J. Embryol. exp. Morph. Vol. 15, 1, pp. 39-60, February 1966
With 3 plates
Printed in Great Britain
39
Etude du developpement embryonnaire et
recherches sur les cellules de regeneration
chez Fembryon de la Planaire Polycelis
nigra (Turbellari^, Triclade)
Par A. LE MOIGNE 1
Laboratoire de Biologie Animate S.P.C.N.
(Directeur: Th. Lender)
Depuis les travauxde Dubois (1949) sur la regeneration chez les Planaires, il est
admis par la plupart des auteurs, que ce sont des cellules totipotentes du parenchyme, les neoblastes, qui participent a la formation du blasteme de regeneration. Une blessure declenche leur migration vers la region lesee. On considere
que les neoblastes ont conserve les caracteres de cellules embryonnaires indifferenciees; ils se differencient dans le blasteme pour reconstituer les organes
manquants.
Cependant, nos connaissances actuelles ne permettent pas de dire s'il existe
deja chez l'embryon des cellules presentant les caracteres des neoblastes, et si,
dans l'afnrmative, l'embryon est apte a les utiliser pour regenerer. On ne sait
rien des mecanismes qui feraient qu'a un moment donne du developpement
embryonnaire des cellules formeraient des ebauches d'organes et se differencieraient, tandis que d'autres resteraient a l'etat embryonnaire.
Dans ce travail, j'ai cherche a savoir s'il existe des neoblastes chez l'embryon
de Polycelis nigra, et s'ils peuvent former un regenerat, en utilisant trois
methodes:
La recherche du RNA dans les cellules embryonnaires par des colorations au
vert de methyle pyronine.
Des cultures d'embryons degangues et sectionnes a differents stades.
Des irradiations d'embryons de differents ages.
La teneur en RNA des cellules embryonnaires de Planaires a ete examinee au
cours d'une etude descriptive du developpement normal de Polycelis nigra (Le
Moigne, 1963). Les neoblastes sont fortement colores par la pyronine, etant
donne leur richesse en RNA (Pedersen, 1959; Lender & Gabriel, 1960); j'ai
pense pouvoir utiliser cette technique de coloration pour les retrouver chez
1
Adresse de Vauteur: Laboratoire de Biologie Animale S.P.C.N., Universite de Paris,
Faculte des Sciences d'Orsay, Orsay (Seine et Oise), France.
40
A. LE MOIGNE
l'embryon. Son efficacite est cependant assez limitee ici, car les cellules embryonnaires sont generalement toutes riches en RNA; Brachet (1959) en donne de
nombreux exemples.
Des experiences ont ete faites pour controler si la regeneration est possible
avant la fin du developpement embryonnaire, ce qui permettrait de conclure a la
presence chez l'embryon de cellules totipotentes, capables de migrer et de restituer les parties amputees comme les neoblastes chez l'adulte.
On sait que les cellules d'une ebauche embryonnaire deja determinee sont plus
resistantes aux rayons X que des cellules encore indeterminees. J'ai employe les
irradiations pour rechercher si, au cours de l'organogenese, on pouvait identifier, a cote d'ebauches determinees, des cellules completement indeterminees qui
pourraient etre a l'origine des neoblastes. Des irradiations de cocons de
Planaires par Benazzi (1959), qui cherchait a induire des mutations, avaient
montre qu'on pouvait obtenir des eclosions apres cette operation.
HISTORIQUE
Les etudes descriptives du developpement des Triclades sont nombreuses
mais anciennes: Knappert, 1865; Metschnikoff, 1883; Iijima, 1884; Hallez,
1887; Curtis, 1902; Mattiesen, 1904; Stevens, 1904; Fulinski, 1916. II n'existait
pas de description detaillee de l'embryogenese de Polycelis nigra.
Peu d'auteurs ont etudie la regeneration chez l'embryon.
Bardeen (1902) decrit le developpement de Planaria maculata et etudie la
regeneration d'embryons. II les sectionne en avant du pharynx: les moities
anterieures reforment un pharynx et une queue dans quelques cas, les moities
posterieures ne regenerent une tete que chez des embryons ages, elles ne regenerent pas chez des plus jeunes, ce qu'il explique par l'absence de cordons
nerveux bien formes dans les jeunes embryons.
Seilern-Aspang (1958) montre que le groupement des cellules vitellines autour
des premiers blastomeres serait du a un facteur que ceux-ci emettent. L'auteur
agit d'autre part sur les ebauches du cerveau et de la region posterieure: elles se
dedoublent a un certain stade; s'il les separe alors par centrifugation, ou s'il
empeche leur dedoublement par compression, les individus obtenus sont dissymetriques. Ceci montrerait que les Triclades n'ont pas un pouvoir de regulation aussi etendu que leur pouvoir de regeneration.
Liotti & Bruschelli (1964) ont confirme l'hypothese de Bardeen, dans une
etude de la regeneration chez l'embryon de Dugesia lugubris. Le pouvoir de
regeneration d'une tete s'accroit avec le developpement des troncs nerveux.
L'absence de regeneration cephalique serait lie au manque d'elements nerveux
differencies dans le fragment isole.
Regeneration chez Vembryon de Polycelis
41
METHODES
Les cocons sont recoltes chaque jour dans un elevage de Polycelis et sont
maintenus a 18 °C.
Etude descriptive
Les cocons jeunes sont fendus et fixes a des intervalles de 24 heures. Us sont
degangues apres fixation. Pour les stades ages, on ouvre les cocons frais et fixe
les embryons apres les avoir anesthesies au chloretone a 2 pour mille.
Etude experimental
Les cocons sont ouverts sous la loupe binoculaire. Les embryons operes et les
temoins sont eleves a 18 °C dans une solution de Holtfreter normale ou diluee de
moitie.
(1) Regeneration d'embryons
Des jeunes a l'eclosion et des embryons aux stades 5, 6 et 7 sont sectionnes en
avant du pharynx (Fig. 1). Les individus d'un meme cocon forment un lot qui est
suivi isolement. Us sont generalement tous au meme stade. Ce stade est determine par un temoin que Ton fixe a l'ouverture du cocon. Queues et tetes
St. 5
St. 6
St. 7
Fig. 1. Schema des experiences de section d'embryons aux stades 5, 6, 7. C,
Cerveau; T.N., troncs nerveux. Les traits transversaux indiquent le niveau de section.
regenerent dans des salieres distinctes pendant 9 a 19 jours. On suit chaque jour
les progres de la regeneration a la loupe binoculaire. Quand un ou plusieurs
individus d'un lot ont regenere, l'experience est arretee, des essais preliminaires
ont en effet montre que ceux qui n'ont pas regenere a ce moment n'evoluent plus
jusqu'a leur mort.
(2) Irradiations
J'utilise un appareil Pickers X-rays, tension 60 kV, intensite 10 mA. La cible
etant a 10 cm de la source, l'appareil debite 1000 roentgens a la minute environ.
42
A. LE MOIGNE
J'irradie des jeunes a l'eclosion, des embryons degangues et des cocons entiers.
Les animaux sont ensuite eleves dans les meraes conditions que precedemment.
(a) Irradiations d? embryons degangues. Un premier temoin est fixe a l'ouverture du cocon, indiquant le stade des embryons mis en experience. Une partie
des embryons est irradiee, puis elevee dans le liquide de Holtfreter; l'autre partie
elevee sans irradiations fournira les temoins. Quand ils ont atteint le stade 7
depuis quelques jours, soit le stade normal de l'eclosion, un jeune est preleve
dans chacun des deux lots, pour etudier l'etat du parenchyme au debut de
l'experience de regeneration qui suit. Les autres Planaires sont sectionnees en
arriere du cerveau. Au bout de 10 a 13 jours, temps necessaire pour la regeneration, elles sont fixees.
(b) Irradiations de cocons entiers. La methode precedente entraine une forte
mortalite qu'on evite en supprimant le choc operatoire du deganguage. On peut
ainsi faire des irradiations plus precoces. Le stade est determine en observant
les cocons chaque jour par transparence: des embryons qui deviennent visibles
et sont encore entoures d'un vitellus secondaire abondant sont au debut du stade
3; 24 a 48 heures plus tard, les embryons tres nettement spheriques et separes les
uns des autres sont au stade 4; au stade 5 on voit nettement l'ebauche du pharynx.
Les embryons plus ages sonttoujours degangues avant irradiation. Apres irradiation, les cocons sont conserves jusqu'a l'eclosion, ou ouverts si elle n'a pas lieu.
Un ou plusieurs jeunes eclos de chaque cocon sont fixes pour apprecier l'etat de
developpement et l'aspect du parenchyme. Les autres sont sectionnes en arriere
du cerveau et mis a regenerer.
Histologie
Les echantillons sont fixes au Helly, au Carnoy ou au Bouin alcoolique. Les
coupes de 5/i sont colorees aux Mann-Dominici, hemalun picro-indigo-carmin
et vert de methyle pyronine. Cette coloration specifique du RNA a ete controlee
par le test a la ribonuclease.
Dans les experiences de regeneration, les regenerats complets, de tete avec
cerveau et yeux, ou de queue avec pharynx, sont simplement observes a la loupe
binoculaire. II en est de meme pour quelques irradies ne presentant pas de
blasteme un certain temps apres decapitation.
RESULTATS
(1) Developpement embryonnaire de Polycelis nigra, et recherche du RNA
dans les cellules embryonnaires
De la ponte a l'eclosion, j'ai distingue sept stades chez cette espece(Le Moigne,
1963). Je les rappellerai brievement:
Stade 1: multiplication des blastomeres
Les cellules-oeuf (o) sont spheriques, de 25 a 30/t de diametre. Le cytoplasme
d'abord peu pyroninophile se colore ensuite plus vivement (Planche 1, fig. 1).
Regeneration chez Vembryon de Polycelis
43
Les cellules vitellines sont de deux categories, les plus petites (F2) formeront le
syncytium nourricier, les plus grandes (Fj) seront absorbees par l'intestin embryonnaire.
La segmentation est irreguliere, les blastomeres (B.) se separent des la telophase. Nucleoles et cytoplasme sont tres riches en RNA (Planche 1, fig. 2).
Quand l'embryon compte une cinquantaine de blastomeres (Fig. 2), l'epiderme
embryonnaire (Ep.) s'ebauche et les cellules migrent vers l'emplacement des
futurs pharynx et intestin embryonnaires.
Fig. 2. Reconstitution d'un embryon au stade 1. On compte 60 blastomeres dans le
syncytium, groupes la ou s'ebaucheront le pharynx et l'intestin embryonnaires.
B., Blastomere; Ep., epiderme embryonnaire; Sy., syncytium nourricier.
Stade 2: edification d'un pharynx et d'un intestin embryonnaires (Fig. 3)
La structure de ces organes est classique, comparable a celle des autres
Triclades (Mattiesen, 1904; Fulinski, 1938).
Le nombre des blastomeres libres, riches en RNA passe a vingt ou trente.
Stade 3: absorption des cellules vitellines et multiplication des cellules embryonnaires
L'embryon prend l'aspect d'une sphere creuse (Fig. 4). L'intestin est distendu.
Le pharynx conserve sa structure.
Les cellules embryonnaires sont repoussees dans le syncytium nourricier a la
peripherie. Tres pyroninophiles, elles se multiplient activement par mitoses.
Certaines presentent des bourgeonnements tres riches en RNA (Bg.) (Planche 1,
fig. 3).
44
A. LE MOIGNE
Stade 4: formation d'un pharynx transitoire
Le pharynx transitoire (P.T.) est propre a Polycelis nigra-tenuis. II s'ebauche
au dessus du pharynx embryonnaire (Fig. 5 A). Ce dernier disparait progressivement (Fig. 5B). Les cellules du parenchyme embryonnaire (CE.) se multi-
Fig. 3. Coupe sagittale d'embryon au stade 2. Pharynx et intestin embryonnaires en
cours de differentiation. B., Blastomere; Ep., epiderme embryonnaire; /., intestin
embryonnaire; N. Sy., noyaux du syncytium nourricier; P., pharynx embryonnaire.
En grise: cytoplasme riche en RNA.
PLANCHE 1
Fig. 1. Cellule oeuf entouree de cellules vitellines.
Fig. 2. Coupe d'embryon au stade 1; blastomeres disperses dans le syncytium nourricier.
Fig. 3. Cellules du parenchyme embryonnaire au stade 3, presentant des bourgeonnements
cytoplasmiques.
Fig. 4. Cellules du parenchyme embryonnaire au stade 4.
Fig. 5. Neoblastes dans le parenchyme d'un embryon au stade 7.
Fig. 6. Parenchyme d'une jeune planaire irradiee au stade 6. Neoblastes leses sans nucleole.
B., Blastomeres; Bg., bourgeon cytoplasmique; C.E., cellule du parenchyme embryonnaire;
Ep., cellule epidermique en cours de differentiation; N, nucleole; Ne., neoblaste; O., oeuf; Sy.,
syncytium nourricier; Vlf cellules vitellines de la lere categorie; V2, cellules vitellines de la
2eme categorie, formatrices du syncytium nourricier. Coloration: vert de methyle pyronine.
/. Embryol. exp. Morph., Vol. 15, Part 1
PLANCHE 1
£&>
A. LE MOIGNE
facing p. 44
Regeneration
chez Vembryon de Polycelis
45
plient activement, surtout ventralement. Certaines, fusiformes, ressemblent aux
neoblastes (Planche 1, fig. 4).
Fig. 4. Reconstitution d'une moitie d'embryon au debut du stade 3. Les blastomeres
sont repartis dans la paroi formee par le syncytium nourricier. Les cellules vitellines
absorbees ne sont pas representees. B., Blastomeres; Ep., epiderme embryonnaire;
/., intestin embryonnaire; P., pharynx embryonnaire; Sy., Syncytium nourricier. En
grise: cytoplasme riche en RNA, des cellules visibles sur la coupe mediane.
Stade 5: apparition du systeme nerveux, du pharynx definitif, organisation de
Vintestin a trois branches (Fig. 6A)
L'embryon s'allonge et differencie des ganglions cerebroides (C.) a l'avant de
la bande germinative ventrale, un pharynx definitif a l'arriere.
Les cellules de la bande germinative ont l'aspect des neoblastes de l'adulte:
riches en RNA, gros nucleole, piriformes ou fusiformes, 10 a 14/* de long. Les
cellules nerveuses (C.N) n'ont pas encore differencie de fibres nerveuses (Fig.
6B). Le pharynx definitif qui s'edifie a l'emplacement du pharynx transitoire
(Fig. 6 A, C) isole le bourgeon caudal qui donnera la region post-pharyngienne,
ou se dessinent les deux branches posterieures de 1'intestin.
Les ebauches des organes qu'on trouvera chez l'animal a l'eclosion, sont alors
en place.
46
A. LE MOIGNE
Stade 6: differentiation des trones nerveux, jusqiCa I'apparition des yeux (Fig. 7)
Les fibres nerveuses (F.) se differencient dans le cerveau et les troncs nerveux
qui progressent d'avant en arriere sur la face ventrale. On passe au stade 7 a
l'apparition des premieres taches oculaires, quand les troncs nerveux atteignent
entre le tiers et la moitie de la longueur de l'embryon.
La pyroninophilie decroit dans les tissus differencies. Elle reste forte dans le
parenchyme constitue en grande partie par des cellules semblables a des
neoblastes.
ci.
Fig. 5. Stade 4. (A) Coupe sagittale d'un embryon au debut du stade 4. Des
cellules s'amassent au-dessus et autour du pharynx embryonnaire pour former un
pharynx transitoire. (B) Pharynx transitoire a la fin du stade 4. Le pharynx
embryonnaire est resorbe. C.E., Cellules du parenchyme embryonnaire; C.I., differentiation d'une cellule intestinale; F., fibres musculaires de la paroi pharyngienne;
/., intestin empli de cellules vitellines; L.P., lumiere pharyngienne; P., pharynx
embryonnaire; P.T., pharynx transitoire; Sy., syncytium nourricier. En grise: cytoplasme riche en RNA. Pointilles: limites du syncytium nourricier.
Stade 7: dernieres differentiations jusqWa Veclosion (Fig. 8)
Le cerveau (C.) prend sa forme definitive avec sa commissure transversale et
ses fibres longitudinales formant un H. Les troncs nerveux (T.N.) se prolongent
jusqu'a l'extremite posterieure. Les yeux se developpent suivant le meme processus que dans la regeneration (Lender, 1952).
Le tissu parenchymateux n'apparait plus forme presque uniquement de cellules basophiles. II presente l'aspect lacuneux du parenchyme adulte, tel que le
montrent les techniques histologiques habituelles, avec une forte densite en cellules indifferenciees, riches en RNA, ayant tous les caracteres de neoblastes
(Ne.) (Planche 1, fig. 5).
Regeneration chez Vembryon de Polycelis
47
Dans le developpement embryonnaire de Polycelis nigra-tenuis, on ne distingue qu'un feuillet unique forme" de blastomeres, puis de cellules embryonnaires dont certaines se differencient progressivement pour donner les divers
Rb.
C.N.
C.P,
Fig. 6. Stade 5. (A) Schema de l'organisation d'un embryon au stade 5, d'apres une
coupe longitudinale. (B) Detail de l'ebauche de cerveau, avec cellules nerveuses a
gros noyau arrondi. Pas de fibres nerveuses. (C) Coupe longitudinale du pharynx
definitif forme a l'emplacement du pharynx transitoire. B.C., Bourgeon caudal; C,
cerveau; C.N., cellules nerveuses; C.P., cavitepharyngienne; Ep., epiderme; F., fibres
musculaires qui subsistent du pharynx transitoire; /., intestin; L.P., lumiere pharyngienne; P., pharynx; Rh., rhabdites. En grise: cytoplasme riche en RNA.
tissus et organes de l'animal, tandis que d'autres restent indifferenciees. On a vu
que, quand commence le stade 5, celles-ci ont deja l'aspect morphologique de
neoblastes. En ont-elles les potentialites? C'est ce que j'ai recherche en faisant
des experiences de regeneration chez des embryons.
48
A. LE MOIGNE
(2) Etude de la regeneration chez des embryons ages
Les experiences (Le Moigne, 19656, c) n'ont porte que sur les derniers stades
du developpement embryonnaire (5 a 7), et sur des jeunes a l'eclosion; on ne
peut pas faire de sections plus tot. Les moities posterieures, aux stades 5 et 6, ne
contiennent pas de fibres nerveuses visibles lors de la section (Fig. 1).
c.
CN.
B.C.
^^s
50//
100//
Fig. 7. Debut du stade 6. (A) Schema de reorganisation de l'embryon d'apres une
coupe frontale. (B) Detail du cerveau; formation des premieres fibres nerveuses.
B.C., Bourgeon caudal; C, cerveau; C.I., caeca intestinaux; C.N., cellules nerveuses;
F., fibres nerveuses; /., intestin a 3 branches; P., pharynx.
(A) Mise en evidence du pouvoir de regeneration
Les possibility de regeneration des embryons, suivant leur etat de developpement, apparaissent a l'examen du Tableau 1.
Les moities anterieures ou posterieures qui survivent apres operation au
moment de l'eclosion, regenerent toujours.
Les embryons operes aux stades 6 ou 7 ne regenerent pas tous, les moities
anterieures semblent avoir un pouvoir de regeneration plus eleve que les moities
posterieures, ce qu'on pourrait expliquer par l'existence d'un gradient de
regeneration antero-posterieur (Br0ndsted, 1955); une region cephalique aurait
un pouvoir de regeneration superieur a celui d'une region caudale. Le systeme
nerveux qui, comme on l'a vu, se developpe dans le sens antero-posterieur
constituerait un support anatomique de ce gradient.
Quelques moities posterieures ont survecu sans former de cerveaujusqu'a 19
jours apres l'operation; elles s'etaient pigmentees et etaient animees de mouvements non orientes.
Regeneration chez Vembryon de Polycelis
49
On ne note pas de difference dans le taux de regeneration entre les stades 6 et
7, alors qu'au stade 7 les troncs nerveux existent dans la moitie caudale, mais pas
au stade 6. II est frequent que, parmi les Planaires d'un meme cocon, certaines
regenerent et d'autres ne regenerent pas.
Au stade 5, la mortalite etait telle que je n'ai obtenu que deux survivants qui
ont regenere; ils suffisent cependant a prouver que les embryons au stade 5
peuvent regenerer.
c.
•T.N.
T.N.
Fig. 8. Schema de l'organisation d'un embryon au stade 7, d'apres une coupe
frontale. C, Cerveau; C.I., caeca intestinaux; Ep., epiderme avec de nombreux
rhabdites; GL, glandes eosinophiles et cellules a rhabdites; /., intestin a 3 branches;
P., pharynx; Pa., parenchyme; T.N., troncs nerveux; Y., yeux.
Histologie
Les coupes histologiques ont permis d'etudier le degre de differenciation des
tissus embryonnaires, et l'etat du regenerat. Les parties posterieures m'ont paru
les plus interessantes pour cette etude, du fait que lorsque je les isolais, les troncs
nerveux n'etaient pas ou n'etaient que tres peu differencies. On a pu ainsi
rapprocher chez un meme individu la differenciation du systeme nerveux
et la formation du blasteme.
Planaires regenerant la moitie anterieure (Planche 2, fig. 7). Les embryons qui
regenerent une tete ont un cerveau (C.R.) avec des fibres nerveuses plus ou moins
4
JEEM 15
50
A. LE MOIGNE
differenciees suivant la duree de l'experience. Les yeux apparaissent. Quand la
regeneration du cerveau n'est pas achevee, on observe dans la tete une abondance
de cellules a caracteres de neoblastes, a cytoplasme basophile et gros nucleole.
Les organes de la partie posterieure ont continue leur differenciation a un
rythme normal et sont, a la fin de l'experience, comparables a ceux d'une
Planaire a l'eclosion quel que soit l'etat de developpement lors de la section. Les
troncs nerveux (T.N.) notamment sont toujours bien differencies, meme si la
differenciation du cerveau en regeneration n'est pas achevee. Cette evolution est
surtout nette chez des embryons operes aux stades 5 et 6. La figure 7, Planche 2,
represente un embryon opere au stade 5; apres 14 jours de regeneration, un
cerveau en voie de differenciation, et des troncs nerveux sont visibles. Le
pharynx normalement developpe n'est pas present sur cette coupe.
Tableau 1. Regeneration anterieure et posterieure d''embryons de Polycelis nigra
Regeneration d'un pharynx et d'une queue a partir d'une
moitie anterieure
Absence de
regeneration
Regeneration
A
A
f
Stade
Operes
Eclosion
Stade 7
Stade 6
Stade 5
36
121
40
\
Survivants Nombre Proportion
21
106
20
21
95
17
100%
90,6%
85%
N
f
Nombre
Proportion
0
10
3
9,4%
15%
Regeneration d'un cerveau et d'une tete a partir d'une
moitie posterieure
Regeneration
A
Absence de
regeneration
A
(
Stade
Operes
Eclosion
Stade 7
Stade 6
Stade 5
36
121
49
\
> (
Survivants Nombre Proportion Nombre Proportion
23
23
100%
0
94
55
58,5%
33
35%
34
58,7%
20
10
29,4%
2
2
Douteux
6
4
Planaires ne regenerant pas la moitie anterieure (Planche 2, fig. 8). Chez les
jeunes qui ne regenerent ni tete ni cerveau, on constate le meme etat de differenciation final dans les tissus embryonnaires, que chez ceux qui regenerent.
La differenciation la plus remarquable est celle des troncs nerveux (T.N.) en
l'absence du cerveau. II n'y en avait pas dans les queues au stade 6, ils etaient
tres minces dans celles au debut du stade 7. A la fin de l'experience ils sont
toujours volumineux et presents sur toute la longueur de la queue (Planche 2,
fig. 8). Ils sont souvent renfles au niveau de la section anterieure et se rejoignent
/. Embryol. exp. Morph., Vol. 15, Part 1
PLANCHE 2
C.R.
T.N.
Fig. 7. Embryon sectionne au stade 5, apres 14 jours de regeneration.
Fig. 8. Embryon sectionne au stade 6, n'ayant pas regenere au bout de 15 jours.
Fig. 9. Blasteme anterieur de 3 jours, chez un embryon decapite au stade 6. Les fleches
indiquent les limites du blasteme.
Fig. 10. Blasteme anterieur de 2 jours, chez un embryon decapite au stade 7.
B., Blasteme; C.P., cavite pharyngienne; C.R., cerveau regenere; /., cavite intestinale; T.N.,
troncs nerveux. Colorations: Figs. 7 et 8, hemalun, picro-indigo carmin; Figs. 9 et 10: vert de
methyle pyronine.
A. LE MOTGNE
facing p. 50
PLANCHE 3
/ Embryol. exp. Morph., Vol. 15, Part 1
12
11
Fig. 11. Coupe longitudinale au stade de l'eclosion d'un embryon irradie a 2000 r au stade 4.
Morphologie normale, faible teneur en RNA des tissus.
Fig. 12. Coupe d'un temoin non irradie, issu du meme cocon. Le parenchyme est riche en
neoblastes.
Fig. 13. Coupe longitudinale d'un embryon irradie a 2000 r et ne regenerant pas de tete 10
jours apres amputation.
Fig. 14. Coupe d'un embryon temoin issu du meme cocon, regenerant un tete.
C, Cerveau; /., intestin; P., pharynx; Pa., parenchyme; /?., regenerat; S., niveau de section.
Colorations: vert de methyle pyronine.
A. LE MOIGNE
facing p. 51
Regeneration chez Vembryon de Polycelis
51
pour former une commissure a l'avant du pharynx, mais il n'y a pas d'accumulation de cellules nerveuses a cette extremite. La partie antepharyngienne est
occupee par un prolongement important de la cavite intestinale. Le pharynx
allonge est souvent replie sur lui-meme dans une cavite pharyngienne restee trop
petite.
On peut degager deux points de ces observations:
(1) Longtemps avant la fin de leur developpement, les embryons de Polycelis
peuvent regenerer si on declenche la regeneration par amputation. Elle se fait a
partir de cellules embryonnaires possedant les memes aptitudes que les neoblastes
de Padulte. Le blasteme se forme cependant plus lentement et peut ne pas se
former chez certains individus.
(2) On observe toujours des troncs nerveux differencies dans la moitie posterieure a la fin des experiences, qu'il y ait regeneration ou non. Leur differenciation est plus poussee dans la partie posterieure que dans le regenerat. Ces troncs
nerveux ont done, aux stades etudies, une ontogenese independante des ganglions cerebroiides puisqu'ils peuvent apparaitre dans des queues qui ne regenerent ni tete ni cerveau, et qui ne possedaient pas de formations nerveuses. Leur
territoire est sans doute deja determine.
Ces observations posent deux problemes que j'ai tente de resoudre:
(1) O n a v u que les troncs nerveux apparaissent independamment du cerveau
dans une queue isolee qui ne regenere pas. On peut se demander si, quand il y a
regeneration, la differenciation dans la queue des troncs nerveux et des autres
tissus ne precede pas la formation d'un blasteme anterieur.
(2) Les embryons ne regenerent pas tous. Peut-on invoq uer une differenciation
insuffisante chez certains, pour qu'ils soient en etat de repondre assez rapidement
au stimulus de la blessure, avant que le cicatrisation se fasse? Ou bien la cicatrisation est-elle trop complete et trop rapide?
(B) Regeneration et differenciation embryonnaires
Pour controler la premiere hypothese, j'ai etudie la formation du blasteme et
la differenciation embryonnaire au cours des premiers jours de la regeneration,
en sectionnant des jeunes eclos et des embryons aux stades 5,6 et 7, et en controlant histologiquement la differenciation embryonnaire et la formation d'un
blasteme anterieur apres 2 a 8 jours de regeneration (Le Moigne, 1965/7).
J'ai constate que le blasteme se forme normalement au stade 7 et chez les
jeunes a l'eclosion e'est-a-dire chez ceux dont les troncs nerveux sont differencies
(Planche 2, fig. 10). Chez les individus plus jeunes par contre, l'accumulation de
neoblastes est beaucoup plus lente (Planche 2, fig. 9).
La formation du blasteme est differee chez les jeunes. Pendant ce delai, les
tissus embryonnaires et notamment les troncs nerveux se differencient. Us ne
l'etaient pas dans la partie posterieure lors de la section, mais ils sont toujours en
place quand le blasteme s'individualise.
La differenciation des tissus embryonnaires et notamment des troncs nerveux
4-2
52
A. LE MOIGNE
se poursuit done jusqu'a un certain stade avant la formation d'un blasteme chez
les embryons. La presence de troncs nerveux est vraisemblablement necessaire
pour que la regeneration ait lieu, ainsi que l'ont montre Lender & Gripon (1962)
chez des Planaires adultes.
(C) Variations individuelles du pouvoir de regeneration
J'ai pense que des differences individuelles pourraient resulter d'une sensibilite
inegale des embryons au stimulus de l'amputation. La regeneration etant differee, ce stimulus s'attenuerait rapidement chez certains, probablement a la suite
d'une fermeture trop complete de la blessure; il serait devenu inoperant quand
l'embryon deviendrait apte a regenerer.
Pour verifier cette hypothese, j'ai ouvert la cicatrice des embryons 18 heures
apres l'amputation de la partie anterieure, pour stimuler a nouveau la formation
d'un blasteme. Les individus sont laisses 16 jours a regenerer. Les resultats sont
groupes Tableau 2.
Tableau 2
Stade
Nombre
d'operes
Nombre de
survivants
Nombre de
regenerats
Regenerats
(%)
7 jeune
6
64
38
56
27
47
7
84
26
Chez les embryons au debut du stade 7, le taux de regeneration passe, apres
reouverture de la blessure, a 84 % au lieu de 58,5 %, ce qui tend a confirmer mon
hypothese. Les resultats obtenus avec des embryons au stade 6 ne sont pas probants. On n'obtient plus que 26 % de regeneration, au lieu de 58,7 % avec une
simple amputation. II est possible que les embryons soient trop jeunes pour
supporter une seconde blessure qui entrainerait des perturbations empechant la
regeneration: la differentiation des tissus embryonnaires anciens n'est pas
perturbee.
L'existence des neoblastes est ainsi mise en evidence pour les derniers stades
embryonnaires. Mais ces experiences laissent subsister un doute: avant une differenciation sufflsante des tissus embryonnaires, les neoblastes semblent peu actifs;
forment-ils une lignee cellulaire distincte de celle qui edifie les divers organes?
Les resultats d'experiences d'irradiations d'embryons permettent de le penser.
(3) Experiences d'irradiations aux rayons X, d'embryons a tous les stades
On sait que les cellules a caractere embryonnaire et grand pouvoir mitotique
sont plus sensibles aux radiolesions que les cellules deja determiners ou differenciees.
Par irradiations aux rayons X, j'ai essaye de leser les cellules indifferenciees aux
divers stades de l'embryogenese, et de dissocier ainsi les processus de differenciation des ebauches d'organes, des processus de regeneration lies a
l'existence d'une reserve de neoblastes indifferencies (Le Moigne, 1965&).
Regeneration chez Vembryon de Polycelis
53
Les embryons irradies sont eleves jusqu'a l'eclosion. Us ont alors atteint un
age ou la regeneration se produit toujours dans les conditions normales (Tableau
1). L'examen histologique d'une partie des jeunes eclos permet de controler
l'etat de differenciation des organes, et l'aspect des neoblastes. Des operations
suivies d'essais de regeneration sont tentees sur les autres jeunes, pour controler
le pouvoir de regeneration.
(A) Effet des irradiations sur le developpement des embryons
J'ai irradie 120 cocons et 8 lots de 4 jeunes a l'eclosion; ceux-ci m'ont permis
de tester l'enicacite des doses qui allaient de 500 a 3000 roentgens. Tous les
cocons etaient viables; les cocons steriles se reconnaissent a ce qu'ils brunissent a
peine et que le vitellus vu par transparence prend un aspect grumeleux.
Tableau 3. Variation de la radiosensibilite des embryons enfonction du
stade auquel Us sont irradies
Dose: 750 a 3000 r.
Individus eclos
Cocons tues
anormaux
Nombre de
cocons
Stades
(Euf, 1 et 2
3
4
5,6,7
<
*
>i
*
Individus eclos
d'apparence normale
>i
*
\
irradies Nombre Proportion Nombre Proportion Nombre Proportion
—
—
—
—
1,00
14
14
33
17
24
0,75
0,85
3
0,15
24
6
6
0,1
0,25
60
0,9
0
0
29
0
0
92
1,00
(1) Effet de la dose. Les irradiations ne sont efficaces qu'au-dessus de 500 r.
Cette dose n'empeche pas certains embryons de se developper normalement et de
regenerer. La regeneration est tres retardee, notamment chez les jeunes irradies
a l'eclosion, ou il n'y a qu'une accumulation de quelques neoblastes sains, avec
quelques mitoses, au niveau de la blessure, au bout de 13 jours. II y a done une
partie des cellules indifferenciees qui est epargnee a ce stade. Les effets des irradiations avec 750 a 2000 r sont tres comparables entre eux. A 3000 r, la proportion d'anormaux est plus forte aux stades 3 et 4 qu'avec les doses inferieures;
les cellules en cours de differenciation sont vraisemblablement lesees plus
gravement.
(2) Radiosensibilite enfonction du stade. On peut distinguer 3 periodes dans la
radiosensibilite des embryons qui apparaissent a Pexamen du Tableau 3.
lire periode. Les irradiations, depuis la ponte jusqu'au debut du stade 3
(absorption des cellules vitellines) entrainent une mort generate au-dela de 500 r.
Les cocons sont ouverts 15 jours apres l'irradiation; le vitellus n'a pas ete avale,
la mort correspond au stade de l'irradiation.
2eme periode. Au stade 3,75 % des cocons sont tues. Les autres (8 cocons)
donnent naissance a quelques embryons anormaux qu'on trouve en ouvrant les
cocons non eclos au bout de 10 a 15 jours.
54
A. LE MOIGNE
3emeperiode. Au stade 4, la mortalite est tres faible; elle disparait aux stades
suivants. Les Planaires a l'eclosion ont une apparence tres generalement
normale, mais ne regenerent pas.
(B) Etude histologique des embryons irradies
A la fin du developpement, un cocon donne, suivant le stade ou il a ete
irradie, des embryons d'apparence anormale, ou des embryons qui semblent
normalement developpes. Sur 100 cocons irradies a plus de 500 r, 56 se sont
developpes. Parmi les 178 jeunes, 23 etaient anormaux, 155 avaient une
apparence normale.
(1) Embryons anormaux. Us proviennent surtout des cocons irradies au debut
du stade 3, non eclos et ouverts 10 a 14 jours apres l'irradiation. Us sont tres
petits, legerement pigmentes; certains, informes, ne manifestent leur vie que par
quelques contractions; d'autres sont allonges et evoquent exterieurement les
stades 5 ou 6; deux d'entre eux avaient meme un ou plusieurs yeux.
J'ai examine 18 de ces embryons provenant de 10 cocons differents. On trouve
partout les memes types d'anomalies. L'epiderme est aplati, sans differentiation
de cils ou de rhabdites. Le parenchyme est pratiquement vide de cellules, on ne
trouve que de rares cellules d'aspect pycnotique. Le pharynx n'existe pas; on
reconnait quelques traces qu'on pourrait identifier au pharynx embryonnaire
dans quelques cas; chez d'autres embryons, on apercoit au fond d'une etroite
cavite pharyngienne qui s'est formee et qui est vide, un minuscule groupe de
cellules necrosees, ebauche d'un pharynx avorte. Par contre, le tissu nerveux est
toujours bien differencie. Les cerveaux sont petits avec cellules nerveuses peu
abondantes mais la diiferenciation des faisceaux de fibres est aussi poussee que
chez les embryons au stade 7, les troncs nerveux sont plus ou moins developpes.
On peut done identifier ces embryons a des stades 7 dont le developpement a
ete partiellement inhibe par irradiation avant la determination de toutes les
ebauches. L'existence d'un systeme nerveux, seul organe bien differencie, permet
de penser que l'ebauche nerveuse est celle qui s'individualise la premiere
pendant le stade 3 vraisemblablement.
(2) Embryons normalement developpes apres irradiations, examines des
Veclosion. 41 de ces embryons ont ete observes histologiquement a l'eclosion.
Le developpement a ete particulierement bien suivi dans les experiences
d'irradiations sur embryons degangues, car dans ce cas la moitie des individus
d'un cocon a ete irradiee, l'autre a servi de temoin. On voit tres peu de differences dans revolution de la morphologie externe, entre les irradies et les
temoins; les yeux sont parfois moins nombreux chez les premiers.
L'histologie montre que, chez les irradies, les organes se differencient comme
chez les non irradies, bien qu'ils soient parfois plus petits, la multiplication cellulaire etant inhibee. J'ai considere les individus comme normaux des qu'ils possedent, outre le systeme nerveux complet, un pharynx, meme petit, et quelques
yeux; la densite cellulaire du parenchyme etant souvent faible, surtout chez des
Regeneration chez Vembryon de Polycelis
55
jeunes irradies tres tot. Les individus irradies a 2000 r, au stade 3, constituent le
cas extreme.
Cette evolution parallele apparait sur les figures 11 et 12 (Planche 3) qui representent 2 embryons extraits d'un meme cocon au stade 4. L'un deux (fig. 11) irradie a 2000 r, l'autre non irradie. Us ont ete fixes 7 jours apres l'irradiation,
apres etre arrives au stade de l'eclosion.
Les cellules du parenchyme (Pa.) riches en RNA, qu'on sait etre a ce stade des
neoblastes, sont beaucoup moins abondantes chez les irradies que chez les
temoins, ainsi que le montre encore la comparaison des memes figures, les coupes
etant colorees au vert de methyle pyronine.
La disparition des neoblastes (Ne.) n'est pas totale au bout de 7 jours, mais
presque toutes ces cellules presentent des lesions. Le nucleole (N.) s'appauvrit
en RNA (Planche 1, fig. 6), le cytoplasme semble se desagreger; les cellules basophiles qui subsistent sont en voie de degenerescence.
La comparaison de ces figures avec des neoblastes d'un parenchyme non irradie de Planaires au stade 7 (Planche 1, fig. 5) illustre 1'evolution des neoblastes
irradies.
Nous avons done des jeunes qui ont subi une irradiation pendant leur
developpement embryonnaire. Suivant notre hypothese, les tissus deja determines lors de l'irradiation se sont differencies normalement, tandis que les cellules indeterminees ont subi des lesions. En tentant de provoquer une regeneration, on peut montrer que les neoblastes se revelent incapables de remplir leur role.
(C) Etude dupouvoir de regeneration de jeunes irradies au cows de leur developpement embryonnaire
106 embryons irradies a plus de 500 r, ont ete decapites a l'eclosion. 86 ont
survecu assez longtemps pour que la regeneration ait pu s'effectuer dans des
conditions normales. 45 d'entre eux sont observes histologiquement, les autres
ne montraient aucune trace de blasteme et commengaient meme parfois a se
necroser, au bout d'une dizaine de jours. 28 jeunes eclos sont aussi decapites
apres irradiations, fixes au bout de 10 jours et examines.
Tableau 4. Essai de regeneration d'embryons eclos apres
irradiations du cocon (750 a 3000 r.)
Individus
decapites
Survivants
Individus ayant
regenere
106
86
0
Les embryons parvenus au stade de l'eclosion sont incapables de regenerer
(Tableau 4). A la fin de l'experience, 7 a 10 jours apres decapitation, les neoblastes sont rares et presentent des lesions; ils sont groupes essentiellement le
long des troncs nerveux. On trouve aussi des trainees pyroninophiles provenant
sans doute de cellules detruites. II n'apparait jamais aucun blasteme.
56
A. LE MOIGNE
Les figures 13 et 14 (Planche 3) illustrent ces observations. II s'agit de 2
planaires d'un merae cocon dont l'une (fig. 13) a ete irradiee au stade 5, a 2000 r,
17 jours auparavant. Les sections (S.) remontent a 10 jours. Le temoin non
irradie (fig. 14) a deja un regenerat de tete developpe (R.) avec des neoblastes
abondants.
Les cellules des autres organes semblent plus normales; on trouve un peu de
RNA dans le cytoplasme autour des noyaux des cellules nerveuses, dans quelques cellules epidermiques, dans l'epithelium pharyngien, dans quelques cellules
glandulaires, ce qui fait encore penser qu'elles ont mieux resiste aux irradiations.
Les irradiations totales ont done permis de leser des neoblastes ou leurs precurseurs pendant l'ontogenese, en menageant la differentiation des organes.
C'est pratiquement a partir du stade 4 qu'on obtient ce resultat, et e'est a ce
meme stade que les cellules embryonnaires deviennent abondantes, elles commencent a prendre l'aspect morphologique des neoblastes entre les stades 4 et 5.
II doit exister a partir de ce moment des ebauches d'organes determinees et done
plus radioresistantes. Ces ebauches continuent a se differencier apres irradiation
et, si elles sont toutes determinees, on obtient des jeunes apparemment normaux;
si certaines d'entre elles n'etaient pas encore determinees, on obtient des jeunes
anormaux; des irradiations encore plus precoces entrainent la mort sans
developpement. D'autre part, les irradiations permettent de leser dans les
memes embryons les cellules indifferenciees, et notamment les neoblastes,
radiosensibles.
DISCUSSION ET CONCLUSION
On sait que le pouvoir de regeneration de la Planaire adulte est lie a la presence
de cellules de regeneration ou neoblastes (Dubois, 1949). Ces cellules constituent
une reserve embryonnaire mobilisable pour la regeneration physiologique et
traumatique. C'est au cours du developpement embryonnaire que doit se faire
cette mise en reserve qui s'accompagne du pouvoir de regeneration.
Les colorations histochimiques du RNA par la pyronine montrent que des le
stade 4 des cellules embryonnaires sont semblables aux neoblastes de l'adulte,
mais on ne distingue pas celles qui resteront a l'etat indifferencie et celles qui
formeront les ebauches d'organes.
La mise en evidence des neoblastes parmi les cellules embryonnaires a ete faite
par des experiences de sections et d'irradiations.
Les experiences de sections d'embryons montrent que deja au stade 5, quand
la differenciation du cerveau et du pharynx definitif commence a etre visible, la
regeneration embryonnaire est possible. Malheureusement, on ne peut pas
pratiquer d'operation chirurgicale avant ce stade.
A partir du stade 5, un blasteme s'edifie par accumulation de neoblastes.
Mais, tant que dans le fragment en regeneration, les organes, entre autres le
systeme nerveux, n'ont pas atteint un certain degre de differenciation, l'edification du blasteme de regeneration est differee. Les embryons presentent des
Regeneration chez Vembryon de Polycelis
57
variations individuelles et certains ne regenerent pas; on peut accroitre le taux de
regeneration en renouvelant la blessure quelques heures apres amputation.
Nous ne pensons pas, contrairement a Liotti & Bruschelli (1964), pouvoir
expliquer le defaut de regeneration par l'absence d'elements nerveux dans une
queue isolee precocement, puisque finalement des troncs nerveux se differencient
toujours dans la moitie isolee, qu'il y ait regeneration ou non. Par contre le
systeme nerveux joue certainement un role dans la formation du blasteme; il
apparait que la migration des cellules de regeneration vers la cicatrice ne devient
sensible que lorsque les troncs nerveux ont pu se differencier. Ceci apporte une
autre confirmation du role du systeme nerveux dans la regeneration chez les
Planaires, que Lender & Gripon (1962), Teshirogi & Jin (1964) ont mis en
evidence chez la Planaire adulte.
On peut comparer ces resultats, faible aptitude a migrer des cellules de regeneration avant un certain stade, avec ceux de Weiss & Matoltsy (1959) sur la
cicatrisation chez l'embryon de poulet. Us constatent que les cellules ne sont
aptes a migrer pour cicatriser une blessure, qu'a partir d'un certain stade qui correspond a une modification du milieu interieur de l'embryon due a l'entree en
activite du systeme hormonal. Peut-etre sommes-nous en presence d'un phenomene analogue, les troncs nerveux interviendraient en activant la migration au
moyen de secretions?
Si les cellules de regeneration sont inactives dans un organisme insuffisamment
differencie, elles sont cependant presentes, comme le prouvent les experiences
d'irradiations aux rayons X.
En effet, avec une dose bien choisie de rayons X (750 a 3000 r) on peut montrer que des le stade 4, il existe deux categories de cellules dans un embryon de
Polycelis: des cellules radioresistantes formant les ebauches des organes qui
continueront a se differencier malgre l'irradiation et des cellules radiosensibles.
Ces dernieres cellules sont des neoblastes puisque le pouvoir de regeneration des
embryons irradies est supprime avec elles.
Les irradiations a des stades anterieurs au stade 4 provoquent la mort des
embryons quand la differentiation des ebauches d'organes n'a pas commence.
Elles entrainent la formation d'embryons anormaux si on irradie au debut de la
differentiation des organes de l'adulte.
Le cerveau est alors le seul organe bien differencie, ce qui semblerait prouver
qu'il est determine le premier. Sans doute joue-t-il au cours de l'embryogenese
un role inducteur semblable a celui qu'il joue dans la regeneration et que Wolff
(1962) met en evidence dans une interpretation recente des mecanismes d'inductions successives pendant la regeneration chez les Planaires.
Les blastomeres peuvent done s'engager dans deux voies au cours du developpement embryonnaire. Ou bien ils restent a l'etat embryonnaire sans determination pour donner naissance aux neoblastes de la Planaire adulte, ou bien ils
subissent une determination qui sera suivie de la differentiation cellulaire. Des
le debut de la determination leur radiosensibilite diminue et semble devenir nulle
58
A. LE MOIGNE
aux doses utilisees, quand les differentiations morphologiques apparaissent. Le
meme phenomene se produit au cours de la regeneration normale. Kratochwil
(1962) conclut de ses experiences d'irradiations differees de Planaires en regeneration, que la regeneration est possible si l'irradiation touche des neoblastes
qui ont deja ete determines. J'ai obtenu le meme resultat en irradiant des
Planaires 24 a 96 heures apres la decapitation (non publie).
RESUME
1. On a cherche a montrer l'existence de neoblastes chez l'embryon de la
Planaire Polycelis nigra, dont on a decrit le developpement, en distinguant 7
stades.
2. Des cellules embryonnaires, semblables aux neoblastes par leur morphologie et leur richesse en RNA commencent a se reconnaitre a la fin du stade 4 et
sont nombreuses au stade 5.
3. Des embryons ages peuvent regenerer meme si on les sectionne avant la fin
de leur developpement embryonnaire, a partir d'un stade ou les troncs nerveux
ne sont pas encore differencies (stade 5). La formation du blasteme est alors retardee, les tissus embryonnaires et les troncs nerveux se differencient d'abord.
Lorsque ces derniers sont suffisamment differencies, le blasteme peut s'edifier.
C'est un nouvel argument en faveur du role du systeme nerveux dans la regeneration des Planaires. Le cours de la differentiation dans les tissus embryonnaires
n'est pas modifie par la regeneration d'une partie manquante.
4. Des irradiations moderees au cours du developpement n'empechent pas,
a partir du stade 4, les embryons de se differencier et d'eclore. Mais ils sont
incapables de regenerer. On peut penser que les neoblastes, plus sensibles aux
radiations, sont plus vite detruits. Ils seraient distincts des autres tissus des le
stade 4, alors que les organes definitifs ne sont pas morphologiquement discernables.
SUMMARY
1. Seven stages have been distinguished in the development of the embryo of
the planarian Polycelis nigra, and a demonstration of the existence of neoblasts
in the embryo has been attempted.
2. Embryonic cells similar to neoblasts as regards their morphology and their
high percentage of RNA begin to be found at the end of stage 4 and are numerous
at stage 5.
3. Older embryos can regenerate even if beheaded before the end of their
embryonic development at a stage when nervous trunks are not yet differentiated
(stage 5). The formation of the blastema is then delayed; the embryonic tissues
and nervous trunks differentiate first. When they are sufficiently differentiated,
the blastema can develop. This is new evidence in favour of the part played
by the nervous system in the regeneration of planaria. The differentiation
Regeneration chez Vembryon de Polycelis
59
process in the embryonic tissues is not modified by the regeneration of a missing
part.
4. Moderate irradiation during embryonic development, starting from stage
4, does not prevent differentiation and hatching; but the embryos are incapable
of regenerating. One can think that the neoblasts, being more sensitive to
irradiation, are more quickly destroyed. They would be distinct from the other
tissues as early as stage 4, though the definitive organs are not morphologically
distinguishable.
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