/ . Embryol. exp. Morph. Vol. 42, pp. 5-14, 1977
Printed in Great Britain © Company of Biologists Limited 1977
La cinetique cellulaire au cours
de la segmentation du germe d'Axolotl: proposition
d'un modele statistique
Par J. SIGNORET1
Laboratoire d'Embryologie, Universite de Caen, France
CET ARTICLE EST DED1E A LA MEMOIRE
DU PROFESSEUR LOUIS GALLIEN
SUMMARY
The present work is based on the study of individual cell cycle times for a given category
of cells. The material considered in detail is the Axolotl embryo during the eleventh cleavage
cycle. In spite of the exceptional homogeneity of this population, individual cycle times show
a remarkable variation from cell to cell, coinciding with a characteristic statistical distribution.
To describe the kinetics of cell proliferation, we propose a model for which the theoretical
distribution of cycle times fits with the distribution observed in our material. Numerous
observations allow us to generalize the model to other types of populations. According to
this concept the notion of cell cycle time disappears in favour of the notion of a statistical
distribution of individual cycle times.
This variability is integral to the cell division process itself. We suggest that in the cycle
there is a particular event the probability of occurrence of which is constant beginning with
a critical state. The cells would therefore remain a certain time in this state, overcoming it at
a characteristic rate.
To this exponential distribution variability would be added the variability of other events
whose cumulative effects would result in a normal distribution. The resultant of both factors
conforms to the frequency distribution implicated in our kinetic model.
Discussing in a more general way the distributions of the cycle times of each cell division
during cleavage, we propose the following interpretation of this development. The introduction of new events in the cyclic process would imply the switching on of certain essential
genetic activities. The final consequences would be the desynchronization and the lengthening
of the cycles observed at the blastula stage.
Thus considered, this period of embryonic development would be eminently suitable for
the study of the factors of cell division control.
INTRODUCTION
La duree du cycle cellulaire est une grandeur fondamentale pour une population definie de cellules. Cette duree differe considerablement d'une categorie a
1'autre, et, pour une meme categorie, en fonction des especes choisies. Lorsqu'on
etudie une population aussi homogene que possible maintenue dans des conditions constantes, on observe que la duree du cycle presente une variability
1
Adresse de Vauteur: Laboratoire d'Embryologie, Universite de Caen, France.
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J. SIGNORET
relativement importante que le renforcement des precautions methodologiques
ne permet pas d'eliminer.
La blastula d'Amphibien constitue a cet egard une population remarquable
de cellules ayant le meme age, non differenciees, totipotentes, et destinees
toutes a se diviser.
Sur le materiel tres particulier, et par certains cotes tres favorable, que
constitute le germe d'Axolotl en cours de segmentation, nous avons determine
la distribution de la duree de chacun des cycles de division. En considerant la
distribution du onzieme cycle nous sommes amenes a rejeter l'hypothese d'une
distribution normale.
Nous proposons alors un modele statistique original de la duree du cycle de
division, inspire de quelques travaux fondamentaux et nous montrons la parfaite
compatibility entre la distribution theorique impliquee par notre modele et la
distribution observee.
Nous considerons enfin les consequences de notre hypothese sur l'interpretation du deroulement du cycle cellulaire, et de revolution de ce cycle au cours
du developpement embryonnaire. Notre modele statistique permet ainsi de
rendre compte de la desynchronisation qui survient lors de la transition blastuleenne (Signoret & Lefresne, 1971).
Les modeles statistiques et la variabilite du cycle
Parmi les tres nombreux travaux destines a evaluer la duree du cycle, la
plupart considerent cette variabilite comme un phenomene parasite, et se contentent de determiner une duree moyenne, en signalant parfois les limites de
variation observees. Lorsqu'il s'agit de connaitre la duree des phases du cycle,
en particulier par la methode des mitoses marquees (Quastler & Sherman, 1959)
on admet en general que les phases elementaires (G l5 S, G2, M) et leur somme
presentent une variabilite aleatoire se traduisant pour chaque grandeur par une
distribution normale pour en echantillonnage defini. Cette hypothese est souvent
implicite, de telle sorte que les difficultes decoulant de l'existence de cette variabilite se trouvent eludees plutot que resolues. Quelques travaux recents interpretent cependant la variabilite de la duree du cycle d'une maniere toute
differente; les modeles proposes integrent cette variabilite dans le mecanisme
meme du cycle cellulaire, la considerent comme l'expression d'un phenomene
fondamental, et lui attribuent un role essentiel dans la regulation de la
proliferation.
Dans le cas d'une proliferation stable a renouvellement lent, Burns & Tannock
(1970) proposent de distinguer deux phases du cycle, l'une de duree indeterminee,
l'autre de duree definie (6), cette derniere comprenant la division proprement
dite. Les cellules quitteraient la premiere phase pour la seconde a un taux
constant (k).
U est possible dans ces conditions de caracteriser une population par les deux
parametres k et 6 correspondants. Remarquons que ce modele, d'une grande
Cinetique cellulaire et segmentation
1
simplicite, rend compte des faits sans qu'il soit necessaire de distinguer des
categories differentes de cellules ('hors du cycle' et 'dans le cycle') et recouvre,
sous une autre forme, la notion de phase Go (Lajtha, 1966). Toutes les cellules
se trouvant dans la phase de duree indeterminee ont une probability egale et
constante de quitter cette phase dans un intervalle de temps donne. Les auteurs
presentent en faveur de leur modele plusiers arguments, dont celui de la simplicite
reste essentiel. Smith & Martin (1974) ont generalise ce modele a des populations
a proliferation relativement rapide. De plus ils montrent que les durees individuelles du cycle mesurees sur des series de photographies prises e intervalles
successifs egaux admettent une distribution compatible avec le modele propose.
Ces auteurs attachent une importance particuliere a la transition de la phase
indeterminee a la phase definie. Ils attribuent a la probability de transition (ou
a son taux) pour une population donnee, ainsi qu'a ses variations sous Peffet
de stimuli specifiques, un role fondamental dans la regulation de la proliferation
cellulaire.
De Maertelaer & Galand (1975) ont repris le modele de Burns & Tannock
sous une formulation plus generate. La description cinetique d'une population
est encore definie par deux parametres, et les phenomenes de differenciation et
de perte de cellules sont pris en consideration. Un programme d'ordinateur a
ete realise de telle sorte qu'en fournissant les donnees concernant la courbe des
mitoses marquees on obtienne les valeurs les mieux adaptees des parametres 0
et k. A partir de 14 courbes de mitoses marquees empruntees a la litterature ces
auteurs determinent les couples de parametres correspondant. II est interessant
de noter que les valeurs de 6 sont toutes superieures a 8 h, et celles de k inferieures
a 0,25 h - / .
De Maertelaer & Galand (1977) ont etendu leur modele a la description d'une
population en croissance exponentielle a la condition qu'il n'y ait pas de perte
de cellules.
La segmentation du germe d'Axolotl
La cinetique cellulaire au cours de cette phase du developpement se presente
d'une maniere particulierement favorable a l'analyse et les techniques de cette
analyse ont ete decrites en detail par ailleurs (Signoret & Lefresne, 1971).
Dans des conditions bien controlees l'oeuf entre en segmentation six heures
apres la ponte et subit une serie de divisions synchrones, au moins en ce qui
concerne l'hemisphere animal.
La duree de ces cycles est de l'ordre de 80 min, avec des variations d'une
cellule a l'autre pour un meme cycle ne depassant pas en general 5 min. A partir
du dixieme cycle de division on peut observer une desynchronisation par allongement inegal des cycles, et ce phenomene est particulierement net au onzieme
cycle, dont les durees individuelles s'echelonnent de 85 a 215 min.
L'allongement des cycles se poursuit, en meme temps que l'analyse devient
plus delicate en raison du chevauchement de plusieurs cycles, et de la diminution
de taille des blastomeres.
J. SIGNORET
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20
10
75
90
105
120
150
135
165
180
210
195
225
Fig. 1. Histogramme representant la distribution des frequences de la duree du
onzieme cycle de division chez le germe d'Axolotl pour 219 mesures. Les duree
(en minutes) sont portees en abscisse groupees par intervalle de 15 min.
Tableau 1. Comparaison de trois distributions des durees du cycle
groupees par intervalles de 15 min, pour 219 mesures
En haut distribution theorique normale (Laplace-Gauss). Au centre distribution
observee. En bas distribution theorique suivant notre modele statistique et pour le
meilleur jeu des parametres a, b, c.
Classes
<- 90
Nombre de cas theoriques
(distribution normale)
Nombre de cas experimentaux
Nombre de cas theoriques
(distribution proposee
97,5-9-23)
105
120
135
150
165
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210
23
38
57
56
36
15
4
1
0
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54
74
44
22
15
6
3
1
9
54
73
44
23
12
6
3
4
Le quatorzieme cycle, qui se deroule peu avant le debut de la gastrulation,
dure 2 h de plus que le onzieme, bien que ses variations individuelles ne soient
pas plus larges.
Nous avons choisi d'etudier la distribution des durees individuelles du onzieme
cycle de division, dont l'etalement se prete favorablement a une analyse
statistique, et dont tous les blastomeres apparents peuvent etre reperes et suivis.
La comparaison de la distribution obtenue pour plusieurs oeufs de la meme
Cinetique cellulaire et segmentation
9
ponte met en evidence l'excellente reproductible et autorise a grouper les
mesures.
Les resultats correspondant a 219 mesures sont repartis par classe de 15 min,
ce qui represente l'intervalle entre deux cliches successifs (Fig. 1).
Nous avons d'abord envisage Phypothese d'une distribution normale de ces
durees, et compare la distribution observee a une distribution theorique definie
par la meme moyenne (127 min) et le meme ecart type (22 min) (Tableau 1).
Le calcul du x2 nous permet d'exclure cette hypothese avec une tres grande
certitude, superieure a 99,9 %.
Nous avons ecarte de meme l'hypothese d'une distribution normale du
logarithme des durees avec une certitude superieure a 99 %.
Nous avons imagine un modele suivant lequel la duree du cycle pour une
cellule donnee serait la somme d'une duree correspondant a une serie d'evenements definis et d'un temps passe dans un etat particulier. En d'autres termes le
processus du cycle cellulaire comporterait un grand nombre d'evenements dont
les durees admettraient des variabilites individuelles aleatoires; leurs effets
cumulatifs correspondraient a une loi normale de distribution. Un evenement
singulier, necessaire au deroulement du cycle, obeirait a une cinetique originale.
Les cellules arrivees a un certain stade du processus auraient une probability
constante et egale de subir cet evenement dans un intervalle de temps donne.
Elles franchiraient done ce pas a un taux constant, et le temps passe dans cet
etat critique admettrait une distribution exponentielle decroissante.
Au total, pour la population cellulaire considered, la fonction de distribution
des durees du cycle serait le produit de convolution d'une fonction normale
dennie par sa moyenne (a) et son ecart type (b) et d'une fonction exponentielle
dennie par son taux (1/c).
La fonction ainsi calculee est definie par trois parametres (a, b, c) qui sont
des temps (voir appendice). La meilleure estimation de ces parametres obtenue
en recherchant la valeur minimale du x2 correspond ka = 97,5 min, b = 9 min,
c = 23 min. La distribution theorique calculee pour ces valeurs est remarquablement conforme a la distribution observee (Tableau 1) et le calcul du x2 confirme
une parfaite compatibilite statistique entre les deux distributions. Le meme test
montre que la distribution theorique reste acceptable avec une securite de 95 %
pour les jeux de valeurs (a = 95, b = 8, c = 25) et (a = 100, b = 11, c = 20).
Consequences et discussion
Le modele que nous proposons decrit parfaitement la cinetique d'un cycle de
division du germe d'Axolotl, mais ne merite d'etre retenu que s'il est susceptible
d'etre generalise. II apparait a cet egard qu'il est en accord avec le modele de
Burns & Tannock (1970) en supposant que pour certaines populations b puisse
etre nelige devant les facteurs a et c, et qu'en premiere analyse de telles populations
soient decrites par deux parametres, et une simple fonction exponentielle (Fig. 2).
Remarquons cependant que cette simplification est statistiquement inacceptable
10
J. SIGNORET
A
B
Fig. 2. Courbes representatives de la fonction de distribution de la duree du cycle
cellulaire. (A) Cas particulier d'une distribution definie par deux parametres, et se
ramenant a une fonction de Laplace-Gauss. (Dans notre modele, c = 0.) (B) Cas
particulier d'une distribution definie par deux parametres, et se ramenant a une
fonction exponentielle. (Dans notre modele, b = 0.) (C) Cas general d'une distribution definie par trois parametres suivant notre modele statistique.
sur notre materiel. Ajoutons que notre modele n'est pas une alternative eventuelle
a la distribution normale, puisque nous avons exclu celle-ci pour des motifs
statistiques. Enfin il est important de souligner que la notion de transition
exponentielle (Smith & Martin, 1974) n'est nullement liee a des phenomenes de
differentiation, ou de renouvellement. En effet les cellules de l'hemisphere
animal de la blastula sont equivalentes, indeterminees et totipotentes. II ne
survient aucune perte ou elimination cellulaires et toutes les cellules se divisent.
En consequence notre modele peut etre propose pour rendre compte des durees
du cycle pour une categorie de cellules quelle qu'elle soit.
Nous avons vu que dans certaines conditions b pouvait etre considere comme
negligeable. Au cours des premieres divisions synchrones de l'ceuf au contraire,
c'est c qui serait pratiquement nul; le cycle presente en effet pendant cette
periode une] duree moyenne facilement observable et une variability tres faible.
Dans le cas general du modele a trois parametres il apparait que la notion de
la duree du cycle cellulaire pour une categorie donnee s'evanouit. C'est la notion
de distribution statistique de la duree qui la remplace.
Evolution du cycle au cours du developpement
II est demontre que le cytoplasme de Pceuf d'Amphibien peut imposer l'initiation d'une DNA synthese en l'absence de toute synthese proteique preliminaire
(Gurdon & Woodland, 1968). Cette situation exceptionnelle peut s'interpreter
en imaginant que l'ceuf contient une notable reserve du facteur d'initiation,
comme il contient les autres elements necessaires a assurer le debut du developpement, en particulier les produits de l'activite des genes de l'ovocyte.
La segmentation debuterait par des cycles reduits aux evenements qui ne
peuvent etre executes a l'avance, c'est a dire a la replication acceleree du DNA,
au processus mitotique proprement dit, et a la plasmodierese. En presence d'un
Cinetique cellulaire et segmentation
11
/o
100
50
Seme-
->- t
11 cme
\ \ . \ \
\ \ X \ \ \ X \
270
330
Fig. 3. Evolution de la distribution des durees du cycle au cours de la segmentation.
D'arriere en avant sont representes les histogrammes correspondant an 8eme, au
11 erne et au 14eme cycle. En ordonnee les frequences. En abscisse les durees en
minutes, groupees par intervalles de 15 min.
signal d'initiation constant et surabondant, la DNA synthese se declencherait
aussitot que le noyau est en etat d'obeir a ce signal, e'est a dire des la decompactation telophasique qui suit chaque anaphase. Ces cycles constants et egaux
caracteriseraient la phase des divisions synchrones du germ (Signoret &
Lefresne, 1974).
A Tissue d'un certain nombre de telles divisions, la multiplication exponentielle
des noyaux amenerait un epuisement du facteur d'initiation. Pour les blastomeres concernes la telophase serait suivie d'une phase Gx au cours de laquelle
les genes pourraient etre exprimes.
En particulier la synthese de novo du facteur d'initiation introduirait une
probabilite constante de realiser l'evenement singulier qui conditionne la poursuite du processus. Ainsi apparaitrait une distribution statistique des durees
du cycle responsable de la desynchronisation (Fig. 3).
On comprend bien qu'au hasard des plasmodiereses on puisse observer un
cycle transitoire (le dixieme sur notre material) entre le dernier cycle synchrone
et le premier obeissant a cette nouvelle cinetique. II est egalement interessant
de noter que l'analyse experimentale des modalites de la segmentation (Signoret
& Lefresne, 1973) s'accorde fort bien avec ce modele. Par ailleurs la desynchron-
12
J. SIGNORET
isation survient en meme temps qu'apparait la phase Gv Enfin des resultats
preliminaires obtenus en utilisant l'a-amanitine sembleraient indiquer qu'en
l'absence de toute expression des genes la segmentation se deroule normalement
jusqu'a un blocage qui se situerait en phase Gx du premier cycle desynchronise.
La segmentation normale comporte, comme nous l'avons vu, un allongement
des cycles chez la blastula agee. Mais cet allongement ne semble pas introduire
de variabilite nouvelle. C'est ainsi qu'en comparant 121 mesures du quatorzieme
cycle a celles deja analysees pour le onzieme nous observons que la moyenne
des durees passe de 127 a 262 min, l'ecart type restant compris entre 20 et 25 min
(Fig. 3). Plus precisement la distribution de ces 121 mesures est compatible avec
le modele statistique que nous proposons en choisissant une distribution
theorique definie par les parametres a = 240, b = 9, c = 23.
Nous admettons done qu'a partir de la fonction de distribution du onzieme
cycle (a = 97,5, b - 9, c = 23) le changement peut ne concerner qu'un parametre. Le cycle se serait allonge par l'introduction d'un evenement nouveau,
correspondant a l'epuisement d'un nouvel element des reserves specifiques de
l'oeuf. Une nouvelle activite propre des genes serait requise mais l'allongement
porterait sur la composante normale de la duree statistique du cycle. Une
situation transitoire s'observerait encore au cours d'un cycle intermediate (le
douzieme).
CONCLUSION
Notre etude de la segmentation du germe d'Axolotl nous amene a considerer
que la variabilite du cycle cellulaire est inherente au processus meme de ce cycle.
Nous devons rejeter l'hypothese d'une distribution normale des durees correspondant a une fonction de Laplace-Gauss.
Nous proposons un modele statistique original suivant lequel la fonction de
distribution des durees du cycle serait definie par trois parametres pour une
population donnee. Ce modele, qui s'accorde parfaitement avec notre materiel
nous parait susceptible d'etre etendu ou generalise. La notion de duree du cycle
pour une categorie de cellules disparait pour etre remplacee par la notion de
distribution statistique caracteristique.
Par ailleurs revolution du cycle au cours de la segmentation traduirait la mise
en ceuvre de nouvelles fonctions necessaires au deroulement du processus, et
jusque la pre-realisees par le cytoplasme du germe.
S'il en est ainsi le germe en cours de segmentation se presente comme un
materiel de choix pour l'analyse de certains evenements essentiels du cycle
comme l'initiation de la DNA replication, ou le declenchement de la mitose.
Cinetique cellulaire et segmentation
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APPENDICE
Suivant le modele que nous proposons, la fonction de distribution de la duree
du cycle F(t) est le produit de convolution des deux fonctions suivantes:
(1) Une fonction de Laplace-Gauss de la forme.
(2) Une fonction exponentielle de la forme
g(t) = -exp — c
|_
cj
(pour t ^ 0, avecg(0 = 0, pour t < 0)
soit
= P Au)g{t
J -00
dont le calcul conduit a
en posant
Un programme de calcul a ete realise de maniere a calculer la distribution
theorique correspondant a chaque jeu de parametres a, b, c. Cette distribution
est comparee a la distribution observee experimentalement par le test du x2A partir d'une solution approchee determinee graphiquement, nous avons
fait varier independamment les trois parametres jusqu'a la valeur minimale
du x*Nous avons trouve: a = 97,5, b = 9, c = 23 (en minutes).
Le traitement mathematique a ete effectue au Centre de Calcul de PUniversite de Caen.
La formulation proprement dite de notre modele ainsi que la preparation du programme
d'ordinateur ont ete realisees par le Professeur Braillon a qui nous adressons nos plus vifs
remerciements.
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