J. Embryol exp. Morph. Vol. 39, pp. 1-7, 1977
Printed in Great Britain
Etude par iinmunofluorescence de
Tapparition d'antigenes neuro-specifiques d'adulte
chez F embryon de Poulet
Par N. TOUZET, 1 R. JEANMAIRE-ZYLBERBERG 2 ET
M. CHAMINADE 1
Laboratoire de Biologie Animate,
Universite de Paris-Sud
SUMMARY
Immunofluorescent study of the distribution of adult neuro-specific antigens
in the chick embryo
The adult neuro-specific antigens have been localized by immunofluorescence techniques
in diencephalon and mesencephalon of chick embryo. This study has been made using fresh
orfixedtissues from embryos 72,48 or 36 h old. At 72 h of incubation the wall of diencephalon
shows marked fluorescence; at 48 h of incubation the fluorescent cells are localized in an
outer layer and an inner one. In the48h-old embryo the reaction is more distinct and intensive
in fresh tissues than in fixed tissues. At 36 h of incubation nofluorescencehas been detected
either in fresh tissues or in fixed tissues.
INTRODUCTION
La presence d'antigenes organo-specifiques (proteines specifiques) d'organe
peut reveler la differentiation cellulaire en l'absence de signes de differentiation
morphologique. De nombreux travaux ont ete effectues concernant l'apparition
de ces antigenes specifiques pendant le developpement embryonnaire. Cependant
les antigenes du systeme nerveux central ont ete peu etudies, comparativement
a ceux des autres organes. En 1963 Schalekamp met en evidence par immunoelectrophorese des proteines nerveuses, Tune chez un embryon de Poulet de
2 jours, l'autre chez un embryon de Poulet de 7 jours. Moore en 1965, puis en
1968 (Moore, Perez & Gehring, 1968), montre qu'il existe deux proteines
nerveuses specifiques, la proteine S-100 et la proteine 14.3.2. Ces proteines ont
ete par la suite purifiees. Friedman & Wenger (1965) chez l'embryon de Poulet,
par la methode de fixation du complement mettent en evidence les premiers
signes d'apparition de ces antigenes specifiques a 2 jours d'incubation. Plus
x
Adresse des auteurs: Laboratoire de Biologie Animale, Bat. 445, Universite de Paris-Sud,
Centre
d'Orsay, 91405 Orsay-Cedex, France.
2
Adresse de Vauteur: Laboratoire de Biologie Vertebres, Bat. 441, Universite de Paris-Sud,
Centre d'Orsay, 91405 Orsay-Cedex, France.
2
N. TOUZET ET COLL.
recemment Cicero & Pro vine (1972) par dosage des proteines dans la moelle
epiniere d'embryon de Poulet ne detectent pas de proteines nerveuses specifiques avant 5 jours d'incubation.
Le but de notre travail est d'explorer la differentiation cellulaire nerveuse
pendant l'embryogenese a l'aide de l'immunofluorescence. Dans un article
precedent (Touzet, Sensenbrenner, Lender & Mandel, 1975) nous avons demontre que des cellules nerveuses isolees, prelevees sur des embryons de 3 et 2
jours d'incubation sont capables de se differencier en culture, alors que celles
prelevees sur des embryons de 36 h ne peuvent pas se differencier dans les
memes conditions. II nous a paru interessant de savoir si dans l'embryon 'in
toto' il existait pour ces trois delais d'incubation, des differences importantes
dans le contenu en antigenes nerveux specifiques.
MATERIEL ET METHODES
(1) Preparation des antiserums
Des encephales (Diencephale et Mesencephale) de poussins de 3 a 4 jours debarrasses de leurs meninges, ont ete broyes dans une solution tamponnee de
Cl Na a 9 g/1, a volume egal. Les broyats ont ete centrifuges a 5.000 tours/minute
pendant 20min; le surnageant a ete ensuite lyophilise pour le conserver. Ces
lyophilisats, redissous dans un volume d'eau distillee egal au volume initial du
surnageant de centrifugation ont ete analyses par electrophorese en gel d'acrylamide a 5 % (a pH: 8,6 pendant 1 h). Dans ces conditions precises d'experimentation 2 fractions tres proches l'une de l'autre ont attire notre attention car
elles migrent tres fortement vers l'anode et se trouvent ainsi eloignees d'un
groupe de fractions restees pres de la cathode dont toute une partie se retrouve
dans l'electrophorese d'un serum de poule faite dans les memes conditions
experimentales. Ces memes lyophilisats additionnes a volume egal d'adjuvant
de Freund ont ete injectes dans les coussinets plantaires de lapin de race Hollandaise a raison de 15 mg de matiere seche par animal. Trois semaines plus
tard les lapins recoivent une injection intraveineuse du meme lyophilisat redissous (5 mg de matiere seche) toujours additionne d'adjuvant de Freund. Apres
une semaine le sang des lapins est recueilli par canule carotidienne. Les serums
obtenus ont ete centrifuges et decomplementes a 57 °C pendant 1 h, puis
lyophilises pour les conserver.
Les immunserums ont ete testes par immunodiffusion avec des broyats
solubles d'encephale de poussin.
Nous n'avons utilise pour nos experiences d'immunofluorescence que les
serums ayant reagi positivement avec les extraits d'encephale.
Antigenes neuro-specifiques d'adulte chez Vembryon de Poulet
3
(2) Preparation des coupes
Deux methodes sont utilisees.
Coupes au crysotat
Des embryons de Poulet de 36, 48 et 72 h ont ete preleves dans une solution
de Cl Na a 9 % tamponnee (pH: 7,0) et congeles par un jet de neige carbonique.
Nous avons effectue des coupes de 7 jum, perpendiculaires a l'axe de l'embryon.
Ces coupes sont recueillies directement sur des lames histologiques et immediatement utilisees.
Coupes a la paraffine
Des embryons de Poulet de 36, 48 et 72 h ont ete preleves dans une solution
de Cl Na a 9%0 tamponnee et fixes pendant 10 h a 4° dans de l'alcool a 90°
prerefroidi. Apres deshydratation les embryons sont inclus dans de la paraffine
a 40°. Les coupes sont effectuees dans les 48 h suivant l'inclusion, deparaffinees,
rehydratees par passage dans des concentrations decroissantes d'alcools et 2
bains de solution tamponnee pendant 40 min. Elles ont ete ensuite immediatement utilisees pour la fluorescence.
(3) Immunofluorescence - Test de specificite
Nous avons utilise la methode indirecte d'immunofluorescence.
Les coupes ont ete laissees au contact des immunserums de lapin dans une
chambre humide pendant 4 h a 4 °C, puis rincees dans une solution tampon
pendant 20 min. Les globulines fluorescentes, mouton anti-lapin, ont ete alors
mises en contact avec les preparations pendant 45 min. Apres des rincages de
20 min dans 3 bains de tampon les coupes ont ete montees dans de la glycerine
tamponnee et observees immediatement au microscope de fluorescence (Leitz—
lampe avecbruleurs au mercure a haute pression HB 200, nitres BG 3 et BG 12).
Mais pour que la reaction soit specifique c'est-a-dire pour que la fluorescence
obtenue provienne effectivement et uniquement de la reaction proteines nerveuses specifiques avec leurs anticorps correspondants presents dans le serum
de lapin il faut eliminer les autres proteines, dites generates. Pour ce faire nous
avons elimine dans les immunserums tous les anticorps autres que les anticorps
anti-proteines nerveuses en epuisant les serums; par des extraits de foie et de
rein d'adulte, par du jaune d'oeuf et par du mesenchyme d'embryon de 8 jours.
Pour chaque age d'embryon etudie nous avons effectue les experiences
suivantes:
ler cas: les coupes sont traitees par une solution de Cl Na a 9%0;
2eme cas: les coupes sont traitees par des serums de lapin normal;
3eme cas: les coupes sont traitees par des serums de lapin immunise;
4eme cas: les coupes sont traitees par des serums de lapin immunise mais
epuises.
N. TOUZET ET COLL.
Antigenes neuro-specifiques d'adulte chez Vembryon de Poulet
5
RESULTATS
L'analyse par immunofluorescence des proteines nerveuses specifiques dans
des cerveaux d'embryons de Poulets tres jeunes nous a permis de preciser leur
apparition au cours du developpement embryonnaire.
Dans les experiences temoins (ler et 2eme cas) nous n'avons jamais observe de
fluorescence dans les tissus mais seulement une coloration verdatre uniforme
due a la fluoresceine. Cette absence de fluorescence dans les coupes traitees par
le Cl Na ou par du serum de lapin non immun nous permet de dire que nous
n'avons pas de fluorescence 'naturelle' des tissus de nos embryons et qu'il
n'existe pas de reaction croisee entre ces tissus et les proteines du serum des lapins.
Par contre pour le 3eme cas nous avons toujours eu, quelque soit l'age de
l'embryon une intense fluorescence dans l'ensemble des tissus prouvant ainsi
que les lapins injectes avaient effectivement fabrique des anticorps contre les
proteines de poulet - C'est avec le 4eme cas experimental que des differences
sont apparues dans les resultats suivant l'age de l'embryon et le traitement des
coupes.
(1) Analyse sur coupes histologiques
Au niveau du Diencephale d'un embryon de Poulet de 72 h toute la paroi du
tube nerveux montre une intense fluorescence (Fig. 1). Les noyaux non fluorescents apparaissent en noir et contrastent fortement avec le cytoplasme tres
fluorescent. Dans la vesicule optique le tissu nerveux correspondant a la zone
de la retine est egalement tres fluorescent. Ceci confirme les resultats de Wenger
& Friedman (1970) qui avec des serums anti-proteine S-100 de Bceuf trouvent
au niveau de la retine des traces de proteine S-100 apres extraction et dosage
biochimique.
On remarquera sur la Fig. 1 la difference nette entre la paroi du tube neural
tres fluorescent et le mesenchyme environnant qui ne Test pas.
Chez les embryons de 48 h on observe une faible fluorescence. Elle est restreinte a certaines parties du tube neural et se manifeste dans une couche
peripherique (Fig. 2).
FIGURES 1-4
Fig. 1. Embryon de 72 h. Coupe transversale du Diencephale montrant de la
fluorescence sur toute l'epaisseur de la paroi.
Fig. 2. Embryon de 48 h. Coupe transversale du Diencephale montrant une couche
de tissu fluorescent a la peripherie du tube neural.
Fig. 3. Embryon de 48 h. Coupe transversale du Diencephale montrant les deux
couches de tissu fluorescent (une couche externe et une couche interne).
Fig. 4. Embryon de 48 h. Coupe transversale du Mesencephale montrant la fluorescence de la chorde dorsale. tn = tube neural; m = mesenchyme; ch = chorde
dorsale.
6
N. TOUZET ET COLL.
Dans les coupes d'embryon de 36 h nous n'avons jamais detecte de fluorescence, meme a l'etat de traces. Les preparations apparaissent tout a fait semblables aux coupes temoins, c'est-a-dire celles traitees par le Cl Na ou par le
serum de lapin normal.
(2) Analyse des coupes faites au cryostat
Pour les embryons de 72 h nous n'avons pas decele de differences entre la
fluorescence dans les coupes faites au cryostat et celle des preparations fixees par
les techniques d'histologie courante.
Par contre pour les embryons de 48 h la fluorescence observee sur les coupes
faites au cryostat est beaucoup plus intense et plus precise que celles observees
sur les coupes-fixees (Fig. 3). Ainsi nous observons une fluorescence nette et
intense dans la zone externe de la paroi du tube neural; une couche fluorescente
plus ou moins epaisse bordant cette fois la lumiere du tube est presente chez
tous les embryons etudies. En examinant les coupes au fort grossissement nous
avons pu preciser que la fluorescence est localisee dans le cytoplasme alors que
le noyau non fluorescent apparait en noir. Au niveau du mesencephale la
chorde dorsale est fluorescente et dans quelques embryons on trouve une zone
fluorescente s'etendant sur toute l'epaisseur de la paroi du tube neural, dans sa
region ventrale, situee juste au-dessus de la chorde (Fig. 4).
Pour les memes regions de l'encephale, aucune trace de fluorescence n'est
visible dans les coupes provenant d'embryons de 36 h. Comme pour les
tissus fixes la paroi du tube neural apparait pale, semblable au mesenchyme
environnant.
DISCUSSION ET CONCLUSION
Nous venons de demontrer que des antigenes nerveux specifiques sont presents
dans l'encephale d'embryon de Poulet de 3 et 2 jours. Par contre chez des
embryons de 36 h nous n'avons pas pu mettre en evidence ces memes antigenes.
Nous avons observe anterieurement que des cellules dissociees d'encephale
d'embryon de Poulet de 36 h ne peuvent pas se differencier en culture dans nos
conditions experimentales alors que celles provenant d'embryon de 48 h sont
capables de se developper en neurones et en cellules gliales (Touzet et al. 1975).
L'ensemble de ces resultats nous amene a penser qu'il existe une correlation
entre la presence des antigenes nerveux specifiques et la differentiation en
culture des cellules nerveuses isolees. II sera interessant maintenant, d'etudier
le contenu en antigenes specifiques des differentes categories cellulaires (neurones
et cellules gliales) au cours de leur developpement en culture.
De plus nous avons observe des differences en ce qui concerne la localisation
de ces antigenes suivant la methode de preparation des coupes. La fixation
prealable des tissus a l'alcool 90° pourrait masquer la manifestation en immunofluorescence des antigenes puisque sur les coupes non fixees la fluorescence
etait plus intense. Cette variation pourrait expliquer les differences obtenues entre
Antigenes neuro-specifiques d'adulte chez Vembryon de Poulet
7
nos resultats et ceux de Nord 1969). En effet Nord ne decele les premieres
traces d'antigenes specifiques nerveux sur des coupes fixees a l'acetone que dans
des embryons de 55 h d'incubation. II apparait ainsi que l'utilisation des coupes
au cryostat, permettant de faire les reactions sur des tissus non fixes, assure une
meilleure mise en evidence par immunonuorescence des proteines specifiques.
RESUME
Nous avons recherche dans les coupes de diencepbale et Mesencephale d'embryon de
Poulet l'apparition des antigenes neurospecifiques d'adulte. Cette etude a ete faite sur des
tissus vivants oufixesa l'alcool 90°, preleves sur des embryons de 72,48 et 36 h d'incubation.
A 72 h d'incubation la paroi du Diencephale montre une intense fluorescence; a 48 h
d'incubation la fluorescence est localisee a une couche externe et une couche interne de la
paroi. Pour ce temps d'incubation nous avons trouve une action plus nette et plus intense
dans les tissus vivants que celle dans les tissus fixes.
Quant aux embryons de 36 h d'incubation aucune trace defluorescencen'a ete detectee
quelque soit le traitement subi par les tissus.
Nous remercions vivement M. Sensenbrenner, Maitre de Recherche au Centre de Neurochimie de Strasbourg, pour les critiques judicieuses qu'elle nous a fournies lors de la redaction de cet article.
TRAVAUX CITES
T. S. & PROVINE, R. R. (1972). The levels of the brain specific proteins, S-100 and
14.3.2, in the developing chick spinal cord. Brain Res. 44, 294-298.
FRIEDMAN, H. & WENGER, B. (1965). Adult brain antigens demonstrated in chick embryos by
fractionated antisera. 7. Embryol. exp. Morph. 13, 35-43.
MOORE, B. W. (1965). A soluble protein characteristic of the nervous system. Biochem. biophys. Res. Commun. 19, 739-744.
MOORE, B. W., PEREZ, V. J. & GEHRING, M. (1968). Assay and regional distribution of a
soluble protein characteristic of the nervous system. /. Neurochem. 15, 265-272.
NORD, L. (1969). Immunofluorescence studies on the development of early mouse and chick
nervous system in ovo and in vitro. Thesis, University of Lund.
SCHALEKAMP, N. A. D. H. (1963). Immunologische aspecten van de orgaanont wikkeling.
Thesis, University of Utrecht.
TOUZET, N., SENSENBRENNER, M., LENDER, TH. & MANDEL, P. (1975). Cultivation and
differentiation of dissociated cells of chick embryo encephalon. Differentiation 4, 183-188.
WENGER, B. & FRIEDMAN, H. (1970). S-100 protein in embryonic chick retinae. Nature,
Lond. 228, 1214.
{Regu le 18 mat 1976, revise le 25 november 1976)
CICERO,