Etude autoradiographique de rincorporation de
CO2 dans des gastrulas d'Axolotl
14
par
R.
TENCER 1
Laboratoire de Morphologie Animale, Bruxelles
INTRODUCTION
D E nombreux precurseurs radioactifs des proteines et des acides nucleiques
ont dte utilises par divers auteurs afin de suivre le metabolisme au cours du
developpement embryonnaire des Batraciens. Les resultats interessants qui ont
6t6 deja obtenus par les methodes biochimiques et par la technique autoradiographique engagent a poursuivre dans cette voie.
Friedberg & Eakin (1949), utilisant la glycine marquee au C14, ont remarque
la faible penetrabilite pour cet acide amine, "a partir de la gastrula. Afin d'augmenter la vitesse d'incorporation, ils se sont vus obliges de travailler sur des
fragments d'embryons. Afin d'eviter cet inconvenient et l'emploi de temps
d'incubation assez longs — ce qui risque de diminuer la precision des resultats
— deux auteurs ont utilise le C14 sous forme de bicarbonate. C'est ainsi que
Cohen (1954) a montre que le 14CO2 s'incorpore dans les acides nucleiques et les
prote'ines, apres etre entre dans le cycle de Krebs. Un travail simultane de
Flickinger (1954) a donne des resultats semblables; mais cet auteur s'est attache,
en outre, a l'e'tude de l'incorporation regionale et il a montre qu'il existe des
differences marquees entre les differentes regions.
En ce qui concerne l'autoradiographie, signalons surtout les travaux de Ficq
(1954), de Sirlin & Waddington (1954) et de Sirlin (1955). Ficq (1954), utilisant
la technique des emulsions nucleaires, a analyse l'inductiori neurale en greffant
des organisateurs marques au prealable soit au glycocolle, soit a l'acide orotique.
Elle a observe, entre autres, que l'activite est tres nettement localisee dans les
noyaux et que les regions de morphogenese active sont celles qui se marquent
le plus. Sirlin & Waddington (1954) et Sirlin (1955), utilisant la methode de stripping de Doniach & Pelc (1950), ont suivi le sort de la glycine et de la methionine
dans des embryons de Triton. Us ont e'galement observe une activite nucleaire
intense; pour ces auteurs, l'activite serait predominante dans le mesoblaste.
Notons toutefois, que tous ces resultats ont ete obtenus apres des temps d'incubation tres longs, en raison de la lente incorporation de ces acides amines.
1
Author's address: Laboratoire de Morphologie Animale, 1850 Chausse"e de Wavre, Bruxelles,
Belgium.
[J.Embryol. exp. Morph. Vol. 6, Part 1, pp. 117-123, March 1958]
118 R. TENCER —L'INCORPORATION DE
14
CO2 DANS DES GASTRULAS
14
C'est pourquoi nous avons utilise* le CC>2 qui diffuse rapidement a travers la
membrane vitelline et le coat des embryons; nous avons alors suivi, par autoradiographie, le sort de ce precurseur dans des gastrulas d'Axolotl, en examinant
l'incorporation dans les differents territoires et en comparant les noyaux au
cytoplasme.
METHODES
Les oeufs d'Axolotl obtenus par ponte spontanee etaient degangues et laves
dans une solution saline ayant la composition suivante: NaCI, 350 mg.; KC1,
5 mg.; CaCl2,10 mg.; H20,1.000 c.c. 2 c.c. de la solution saline additionnee de
bicarbonate radioactif (concentration finale 4 /xc./c.c. soit 56 7/c.c.) etaient
verses dans un pese-filtre. Dix a vingt ceufs etaient traites, dans un pese-filtre,
pendant une duree de 5 heures. Apres ce laps de temps, les embryons etaient
laves etfixesa l'alcool-acetique a froid (acide acetique a 5 pour cent dans l'alcool
absolu refroidi a - 8°) pendant 4 heures. Apres un sejour de 12 heures dans de
l'alcool absolu, egalement a - 8°, les oeufs etaient places dans du toluol prealablement refroidi; ils etaient enfin ramenes a la temperature ordinaire et
enrobes dans la paraffine. Les coupes de 10 microns etaient deposees sur ,des
lames recouvertes au prealable d'un film de gelatine alunee, permettant l'application de l'emulsion. Certaines lames ont ete traitees a la ribonucle'ase pendant
1 a 2 heures a 38° (cone. 0,4 a 1 mg. /c.c.) afin d'eliminer l'activite de l'ARN. Un
autre lot de preparations a ete soumis a Faction successive de la ribonuclease et
de la desoxyribonuclease (2 heures dans une solution a 0,1 mg./c.c. de NaCI
9%o additionnee de Mg ++ M/300). Apres un lavage soigneux des lames hydrolysees et sechage, l'emulsion nucleaire etait appliquee suivant la technique
decrite par Ficq (1955). Les durees d'exposition etaient de 5 jours. Apres revelation et fixation, toujours suivant la technique de Ficq, les preparations ont ete
colorees au melange vert de methyl-pyronine pendant 10 minutes environ, lavees
a l'eau courante et montees a la glycerine.
RESULTATS
Voice les resultats obtenus pour l'incorporation totale du CO2:
Nous avons etudie quatre regions de jeune gastrula (cf. fig. 1). Le tableau 1
donne les resultats. C'est le neuroblaste qui presente la plus forte activite; l'ectoblaste est un peu plus actif que le chordomesoblaste, tandis que l'entoblaste est
tres peu actif. D'une fa?on generate, l'activite est elevee dans les noyaux.
Les territoires de la gastrula avancee ou les traces ont ete denombrees sont
indiques sur la fig. 2. Les resultats sont resumes dans le tableau 2. L'activite se
distribue de la meme fa?on (A > B > C > D) que dans la gastrula jeune.
Enfin, nous avons determine l'activite par unite de surface pour le cytoplasme
et le noyau. Les tableaux 3 et 4 resument les resultats obtenus aux deux stades
etudies. Nos observations montrent que, des la jeune gastrula, des gradients
R. T E N C E R — L ' I N C O R P O R A T I O N DE " C O , D A N S DES G A S T R U L A S
119
FIG. 1. Jeune gastrula. Territoires etudes: A, neuroblaste
presomptif; B, ectoblaste; c, region correspondant a
l'organisateur; D, portion entoblastique.
FIG. 2. Gastrula avancee. Territoires e'tudie's: A, neuroblaste; B, ectoblaste ventral; c, ehordome'soblaste; D, portion entoblastique.
TABLEAU 1
Resultats relatifs a la jeune gastrula. Nombre moyen de traces par unite de
surface des quatre territoires etudies (cf. fig. 1)
Nombre total de traces/
A.
B.
C.
D.
Regions
Nombre de traces /156 y?
Nombre total de surfaces
Neuroblaste .
Ectoblaste .
Region de l'organisateur
Portion entoblastique
3,12
1,83
1,52
0,50
572/183
737/402
711/405
166/331
Dans la colonne de droite, figurent le nombre total de traces et le nombre total
de surfaces de'nombre'es.
TABLEAU 2
Resultats relatifs a la gastrula avancee. Nombre moyen de traces par unite
de surface des quatre territoires etudies (cf. fig. 2)
Regions
A.
B.
C.
D.
Neuroblaste .
Ectoblaste ventral .
Chordomesoblaste.
Portion entoblastique
Nombre de traces /156 fi2
4,14
2,91
1,00
0,55
Nombre total de traces/
Nombre total de surfaces
1556/372
993/341
546/541
131/238
120 R. TENCER — L'INCORPORATION DE I4CO2 DANS DES GASTRULAS
TABLEAU 3
Jeune gastrula. Nombre moyen de traces par unite de surface
Regions
Noyau
Cytoplasme
A
4,93
(291/59)
4,84
(659/136)
4,65
(652/140)
4,16
(129/31)
1,79
(172/96)
1,20
(34/11)
0,70
(145/205)
0,27
(116/420)
B
C
D
Entre parentheses, figurent le nombre total de traces et le nombre
total de surfaces de'nombre'es.
TABLEAU 4
Gastrula avancee. Nombre moyen de traces par unite de surface
Regions
Noyau
Cytoplasme
A
7,44
(849/114)
5,23
(361/69)
4,96
(164/33)
2,30
(23/10)
2,45
(59/24)
1,46
(49/33)
0,83
(150/179)
0,48
(64/131)
B
C
D
Entre parentheses, figurent le nombre total de traces et le nombre
total de surfaces de'nombre'es.
d'activite sont tres reconnaissables dans le cytoplasme, sans qu'il y ait de grandes
differences pour les noyaux; au stade gastrula avancee par contre, les noyaux
presentent des gradients d'activite tres nets, paralleles a ceux qu'on trouve dans
le cytoplasme aux deux stades etudies.
En ce qui concerne la distribution de l'activite parmi les diff^rentes substances
marquees, nous ne pouvons faire etat que de quelques resultats se rapportant a
la gastrula moyenne (fig. 3). Trois embryons seulement ont ete observes. Les
tableaux 5 et 6 rendent compte de ces resultats.
R. TENCER —L'INCORPORATION DE "CO 2 DANS DES GASTRULAS 121
TABLEAU 5
Resultats relatifs a la gastrula moyenne
Regions:
1. Temoin
.
.
.
.
2. Apres RNase
3. Apres RNase et DNase
A
B
C
D
3,71
(2692/725)
0,91
(579/630)
0,30
(178/591)
2,42
(2169/893)
0,69
(328/474)
0,26
(149/563)
0,60
(618/1026)
0,29
(122/410)
0,29
(147/499)
0,37
(397/1063)
0,18
(93/506)
0,19
(82/427)
Ce tableau indique les moyennes obtenues: (1) pour l'activite* totale
(te"moin); (2) apres hydrolyse a la ribonucle"ase; (3) apres hydrolyse
successive a la ribonucle'ase et & la de'soxyribonucle'ase.
Entre parentheses, figurent le nombre total de traces et le nombre
total de surfaces de'nombre'es.
TABLEAU 6
Distribution de la radioactivite parmi les differentes substances marquees
Regions:
1. ARN .
2. ADN .
3. Proteines
A
B
C
D
2,80
0,61
0,30
1,73
0,43
0,26
0,31
0,19
0,29
0,19
Ces moyennes ont 6t6 obtenues:
1. par difference entre les moyennes obtenues pour l'activite" totale
(ARN + ADN + proteines) et celles obtenues apres elimination
de l'ARN;
2. par difference entre les moyennes obtenues apres l'elimination
de l'ARN et celles obtenues apres elimination de l'ARN + ADN;
3. par de"nombrement des traces re"siduelles apres elimination de
l'ARN et de l'ADN.
FIG. 3. Gastrula moyenne. Territoires eludi^s: A, neuroblaste pre"somptif; B, ectoblaste; c, organisateur; D, entoblaste.
DISCUSSION
En ce qui concerne l'incorporation totale du 14CC>2, nos observations autoradiographiques sont en bon accord avec les resultats de Flickinger (1954) qui
a travaille avec un compteur: il a observe des gradients d'activite, analogues a
ceux que nous venons de decrire, tant en ce qui concerne les proteines que les
122 R. TENCER — L'INCORPORATION DE i4CO2 DANS DES GASTRULAS
acides nucleiques. Toutefois, nos premiers resultats n'indiquent de gradients que
pour l'ARN au debut de la gastrulation.
Ces gradients d'activite sont superposables aux gradients ribonucleiques,
animal-vegetatif et dorso-ventral, qui ont ete observes cytochimiquement par
Brachet (1944, 1952) et dont l'existence a ete verifiee par le dosage direct de
l'ARN (Steinert, 1954; Takata, 1953).
Comme l'ont signale Ficq (1954) et Sirlin (1955), la radioactivite est surtout
concentree dans les noyaux. Des lors, il n'est pas etonnant de trouver une
activite globale plus grande dans la partie animale, ou les noyaux sont plus
abondants. Mais l'examen de la distribution de l'activite cytoplasmique dans la
jeune gastrula montre un parallelisme entre l'augmentation du nombre de traces
et la diminution de la taille des plaquettes vitellines. Les differences metaboliques qui existent, au stade jeune gastrula, entre le neuroblaste et l'ectoblaste
presomptifs etaient cependant inattendues: en effet, de nombreuses experiences
(d'explantation, de transplantation, d'exogastrulation, etc.) ont montre que, en
l'absence d'induction, ni la plaque medullaire presomptive, ni l'ectoderme presomptif d'une jeune gastrula ne sont capables de former du tissu nerveux.
Par contre, on peut mettre en evidence experimentalement des differences
entre le mesoblaste dorsal et ventral a ce stade. Nous savons toutefois par des
experiences de Yamada (1950) et de Kawakami & Okano (1955) que la determination est encore labile a ce moment. C'est a ce meme stade que l'organisateur
transforme l'ectoderme competent en systeme nerveux, que differents agents
chimiques peuvent provoquer la neuralisation, que la precytolyse, comme l'a
montre Holtfreter (1947), suffit a provoquer la neuralisation spontanee de l'ectoblaste.
Au moment ou les territoires cytoplasmiques commencent a se differencier,
des la jeune gastrula, les noyaux presentent encore, en ce qui concerne l'incorporation du 14CC>2, des radioactivites tres voisines. Par contre, au stade gastrula
avancee, les noyaux des divers territoires semblent s'etre individualises. Une
pareille constatation concorde avec les resultats obtenus par Briggs et King qui
ont transplants des noyaux de jeune gastrula (Briggs & King, 1952) et de gastrula
avancee (King & Briggs, 1955) dans des oeufs vierges prealablement enuclee's.
Us ont conclu de leurs experiences que les noyaux n'ont pas encore subi de
changements irreversibles et qu'ils ont conserve toutes leurs potentialites dans
la jeune gastrula et que c'est au cours de la gastrulation qu'ils se differencient.
II serait, croyons-nous, interessant d'etendre ces resultats au cas des embryons
dont le developpement a ete altere experimentalement (gastrulas centrif ugees ou
lithinees, hybrides letaux, etc.) afin de preciser la nature des echanges entre le
noyau et le cytoplasme au cours de la morphogenese.
RESUME
14
L'incorporation du CO2 a ete suivie, dans differents territoires de la gastrula
R. TENCER —L'INCORPORATION DE i*co 2 DANS DES GASTRULAS 123
d'Axolotl, par la methode autoradiographique. Des la jeune gastrula, on observe
des gradients d'activite animal-vegetatif et dorso-ventral. Ces differences affectent surtout le cytoplasme; les noyaux sont tres actifs, mais ils presentent des
radioactivites tres voisines. On retrouve les memes differences au stade gastrula
avancee. Mais a ce moment, les noyaux presentent des gradients d'activite
paralleles a ceux qu'on trouve dans le cytoplasme.
SUMMARY
Regional incorporation of 14CO2 into Amphibian gastrulae has been followed
by autoradiography. Differences in uptake of the tracer in different parts appear
already in the early gastrula. These differences only affect the cytoplasm while
the nuclei, heavily labelled, show very similar radioactivities. In the late gastrula,
however, the nuclei show the same gradients of activity as the cytoplasm.
TRAVAUX
CITES
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(Manuscript received 11: vii: 57)