/. Embryo/, exp. Morph. Vol. 42, pp. 29-42, 1977
29
Printed in Great Britain (j£> Company of Biologists Limited 1977
L'activite 3(3-hydroxysteroide deshydrogenasique
dans les gonades en differentiation de Pleurodeles
waltlii (Amphibien, Urodele); visualisation sur
coupes seriees a Taide d'une nouvelle
technique histochimique
Par G. COLLENOT 1 ET A. COLLENOT 1
Laboratoire d'Anatomie comparee, Universite Paris VII
Laboratoire de Biologie du Developpement,
Universite Pierre et Marie Curie et Centre de Cytologie
experimental du CNRS
SUMMARY
3/?-hydroxysteroid dehydrogenase activity in the larval gonads of Pleurodeles waltlii
(amphibian, urodele); a new histochemical technique for serial sections.
In order to detect a 3/?-hydroxysteroid dehydrogenase (3/?-HSDH) activity in the larval
gonads of the newt Pleurodeles waltlii an original histochemical method has been derived
from the cytochemical technique used by Bara & Anderson (1973) in their ultrastructural
studies on the same enzyme activity. The new technique which is described here, allows the
incubation in toto of the larval gonads, their paraffin embedding and their sectioning into
serial sections of 7 /tm thickness. Unisexual, male and female, offsprings were used.
The 3/tf-HSDH activity could be detected, in the larval gonads, at the level of the inner
cells which constitute the medulla inside the cavity of the genital ridge, as early as the end
of the first third of the larval life, at a stage when the gonads are not yet differentiated.
When an ovary differentiates, the enzyme activity remains at the level of the ovarian sac
which will constitute the theca of the follicles in the mature ovary. When a testis differentiates,
the medullary positive cells which associate with the germinal cells constitute the testicular
ampullae or cysts and (later) become negative; but, at the level of the posterior part of the
testis, several clusters of interstitial cells showed a 3/?-HSDH activity in metamorphosed
and juvenile animals.
The results are discussed in relation with former reports about the steroid-synthesizing
cellular sites in the mature ovaries and testes of urodelean amphibians.
INTRODUCTION
La detection, par des methodes histochimiques, de plusieurs activites enzymatiques permet de visualiser les cellules steroid ogenes (Baillie, Ferguson &
Hart, 1966) et de les etudier dans diverses conditions experimentales dans
1
Adresse postale des auteurs: Centre de Cytologie experimental du CNRS, 67, rue
Maurice Giinsbourg, 94200 Ivry/Seine, France.
3
EMB 42
30
G. COLLENOT ET A. COLLENOT
l'organisme (Levy, Deane & Rubin, 1959) ou en culture in vitro (Steinberger
et al. 1967). L'activite 3^-hydroxysteroide deshydrogenasique (3/?-HSDH) est
considered, a cet egard, comme la plus significative en raison du role que joue
l'enzyme correspondante dans la chaine de biosynthese des hormones steroides.
La detection histochimique de cette activite, dont l'emploi est maintenant
generalise, a permis, chez les Amphibiens Anoures et Urodeles, d'identifier
les cellules productrices de steroides au niveau des testicules et des ovaires
adultes etudies a differentes etapes du cycle de reproduction (revue in Guraya,
1976 a, b).
Des observations ayant trait a la mise en evidence histochimique d'une
activite 3/?-HSDH dans les gonades larvaires et juveniles du Triton Pleurodeles
waltlii ont deja permis a l'un de nous (Collenot, 1964, 1965 a) de constater
l'existence de cette activite dans les gonades larvaires a un stade precoce de
leur formation, anterieur a celui ou s'effectue leur differenciation en ovaires
ou en testicules. La technique qui avait ete utilisee au cours de ces recherches
est une adaptation de celle decrite par Levy et al. (1959) et elle implique la
realisation de coupes de tissu frais au cryostat; dans ces conditions techniques
la confection des coupes de gonades des larves s'est revelee tres difficile (les
larves etaient congelees et sectionnees in toto) cependant que la fabrication de
coupes seriees s'averait impossible. Les coupes les plus minces qu'il avait ete
possible de realiser a l'aide du cryostat avaient une epaisseur de 12 a 15 /.im.
De plus, l'architecture des structures anatomiques oil l'activite enzymatique
est decelee grace a la presence d'un precipite bleu-noir de diformazan, est
visualisee grace a une coloration nucleaire par le rouge solide; cette derniere
coloration n'a permis que rarement de reconnaitre de fac.on precise la disposition des cellules dans la gonade en differenciation.
Enfin, la gelatine-glycerinee utilisee comme milieu de montage est peu
favorable a une bonne conservation des coupes pendant une longue duree.
Nous avons entrepris de resoudre ces difficultes qui ne sont d'ailleurs pas
particulieres a notre materiel biologique et nous decrivons ici une technique
histochimique originale qui permet de detecter une activite 3/?-HSDH, dans
les gonades larvaires du Pleurodele, apres l'incubation des gonades in toto,
leur inclusion dans la paraffine, leur debitage en coupes seriees, la coloration
des coupes par le vert de methyle et leur montage apres une deshydratation.
Nous rapportons, en outre, les observations que cette technique nous a permis de
realiser chez les larves males et femelles du Pleurodele depuis lafindu premier
tiers de la vie larvaire, avant la differenciation sexuelle des gonades, jusqu'a
la metamorphose.
MATERIEL ET TECHNIQUES
L'activite 3/?-HSDH a ete recherchee dans les gonades des larves du triton
Pleurodeles waltlii Michah. depuis la fin du premier tiers de la vie larvaire
(stade 46 de la table de Gallien & Durocher, 1957) jusqu'a la fin de la meta-
Vactivite 3fi-hydroxysteroide deshydrogenasique chez Pleurodeles 31
morphose et chez quelques individus juveniles des deux sexes 3 mois apres la
metamorphose. Les animaux utilises etaient issus de pontes unisexuees, males
et femelles, obtenues au laboratoire a partir de femelles arrhenogenes et thelygenes; les conditions de fabrication de ces femelles ont ete rapportees ailleurs
par l'un de nous (Collenot, 1975).
Deux techniques histochimiques qui permettent de visualiser l'activite 3/?HSDH ont ete utilisees. La premiere est tres proche de celle decrite par Levy
et al. (1959), nous la designerons en abrege: technique LDR; la seconde que
nous avons mise au point et que nous decrivons pour la premiere fois derive
d'une technique de cytochimie ultrastructurale lisee utipar Bara & Anderson
(1973), nous la designerons en abrege: technique BAC.
Technique LDR. Les coupes sont effectuees au cryostat sur du tissu frais
congele et recueillies sur des lames porte-objet. Les larves sont congelees in
toto ou bien, chez les individus en cours de metamorphose ou metamorphoses, les gonades seules sont prelevees et congelees apres avoir ete enrobees
dans des fragments de tissu hepatique. Avant l'incubation, les coupes sont
fixees pendant 1 min, soit dans une solution de formol a 10 % a la temperature de 4 °C, soit dans l'acetone a - 1 8 ° C . Les coupes sont ensuite
lavees dans 3 bains successifs de tampon phosphate (0,1 M; pH 7,2). La
composition du milieu d'incubation employe est la suivante: dehydroepiandrosterone (DHA), 2mg; dimethylformamide, 5 ml; eau distillee, 15 ml; tampon
phosphate ( 0 , 1 M ; pH 7,2), 40 ml; nicotinamide, 11,2 mg; nitro BT, 10 mg;
NAD, 24 mg.
Ce milieu d'incubation est celui qui a ete utilise par Levy et al. (1959) modifie
selon les indications fournies par Baillie et al. (1966); le substrat (DHA) est
dissous dans la dimethylformamide; de plus, apres une incubation de 30 min.
a 37 °C, les coupes sont definitivement fixees dans une solution aqueuse a
10% de formol. Apres cette fixation, les coupes sont rincees a l'eau distillee,
colorees par une solution de rouge nucleaire solide et montees dans un milieu
aqueux.
Technique BAC. La dissection des animaux et le prelevement de leurs gonades
sont effectues dans le milieu de fixation maintenu a 4 °C. La duree de la fixation
varie de 30-60 min. Le milieu de fixation est une solution de formaldehyde a
2 % dans du tampon phosphate (0,05 M; pH 7,2 lorsqu'il s'agit de larves et
0,1 M et pH 7,2 lorsqu'il s'agit d'individus metamorphoses ou juveniles). La
solution de formaldehyde est preparee extemporanement a partir de paraformaldehyde (TAAB) de la facon suivante: on ajoute 1 a 2 gouttes de solution
de soude, 1 N, a une solution de paraformaldehyde (a 4 % dans l'eau distillee)
chauffee jusqu'a 70 °C environ; la solution, initialement d'aspect laiteux,
s'eclaircit progressivement, et, lorsqu'elle est devenue limpide, on la refroidit
puis la melange a parties egales avec du tampon phosphate a 0,1 M ou 0,2 M
selon la concentration finale desiree. La fixation est suivie de nombreux rincages dans la solution tampon renouveles tous les quarts d'heure pendant 2 h;
3-2
32
G. COLLENOT ET A. COLLENOT
les pieces peuvent sejourner eventuellement pendant une douzaine d'heures
dans la solution tampon avant d'etre mises a incuber.
Le milieu d'incubation est derive de celui employe par Bara & Anderson
(1973) qui utilisent l'etiocholanolone comme substrat. L'etiocholanolone est
dissoute dans le dimethylsulfoxide (DMSO) qui facilite la penetration du
substrat dans les tissus incubes (Makita & Sandborn, 1971). La composition
du milieu d'incubation est la suivante: etiocholanolone (Sigma), 1 mg; tampon phosphate (0,05 M; pH 7,2), 4,2 ml; DMSO, 0,5 ml; NAD, 5mg; Nitro
BT, 5 mg.
Apres une incubation de 45-60 min a 37 °C, les pieces sont rincees dans 3
bains successifs de 1 h chacun dans la solution tampon. Le dernier bain de
rincage peut etre prolonge jusqu'a 12 h. Les pieces sont ensuite rapidement
deshydratees, eclaircies dans le toluene puis montees in toto entre lame et lamelle
ou bien impregnees puis incluses dans la paraffine. Les coupes seriees sont
colorees par le vert de methyle acetique. II est necessaire, pour cette technique,
de purifier soigneusement, avant de le dissoudre, le vert de methyle avec du
chloroforme pour eliminer le violet de methyle qui contamine habituellement
le vert de methyle en poudre. Pour chacun des stades etudies, lors de la mise
en oeuvre de l'une ou l'autre technique, des incubations dans des milieux
depourvus de substrat ont permis de controler la specificite des depots de
formazan observes dans les tissus. En outre, l'architecture des gonades aux
stades correspondants a ete verifiee sur des coupes histologiques colorees au
glychemalun de Mayer-eosine apres une fixation avec le liquide de BouinHollande, et elle a ete comparee a celle decrite par Houillon (1956) dans son
etude de la differenciation des gonades du Pleurodele.
RESULTATS
(A) Detection de Pactivite 3fi-HSDH dans les gonades des lanes
(1) Avant la differenciation sexuelle
Une faible reaction positive a ete observee dans les gonades des larves, au
stade 46, au niveau de quelques rares cellules presentes dans la cavite de la
crete genitale (Fig. 1A). Au cours des stades ulterieurs, ces cellules vont
devenir plus abondantes, s'organiser en cordons et former la medulla (selon la
terminologie de Witschi, 1956) ou la reaction positive est plus intense que
precedemment, facilement decelable et nettement circonscrite a la partie
profonde de la gonade; les cellules de l'epithelium peritoneal associees aux
cellules germinales constituent le cortex de la gonade sexuellement indifferenciee qui est depourvu de toute trace de reaction positive (Fig. 1B, C).
(2) Au cours de la differenciation sexuelle
Des le stade 51, l'orientation des gonades males genetiques dans la voie de
la differenciation testiculaire est indiquee par la presence de quelques cellules
B
Fig. 1. Stades precoces du developpement des gonades du Pleurodele; mise en evidence d'une activite 3/?-HSDH par la
technique BAC.
(A) Stade 46; gonade d'une larve male. Le cytoplasme de quelques cellules situees dans la cavite de la crete genitale est positif
(fleches). M, plage sombre correspondant a un amas de grains de melanine.
(B, C) Stade 49; gonades d'une larve femelle. Les cellules profondes positives sont abondantes. C.A., corps adipeux;
G., gonocyte. L'echelle de B est commune a (A) et (C).
20 fim
G.
C.A.
o
2-
t
t
34
G. COLLENOT ET A. COLLENOT
50 //rn
100//m
E
Fig. 2. Debut de la differentiation sexuelle des gonades du Pleurodele; mise en evidence d'une activite 3/?-HSDH (A, B, D, E, F: techniqueBAC; C: technique LDR).
(A) Stade 51, gonade d'une larve femelle.
(B) Stade 51, gonade d'une larve male. Un gonocyte (G.S.) occupe une position
superficielle, un autre (G.P.) est en cours de passage vers la profondeur de la gonade.
(C) Stade 52 a, gonade d'une larve male. Deux gonocytes sont visibles en position
profonde (G.P.); seules les cellules de la partie distale d'un cordon medullaire (CM.)
sont positives.
(D) Stade 53, gonade d'une larve femelle. Les gonocytes occupent une position
superficielle, deux lacunes sont visibles dans la masse des cellules centrales positives.
(E) Stade 54, gonade d'une larve male. Deux gonocytes occupent encore une position
superficielle, les autres sont etroitement entoures par des cellules positives dans la
profondeur de la gonade.
(F) Stade 54, mesonephros et gonades d'une larve femelle. Le tissu interrenal (/.)
et la partie profonde des gonades sont positifs. Mes.: mesentere; P., plages de
grains de melanine. A, B, D d'une part, C et E d'autre part, ont respectivement la
meme echelle.
L'activite 3fi-hydroxystero'ide deshydrogenasique chez Pleurodeles 35
germinales dans la partie profonde des gonades ou elles sont associees aux
cellules des cordons medullaires (Fig. 2B, C). Ces dernieres presentent une
forte reaction positive, elles sont etroitement appliquees a la surface des cellules germinales et elles contribuent a la formation des ampoules testiculaires ou
cystes.
La differenciation des testicules qui a debute dans la partie anterieure se
poursuit au cours des stades suivants selon une sequence antero-posterieure.
Elle est presque totalement achevee au stade 54. Cependant, on peut encore
observer a ce stade, a differents niveaux de la gonade, quelques cellules germinales qui occupent une position superficielle (Fig. 2E).
L'evolution dans la voie de la differenciation ovarienne est caracterisee par
le fait que les cellules germinales superficielles, au stade 51 (Fig. 2 A) vont rester
en position corticale, ou elles vont se diviser et s'organiser en nids d'ovogonies
cependant que la partie medullaire, profonde, de la gonade indifferenciee
presente une reaction positive intense et devient lacunaire (Fig. 2D). Progressivement, les lacunes vont confluer et former, au centre de l'ovaire, une cavite
limitee par les cellules au niveau desquelles la reaction positive est tres intense
et qui constituent le sac ovarien (Fig. 2F).
(B) Detection de Vactivite 3J3-HSDH dans les gonades des animaux
metamorphoses et des animaux juveniles
Chez les femelles, l'organisation generale des ovaires est la meme que celle
observee a la fin de la vie larvaire. Les dimensions des ovaires augmentent; la
cavite ovarienne devient vaste, elle est toujours limitee par les cellules du sac
ovarien disposees en une couche unicellulaire ou la reaction positive est intense (Fig. 3C). Cependant, au cours des 3 premiers mois qui suivent la metamorphose l'augmentation des dimensions de la cavite ovarienne et la croissance
des ovocytes qui font saillie vers l'interieur de la cavite contribuent a distendre
la nappe de cellules ou la reaction est positive; sur les coupes des ovaires les
cellules positives apparaissent alors dispersees (Fig. 3E).
A la difference de celle des ovaires, l'organisation generale des testicules se
transforme apres la metamorphose en raison du fait que l'activite spermatogene
debute dans leur partie posterieure qui augmente rapidement de volume alors
que les regions moyenne et anterieure restent filiformes. L'etude de coupes
transversales dans ces dernieres regions permet de constater la presence de
quelques cystes primordiaux constitues chacun par une ou deux cellules
germinales et par quelques cellules somatiques etroitement appliquees a leur
surface; a aucun niveau il n'est possible de deceler la trace d'une reaction
positive. En revanche, dans la volumineuse partie posterieure, les cystes sont
plus nombreux et de plus grandes dimensions que ceux des autres regions
et, a ce niveau du testicule, la reaction positive n'est plus observee dans
les cellules somatiques appliquees etroitement contre les cellules germinales
des cystes mais dans des amas de cellules qui occupent une position
36
G. COLLENOT ET A. COLLENOT
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L'activite 3fi-hydroxysteroide deshydrogenasique chez Pleurodeles 37
interstitielle par rapport aux cystes et qui sont principalement localises au
voisinage du hile de la gonade, a proximite de la zone d'insertion du mesorchium
(Fig. 3 A, B).
DISCUSSION
La technique histochimique (technique BAC) que nous avons raise au
point pour detecter l'activite 3/?-HSDH dans les gonades des larves du Triton
Pleurodele et dont nous venons de presenter les resultats, perraet de lever les
obstacles rencontres quand nous avions applique la technique de Levy et al.
(1959) a ce meme materiel.
La confection de coupes seriees de 7 /.im d'epaisseur, moins epaisses que
celles realisees au cryostat (12-15/tm), de meme que les montages in toto
permettent une etude complete du materiel dans des conditions d'autant
plus satisfaisantes que l'architecture des structures anatomiques est tres bien
conservee.
Les incubations dans un milieu depourvu de substrat nous ont permis, lors
de chaque experience, de controler la specificite de la reaction positive observee
au niveau des gonades. II convient d'indiquer que nous avons parfois observe
apres des incubations effectuees dans les milieux avec ou sans substrat, d'une
part une faible reaction positive au niveau de quelques tubes du mesonephros
et, d'autre part, une forte reaction positive dans quelques rares leucocytes.
Mais au niveau des gonades elles-memes aucune reaction positive n'a ete
observee apres une incubation en l'absence du substrat.
La reaction positive est decelee grace au depot de grains de diformazan mais
aussi grace a une teinte violacee repartie dans le cytoplasme de facon diffuse,
qui correspond a un depot de monoformazan; c'est le cas lorsque la reaction
positive est peu intense (Fig. 1A). La coloration des noyaux des cellules par
le vert de methyle acetique rend plus aisee, par contraste, la detection de cette
teinte qui est parfois discrete.
FIGURE 3
L'activite 3/ff-HSDH dans les gonades de Pleurodeles en cours de metamorphose et
metamorphoses (A, C, D, E: technique BAC; B: technique LDR).
(A) Stade 55 b, section transversale dans la partie posterieure d'un testicule d'une
larve male en cours de metamorphose. Reaction positive dans plusieurs amas
voisins du hile de la gonade.
(B) Metamorphose achevee, section transversale dans la partie posterieure d'un
testicule. La partie posterieure a augmente de volume depuis le stade precedent.
Les contours du testicule enrobe dans du tissu hepatique sont peu distincts.
(C, D) Stade 55 b, ovaires de larves femelles en cours de metamorphose. L'ovaire
represente en D a ete incube dans un milieu depourvu de substrat, aucune reaction
positive n'est decelee au niveau du sac ovarien.
(E) Ovaire d'un Pleurodele juvenile, 3 mois apres la metamorphose. Les cellules
positives du sac ovarien qui constitue la theque des follicules sont dispersees (fleches).
Aucune autre reaction positive n'est decelee dans l'ovaire a ce stade de 1'evolution
des follicules. Cav.ov., cavite ovarienne. A et E d'une part, B, C et D d'autre part
ont respectivement la meme echelle.
38
G. COLLENOT ET A. COLLENOT
Au cours de la lecture des resultats au microscope photonique, les grains de
diformazan de couleur bleu-noir ne peuvent pas etre confondus avec les grains
de melanine de couleur brune qui sont relativement abondants dans le cytoplasme des gonocytes des plus jeunes stades larvaires etudies. II n'en va pas
de meme sur les documents photographiques en noir et blanc et la photographie
en couleurs est sans doute la meilleure maniere de presenter les resultats.
Les resultats fournis par notre technique se sont reveles satisfaisants pour
les stades ou les gonades sont minces mais chez les males juveniles la reaction
positive, au niveau des amas de cellules qui occupent une position interstitielle
par rapport aux cystes, est moins intense que celle obtenue avec la technique
LDR ou les coupes sont realisees avant l'incubation. Cette discordance est
tres vraisemblablement due a une penetration mediocre du milieu d'incubation
dans la partie posterieure volumineuse et compacte du testicule juvenile.
Notre technique peut etre mise en oeuvre sur d'autres materiels biologiques;
nous avons obtenu des resultats positifs (non publies), d'une part, sur les
testicules et les ovaires d'embryons de Souris de 16 jours, et d'autre part, sur
du tissu glandulaire steroidogene preleve sur des testicules de Pleurodeles
adultes en activite sexuelle; cependant, pour ce dernier materiel, il a ete necessaire, prealablement a la fixation initiale, de le debiter en tranches minces de
50-100 [im d'epaisseur a l'aide d'un 'Tissue sectionner' de Smith et Farquhar.
L'activite 3/?-HSDH detectee dans les gonades des larves du Pleurodele pose
les problemes de l'existence d'une synthese actuelle de sterol'des dans les gonades en differenciation et du role eventuel de ces steroides dans les mecanismes
de la differenciation sexuelle des gonades. Ces problemes ne pourront etre
resolus que par la mise en oeuvre de techniques biochimiques et experimentales.
A cet egard, toutefois, nos resultats qui confirment les observations de l'un
de nous (Collenot, 1965 a), demontrent que l'activite 3/?-HSDH est presente
dans les gonades avant leur differenciation sexuelle chez les larves males
comme chez les larves femelles.
Nos observations posent une autre question, celle de savoir quelle parente
existe entre les cellules qui presentent une activite 3/?-HSDH dans les gonades
des larves males et femelles, et les cellules qui manifestent la meme activite
dans le testicule et l'ovaire adultes? Le present travail constitue une etape vers
la reponse a cette question, il sera prolonge par une etude cytochimique et
ultrastructurale pour laquelle une adaptation des techniques existantes aux
gonades larvaires du Pleurodele a ete entreprise.
En ce qui concerne l'ovaire adulte des Urodeles, une activite 3/?-HSDH a ete
decrite, en meme temps qu'au niveau des cellules folliculaires (Guraya, 1976 a),
au niveau de la theque chez Triturus cristatus (Delia Corte, Galgano & Cosenza
1962) et chez Ambystoma mexiccmum (N'Diaye, 1971); cependant, N'Diaye
(1970) indique que l'activite 3/?-HSDH dans ce dernier site est faible chez
l'Axotol age de 5 mois et ceci pourrait rendre compte du fait que nous ne
l'ayons pas observee chez les quelques femelles juveniles de Pleurodele que
Uactivite 3fi-hydroxysteroide deshydrogenasique chez Pleurodeles 39
nous avons etudiees. Si une filiation tres probable peut etre etablie entre les
cellules de la theque et les cellules du sac ovarien qui constituaient initialement
la medulla de la gonade sexuellement indifferenciee, il n'est pas possible, dans
Tetat actuel de nos observations, de preciser l'origine des cellules folliculaires
elles-memes, origine que seule une etude ultrastructurale des stades precoces
de la differenciation des gonades devrait nous permettre de connaitre.
En ce qui concerne le testicule, deux aspects meritent d'etre discutes. Tout
d'abord, il est remarquable de constater que l'activite 3/?-HSDH, repartie de
fac.on homogene sur toute la longueur de la gonade jusqu'a la metamorphose,
est limitee a la partie posterieure, celle-la meme ou la spermatogenese va
debuter, chez les individus metamorphoses et juveniles. A la difference de
l'ovaire, le testicule du Pleurodele et, d'une facon plus generate, des Urodeles
apparait ainsi comme un organe ou les activites morphogenetiques sont polarisees cephalo-caudalement. A notre connaissance, l'analyse experimentale du
determinisme de cette polarisation n'a pas encore ete entreprise. D'autre part,
les sites ou une activite 3/?-HSDH est decelee varient au cours de revolution du
testicule. L'existence d'un tissu interstitiel steroidogene decrite chez le Pleurodele (Collenot, 19656) et confirmee par Picheral (1972) a ete observee egalement chez Ambystoma mexicanum (N'Diaye, 1971) et Triturus cristatus (Vellano,
1968).
Le site principal de l'activite endocrine du testicule des Urodeles est represente
par le tissu glandulaire adipopexique (Aron, 1924; Ozon, 1967).
Chez le Triton Pleurodele ce tissu est permanent et constitue une zone
effilee de couleur jaune orangee localisee a la partie posterieure du testicule
(Kolmer & Koppanyi, 1923). Ce tissu se developpe a partir des cellules conjonctives qui entourent les cystes dont les spermatozoides murs ont ete evacuees.
Les cellules conjonctives limitantes des cystes ('lobule boundary cells' selon
la conception de Marshall & Lofts, 1956) ou cellules pericystiques (Joly, 1971)
deviennent de plus en plus epaisses, elles se disposent en plusieurs couches,
cependant que se reduit progressivement la lumiere du cyste vide qui n'est
plus occupee que par les cellules de Sertoli. Selon les especes etudiees, ces
dernieres degenerent ou non pouvant ainsi participer a l'activite du tissu
glandulaire.
Chez l'Axolotl, N'Diaye (1971) a constate egalement l'existence d'une
activite 3/?-HSDH dans les cellules de Sertoli, d'une part, au niveau du tissu
glandulaire (cette activite n'a pas ete observee chez le Pleurodele) et, d'autre
part, au niveau des cystes creux a spermatogonies primaires; nous avons
observe cette activite, au meme site, chez le Pleurodele apres l'hypophysectomie
suivie de la stimulation de l'activite testiculaire par injection d'hormone gonadotrope FSH mammalienne (resultats non publies).
Quelle filiation peut-on etablir entre les cellules des differents sites testiculaires a activite 3/9-HSDH et les cellules ou cette activite est detectee dans le
testicule en cours de differenciation ? II semble plausible de considerer que les
40
G. COLLENOT ET A. COLLENOT
cellules positives, d'origine medullaire, etroitement appliquees contre les gonocytes, observees au stade 54 chez les males sont a l'origine des futures cellules
de Sertoli mais cela implique qu'elles perdent, au moins transitoirement,
l'activite 3/?-HSDH lorsque 1'organisation des cystes est achevee. Une telle
modulation des activites des cellules de Sertoli en correlation avec les etapes
de la spermatogenese a ete demon tree chez Scyliorhinus canicu/a (Collenot,
1969). Les cellules des ilots positifs en position interstitielle et les cellules qui
sont a l'origine du tissue glandulaire et dont Picheral (1972) a demontre qu'elles
occupent egalement une situation interstitielle par rapport aux lames basales
qui delimitent les cystes, ont-elles la meme origine medullaire dans la gonade
sexuellement indifferenciee? L'etude ultrastructurale des gonades larvaires en
differenciation que nous avons entreprise devrait, la encore, nous permettre
de repondre a cette question. Toutefois, l'ensemble des informations dont nous
disposons actuellement permet d'etablir un parallele entre les populations de
cellules a activite 3/9-HSDH des testicules et des ovaires du Pleurodele, constituees d'une part de cellules etroitement associees aux gonocytes (cellules de
Sertoli et cellules folliculaires) et d'autre part, de cellules topographiquement
distinctes des zones d'elaboration des gametes (cellules des tissus interstitiel
et glandulaire et cellules de la theque).
RESUME
Afin de pouvoir visualiser une activite 3/?-hydroxysteroide deshydrogenasique dans les
gonades larvaires du Triton Pleurodeles waltlii, une technique histochimique originale a ete
mise au point a partir de la technique cytochimique employee par Bara & Anderson (1973)
dans leur etude ultrastructurale de l'activite 3/?-HSHD. La nouvelle technique decrite ici
permet d'incuber les gonades larvaires in toto, de les inclure dans la paraffine et de les debiter
en coupes seriees de 7/<m d'epaisseur. Des pontes unisexuees males ou femelles ont ete
utilisees.
L'activite 3/?-HSDH a ete decelee dans les gonades larvaires, au niveau des cellules profondes qui constituent la medulla dans la cavite de la crete genitale, des la fin du premier
tiers de la vie larvaire quand les gonades ne sont pas encore sexuellement differenciees.
Au cours de la differenciation dans la voie ovarienne, l'activite enzymatique persiste au
niveau du sac ovarien qui constituera ulterieurement la theque des follicules de I'ovaire
mature. Au cours de la differenciation dans la voie testiculaire, les cellules medullaires
positives s'associent etroitement aux cellules germinales, forment les cytes ou ampoules
testiculaires et deviennent plus tard negatives; mais, au niveau de la partie posterieure du
testicule, chez les individus metamorphoses et chez les juveniles, plusieurs amas de cellules
en position interstitielle ont une activite 3/?-HSDH.
Les resultats sont discutes en relation avec les travaux anterieurs concernant les cellules
secretrices de steroides des ovaires et testicules matures des Amphibiens Urodeles.
Ce travail a ete realise grace a la collaboration technique de Mme Pergrale et de Melle
F. Allizard et a l'aide financiere de la DGRST (contrat no. 75.7.1616) auxquelles nous
exprimons notre reconnaissance.
Uactivite 3fi-hydroxysteroide deshydrogenasique chez Pleurodeles 41
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