Physiologie du cceur de rembryon de Poulet in
vitro apr&s congelation a tres basse temperature
par
L O U I S R.
REY 1
Laboratoire de Zoologie-Physiologie, Ecole Normale Superieure, Paris
LA decouverte (Rostand, 1946; Polge, Smith, & Parkes, 1949) des remarquables
proprietes protectrices de la glycerine a permis de soumettre a des froids tres
intenses, divers tissus et organes, tout en leur conservant un degre de survie
important. Nous avons voulu analyser sur un exemple precis quelles etaient les
conditions de protection qu'offrait le traitement par la glycerine.
TECHNIQUE
Materiel experimental
Nous avons utilise le coeur de l'embryon de Poulet (Leghorn blanc) au bout
de 7 jours } d'incubation. Ce coeur, apres dissection sterile, est cultive en
culture d'organes selon la technique du professeur Wolff (Wolff & Haffen, 1952)
sur milieu solide (solution physiologique d'Agar, extrait embryonnaire, solution
physiologique tamponnee). Les cultures sont incubees a la temperature de
37° C pendant 48 heures, et deux examens sont faits au bout de 24 et de 48
heures. Le test d'activite physiologique utilise a ete les battements des oreillettes
et des ventricules.
Techniques de congelation
Les coeurs ont ete congeles, soit directement, soit apres impregnation pendant
30 minutes dans une solution physiologique (liquide d'Earle) contenant divers
pourcentages de glycerine. Les coeurs temoins sont conserves pendant le meme
temps dans la solution physiologique pure, a +20° C.
Trois techniques de congelation differentes sont utilisees.
(1) Congelation ultra-rapide. Les coeurs sont montes sur des rubans d'aluminium et immerges brutalement dans du propane liquide maintenu a la temperature de l'azote liquide ( - 196° C). L'utilisation de propane permet une
congelation extremement rapide par suite de l'absence de phenomenes d'ebullition et de calefaction autour du fragment. Nous avons pu montrer par des
1
Author's address: ficole Normale Superieure, Laboratoire de Zoologie-Physiologie, 24 rue
Lhomond, Paris (5e), France.
[J. Embryol. exp. Morph. Vol. 6, Part 1, pp. 171-177, March 1958]
L. P. REY—ACTION DE LA
172
experiences de cultures de tissus prealables (Rey, 1957) qu'un sejour de 5 a 30
secondes dans le propane liquide ne provoquait pas d'alterations. La duree
de congelation d'un cceur entier, mesuree a l'oscillographe cathodique, est de
l'ordre de 0,5 seconde (Fig. 1). Les coeurs sont laisses 15 secondes dans le propane liquide, puis transferes dans l'azote liquide pendant 30 minutes.
AZOTE
C o n aeI a t ' on
PROPANE
L I Q U i D E
D e ge I
LIQUIDE
-196'
Conge
Ia t
ion
D egel
FIG. 1. Evaluation de la vitesse de refroidissement des cceurs a tres basse
temperature
Congelation directe du coeur dans l'azote liquide et dans le propane liquide
a —196° C. De"gel direct dans une solution physiologique a +20° C.
Couple cuivre-constantan de 0,6 mm. Enregistrement a l'oscillographe
cathodique avec repe'rage. du temps par modulation basse-fr^quence.
Chaque trait represente ^ de seconde.
(2) Congelation rapide. Une technique semblable est utilisee, mais les rubans
d'aluminium sont plonges dans l'azote liquide directement. Le temps de congelation est de l'ordre de 1,5 secondes (Fig. 1).
(3) Congelation lente. {a) Congelation directe. Les coeurs sont monies sur
une lamelle de verre de 4/10 mm d'epaisseur, placee dans un tube de pyrex de
11 mm de diametre et de 1 mm de paroi. Ce tube est immerge dans l'azote
liquide. Le temps de congelation est de l'ordre de 1 minute.
(b) Congelation par etapes. Pour congeler a des temperatures intermediaires,
entre 0° C et l'azote liquide, nous avons utilise l'enceinte thermostatique pour
basses temperatures que nous avons decrite precedemment (Rey, 1957). Les
C O N G E L A T I O N SUR LE CCEUR DE L ' E M B R Y O N
173
cceurs contenus dans des tubes de pyrex, comme precedemment, sont congeles
d'abord a - 30° C ou a - 60° C, puis ensuite plonges dans l'azote liquide.
Techniques de degel
Pour etudier l'influence du degel, nous avons degele les preparations apres
congelation, selon 3 vitesses differentes.
(1) Degel tres rapide. Les rubans d'aluminium ou les lamelles de verre sont
immerges directement dans une solution physiologique a + 20° C. Divers essais
ont 6t6 effectues en utilisant, soit une solution physiologique simple, soit une
solution physiologique contenant de la glycerine. Le temps de degel est de l'ordre
de 0,5 seconde (Fig. 1).
(2) Degel a vitesse moyenne. Le tube de pyrex contenant les explants est
plonge dans de l'eau a + 20° C. Le degel est complet au bout de 45 secondes.
(3) Degel tres lent. On laisse rechauffer le tube a l'air a +20° C. II faut
environ 6 minutes pour que le degel soit complet.
Evaluation de l'activite physiologique
Des experiences preliminaires nous ont montre, qu'apres congelation, le tissu
cardiaque conservait une grande partie de sa viabilite lorsqu'il avait etc" impregne au prealable par une concentration adequate de glycerine. Ce degre de
survie a ete apprecie par la culture in vitro de fragments du coeur congele. Dans
cette deuxieme serie d'experiences, nous avons voulu voir comment etait conservde l'activite fonctionnelle du coeur dans son ensemble. Nous avons utilise
deux tests principaux.
(1) L'examen des battements cardiaques. Selon le degre de survie, l'intensite
des battements est plus ou moins grande et nous avons defini une echelle
d'activite croissante: aucun battement — battements de points ventriculaires
isoles — battements d'un ventricule unique — battements des deux ventricules
— battements des oreillettes et des ventricules — et battements coordonnes des
oreillettes et des ventricules, ce dernier stade representant l'activite physiologique maximum.
Nous avons etudie la variation de la frequence des battements en fonction
de la temperature entre + 32° C et + 38° C.
(2) L'evolution du pH du milieu de culture nous permet d'evaluer, de fagon
approchee, l'activite metabolique du coeur pendant la periode precedant l'examen. Pour cela, nous avons incorpore a la solution physiologique du milieu
de culture, des traces de rouge de phenol. Cet indicateur utilise couramment en
cultures de tissus, n'est en effet pas toxique. Dans les cultures ou le coeur a conserve une activite physiologique importante, le pH evolue tres rapidement vers
Facidite.
RESULTATS EXPERIMENTAL^
Comportement des temoins
Les coeurs temoins en culture conservent des battements reguliers pendant
48 heures environ. II s'agit de battements simultanes des oreillettes et de batte-
174
L. R. REY—ACTION DE LA
ments simultanes des ventricules, avec, le plus souvent, coordination des mouvements auriculo-ventriculaires. La frequence des battements depend de la temperature ambiante et, en premiere approximation, entre 32° et 38° C, cette
variation est lineaire. La frequence propre varie assez sensiblement d'un coeur
a l'autre, mais le coefficient de temperature est exactement le meme. L'examen
histologique montre qu'au bout de 48 heures l'organe est encore parfaitement
conserve et il n'y a que peu de necrose a l'interieur. Au bout de 24 heures de
culture, par contre, la necrose est pratiquement inapparente, et c'est generalement la periode que nous choisissons pour tester l'activite physiologique.
Comportement des cazurs congeles
(1) Influence de la glycerine. Nous avons trouve des resultats identiques a
ceux que nous avons obtenus par la methode de cultures de tissus. L'impregnaAct) *i te
6.
Physi olog iq i) e
5.
35
10
Glycerine
P. 100
FIG. 2. Variation de l'activite physiologique en fonction des vitesses de congelation
Congelation en tube dans l'azote liquide (65 secondes).
Congelation directe dans le propane liquide (0,5 seconde).
Congelation directe dans l'azote liquide a —196° C (1,5 seconde).
Congelation en tube a - 30° C (40 secondes) puis a -196° C (20 secondes).
L'activite physiologique comporte 6 niveaux differents:
1 aucune activity physiologique.
2 battements de points ventriculaires isole's.
3 battements de 1 ventricule unique.
4 battements des 2 ventricules.
5 battements des oreillettes et des ventricules.
6 battements coordonne"s des oreillettes et des ventricules.
tion prealable par une solution physiologique contenant un certain pourcentage
de glycerine est necessaire au maintien de la viabilite. Quelles que soient les
vitesses de congelation et de degel, aucun coeur non impregne n'a pu survivre.
C O N G E L A T I O N SUR LE CCEUR DE L ' E M B R Y O N
175
II existe un optimum dans la concentration de glycerine qui est de 30 pour cent
en poids.
Activi t i
Pttysiotogique
r.?.'.:&?.?....A
T
10
A
—r "I
15
••A.
a'
20
r
25
30
A
35
....A
Gl/cirine
p. too -
FIG. 3. Variation de l'activite physiologique en fonction des vitesses de degel
D6gel rapide a +20° C (1 seconde).
Degel lent en tube (45 secondes).
D6gel tres lent a I'air (6 minutes).
Activity physiologique: meme notation que pour la Fig. 2.
Des experiences de controle nous ont montre, que meme apres une ou deux
heures de sejour dans la solution glycerinee, il n'y avait aucune action toxique
apparente.
(2) Influence de la Vitesse de congelation. La figure 2 indique que pour une
concentration optima de glycerine (30 pour cent en poids), l'activite physiologique varie relativement peu avec la vitesse de congelation. Toutefois, pour
des vitesses extremement elevees (propane liquide direct et azote liquide direct),
il semble qu'il y ait une legere diminution de l'activite physiologique. Nous
avons pu relier cette diminution au fait que, lors de ces congelations extremement rapides, il se produit des craquelures et des lesions anatomiques importantes du coeur. Par contre, pour les concentrations de glycerine inferieures ou
superieures a l'optimum, la congelation diminue considerablement l'activite
physiologique, et il semble alors que les meilleurs resultats soient obtenus par
une congelation lente procedant par etapes.
(3) Influence des vitesses de degel. Le plus souvent, il semble que Ton n'ait
pas accorde beaucoup d'interet aux vitesses de degel. Cependant, une tres
grande partie des alterations provoquees par le froid est due a de mauvaises
conditions de degel. Les resultats que nous avons obtenus montrent qu'apres
congelation a une vitesse moyenne (representant l'optimum), il est essentiel
176
L. R. R E Y — A C T I O N DE LA
que le degel soit le plus rapide possible (Fig. 3). Les degels lents ou tres lents
provoquent des alterations tres graves, et toute viabilite disparait. Nous avons
trouve des resultats pratiquement identiques lorsque le degel est effectue dans
une solution physiologique a + 20°C ou a une temperature plus elevee (+ 39 °C).
Lorsque la solution utilisee pour le degel est la meme que celle ayant servi a
l'impregnation, les resultats sont les meilleurs. Par contre, aucune amelioration
n'est apportee par un degel effectue dans une solution physiologique simple ou
contenant des concentrations de glycerine plus elevees ou plus faibles.
(4) Conservation de longue duree. Nous avons essaye, apres congelation, de
conserver les coeurs a basse temperature pendant plusieurs semaines.
Une premiere serie d'experiences nous a montre qu'a la temperature de
- 80° C (glace carbonique), la viabilite etait parfaitement maintenue, et qu'au
bout de quelques semaines, apres un degel rapide, le coeur reprenait une activite
physiologique presque normale. Pour connaitre exactement a quelle temperature commencent a apparaitre les premiers signes d'alte"ration, nous avons entrepris des recherches nouvelles dans lesquelles nous conservons des coeurs congeles,
a des temperatures differentes maintenues soigneusement constantes. Nous
donnerons les resultats ulterieurement.
CONCLUSION
L'analyse de la protection offerte par la glycerine contre les effets toxiques du
sejour aux basses temperatures, nous a montre qu'il existait un optimum qui se
situe a 30 pour cent en poids pour le coeur de 1'embryon de poulet. Apres impregnation par la solution glycerinee et congelation, il ne semble pas que
l'activite physiologique soit modifiee par le froid. En effet, non seulement les
coeurs ont un comportement physiologique normal avec un coefficient thermique
identique a celui des temoins, mais de plus il n'y a pas de signes physiologiques
ou histologiques d'alterations.
II est encore difficile d'expliquer de facon precise comment les solutions
glycerinees inferieures a l'optimum, apportent une protection partielle. II
semble que les differents niveaux d'activite physiologique soient dus au maintien
a l'etat vivant d'un nombre plus ou moins grand de cellules. II reste encore a
expliquer pourquoi certaines cellules sont protegees et pourquoi d'autres, au
contraire, sont detruites. Plusieurs explications de ce phenomene sont possibles.
On peut, d'une part, envisager qu'il existe dans un meme groupe cellulaire des
degres de resistance au froid variables, et que certaines lignees cellulaires sont
moins sensibles que d'autres; on peut, d'autre part, penser que Faction differentielle de la congelation est due a une repartition inegale des processus de cristallisation et que certaines cellules cristallisent de facon plus brutale que d'autres
et se trouvent ainsi mortellement lesees.
De toute maniere, pour les faibles concentrations en glycerine, il semble que
les cellules survivantes soient atteintes de facon serieuse. En effet, en culture
CONGELATION SUR LE CCEUR DE L'EMBRYON
177
de tissus, nous avons pu montrer que pour des concentrations en glycerine inferieures a 5 pour cent il y avait une certaine migration cellulaire apres la mise
en culture, mais que ces cellules n'etaient pas susceptibles d'une survie prolongee
et manifestaient, au bout de 48 heures, des phenomenes de degenerescence
graisseuse avec apparition de tres grosses vacuoles huileuses dans le cytoplasme.
Une constatation identique a ete faite par McPherson, Draheim, Evans, & Earle
(1956) dans les cultures de cornee.
RESUME
L'activite physiologique du coeur de l'embryon de Poulet est etudiee in vitro
apres exposition prealable a de tres basses temperatures. La glycerine exerce une
action protectrice qui varie avec son pourcentage et l'optimum est atteint par
30 pour 100 en poids. L'etude precise des conditions de refroidissement et de
rechauffement montre que le degel constitue une phase critique et qu'il doit etre
le plus rapide possible. L'auteur suggere quelques hypotheses expliquant la protection partielle apportee par des solutions glycerinees differentes de l'optimum.
SUMMARY
The physiological activity of the chick embryo heart after an initial exposure
to very low temperatures has been studied in vitro. Glycerine has a protective
action which varies with its concentration, the optimum being 30 per cent, by
weight. A precise study of the conditions of cooling and of rewarming show
that thawing is a critical phase and must be as rapid as possible. Certain hypotheses are suggested to explain the partial protection provided by solutions of
glycerine differing from the optimum.
TRAVAUX
CITES
MCPHERSON, S., DRAHEIM, J., EVANS, V. J., & EARLE, W. (1956). Amer. J. Ophthal. 41, 513-19.
POLGE, G., SMITH, A. U., & PARKES, A. S. (1949). Revival of spermatozoa after vitrification and
dehydration at low temperatures. Nature, Lond. 164, 666.
REY, L. R. (1957). Studies on the action of liquid nitrogen on cultures in vitro of fibroblasts.
Proc. roy. Soc. B, 147, 460-6.
ROSTAND, J. (1946). Glycerine et resistance du sperme aux basses temperatures. C.R. Acad. Sci.
Paris, 222,1524-5..
WOLFF, E., & HAFFEN, K. (1952). Sur une technique permettant la culture in vitro des gonades
embryonnaires des Oiseaux. C.R. Acad. Sci. Paris, 234, 1396-8.
(Manuscript received 25: vii: 57)
5584.6