granules sont hypertrophies et constituent de veritables
vacuoles de plusieurs microns de diametre. La microscopie electronique nous a
done demontre que cette accumulation s'opere au niveau des corps multi-
304
J. J. PASTEELS
vesiculaires au terme de leur evolution. Les ''granules /?' sont done bien des corps
multivesiculaires qui ontfixe le colorant (sous sa forme metachromatique comme
nous le savons par 1'observation sur le vivant). En revanche, l'appareil de Golgi
(d'ailleurs tres diffus dans l'oeuf), ne semble pas jouer de role dans la fixation du
colorant.
(b) Phosphatase acide {Planche 2)
Comme nous l'avons vu plus haut (cf. technique) nous nous sommes assure
prealablement, sur des preparations in toto, apres revelation au sulfure d'ammonium, du temps minimum d'incubation necessaire pour voir les premieres manifestations de la reaction enzymatique (1 heure) et nous nous sommes systematiquement tenu a ce temps. Nous avons voulu eviter ainsi des diffusions focales
eventuelles et observer uniquement des sites bien electifs de reaction. Mais il
est evident que dans de telles conditions nos conclusions n'ont qu'une valeur
relative.
La presence d'une precipitation de phosphate de Pb dans un endroit de nos
coupes nous permet de conclure a la presence d'une activite phosphatasique
acide; cependant, Vabsence de precipite ne nous permet aucune conclusion
directe, car elle peut s'interpreter soit par une absence effective d'activite enzymatique, soit par une activite plus faible qui aurait pu eventuellement se manifester
par une incubation plus prolongee.
L'examen des preparations 'a blanc', e'est a dire incubees sans glycerophosphate ne revele qu'un tres fin precipite tres disperse dans l'ensemble du
cytoplasme; il se retrouve dans les preparations au glycerophosphate et est done
depourvu de signification. Compte tenu de ce leger artefact et dans les conditions d'incubation que nous avons utilisees, nous n'avons pu detecter de
reaction enzymatique qu'a quatre niveaux: (1) dans certaines plaquettes vitellines; (2) dans des c.m.v. et a leurs environs immediats; (3) au sommet des
microvillosites corticales; (4) a des endroits tres limites de la vesicule germinative.
Nous n'insisterons pas ici sur cette activite eventuelle dans le noyau, ce qui
devra faire l'objet d'etudes complementaires, et nous nous bornerons aux trois
sites d'activite cytoplasmique.
Nous n'avons pas pu, a leur sujet, deceler d'eventuelles differences entre l'oeuf
vierge et l'oeuf feconde, fixe soit en maturation soit au stade d'accouplement des
pronuclei. Si les figures de la Planche 2 se rapportent a des oeufs vierges, elles ne
presentent aucune difference avec des documents provenant d'eeufs fecondes.
(1) Certaines plaquettes vitellines (et pas toutes!) montrent des ilots de
precipite tres localises. Sur le haut de la Planche 2, fig. 2, on peut ainsi deceler
une quinzaine de ces ilots sur une seule coupe d'une plaquette; ils peuvent se
trouver indifferemment a la peripherie ou dans la masse centrale; ils restent
strictement localises dans la plaquette sans deborder dans le cytoplasme ambiant.
On peut ainsi conclure que certaines plaquettes vitellines sont le siege de foyers
multiples, tres localises, d'activite enzymatique.
Corps multivesiculaires de Voeuf
305
(2) Des foyers multiples d'activite se rencontrent aussi niveau de corps multivesiculaires en voie de maturation, c'est a dire au niveau de plaquettes vitellines
dans lesquelles se dessinent de nombreuses vesicules. L'activite semble plus
focale encore que dans le cas precedent et dans certains cas on voit nettement le
precipite cerner la paroi des vesicules (cf. Planche 2, fig. 2, m.v.b.). Dans d'autres
cas nous avons vu a cote de ces petits foyers d'activite vesiculaire, des foyers
d'activite dans le cytoplasme ambiant mais a proximite immediate (0,3 a 0,6 ju)
du c.m.v. (Ces foyers d'activite cytoplasmique se revelent par des amas de
precipite qui ont a peu pres la meme taille que les gouttelettes lipidiques reduites
par l'OsO4 et qui apparaissent en noir; la distinction est toutefois possible:
les lipides sont des masses homogenes, les amas de precipite montrent nettement
leur caractere heterogene d'accumulation cristalline.)
Concluons done que les m.v.b. en voie d'evolution montrent de multiples
petits foyers d'activite enzymatique qui paraissent se situer sur la paroi des
vesicules; contrairement a ce que nous avons vu pour les plaquettes vitellines,
quelques foyers peuvent se rencontrer egalement dans le cytoplasme ambiant,
mais a proximite immediate des c.m.v.
Notons cependant que le materiel dont nous disposons jusqu'a present ne
nous a pas permis d'observer des c.m.v. en fin d'evolution, c'est a dire deversant
leurs vesicules dans le cytoplasme ambiant.
(3) La Planche 2, fig. 3, montre une reaction extremement prononcee dans les
micro villosites corticales, en particulier dans leur 1/3 apical. En revanche, dans
le restant du cortex, la reaction est entierement negative; les alveoles corticaux
ne temoignent d'aucune activite.
Par consequent, dans les limites courtes d'incubation que nous avons choisies,
la seule activite phosphatasique acide que nous ayons pu observer dans le cortex
ovulaire se trouve au sommet des microvillosites.
DISCUSSION
(7) Videntification des metagranules
En collaboration avec Mulnard (1963) nous avions assimile les granules a
(granules metachromatiques directement colorables) a certaines plaquettes
vitellines. Ces granules a ont comme caracteristique non seulement d'etre
metachromatiques in vivo, de se sedimenter apres centrifugation dans la strate
vitelline, mais aussi d'avoir une activite phosphatasique acide (Pasteels &
Mulnard, 1957). La microscopie electronique confirme notre hypothese puisque,
dans de memes conditions d'incubation que celles que nous avions utilisees lors
de ce travail anterieur, l'activite phosphatasique acide caracterise bien certaines
plaquettes vitellines.
De meme, nous avions considere comme granules /? les corps multivesiculaires resultant de revolution et de la transformation des plaquettes vitellines.
Rappelons que ces metagranules /? ont la particularite d'etre plus legers que
306
J. J. PASTEELS
les a, de se sedimenter dans la couche hyaline apres centrifugation, qu'ils ne
sont pas directement colorables mais qu'ils reprennent secondairement le
colorant fixe sur les a au point qu'ils finissent par accumuler selectivement tout
le colorant absorbe par l'oeuf et qu'ils temoignent ainsi d'une activite phosphatasique acide.
La microscopie electronique est done venue demontrer la pertinence de notre
these: (1) les 'vacuoles' au rouge neutre sont constitutes par des c.m.v. dilates;
(2) ces corps multivesiculaires ont effectivement une activite phosphatasique
acide.
(2) La signification de Vactivite phosphatasique acide dans les plaquettes vitellines
Apres les courtes incubations qui donnent des images tres electives, l'activite
enzymatique apparait, au sein d'une meme plaquette, eparpillee en des sites
multiples. On a nettement l'impression qu'il existe ainsi de nombreux foyers
d'activite independants les uns des autres. C'est avec la meme repartition
topographique qu'apparaissent dans les plaquettes les differentes vesicules dont
l'accumulation ulterieure constituera le c.m.v. (cf. Pasteels & de Harven, 1963), et
il y a tout lieu de penser que l'activite enzymatique constitue ainsi le prelude
de la vesiculation. La transformation de la plaquette vitelline peut etre ainsi
considered comme une 'digestion', prelude de son utilisation pour l'embryon.
Quant a decider si la plaquette vitelline, au moment de cette phase terminale
de son evolution, peut etre qualifiee de 'lysosome' ceci nous parait etre une
discussion de terminologie assez oiseuse.
Cette lyse de la plaquette vitelline ne signifie toutefois pas le terme de son
evolution: elle aboutit a la constitution d'un corps multivesiculaire. Celui-ci,
bien que transitoire puisqu'il s'ouvre bientot dans le cytoplasme en y deversant
son contenu, est une entite fonctionnelle dont les proprietes sont identiques a
celles de certains corps multivesiculaires decrits dans des cellules non embryonnaires.
Nous avons vu, en effet, que les c.m.v. extrayent et concentrent tout le
colorant basique qui impregnait prealablement le fond du cytoplasme et qui
s'etait fixe sur les plaquettes vitellines. Nous avons vu (Pasteels & Mulnard,
1963) que cette faculte de concentration et d'absorption du colorant est litteralement exaltee au cours des cycles mitotiques et qu'elle aboutit assez rapidement
a extraire et concentrer tout le colorant present dans l'oeuf. Nous venons de
voir dans ce travail comment cette concentration du colorant engorge et dilate
le c.m.v. dont le contenu vesiculaire est litteralement refoule par la masse du
colorant (fixe vraisemblablement sur un substrat mucopolysaccharidique
acide).
Or, ces images que nous avons observees et decrites plus haut, sont litteralement superposables a celles qui ont ete publiees par Robbins, Marcus & Gonatas
(1964) a la suite d'un traitement de cellules Hela par des solutions d'acridineorange. Dans ces cellules egalement—ou a fortiori le vitellus n'est pas en cause —
Corps multivesiculaires de Voeuf
307
l'acridine-orange (qui au surplus de ses proprietes de fluorescence est un
colorant basique), se fixe electivement sur les c.m.v. Ceux-ci ont egalement une
activite phosphatasique acide. Lorsque les conditions experimentales sont les
memes que les notres, c'est a dire une coloration initiale assez forte mais de
duree courte, suivie d'un temps de repos, le resultat est identique: tout le
colorant qui au debut impregnait uniformement le cytoplasme est absorbe par
les c.m.v. et les aspects morphologiques de cet engorgement sont absolument
identiques a ceux que nous avons observes.
Robbins, Marcus & Gonatas ont egalement decrit les transformations profondes et complexes des c.m.v. soumis aux effets progressifs d'une concentration
constante de colorant. Nous n'insisterons pas sur ce point puisque, jusqu'a
present, nous n'avons pas fait d'experiences semblables. II y a lieu de relever
cependant que ces auteurs ont pu demontrer que la fixation du colorant par les
c.m.v. est un mecanisme actif, lie a une consommation d'energie par le metabolisme des glucides.
II est done prouve que, en depit ce leur caractere transitoire, les c.m.v. des
oeufs sont des organites actifs, identiques aux c.m.v. des cellules non embryonnaires. Leur role (ou peut-etre Pun de leurs roles) consiste a extraire certains
corps etrangers de la cellule, a les concentrer et eventuellement, lorsque ces
corps sont susceptibles aux enzymes hydrolytiques, les detruire.
L'oeuf presente toutefois un aspect particulier: le c.m.v. est un stade transitoire
de 1'evolution du vitellus et non un organite permanent. On peut ainsi presumer
qu'au fur et a mesure de 1'evolution vitelline, des generations successives de
c.m.v. se relaient pour assurer la continuity de la fonction.
(3) Le 'vacuome' de Parat
Une des questions les plus controversies d'il y a trente ou quarante ans semble
bien a present en voie de solution. Des colorations au rouge neutre in vivo faites
par Parat et ses collaborateurs (cf. Parat, 1928) avaient fait etablir par cet
auteur l'existence eventuelle d'un systeme de vacuoles intracellulaires (le
'vacuome') dont la signification a fait l'objet de nombreuses controverses.
Considere comme artefact par les uns, systeme golgien par d'autres, ce vacuome
semblait n'avoir plus actuellement qu'un simple interet historique. Les travaux
paralleles de Robbins et al. ainsi que les notres semblent bien demontrer, dans
les deux cas ou il a ete analyse, que le 'vacuome' est constitue par des corps
multivesiculaires.
(4) Le role des microvillosites corticales
La microscopie electronique a demontre la presence de microvillosites a la
surface de tous les oeufs. Les oeufs marins n'y font pas exception. Ces microvillosites peuvent varier dans leur abondance; chez certaines especes, elles
peuvent etre aussi considerablement remaniees au moment de la fecondation
(cf. Pasteels, \%Sb). De plus, comme nous l'avons fait remarquer dans ce
308
J. J. PASTEELS
precedent travail, on trouve souvent a leur base un complexe de vesicules suggerant fortement une pinnocytose. II est done extremement vraisemblable
que cet appareil microvillositaire assure les echanges de Foeuf et du milieu
exterieur. Mais dans quel sens? La presence d'une forte activite phosphatasique
acide au sommet des villosites peut servir d'indication a cet egard. La seule
explication plausible du role eventuel de cette phosphatase serait d'hydrolyser
un substrat existant dans Pceuf, prealablement a son excretion dans le milieu
exterieur.
RESUME
1. Des ceufs fecondes, colores pendant 5 minutes au rouge neutre 1/5000
montrent sur le vivant, 1 heure plus tard (stade des pronuclei), une accumulation
de colorant dans des vacuoles de 4 a 5 /* de diametre situees autour des pronuclei
(cf. Pasteels & Mulnard, 1963); un examen au microscope electronique demontre
que ces vesicules resultent de la dilatation des corps multivesiculaires provenant
de la transformation des plaquettes vitellines.
2. L'activite phosphatasique acide, apres une incubation courte (1 heure),
a ete decelee au microscope electronique: elle apparait electivement en des sites
tres limites de certaines plaquettes vitellines, au niveau des corps multivesiculaires
ainsi qu'au sommet des microvillosites corticales.
3. Ces observations nous permettent de confirmer l'hypothese emise precedemment (Pasteels & Mulnard, 1963): les meta-granules oc sont constitues
par certaines plaquettes vitellines, les meta-granules /? par les c.m.v. qui derivent
de la transformation des plaquettes vitellines.
4. Les images d'accumulation du rouge neutre par les c.m.v. sont superposables a celles qui ont ete decrites par Robbins, Marcus & Gonatas (1964)
apres coloration de cellules Hela, par l'acridine orange, dans des conditions
experimentales semblables. Les c.m.v. de l'ceuf, bien que constituant une phase
transitoire de la transformation du vitellus, ont done une fonction identique a
celle des c.m.v. de certaines cellules non embryonnaires.
5. A la lumiere de ces observations, le 'vacuome' de Parat peut etre assimile
aux c.m.v.
6. La presence d'une activite phosphatasique acide au sommet des microvillosites corticales permet de supposer qu'il existe a ce niveau une dephosphorylation prealable a une elimination de substances ovulaires vers le milieu
exterieur marin.
Corps multivesiculaires de Vceuf
309
SUMMARY
Multivesicular bodies of the egg o/Barnea Candida studied with the
electron microscope
1. Fertilized eggs, stained for 5 min with 1/5000 neutral red solution, when
examined an hour later (at the stage of the pronuclei) show all the stain concentrated in vacuoles having a diameter from 4 to 5 /i, crowded around the
pronuclei (cf. Pasteels & Mulnard, 1963). After examination with the electron
microscope, it appears that these vacuoles are the result of an enlargement of
the multivesicular bodies (m.v.b.) deriving from the transformation of the yolk
platelets.
2. Acid phosphatase activity (after an incubation of 1 h) has been detected
in e.m. sections; this activity appears selectively in very limited areas of some
yolk platelets, on the m.v.b. and at the top of the cortical microvilli.
3. These observations allow us to confirm the previous hypothesis of Pasteels
& Mulnard (1963): that the a meta-granules are some of the yolk platelets while
the /? meta-granules are the m.v.b. deriving from those platelets.
4. The pictures of the accumulation of neutral red into the m.v.b. are
identical with those which have been published by Robbins, Marcus & Gonatas
(1964), who stained Hela cells with acridine orange under the same experimental
conditions. The m.v.b. of the egg, although being a transitory phase of the
transformation of the yolk, have thus the same properties as the m.v.b. of some
non-embryonic cells.
5. It might be concluded that the 'vacuome' of Parat (1928) is constituted by
the m.v.b.
6. The existence of an acid phosphatase activity on top of the cortical microvilli permits one to presume that this activity is preliminary to an excretion of
some substances from the egg into sea-water.
TRAVAUX CITES
A. M. (1952). La coloration vitale au bleu de toluidine et sa manifestation metachromatique. C. R. Soc. Biol. 146, 1408-11.
DALCQ, A. M. (1962). Localisations et evolution des phosphatases aux premiers stades du
developpement. Bull. Acad. r. Med. Belg. (Vlleme ser.) 2, 573-610.
DALCQ, A. M. & PASTEELS, J. J. (1963). La localisation d'enzymes de dephosphorylation dans
les ceufs de quelques Invertebres. Devi. Biol. 7, 457-87.
PARAT, M. (1928). Contribution a l'etude morphologique et physiologique du cytoplasme.
Arch. Anat. microsc. 24, 73-356.
PASTEELS, J. J. (1965 a). Aspects structuraux de la fecondation vus au microscope electronique.
Arch. Biol., Liege 16, 463-509.
PASTEELS, J. J. (19656). Etude au microscope electronique de la reaction corticale. I. La
reaction corticale de fecondation chez Paracentrotus et sa chronologic II. La reaction
corticale de 1'ceuf vierge de Sabellaria alveolata. J. Embryol. exp. Morph. 13, 327-39.
PASTEELS, J. J. & de HARVEN, E. (1963). Etude au microscope electronique du cytoplasme de
Pceuf vierge et feconde de Barnea Candida (Mollusque bivalve). Archs Biol, Liege 74,415-37.
DALCQ,
310
J. J. PASTEELS
PASTEELS, J. J. & MULNARD, J. (1957). La metachromasie in vivo au bleu de toluidine et son
analyse cytochimique dans les oeufs de Barnea Candida, Gryphaea angulata (Lamellibranches)
et de Psammechinus miliaris.
PASTEELS, J. J. & MULNARD, J. (1963). Les relations entre meta-granules a et /? dans l'oeuf du
Mollusque bivalve Barnea Candida. Archs Biol., Liege 74, 319-40.
ROBBINS, E., MARCUS, P. I. & GONATAS, N. K. (1964). Dynamics of acridine orange-cell
interaction. / . Cell. Biol. 21, 49-62.
(Manuscrit regu le 27 Avril 1966)