J. Embryol. exp. Morph., Vol. 14, Part 2, pp. 181-189, October 1965
Printed in Great Britain
Effets du 5-fluoro-uracile et de la 6-methylpurine
sur le developpement de Foeuf de Foursin
Paracentrotus lividus
par ROGER LALLIER1
Centre National de la Recherche Scientifique,
Station Zoologique, Villefranche-sur-Mer
L E 5-fluoro-uracile, un analogue de base pyrimidique, interfere avec le metabolisme des acides nucleiques. Le 5-fluoro-uracile inhibe la methylation au
cours de la synthese de la thymine (Eidinoff et al, 1957; Bosch et al, 1958; Cohen
et al, 1958; Harbers et al, 1959). Le 5-fluoro-uracile est incorpore dans l'acide
ribonucleique a la place de l'uracile (Bosch et al, 1958; Chaudhuri et al, 1958;
Horowitz & Chargaff, 1959). Ce remplacement de base dans l'acide ribonucleique entraine des modifications de la composition et des proprietes de
certaines proteines synthetisees en presence de 5-fluoro-uracile (Naono & Gros,
1960; Hignett, 1964). La synthese des ribosomes fonctionnels est inhibee par le
5-fluoro-uracile (Kempner & Miller, 1963).
Les effets du 5-fluoro-uracile et de plusieurs autres pyrimidines fluorees ont
ete etudies sur l'ceuf de l'echinoderme, Echinarachnius parma par Karnofsky et
Basch (1960), qui observent un arret du developpement austadejeuneblastula.
Toivonen et ses collaborateurs (1961) ont publie une interessante observation
sur les effets du 5-fluoro-uracile sur l'ceuf de l'amphibien, Triturus vulgar is. Dans
cet embryon, le 5-fluoro-uracile inhibe la differenciation des structures neurales
sans affecter la differenciation des structures mesodermiques. Nous fondant sur
cette observation et sur le fait que la determination embryonnaire chez
les amphibiens et chez les echinodermes peut etre modifiee par les memes
agents, nous avons recherche si le 5-fluoro-uracile est capable de changer la
determination embryonnaire de la larve d'oursin et plus precisement de provoquer
la vegetalisation des larves c'est a dire l'hyperdeveloppement de leurs structures
entomesodermiques.
La 6-methylpurine, un analogue de l'adenine, deprime la croissance de
differents organismes (Clarke et al, 1958; Freese, 1959; Dewey et al, 1960).
Cet analogue inhibe la formation d'acide guanylique a partir de l'acide adenylique, diminue l'incorporation de l'adenine dans l'acide ribonucleique et inhibe
la synthese des ribosomes (Miller & Kempner, 1963).
1
Adresse de Vauteur: Station Zoologique, Villefranche-sur-Mer (06), France.
182
R. LALLIER
Nous decrirons ici les effets du 5-fluoro-uracile et de la 6-methylpurine sur le
developpement de l'oeuf d'oursin et nous examinerons les effets antagonistes
exerces par certaines bases et nucleosides puriques et pyrimidiques.
MATERIEL ET METHODES
Toutes les experiences sont faites sur les oeufs de l'oursin Paracentrotus lividus.
Deux series de cultures sont faites. Dans la premiere serie, les oeufs sont soumis
a Faction des substances etudiees, 30 minutes apres la fecondation, c'est a dire
avant la premiere division en 2 blastomeres. Dans la seconde serie, les larves
sont traitees a partir du stade blastula, lorsque l'eclosion est faite et que les
cellules mesenchymateuses primaires sont formees. Dans chaque serie
d'experiences les cristallisoirs regoivent chacun une quantite equivalente d'oeufs,
de l'ordre de 2000 oeufs par ml., provenant tous d'une meme femelle. Les cultures
sont faites a la temperature du laboratoire, soit 19°-20°C. Toutes les solutions
de substances etudiees sont preparees directement avec de l'eau de mer au
moment de l'emploi. Lorsque les effets de derives puriques ou pyrimidiques
sont etudies, ces substances sont ajoutees aux cultures en meme temps que le
5-fluoro-uracile ou la 6-methylpurine. Les cultures contenant du 5-fluoro-uracile
sont faites a l'obscurite pour eviter une alteration de cette substance par la
lumiere.
RESULTATS
Nous examinerons successivement les effets obtenus en traitant les ceufs par
le 5-fluoro-uracile et par la 6-methylpurine utilises seuls ou en combinaison avec
differents derives pyrimidiques et puriques.
5-fluoro-uracile
Tous les oeufs traites a partir de la fecondation par le 5-fluoro-uracile (100 /xg.
a 5 /xg./ml.) cessent de se segmenter aux stades 16-32 blastomeres. Reportes
dans l'eau de mer, apres plusieurs lavages, les oeufs restent bloques aux stades
16-32 blastomeres; l'arret de la segmentation est done irreversible.
L'uracile, l'uridine, la cytosine et Padenine a differentes concentrations
(20 /xg., 10 /xg. et 5 /xg./ml.) n'empechent pas le blocage de la segmentation aux
stades 16-32 blastomeres chez les oeufs traites par le 5-fluoro-uracile (5 /xg./ml.).
En presence de thymine ou de thymidine, les oeufs traites par le 5-fluoro-uracile
se developpent au dela des stades 16-32 blastomeres.
Dans les cultures contenant du 5-fluoro-uracile (10 /xg./ml.) et de la thymine
(20 /xg./ml.) tous les oeufs forment des larves prismatiques. Avec le 5-fluorouracile (5 /xg./ml.) et la thymine (20 /xg./ml.) les oeufs se developpent en pluteus
qui ne se distinguent pas des temoins.
La thymidine protege aussi les oeufs contre les effets inhibiteurs du 5-fluoro-
Effets du 5-fluoro-uracile et de la 6-methylpurine
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uracile; 50 /xg. de thymidine par ml. permettent le developpement de pluteus
comparables aux temoins en presence de 5-fluoro-uracile (5 jug./ml.).
Les larves traitees au stade blastula avance, cessent de se developper en
presence de 5-fluoro-uracile (100 /xg. a 5 /xg./ml.). Le blastocele se remplit de
cellules grisatres. Le pigment est forme. Les spicules ne se differencient que
chez les larves traitees par le 5-fluoro-uracile a des concentrations inferieures a
50 /xg./ml.
Aucune modification de la determination embryonnaire, dans le sens de
Tanimalisation ou de la vegetalisation, n'est observee dans ces conditions.
Les larves traitees au stade blastula par le 5-fluoro-uracile (5 /*g./ml.) en
presence de thymine (20 /xg./ml.) se developpent en pluteus normaux; par contre
les blastulas traitees par l'uracile (20 /xg./ml.) en presence de 5-fluoro-uracile
(5 /xg./ml.) restent bloquees au stade blastula.
6-methylpurine
Les ceufs traites, a partir de la fecondation, par la 6-methylpurine (100 /xg. a
5 /xg./ml.) poursuivent leur developpement jusqu'au stade blastula. Le blastocele
de ces larves se remplit de cellules grisatres et la lyse se produit d'autant plus
rapidement que la concentration en 6-methylpurine est plus elevee. Les larves
arretees au stade blastula, et reportees apres plusieurs lavages dans l'eau de mer,
restent bloquees a ce stade; l'arret du developpement est done irreversible.
Aucune modification de la determination embryonnaire n'est observee dans ces
conditions.
En presence de thymine, de thymidine, d'uracile, d'uridine ou de cytosine
(20 /xg./ml.), la 6-methylpurine (5 /xg./ml.) arrete le developpement des oeufs au
stade blastula.
Dans les cultures contenant de la 6-methylpurine (20 /xg./ml.) et de l'adenine
(20 /xg./ml.) tous les oeufs se developpent jusqu'au stade prismatique. Les
pluteus se developpent en presence de 6-methylpurine (5 /xg./ml.) et d'adenine
(20 /xg./ml.). Ces pluteus sont plus petits que les temoins.
Les oeufs traites par la 6-methylpurine (20 /xg./ml.) en presence d'adenosine
(100 /xg./ml.) atteignent le stade blastula; seules quelques-unes de ces blastulas
sont capables d'ebaucher la formation d'un petit archenteron. Le pigment n'est
pas forme et les spicules ne sont que tres rarement observes. L'adenosine n'exerce
done qu'une action protectrice tres faible sur le developpement des oeufs traites
par la 6-methylpurine. Par contre les larves cultivees en presence de 6-methylpurine (20 /xg./ml.) et d'adenosine (100 /xg./ml.) se lysent plus tard que les larves
cultivees en presence de 6-methylpurine seule a raison de 20 /xg./ml. L'adenosine
augmente done la viabilite des larves cultivees en presence de 6-methylpurine.
Les larves traitees au stade blastula par la 6-methylpurine (100 /xg. a 20 /xg./ml.)
restent bloquees a ce stade. Le developpement peut se poursuivre au dela de ce
stade lorsque la concentration en 6-methylpurine est abaissee. C'est ainsi que,
184
R. LALLIER
les blastulas traitees par la 6-methylpurine (10 a 5 /xg./ml.) forment un archenteron
etroit a parois epaisses. Deux petits spicules triradies et du pigment sont formes
dans ces conditions. Le stade prismatique est atteint dans les cultures contenant
de la 6-methylpurine (2 /xg./ml.) et des pluteus se forment en presence de 1 /xg./ml.
de 6-methylpurine. Ces pluteus sont toutefois d'une taille inferieure a celle des
temoins.
En presence d'adenine (20 /xg. a 50 /xg./ml.) et de 6-methylpurine, les larves
traitees au stade blastula forment des pluteus de structure normale, mais plus
petits que les temoins. Avec une concentration plus elevee en adenine (100
/xg./ml.) les larves ne depassent pas le stade prismatique. Le developpement
s'arrete d'ailleurs au stade prismatique en presence d'adenine seule a la concentration de 100 /xg./ml.
L'adenosine protege aussi les larves contre les effets de la 6-methylpurine mais
son action protectrice est inferieure a celle exercee par l'adenine. C'est ainsi
que les blastulas cultivees en presence de 6-methylpurine (20 /xg./ml.) en presence
d'adenosine a differentes concentrations (20 /xg., 50 /xg. et 100 /xg./ml.) forment
des larves prismatiques. Les blastulas traitees par l'adenosine seule (20 /xg./ml.)
forment de petits pluteus. En presence d'adenosine (50 /xg./ml., 100 /xg./ml.) les
pluteus formes sont depourvus de bras anaux et oraux.
DISCUSSION
L'inhibition de la segmentation des oeufs de Paracentrotus lividus par le
5-fluoro-uracile et le renversement de cette inhibition par la thymine et la
thymidine suggerent que le 5-fluoro-uracile interfere avec l'elaboration de la
thymine necessaire a la synthese de l'acide desoxyribonucleique. Cette interpretation est en accord avec les resultats obtenus par differents auteurs et qui
indiquent que le 5-fluoro-uracile inhibe la methylation au cours de la synthese
de la thymine (Eidinoffe* al., 1957; Boschetal, 1958; Cohen ef al, 1958;Harbers
et al, 1959).
L'oeuf d'oursin synthetise de l'acide desoxyribonucleique au cours de son
developpement. Les dosages d'acide desoxyribonucleique dans l'oeuf vierge et
pendant la segmentation indiquent que l'oeuf d'oursin contient une petite reserve
de materiel precurseur d'acide desoxyribonucleique capable d'assurer la segmentation jusqu'aux stades 16-32 blastomeres (Brachet, 1937; Villee et ah, 1949;
Abrams, 1951; Elson et al., 1954; Hoff-targensen, 1954; Agrell & Persson,
1956; Whiteley & Baltzer, 1958). Les observations de Nemer (1962) suggerent
qu'il existe dans l'oeuf vierge de Paracentrotus lividus, une reserve de thymidine
capable d'assurer la synthese d'acide desoxyribonucleique jusqu'au stade 8
blastomeres. Apres ce stade, l'oeuf doit elaborer la thymidine necessaire a la
poursuite de la synthese d'acide desoxyribonucleique. Le blocage du developpement aux stades 16-32 blastomeres par le 5-fluoro-uracile et la poursuite du
developpement en presence de thymine suggerent l'existence d'une reserve de
Effets du 5-fluoro-uracile et de la 6-methylpurine
185
thymine. L'arrSt de la segmentation interviendrait lorsque cette reserve etant
epuisee, la synthese de nouvelles molecules de thymine est inhibee par le 5-fluorouracile. Karnofsky & Basch (1960) ont montre chez l'oeuf d'une autre espece
d'echinoderme, Echinarachnius parma, que le 5-fluoro-uracile ainsi que d'autres
pyrimidines fluorees arretent le developpement des larves au stade blastula.
Ces substances exercent un effet uniforme sur le developpement, mais les concentrations efficaces varient selon l'agent considere. La thymidine et la thymine
protegent les oeufs contre les effets des pyrimidines fluorees. Karnofsky et
Basch suggerent que les pyrimidines fluorees provoquent une deficience en
thymidine interferant ainsi avec la synthese des acides desoxyribonucleiques.
Le blocage plus tardif du developpement chez Echinarachnius parma peut etre
du, comme le suggere Nemer (1962), a l'existence de reserves plus importantes
que chez Paracentrotus lividus de precurseurs capables d'assurer la synthese de
l'acide desoxyribonucleique jusqu'au stade blastula.
L'inhibition du developpement des larves traitees au stade blastula par le
5-fluoro-uracile et la suppression de cette inhibition par la thymine et la thymidine
suggerent egalement qu'au stade blastula l'effet inhibiteur du 5-fluoro-uracile est
du a son action inhibitrice sur les syntheses d'acides desoxyribonucleiques.
Un effet differentiel sur la differenciation des larves de l'Amphibien Triturus
vulgar is traitees par le 5-fluoro-uracile a ete observe par Toivonen et ses collaborateurs (1961). Les tissus traites par le 5-fluoro-uracile en presence de thymidine
ne differencient pas de structures neurales alors que la differenciation des
structures mesodermiques n'est pas affectee. Ces auteurs interpreted ce phenomene de la facon suivante: l'addition de thymidine diminue les effets du 5-fluorouracile sur la synthese d'acide desoxyribonucleique et l'analogue est incorpore
dans l'acide ribonucleique. Les proteines synthetisees en presence de cet acide
ribonucleique modifie par l'incorporation du 5-fluoro-uracile, seraient ellesmemes alterees dans leur composition. Cette synthese de proteines anormales
serait a l'origine de l'inhibition de la differenciation des structures neurales chez
la larve d'amphibien.
Chez l'oursin, nous n'avons observe aucune modification de la determination
embryonnaire dans les larves traitees par le 5-fluoro-uracile. La differenciation
des structures ectodermiques et celle des structures entomesodermiques sont
egalement inhibees par le 5-fluoro-uracile. Chez l'oursin l'incorporation
eventuelle du 5-fluoro-uracile dans les acides ribonucleiques, phenomene qui
reste a demontrer dans ce cas particulier, n'apparait done pas susceptible de
modifier la determination embryonnaire.
L'effet inhibiteur de la 6-methylpurine sur le developpement de l'oeuf d'oursin
et son renversement par l'adenine suggerent que la 6-methylpurine interfere
avec l'utilisation de l'adenine pour la synthese des acides nucleiques. Chez
l'oeuf d'oursin, au debut du developpement, on n'observe pas d'augmentation
de la teneur en acide ribonucleique (Schmidt et ah, 1948; Villee et al, 1949),
celui-ci est cependant le siege d'un metabolisme actif. On observe notamment
186
R. LALLIER
une augmentation de l'acide ribonucleique nucleaire et une diminution equivalente de l'acide ribonucleique cytoplasmique (Tocco et ah, 1963). La methode
autoradiographique a montre que, pendant la periode de segmentation, les
noyaux presentent un metabolisme tres actif de l'acide ribonucleique, pouvant
correspondre a la synthese d'acide ribonucleique 'messager' (Ficq et ah, 1963).
L'etude de l'incorporation de differents precurseurs marques a permis de mettre
en evidence la synthese d'acides ribonucleiques de 'transfert' et 'messager'
(Gross et al, 1964; 1965; Glisin & Glisin, 1964).
L'adenine, ajoutee au milieu de culture, est incorporee dans les acides
nucleiques a tous les stades du developpement (Scarano & Kalckar, 1953).
L'incorporation de l'adenine est particulierement active dans les noyaux
(Markman, 1961). Les acides ribonucleiques synthetises dans le noyau jouent
un role essentiel dans la morphogenese; c'est ainsi que, l'actinomycine, un
inhibiteur des syntheses d'acides ribonucleiques gouvernees par les acides
desoxyribonucleiques, arrete le developpement des larves avant la gastrulation
(Brachet et aL, 1963; Lallier, 1963; Gross & Cousineau, 1964).
Le fait que la 6-methylpurine n'inhibe pas la segmentation mais arrete le
developpement des larves au stade blastula suggere que cet analogue interfere
avec les syntheses d'acides ribonucleiques necessaires a la differentiation des
larves. Deux possibilites d'action de la 6-methylpurine peuvent etre envisagees.
Dans la premiere eventualite, la 6-methylpurine etant incorporee dans les acides
ribonucleiques a la place de l'adenine, ce changement de base entrainant a son
tour des modifications des proprietes des acides ribonucleiques, celles-ci peuvent
etre incompatibles avec les fonctions qu'ils exercent au cours de la differenciation
embryonnaire. Dans la seconde eventualite, la 6-methylpurine interviendrait
en empechant la synthese de l'acide ribonucleique des ribosomes. Les observations recentes de Comb & Brown (1964), sur l'oeuf de l'oursin Lytechinus
variegatus, ont montre que la teneur en acide ribonucleique d'origine ribosomale
augmente juste avant la gastrulation, cependant que la teneur en acide
ribonucleique nucleaire diminue. Or la 6-methylpurine a ete montree capable
d'inhiber la synthese de l'acide ribonucleique des ribosomes (Miller & Kempner,
1963).
REMERCIEMENTS
Nous remercions les 'Produits Roche' (Paris) pour le don du 5-fluorouracile utilise dans
ces experiences.
RESUME
Le 5-fluoro-uracile, un analogue de base pyrimidique, bloque le developpement
des ceufs de l'oursin Paracentrotus lividus aux stades 16-32 blastomeres. La
thymine et la thymidine suppriment Peffet inhibiteur du 5-fluoro-uracile. L'arret
du developpement est interprete comme du a Faction inhibitrice du 5-fluorouracile sur les syntheses d'acide desoxyribonucleique.
Les larves traitees au stade blastula par le 5-fluoro-uracile cessent de se
Effets du 5-fluoro-uracile et de la 6-methylpurine
187
developper. La thymine et la thymidine renversent les effets du 5-fluoro-uracile.
L'uracile est sans action sur l'effet inhibiteur du 5-fluoro-uracile. Aucune
modification de la determination embryonnaire n'est observee dans les ceufs
traites par le 5-fluoro-uracile.
La 6-methylpurine, un analogue de la purine, arrete le developpement des
ceufs au stade blastula. L'adenine supprime l'effet inhibiteur de la 6-methylpurine. Le blocage du developpement par la 6-methylpurine serait du a son
action sur les syntheses d'acides ribonucleiques. Les modifications de la structure
des acides ribonucleiques a la suite de l'incorporation de la 6-methylpurine a la
place de l'adenine et l'arret de la synthese d'acide ribonucleique des ribosomes
peuvent etre envisages comme causes possibles des effets de la 6-methylpurine
sur le developpement.
Les oeufs traites au stade blastula par la 6-methylpurine cessentde se developper
Cet effet inhibiteur est supprime en presence d'adenine. Aucune modification de
la determination embryonnaire n'est observee dans les oeufs traites par la
6-methylpurine.
SUMMARY
The effects of5-fluorouracil and of6-methylpurine on the development of the egg of
Paracentrotus lividus
1. 5-fluorouracil, a pyrimidine analogue, blocked the development of the
sea urchin Paracentrotus lividus at the 16-32 blastomere stage. Thymine and
thymidine suppressed the inhibitory effects of 5-fluorouracil. The block to
development is interpreted as due to the inhibitory action of 5-fluorouracil on the
synthesis of DNA.
2. Eggs treated at the blastula stage by 5-fluorouracil. stopped developing.
Thymine and thymidine reversed the effects of 5-fluorouracil. Uracil is without
effect on the inhibitory action of 5-fluorouracil. No modification of embryonic
determination is observed in eggs treated by 5-fluorouracil.
3. 6-methylpurine, a purine analogue, blocked development of eggs at
blastula stage. Adenine suppressed the inhibitory effect of 6-methylpurine. The
block to development appears to be due to action of 6-methylpurine on RNA
synthesis, possibly by altering RNA structure and/or stopping the synthesis of
ribosomal RNA.
4. Eggs treated at the blastula stage by 6-methylpurine stopped developing.
Adenine reversed the effects of 6-methylpurine. No modification of embryonic
determination is observed in eggs treated by 6-methylpurine.
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