/ . Embryol. exp. Morph., Vol. 15, 2, pp. 143-151, April 1966
With 5 plates
Printed in Great Britain
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Formation de cytasters dans les oeufs de Batraciens
sous Faction de Feau lourde
Par S. VAN ASSEL & J. BRACHET 1
Laboratoire de Morphogenese experimentale et de Physiologie cellulaire,
Faculte des Sciences, Universite Libre de Bruxelles
Des travaux recents de Gross et de ses collaborateurs (Gross & Spindel, 1960 a, b;
Gross & Cousineau, 1963; Gross, Spindel & Cousineau, 1963,1964) ont montre
que la formation de cytasters, dans le cytoplasme des oeufs vierges d'oursins,
s'obtient aisement par un traitement avec de l'oxyde de deuterium (eau lourde:
D2O). A haute concentration, l'eau lourde agit comme un agent parthenogenetique.
Les ceufs fecondes, traites a l'eau lourde, forment aussi de nombreux cytasters.
Mais ce phenomene s'accompagne d'un arret brusque de la mitose: le cycle de
division se bloque au stade ou il se trouvait au moment ou l'ceuf a ete place dans
l'eau lourde. Tout se passe comme si l'appareil mitotique normal se 'petriflait'.
Gross & Spindel (1960 a, b, c) et Gross et al. (1964) ont emis diverses hypotheses pour expliquer l'actioh antimitotique du D 2 O. Voici celle qu'ils considerent comme la plus probable: il se produirait une substitution de liens
deuteres (D) aux liens hydrogene (H) dans les macromolecules qui forment la
substance fondamentale du cytoplasme et dans les liaisons qui maintiennent ces
molecules sous forme colloidale.
Les liens D etant probablement plus solides que les liens H, ces alterations
auraient pour effet d'accroitre la rigidite du cytoplasme. Le blocage de la
mitose proviendrait done d'un processus de gelification du cytoplasme et de
structures en voie de formation, ou completement organisees, qui incluent les
asters, le fuseau, les sillons de clivage, mais vraisemblablement pas les centrosomes et le materiel chromosomial.
On peut citer, en faveur de cette hypothese, le fait que la viscosite du cytoplasme augmente effectivement sous Faction du D 2 O. Les mesures de rigidite
du cytoplasme deutere effectuees par Marsland & Zimmerman (1963) concordent egalement avec l'hypothese de Gross et al.
Les effets du D2O sur le developpement des oeufs d'Amphibiens ont ete etudies,
pour la premiere fois, par Ussing (1935). II resulte de son travail que la sensibilite des oeufs de grenouille (Rana platyrrhina) est plus grande que celle des
1
Adresse des auteurs: Laboratoire de Morphogenese experimentale et de Physiologie cellulaire, 67, Rue des Chevaux, Rhode-Saint-Genese, Belgique.
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ceufs d'oursins. En effet, des concentrations en D2O au-dessus de 30 % inhibent
deja completement la segmentation. Les ceufs de crapaud (Bufo viridis) sont un
peu plus resistants que ceux de grenouille; ils peuvent se developper pendant
24 heures, dans 30 a 40 % de D 2 O; les embryons meurent alors.
Ce n'est qu'en 1962 que les travaux sur les oeufs d'Amphibiens ont ete repris
par Beetschen & Dubost. Ils ont etudie les effets de concentrations en D 2 O
comprises entre 10 et 50 %, sur les divers stades du developpement des oeufs de
pleurodele. II ressort de leurs experiences que, a mesure que leur developpement progresse, les oeufs supportent des concentrations croissantes d'eau lourde,
pendant des temps de plus en plus longs. Les oeufs fecondes, encore indivis, se
clivent d'une maniere anarchique, pendant quelques heures s'ils sont traites par
30 % d'eau lourde, avant l'amphimixie. Pour une concentration de 40 % de
D 2 O, la pigmentation de l'ceuf devient tres irreguliere et la segmentation ne
debute pas. Des concentrations de 30 a 50 % de D2O inhibent fortement la
gastrulation et la neurulation.
Zotin (1964) a place des ceufs d'axolotl, au debut de leur premiere division,
dans 99,8 % d'eau lourde et il les a reportes, apres quinze minutes, dans de
l'eau ordinaire. Ce traitement a provoque un arret du clivage et la formation
d'un grand nombre de petits blastomeres a la surface de l'oeuf, a cote du sillon
de premiere division. Zotin pense que la formation de ces pseudo-blastomeres
est due a l'induction de sillons, a la surface de l'ceuf, par les nombreux diastemes
qui auraient ete formes par action de l'eau lourde.
Comme aucune etude portant sur des oeufs d'Amphibiens traites a l'eau lourde
ne fait mention de l'apparition de cytasters dans le cytoplasme de ces ceufs, il
nous a paru utile de reprendre la question.
MATERIEL ET METHODES
Les experiences ont ete effectuees sur des oeufs de Xenopus laevis, Pleurodeles
waltlii et Rana temporaria.
Les oeufs utilises etaient soit vierges, soit fecondes; dans ce cas, il s'agissait
toujours de stades tres jeunes (oeufs indivis, 2-4 ou 8 blastomeres). Ils etaient
degangues a la pince. Apres un pretraitement eventuel, ils etaient mis, par lots
de 8 ou 10, dans de petits cristallisoirs contenant 2 ml. d'eau lourde (Norsk
Hydro-Elektrisk Kvaelstofaktieselskab) a la concentration desiree (100 %
D2O ou 50 % D2O dans de l'eau bidistillee).
Des oeufs temoins etaient places dans de l'eau bidistillee, qui n'exerce aucun
effet defavorable sur le developpement.
La duree d'exposition des oeufs a l'eau lourde ne depassait guere 2 heures; en
effet, les fortes concentrations bloquent tres rapidement la division.
Au moment voulu, les oeufs traites a l'eau lourde etaient fixes, en meme temps
que des oeufs temoins, au Zenker, pendant 1 heure. Les coupes a la paraffine
etaient colorees soit a l'Unna, soit au bleu de toluidine, soit au Feulgen.
Cytasters dans les ceufs de Batraciens
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Dans quelques cas, des coupes d'oeufs fixes par freeze-substitution ont ete
traitees par de l'actinomycine 14C et soumises a l'autoradiographie, dans les
conditions adoptees par Brachet & Ficq (1964). Cette technique a pour but de
deceler des acides deoxyribonucleiques (DNA) trop labiles pour resister a la
reaction de Feulgen. C'est le cas, en particulier, de la majeure partie du DNA
cytoplasmique.
Enfin, des ceufs bloques par un traitement d'une heure dans l'eau lourde
(100 %) ont ete fixes par de l'aldehyde glutarique a 6 % dans un tampon phosphate a pH 7,4 pendant 24 heures. Apres un lavage de 16 a 18 heures dans ce
tampon, ils ont subi une surfixation d'une heure a l'OsO 4 1 % dans le tampon
phosphate et ont ete inclus dans de l'Araldite.
Des coupes ultra-fines ont ete pratiquees a l'aide d'un Ultrotome L.K.B.
Apres une double coloration a l'acetate d'uranyle et au citrate de plomb, elles
ont ete observees avec un microscope electronique Hitachi H S-6.
RESULTATS EXPERIMENTAUX
A. Microscopie optique
I. Action de Veau lourde a concentration elevee sur des stades tres jeunes d'ceufs
de Batraciens
(a) Observations directes. 1°. 100 % de D 2 O. Lorsque des oeufs, quelle que
soit l'espece etudiee, sont places aux stades indivis, 2- 4 ou 8 blastomeres dans
de l'eau lourde pure, ils n'arrivent pas a terminer la division en cours.
En comparant le comportement des oeufs traites au D2O et celui des oeufs
temoins, on observe simultanement l'apparition des sillons de la nouvelle division
dans les traites et dans les temoins. Ce n'est qu'une vingtaine de minutes
plus tard que Faction du D2O devient manifeste. En effet, alors que les sillons
de clivage progressent normalement chez les temoins, ils s'estompent peu a peu
dans les oeufs traites. Bientot, a Pemplacement de ces sillons, il ne subsiste plus
qu'une ligne depigmentee a la surface de l'oeuf. Ce phenomene s'accompagne
de deplacements du pigment, particulierement visibles au pole animal.
Tous les oeufs sont totalement bloques une heure a une heure et un quart apres
le debut du traitement a l'eau lourde. Durant ce laps de temps, les oeufs temoins
ont accompli deux cycles mitotiques complets.
Si les oeufs bloques sont laisses dans l'eau lourde, ils se cytolysent au bout de
quelques heures.
2°. 50 % de D2O. Des ceufs, aux stades 2 et 8 blastomeres, ont ete places dans
une solution de 50 % de D2O et 50 % d'eau bidistillee. Dans les deux cas, les
ceufs ont pu achever un cycle mitotique complet. Une fois cette division terminee, le developpement des ceufs s'est bloque irremediablement, en peu de
temps. On peut observer un remaniement tres marque de la pigmentation des
oeufs: de nombreux amas pigmentaires etoiles se forment a leur surface.
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(b) Examens cytologiques. Les ceufs bloques par l'eau lourde et les temoins
correspondants qui proviennent des experiences qui viennent d'etre resumees
ont ete examines cytologiquement.
L'examen des coupes pratiquees dans les ceufs de xenope ou de pleurodele
bloques par le D 2 O, colorees a l'Unna, revele la presence d'un nombre considerable de cytasters dans le cytoplasme de ces oeufs. On observe cette meme
abondance de cytasters quel que soit le stade de l'ceuf considere, qu'il s'agisse
d'ceufs traites par 100 % ou 50 % de D 2 O. Ces cytasters sont accumules principalement au pole animal. Us sont fortement colores par la pyronine ou le bleu
de toluidine et negatifs au Feulgen. Us ont la meme structure rayonnee que les
asters normaux, qui sont bien visibles chez les temoins; mais leur taille est
beaucoup plus petite et leurs fibres sont plus grossieres (Planche 1, figs. 1 et 2).
Dans le cas des oeufs de grenouille, l'abondance du pigment rend l'examen
cytologique plus delicat. II semble bien qu'il y ait de nombreux cytasters, mais
ils sont dissimules sous d'importants amas pigmentaires. Dans les oeufs de
xenope et de pleurodele, les cytasters forment, au contraire, des zones depourvues de pigment.
Signalons, enfin, le fait que Faction antimitotique de l'eau lourde ne semble
pas se manifester a un stade particulier du cycle mitotique. En effet, nous avons
pu observer, dans les oeufs bloques, des noyaux aux differents stades de la
mitose.
II. Reversibilite de Faction de Veau lourde
Des oeufs de xenope (stade 2 ou 4 blastomeres), bloques, sous Faction de l'eau
lourde pure, ont ete laves et remis dans de l'eau bidistillee. Ils ont ete fixes une
heure plus tard.
(a) Observations directes. II n'a pas ete possible d'observer une reversibilite
totale de Faction antimitotique de l'eau lourde. Toutefois, le retour des oeufs
dans un milieu normal leve partiellement l'inhibition due a l'eau lourde. En
effet, dans les cas les plus favorables, on peut observer l'apparition, en une
heure, d'un grand nombre de tres petits blastomeres anarchiques a la surface
des oeufs. Ce phenomene est rapidement suivi de la cytolyse.
II apparait done que, par report dans un milieu normal, les ceufs recuperent
la capacite, sinon de se diviser, tout au moins de se fragmenter. En tout etat de
cause, un developpement normal ne peut plus se produire, la structure de l'oeuf
ayant probablement subi de trop fortes alterations durant le traitement au D 2 O.
Les resultats de ces experiences concordent bien avec les observations de Beetschen & Dubost (1962) et de Zotin (1964), qui ont travaille sur d'autres especes.
(b) Observations cytologiques. L'examen des coupes pratiquees dans les oeufs
qui ont ete reportes en milieu normal montre que le nombre des cytasters a
sensiblement diminue. Ceux qui subsistent se sont considerablement agrandis
et leur ressemblance avec les vrais asters mitotiques s'est accentuee (Planche 2,
fig. 3).
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PLANCHE
Fig. 1. Cytoplasme et asters normaux dans un oeuf temoin (Xenope). x 160.
Fig. 2. Cytasters au pole animal d'un oeuf de Xenope (stade 4 blast.) traite pendant \-\ heures
a l'eau lourde 100%. x 640.
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PLANCHE 2
Fig. 3. (Euf de Xenope (stade 2 blast.) reporte dans de l'eau apres H heures de traitement au
D2O, pendant 2 heures. Les cytasters se sont agrandis. x 160.
Fig. 4. (Euf de Pleurodele centrifuge et traite au D2O. De haut en bas: calotte graisseuse,
hyaloplasme contenant des cytasters, pigment, vitellus. x 200.
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Cytasters dans les ceufs de Batraciens
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Les blastomeres anarchiques contiennent un nombre variable de cy tasters.
Ce ne sont, en realite, que des pseudo-blastomeres, depourvus de materiel
chromosomial.
III. Action de Veau lourde sur les ceufs vierges
Les coupes pratiquees a travers des oeufs vierges de xenope, traites a l'eau
lourde (50 ou 100 %) pendant une a deux heures, revelent aussi la presence de
tres nombreux cytasters, concentres au pole animal de l'oeuf.
II ne semble cependant pas que l'eau lourde ait provoque une reelle activation parthenogenetique des oeufs vierges. En effet, si le traitement par le D2O
est suivi d'un retour dans un milieu normal, les oeufs se cytolysent rapidement
sans qu'apparaissent, a aucun moment, des sillons de clivage.
Nos resultats different done, sur ce point, de ceux qui ont ete obtenus dans le
cas des ceufs d'oursins (Gross et ah 1964).
IV. Etude de Vapparition des cytasters au cours du temps
Nous avons cherche a preciser si le nombre de cytasters formes varie en
fonction de la duree du traitement a l'eau lourde qui precede le blocage de la
division de l'ceuf.
Des coupes pratiquees dans des ceufs de xenope (stade 2 blastomeres) fixes
de dix en dix minutes, ont permis de constater que les cytasters apparaissent
tous simultanement et que leur nombre n'augmente plus par la suite.
Apres trente-cinq minutes environ de traitement par l'eau lourde, le cytoplasme commence a presenter des bouleversements, correspondant sans doute a
une gelification. Une dizaine de minutes plus tard, on observe l'apparition de
tres petits cytasters. Us n'atteignent leur taille definitive qu'apres dix a vingt
minutes supplementaires de traitement.
V. Lieu de formation des cytasters
Des oeufs indivis de xenope et de pleurodele ont ete centrifuges a 1.400
tours/min. pendant 5 min. de facon a separer le vitellus de l'hyaloplasme.
Ces oeufs ont ensuite ete soumis a Faction de l'eau lourde (100 %). L'examen
des coupes pratiquees a travers ces oeufs permet de constater que les cytasters se
forment uniquement dans la zone hyaloplasmique, riche en RNA (Planche 2,
fig. 4).
VI. 'Coloration' a Vactinomycine-^C des coupes pratiquees dans des oeufs de
xenope traites au D2O
L'examen des autoradiographies n'a pas permis de distinguer une radioactivite plus intense au niveau des cytasters que dans le restant du cytoplasme.
II n'y a aucune difference nette entre les oeufs traites a l'eau lourde et les temoins.
On ne peut cependant pas conclure de ce resultat negatif qu'il n'existe pas
de DNA au niveau des cytasters.
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B. Micwscopie electronique
Notre principal objectif a ete de rechercher la presence eventuelle de centrioles au centre des cytasters et de preciser la structure des fibres asteriennes.
Plusieurs photographies ont revele la presence, dans le cytoplasme, de petites
structures dont la forte densite electronique et l'aspect particulier permettent
de les identifier, presque certainement, comme des centrioles (Planche 3, figs.
5 et 6). Nous ne possedons, malheureusement, pas de photos de centrioles
presents dans des oeufs de xenope normaux, ce qui leverait les derniers doutes.
On remarque souvent des paquets de fibres (Planche 4, fig. 7) qui s'irradient
a partir de la zone ou sont situes les centrioles. II s'agit vraisemblablement des
fibres asteriennes qui, au microscope optique, forment les structures rayonnantes des cytasters. De tels faisceaux de fibres sont visibles en maints endroits
du cytoplasme. Elles semblent moins bien organisees que lors des mitoses
normales.
II est a remarquer que les fibres asteriennes et les centrioles sont toujours
localises dans des plages de cytoplasme dont l'aspect est tres particulier. Elles
se distinguent facilement du restant du cytoplasme parce qu'elles sont depourvues de grosses particules telles que les plaquettes vitellines, les mitochondries,
le pigment. Ces plages sont occupees par de nombreuses petites vesicules et
d'abondants ribosomes. On y observe tres frequemment aussi de longues vesicules, qui semblent s'etirer de facon a prendre un aspect plus ou moins tubulaire
(Planche 5, fig. 8). Leurs relations avec les fibres asteriennes demeurent
obscures.
Signalons, enfin, le fait qu'on peut observer la presence de nombreuses
'vesicules multi-granulaires' situees soit dans les zones asteriennes, soit en
dehors (Planche 5, fig. 9). Ces vesicules, qui sont actuellement etudiees dans
notre laboratoire, emprisonnent un grand nombre de ribosomes. Leur role est
encore inconnu.
Ces vesicules, dans le cas des oeufs de xenope traites au D 2 O, sont anormalement developpees par rapport au stade ou ces oeufs se trouvent: en effet, les
oeufs de xenope indivis ne contiennent normalement que de petites vesicules, qui
commencent seulement a se former. Normalement, les vesicules 'multigranulaires' bien constitutes, semblables a celle de la Planche 5, figure 9,
n'apparaissent que vers la gastrulation (communication personnelle de P. Van
Gansen).
DISCUSSION
Ce travail montre qu'il est possible d'obtenir, a volonte, des cytasters, par
traitement des oeufs de Batraciens par de l'eau lourde concentree. On peut done
etendre a ces oeufs les donnees de Gross et de ses collaborateurs sur les effets du
traitement par l'eau lourde des oeufs d'oursins.
Les oeufs des diverses especes d'Amphibiens etudiees sont toutes egalement
sensibles a l'action de l'eau lourde. Celle-ci est un excellent agent antimitotique,
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PLANCHE 3
Figs. 5 et 6. Coupes transversales de centrioles (?)—c. x 100.000.
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Fig. 7. Fibres asteriennes, detail, x 100.000.
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PLANCHE 4
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PLANCHE 5
Fig. 8. Longues vesicules tubulaires. x 35.000.
Fig. 9. Vesicule 'multi-granulaire'. x 35.000
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facing p. 149
Cytasters dans les ceufs de Batraciens
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a tous les stades jeunes du developpement embryonnaire. Ses effets, a concentration elevee, sont quasi identiques pour les oeufs de Batraciens et ceux d'oursins.
Dans les deux cas, l'arret des mitoses est brutal, quel que soit le stade du
developpement des oeufs. Les oeufs de Batraciens et d'oursins forment, tous
deux, de nombreux cytasters; ceux-ci, apres report dans le milieu normal,
diminuent de nombre, mais augmentent de taille.
Les reactions des deux types d'oeufs different, cependant, sur certains points.
Par exemple, l'arret des mitoses se produit moins rapidement chez les oeufs
de Batraciens que chez ceux des oursins. Chez les Batraciens, il faut une demiheure environ avant que les effets de l'eau lourde ne deviennent evidents; chez
l'oursin, l'arret de la mitose suit immediatement l'immersion dans l'eau lourde.
D'autre part, la reversibilite de l'action du D2O est beaucoup moins nette
chez les Batraciens que chez les oursins. L'activation parthenogenetique des
ceufs de Batraciens ne semble pas se produire, alors que l'eau lourde constitue
un agent d'activation tres efficace pour les oeufs d'oursins. Cette variability
relative des resultats est sans doute en rapport avec l'enorme difference de
volume existant entre les oeufs des Batraciens et ceux des Echinodermes.
En ce qui concerne la formation de cytasters, nos resultats ne concordent pas
toujours avec ceux obtenus chez les oeufs d'oursins. En effet, on sait que, chez
ceux-ci, les cytasters n'apparaissent pas tous en meme temps lors du traitement
par l'eau lourde et qu'ils sont capables de former des figures mitotiques multipolaires lorsque les ceufs sont remis dans un milieu exempt de deuterium. Chez
les Batraciens, par contre, les cytasters se forment apparemment tous au meme
moment; l'examen cytologique des oeufs reportes dans de l'eau ne nous a
jamais permis d'observer la formation de fuseaux, en rapport avec les cytasters.
Nos donnees sur la formation et l'ultrastructure des cytasters sont, dans
l'ensemble, favorables a l'idee qu'ils ressemblent beaucoup aux asters mitotiques normaux.
En effet, les cytasters et les asters normaux se forment tous deux dans l'hyaloplasme. Ils sont colores de la meme fa9on par la pyronine et le bleu de toluidine.
Ils contiennent tous deux du RNA. Enfin, l'ultrastructure des cytasters est, tres
vraisemblablement, proche de celle des asters normaux: ils sont formes de fibres
asteriennes et peuvent posseder des centrioles, dont les dimensions (de l'ordre
de 800 a 1.000 A) sont normales. Nos observations sur la presence de centrioles
dans les cytasters concordent avec celles de Dirksen (1961), qui a demontre
l'existence de centrioles dans les asters d'oeufs d'oursins actives artificiellement.
On a vu que les cytasters se forment dans des zones de cytoplasme riches en
ribosomes et en vesicules et depourvues de grosses particules. De telles zones
ont ete decrites aussi par Gross & Spindel (19606) dans des oeufs d'oursins
traites a l'eau lourde, mais ils ne signalent pas la presence de fibres asteriennes
et de centrioles dans ces regions qu'ils interpretent comme de simples ilots de
gelification du cytoplasme.
S'il se confirme que les cytasters induits par traitement a l'eau lourde con-
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tiennent des centrioles, le probleme de la formation des cytasters se transformera
en celui de l'origine des centrioles. On peut evidemment emettre deux hypotheses a ce sujet; ou bien, les centrioles pourraient se former par replication de
centres preexistants dans l'oeuf, ou bien les centrioles apparaitraient de novo.
Dans ce dernier cas, il est concevable que les oeufs contiennent le materiel
necessaire a l'elaboration de ces centres, mais sous une forme dispersee dans le
cytoplasme; l'eau lourde pourrait eventuellement favoriser l'agregation de ce
materiel, ce qui entrainerait la formation de centrioles bien organises.
Seule, une etude plus poussee des cytasters et de l'action de l'eau lourde,
pourra nous eclairer. II conviendra, en particulier, de rechercher si la formation
des cytasters exige des syntheses de proteines et d'acides nucleiques pour se
realiser.
RESUME
Des oeufs de Batraciens ont ete soumis a Faction de l'eau lourde a haute concentration (50 ou 100 %). II resulte de ce traitement:
(a) un arret rapide des mitoses dans les oeufs fraichement fecondes;
(b) 1'apparition de nombreux cytasters dans les oeufs vierges et fecondes.
Une etude de ces cytasters a permis d'etablir les points suivants:
(1) les cytasters se forment dans l'hyaloplasme;
(2) ils apparaissent simultanement;
(3) ils diminuent de nombre et augmentent de taille par report des oeufs dans
un milieu normal;
(4) un examen au microscope electronique montre que les cytasters sont
formes de fibres asteriennes et qu'ils peuvent contenir des centrioles.
Ces resultats sont discutes.
SUMMARY
The formation of cytasters in amphibian eggs after treatment
with heavy water
Amphibian eggs have been subjected to the action of heavy water (D2O) at
high concentration (50 % or 100 %). Such a treatment results in:
(a) a quick arrest of mitotic activity in newly fertilized eggs;
(b) the appearance of many cytasters in unfertilized and fertilized eggs.
A study of these cytasters has led to the following conclusions:
(1) the cytasters are formed in the hyaloplasm;
(2) they appear simultaneously;
(3) they decrease in number and increase in size when the eggs are replaced
in normal medium;
(4) electron microscopy shows that the cytasters are formed of astral fibres
and that they may contain centrioles.
These results are discussed.
Cytasters dans les ceufs de Batraciens
151
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