J. Embryol. exp. Morph., Vol. 14, Part 1, pp. 37-51, August 1965
Printed in Great Britain
Action de la vitamine et de Fantivitamine B6 sur
le developpement de Tembryon de poulet
par
G. CONTI et G. MILIO 1
lustitut d'Histologie et d'Embryologie generate, Universite de Fribourg
LE groupe des vitamines B6 comporte trois substances distinctes: la pyridoxine,
qui est un derive de la pyridine; la pyridoxamine et le pyridoxal qui derivent de
la pyridoxine. Tous les organismes utilisent le pyridoxal; certains utilisent
egalement la pyridoxine, d'autres la pyridoxamine, d'autres enfin (le rat, par
exemple), utilisent les trois substances. Cette constatation a fait penser que la
substance reellement active serait le pyridoxal, et que seuls certains organismes
pourraient former de la pyridoxine, de la pyridoxamine ou les deux substances.
De plus, le pyridoxal, sous forme d'ester phosphorique (pyridoxalphosphate)
deploie une action importante comme co-enzyme dans de nombreux complexes
enzymatiques actifs dans le metabolisme des acides amines; parmi ces complexes, il faut citer les transaminases, les aminoacide-decarboxylases, les deshydratases, les desulfhydrases, les racemases, l'histaminase et les tryptophanases.
Chez les animaux, la carence en vitamines du groupe B 6 provoque des
troubles varies. Chez les rats, on observe une dermatite caracteristique, associee
a un syndrome convulsif epileptiforme, une fatigue musculaire et un retard
d'accroissement. Chez le chien, on observe une anemie hypochrome; chez le
pore, une anemie hypochrome s'accompagnant de convulsions, de troubles des
mouvements et de lesions du systeme nerveux. Chez les poussins, la carence
en vitamines du groupe B 6 provoque un arret de la croissance. Enfin, chez
l'homme, on n'a pas encore constate de veritable syndrome provoque par la
carence en vitamines B 6 ; le premier syndrome carentiel a ete obtenu therapeutiquement, a la suite d'administration de desoxypyridoxine, antagoniste de la
pyridoxine.
Parmi les antivitamines du groupe B 6 , la plus active est la desoxypyridoxine
(DPX), decouverte par Ott en 1945. La DPX a une structure chimiquement
analogue a celle de la vitamine B 6 , et plus precisement, une structure analogue
a celle de la pyridoxine (PX); dans la DPX, un groupe OH est remplace par un
atome H en position 4.
1
Adresse des auteurs: Institut d'Histologie et d'Embryologie generate, Universite de
Fribourg, Fribourg, Suisse.
38
G. CONTI et G. MILIO
H
CH2OH
CH3
H-CCN:-H
Pyridoxine
(Vitamine B 6 )
D&oxypyridoxine
(Antivitamine B 6 )
En 1946, Ott etudia l'action biologique de la DPX sur les poussins. Ce
compose se revela etre le plus puissant parmi les inhibiteurs des vitamines du
groupe Bg. Ott put en effet etablir qu'une molecule de PX neutralisait les effets
de deux molecules de DPX, tandis que, pour les autres inhibiteurs, une molecule
de vitamine etait capable d'en neutraliser 40 ou plus. La DPX montra un effet
lethal meme a des doses tres faibles (16 y), chez des poussins qui souffraient de
carence alimentaire en vitamine B6. L'effet lethal ne se produisit pas chez des
poussins qui recurent de la DPX apres avoir ete prealablement alimentes avec
une nourriture normale contenant de la vitamine B6; dans ces conditions, on
n'observa aucun ralentissement de la croissance.
Emerson (1947) constata, chez des rats sevres, recevant une nourriture ne
contenant pas de vitamine Bg, que le temps necessaire a Papparition de Facrodynie se trouvait sensiblement reduit par Padjonction d'une certaine quantite
de DPX a la nourriture.
Cravens et Snell (1949) ont injecte des doses de DPX dans des oeufs fecondes
de poule. La quantite de 1 mg de substance a revele des effets toxiques prononces en provoquant la mort des embryons dans 100% des cas lorsque
l'injection etait faite avant l'incubation; si la dose de 1 mg. ou de 0,5 mg.
etait injectee 4, 5, jusqu'a 15 jours apres le debut de l'incubation, le nombre
des morts s'est montre tres modeste et a varie entre 5 et 21 % des embryons
traites. En injectant, avant l'incubation, 1 mg. de DPX associe a differentes
quantites de vitamines du groupe B6 (de 2 a 1000 y), les effets lethaux ont
sensiblement diminue parallelement a l'augmentation de la quantite de PX. Ces
auteurs ont constate que, pour obtenir la survie de 50% des embryons, on
devait associer soit une partie de pyridoxal a 20 parties de DPX, soit encore
une partie de pyridoxamine a 50 parties de DPX, soit enfin, une partie de
pyridoxine a 100 parties de DPX. De cette maniere, on a pu etablir que la
pyridoxine possede le pouvoir de neutralisation le plus puissant. Ces resultats
sont toutefois tres differents de ceux obtenus par Ott auparavant. Des quantites
de DPX depassant 1 mg., injectees au 6eme jour d'incubation, se sont revelees
toxiques; cependant, cette toxicite n'a pu etre prevenue par aucune des trois
formes de vitamine B6. D'ailleurs, meme la pyridoxine et le pyridoxal se sont
reveles toxiques a des doses tres elevees (5 et 10 g. par oeuf), contrairement a la
pyridoxamine qui ne semble avoir montre aucune action lethale meme a de si
fortes doses.
Les donnees rapportees dans la bibliographie sur l'action de la PX et de la
DPX sur l'embryon de poulet n'etant pas completes ni concordantes, il nous a
Vitamine et antivitamine B§ et Vembryon de poulet
39
paru interessant de reprendre cette etude en nous posant surtout les questions
suivantes:
(a) Peut-on considerer la DPX comme un agent teratogene ?
(b) Dans l'affirmative, existe-t-il chez l'embryon de poulet une periode de
sensibilite teratogene specifique pour la DPX?
(c) L'injection de PX est-elle nuisible, et a quelle dose, pour le developpement
de l'embryon de poulet?
(d) Les effets nuisibles eventuels exerces par la DPX sont-ils specifiques?
peuvent-ils etre annules par une dose adequate de PX, administree
contemporanement ?
MATERIEL ET TECHNIQUE
Nos experiences portent sur un ensemble de 2463 oeufs de poule, tous
fecondes. Les oeufs provenaient de poules de race Leghorn du meme elevage.
Des experiences anterieures nous avaient montre que l'injection de 0,1 cc de
liquide de Tyrode doit etre considered comme pratiquement inoffensive pour le
developpement de l'embryon de poulet; c'est pourquoi les differentes doses de
substance que nous avons injectees ont toujours ete dissoutes dans cette quantite
de liquide de Tyrode.
Quant a la modalite de l'injection, nous avons opere de la maniere suivante:
en tenant de la main gauche l'oeuf legerement incline, avec le bout pointu vers
le haut et le gros bout sur la table de travail, nous avons injecte la substance
dans l'albumen au niveau du petit bout; pour ce faire, on introduit l'aiguille
obliquement a une profondeur de 2 cm. environ. De cette fa?on, il n'y a aucun
risque de leser l'embryon ou de perforer le jaune, et Ton est ainsi certain
d'introduire la substance dans l'albumen. Cela nous est en particulier demontre
par le fait que, en injectant la substance, une petite goutte d'albumine sort a
travers le trou de la coquille par lequel l'aiguille a ete introduite. Apres
l'injection, nous fermons le trou avec une goutte de paraffine. Lorsque l'injection
est faite avant l'incubation, le liquide injecte n'est pas prealablement chauffe,
mais se trouve a la temperature de la piece de travail; lorsque les injections sont
faites apres l'incubation, les liquides sont chauffes a la temperature de 37-38° c .
Avant la mise en couveuse ou le traitement avant l'incubation, on laisse les
oeufs en position horizontale pendant 12 heures au moins, a la temperature du
laboratoire. Pour controler les oeufs en experience, nous les avons mires apres
3 jours d'incubation et, dans chaque serie, nous avons elimine les oeufs qui
n'etaient pas fecondes. A partir du troisieme jour, nous avons systematiquement controle les oeufs toutes les 24 heures en les mirant; les embryons morts
ont ete immediatement preleves, observes au stereomicroscope, eventuellement
photographies et enfin, s'ils presentaient des particularites ou des malformations
interessantes, fixes au formol a 10%. Les embryons morts au 15eme jour ou
plus tard, ont tous ete systematiquement peses. Pour evaluer le stade de
40
G. CONTI et G. MILIO
d e v e l o p p e m e n t d e s e m b r y o n s , n o u s n o u s s o m m e s t e n u s a l a classification
proposee p a r Hamburger et Hamilton.
N o s e x p e r i e n c e s se d i v i s e n t e n 4 g r o u p e s ; le s c h e m a q u i s u i t n o u s d o n n e
u n e idee quantitative d u n o m b r e d ' e m b r y o n s traites d a n s c h a c u n des 4 g r o u p e s :
O e u f s d e c o n t r o l e ( p l u s i e u r s series)
.
.
O e u f s s i m p l e m e n t p i q u e s d a n s le b l a n c
O e u f s injectes a v e c 0,1 c c d e T y r o d e
Oeufs traites avec la D P X :
1 m g . avant l'incubation
1 m g . apres 24 heures
.
1 m g . apres 36 heures
.
1 m g . apres 48 heures
.
1 m g . apres 60 heures
.
0,6 m g . a p r e s 2 4 h e u r e s .
0,4 m g . a p r e s 2 4 h e u r e s
0,2 m g . a p r e s 2 4 h e u r e s
0,1 m g . a p r e s 2 4 h e u r e s
Oeufs traites avec la P X :
1 m g . apres 24 heures
.
0,6 m g . a p r e s 2 4 h e u r e s
0,4 m g . a p r e s 2 4 h e u r e s
0,2 m g . a p r e s 2 4 h e u r e s
0,1 m g . a p r e s 2 4 h e u r e s
Oeufs avec traitement combine
1:1 a v a n t l ' i n c u b a t i o n
.
1:10 a v a n t l ' i n c u b a t i o n .
1:100 avant l'incubation
1:1 a p r e s 2 4 h e u r e s
.
1:10 a p r e s 2 4 h e u r e s
.
1:100 apres 2 4 heures
.
.
.
.
.
.
.
.
.
. 1 0 9
.
.
.
.
. 1 0 6
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
DPX
.
.
.
.
.
256
+ PX:
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
. 1 0 5
106
103
103
. 1 0 5
.
.
.
.
.
. 1 0 2
. 1 0 2
. 1 0 7
100
. 1 0 4
. 1 0 4
. 9 4
. 1 0 1
. 1 0 0
.
.
.
N o m b r e t o t a l d e s e m b r y o n s d e p o u l e t q u i o n t servi p o u r c e s
experiences
92
92
9 1
92
94
95
2463
RESULTATS ET DISCUSSION
Action de differentes doses de DPX injectees a la 24eme heure de Vincubation
Dans ce premier groupe d'experiences, nous avons injecte a des oeufs fecondes
la DPX a des doses de 1, 0,6, 0,4, 0,2, et 0,1 mg.; pour chacune de ces doses,
l'injection a toujours ete faite a la 24eme heure d'incubation. Les resultats
obtenus se trouvent resumes dans le tableau suivant (Tableau 1).
Si nous considerons les chiffres de la premiere ligne, nous voyons des valeurs
qui indiquent le nombre en pour-cent des embryons morts dans les trois premiers
Vitamine et antivitamine B6 et Vembryon de poulet
41
jours qui ont suivi le traitement; ces valeurs nous donnent une idee de l'effet
immediat du traitement. Pour les embryons de controle n'ayant subi aucun
traitement (C), les valeurs se rapportent au nombre en pour-cent des embryons
morts durant la periode allant du moment de la mise en couveuse jusqu'a la
72eme heure de l'incubation. On peut remarquer que, deja chez les controles
non traites, il y a 6,9 % d'embryons qui meurent precocement, et ce pourcentage
est a peu pres equivalent chez les embryons simplement piques (P) ou ayant
TABLEAU 1
Embryons (%) traites par la DPX apres
24 heures d'incubation
Controles (c,Vo)
C
6,9
11,1
Mortalite precoce
Mortalite tardive
Vivants le 21 erne
82,0
jour
2,5
Hypodeveloppes
5,5
Malformes
A
T
P
4,5
16,9
6,5
7,9
7 mg.
14,7
48,0
78,6
3,4
4,8
85,6
2,1
3,5
37,3
13,8
14,9
0,6 mg. 0,4mg. 0,2 mg. 0,7 mg
13,5
22,3
12,9
16,0
30,7
21,3
12,8
11,0
55,8
17,7
14,4
56,4
13,5
14,9
74,3
10,2
2,3
73,0
10,8
3,6
C = Controles sans aucun traitement.
P = Controles piques sans injection.
7" = Controles ayant subi une injection de 0,1 c.c. de liquide de Tyrode apres 24 heures
d'incubation.
recu 0,1 cc de liquide de Tyrode (T) apres 24 heures d'incubation. Si nous
comparons maintenant le pourcentage des morts parmi les embryons de
controle et parmi les embryons traites par les differentes doses de DPX, nous
constatons que, parmi les traites, les valeurs augmentent, doublent, triplent ou
plus, mais sans jamais atteindre des chiffres tres importants. II est interessant
de remarquer que les dififerentes valeurs ne sont pas directement proportionnelles
aux doses de DPX employees; en effet, les doses relativement faibles (0,4 mg.)
sont celles qui ont provoque le nombre le plus eleve de mortalite precoce (22,3 %)
tandis que la dose la plus elevee (1 mg.) n'a determine que le 14,7 % de mortalite
precoce.
Les chiffres reportes dans la deuxieme ligne nous donnent une idee de la
mortalite tardive qui frappe les embryons apres le troisieme jour et jusqu'au
moment de l'eclosion. Dans les groupes des embryons de controle, le nombre
des embryons qui meurent pendant cette periode n'est pas eleve; chez les
embryons traites, le pourcentage est sensiblement superieur. Ici, les chiffres
correspondant aux differentes doses SUivent une courbe regulierement descendante, qui souligne d'une maniere evidente l'importance de la dose de DPX
sur la mortalite tardive.
L'examen des chiffres de la troisieme ligne du tableau nous fournit des
renseignements egalement significatifs. Ces chiffres indiquent le nombre en
pour-cent des embryons arrives vivants a l'eclosion. Les chiffres de cette ligne
42
G. CONTI et G. MILIO
confirment ceux de la deuxieme et montrent encore une fois que la survie des
embryons augmente avec la diminution de la dose. II nous semble en definitive
que la DPX n'a pas un effet lethal immediat, mais plutot un effet retarde
nuisible a la vitalite de l'embryon, en provoquant sa mort (chiffre de la deuxieme
ligne) ou en arretant son developpement (chiffre de la quatrieme ligne) dans
des periodes intermediaries.
Parmi les embryons qui sont morts au-dela du troisieme jour apres le traitement, on trouve de nombreux cas d'hypodeveloppement; le degre de maturite
et le poids de ces embryons hypodeveloppes est sensiblement inferieur a celui
correspondant des controles. Dans la quatrieme ligne, les valeurs indiquent le
nombre des embryons qui ont subi un retard dans leur developpement; ces
embryons presentaient au moment de la mort ou au moment de Peclosion un
degre de maturite et un poids sensiblement inferieurs aux valeurs moyennes
obtenues chez des embryons normaux. A propos des poussins et des embryons
hypodeveloppes, nous pouvons affirmer que, lorsque le poussin est capable
d'eclore spontanement, il n'est jamais hypodeveloppe.
Nous n'avons done jamais pu observer de poussins vivants hypodeveloppes.
Par contre, parmi les embryons morts a la fin de la periode d'incubation, entre
le 19eme et le 21 erne jour, le nombre des hypodeveloppes est plus marque que
durant le reste de l'incubation. Ces embryons correspondent apparemment
(formation des membres, developpement des plumes . . . etc.) aux embryons
normaux, mais ils sont plus chetifs, plus petits. Parmi ceux-la, nous avons
frequemment constate des poids de moins de 25 g. (parfois meme 16-17 g.).
On pourrait s'etonner, a propos du poids des poussins vivants, de la grande
marge entre les poids extremes (plus de 10 g.); il faut cependant penser que les
oeufs eux-memes peuvent varier assez fortement de grandeur et de poids (la
moyenne des poids des oeufs que nous avons utilises va de 48 a 57 g.). A propos
de 1'evaluation du degre d'hypodeveloppement, nous devons encore dire qu'elle
presente parfois certaines difficultes et cela surtout chez les embryons qui
meurent dans des phases relativement precoces du developpement.
Les chiffres de la quatrieme ligne nous indiquent que la DPX manifeste, a
toutes les doses employees, un effet inhibiteur sur la croissance, se traduisant
par un certain pour-cent d'embryons hypodeveloppes.
En definitive, l'examen comparatif des quatre premieres lignes semble nous
indiquer d'une maniere assez nette que la DPX exerce des effets inhibiteurs sur
le developpement de l'embryon de poulet. Ces effets se manifestent selon une
triple modalite: par la mort precoce des embryons, par une mortalite tardive
ou enfin par un retard du developpement. Parmi ces trois effets, un seul semble
etre lie a la quantite de substance employee: la mortalite tardive, tandis que
les deux autres effets inhibiteurs se manifestent dans des pourcentages modestes
et qui sont tout a fait independants de la quantite de substance employee.
Dans la derniere ligne, enfin, nous reportons les valeurs en pour-cent des
embryons malformes. Puisque, en general, on n'arrive pas a reconnaitre assez
Vitamine et antivitamine B6 et Vembryon de poulet
43
bien les malformations chez les embryons morts au cours des trois premiers
jours, dans ce calcul comme d'ailleurs dans les calculs sur les hypodeveloppes,
nous n'avons pas tenu compte du nombre total des embryons traites dans
chaque serie mais nous avons calcule le pour-cent sur le nombre des embryons
qui vivaient au-dela du troisieme jour. En effet, les doses plus elevees ont fait
doubler ou tripler le nombre des malformes par rapport a la normale, mais ce
nombre reste toujours dans des pourcentages tres peu importants (14-15%).
Par contre, les doses les plus faibles n'ont montre aucun effet teratogene, et le
nombre des malformations obtenues est inferieur a celui observe chez les
embryons de controle. Parmi les differentes malformations que nous avons
obtenues, nous n'avons pu identifier aucune malformation a laquelle on puisse
attribuer un certain caractere de specificite.
Action de 1 mg. de DPX injecte a differentes epoques de Vincubation
Les etudes sur la chimio-teratogenese nous indiquent que l'embryon de poulet
reagit differemment aux differentes stimulations et qu'il possede une periode
accrue de sensibilite au cours de son developpement precoce; cette periode
critique varie, d'une part selon la nature des substances employees et d'autre
part, en rapport avec les ebauches qui pourraient etre impliquees pour les
malformations (Ancel). Nous avons par consequent realise un deuxieme
groupe d'experiences avec la DPX. Celle-ci a ete injectee a des periodes
differentes du developpement, a savoir avant l'incubation ou bien 24, 36, 48
et 60 heures apres le debut de l'incubation.
Dans ce deuxieme groupe d'experiences, nous avons maintenu constante la
dose de 1 mg. Les resultats sont resumes dans le tableau qui suit (Tableau 2).
Les chiffres de la premiere ligne nous montrent que la mortalite precoce
chez les controles (embryons ayant regu une injection de liquide de Tyrode) est
un peu plus elevee dans le groupe des embryons injectes avant l'incubation et
TABLEAU 2
Embryons traites (%) avec 1 mg. de DPX
a differentes epoques
Controles (ct
A
TO
Mortalite precoce
Mortalite tardive
Vivants le 21 erne
jour
Hypodeveloppes
Malformes
10,4
14,6
75,0
7,0
16,3
T24
6,5
7,9
T48
85,6
2,1
91,8
3,5
6,1
2,1
2,2
2,2
48 hr.
13,0
22,0
60 hr.
19,2
19,3
53,3
17,4
65,0
7,2
5,7
61,5
11,9
8,3
Avant
44,1
40,2
24 hr.
14,7
48,0
36 hr.
15,7
21,1
37,3
13,8
14,9
8,8
8,4
38,3
9,1
TO — Embryons de controle ayant recM une injection de 0,1 cc de liquide de Tyrode avant
l'incubation.
T24 = Embryons de controle ayant rec.u une injection de 0,1 cc de liquide de Tyrode apres
24 heures d'incubation.
T48 = Embryons de controle ayant recu une injection de 0,1 cc de liquide de Tyrode apres
48 heures d'incubation.
44
G. CONTI et G. MILIO
qu'elle se reduit sensiblement dans les autres groupes. Ce fait nous est confirme
en observant les resultats obtenus avec la DPX: le nombre des morts precoces
est tres eleve (44,1 %) lorsque l'injection est faite avant l'incubation, tandis que
dans les jours suivants, la mortalite precoce se reduit a des valeurs sensiblement
inferieures; ces valeurs restent toutefois superieures par rapport aux series
correspondantes de controle.
La mortalite tardive (effet retarde) chez les embryons traites avec la DPX
nous confirme que la periode la plus critique pour l'embryon se situe avant
l'incubation. En effet, si Ton additionne les chiffres des deux premieres colonnes,
on trouve que 84,3 % des embryons meurent avant l'eclosion lorsque l'injection
se fait avant l'incubation; ce chiffre va graduellement se reduire pour arriver a
environ 35% lorsque l'injection est faite apres 48 ou 60 heures d'incubation.
Dans tous les cas, nous pouvons observer que la mortalite tardive est plus
importante que la mortalite precoce, et que la dose de 1 mg. de DPX exerce
un effet inhibiteur assez important qui permet a un nombre assez restreint
d'embryons d'atteindre le jour de l'eclosion (chiffre de la troisieme ligne).
Un autre aspect de l'effet retarde du traitement est represente par l'hypodeveloppement. Ici encore, nous voyons des valeurs qui sont superieures aux
controles, mais qui restent quand meme dans des limites relativement basses.
Ces valeurs confirment encore une fois que Pepoque la plus critique pour
l'embryon, se traduisant par la mortalite precoce, la mortalite tardive et les
hypodeveloppes, se situe avant l'incubation.
En ce qui concerne l'effet teratogene, les chiffres de la cinquieme ligne montrent que la substance ne produit pas de malformations. Seulement lorsque
la DPX est injectee apres 24 heures d'incubation, le nombre des malformes est
un peu plus eleve mais atteint seulement 15 % des embryons traites; cette valeur
n'est pas suffisante pour attribuer a la DPX un effet teratogene specifique,
d'autant plus qu'un pourcentage egal de malformes a ete obtenu en injectant
du Tyrode avant l'incubation.
En definitive, ce deuxieme groupe d'experiences nous permet de tirer les
conclusions suivantes:
(a) La DPX exerce un effet inhibiteur sur le developpement de l'embryon de
poulet.
(b) Un tel effet inhibiteur peut etre plus ou moins marque et plus ou moins
precoce: dans un certain pourcentage il se manifeste par la mort precoce
de l'embryon; dans d'autres cas, par la mort plus tradive; dans d'autres
cas encore, par un simple retard du developpement qui, dans beaucoup
de cas, est associe a la mort de l'embryon. En d'autres termes, l'effet
inhibiteur de la DPX est represente par un arret ou un retard du developpement qui est, dans bien des cas, suivi par la mort.
(c) L'effet inhibiteur parait d'autant plus marque que la periode du traitement
est plus precoce: Fintensite maximale s'observe en administrant la
DPX avant l'incubation.
Vitamine et antivitamine B6 et Vembryon de poulet
45
(d) La DPX, injectee a la dose de 1 mg a differentes epoques de l'incubation,
n'a pas d'effet teratogene specifique.
Action de differentes doses de PX injectees a la 24eme heure de Vincubation
Avant de realiser le traitement combine avec les deux substances, nous avons
realise un troisieme groupe d'experiences dans le but d'etudier la tolerance de
l'embryon de poulet vis-a-vis de la PX. La substance a ete injectee aux embryons
de poulet aux memes doses et en suivant exactement les memes modalites que
celles employees dans le premier groupe de nos experiences.
TABLEAU 3
Embryons traites (%) avec la PX apres
24 heures d'incubation
Contrdles (°,
A
Mortalite precoce
Mortalite tardive
Vivants le 21 erne
jour
Hypodeveloppes
Malformes
A
C
6,9
11,1
P
4,5
16,9
T
6,5
7,9
1 mg.
6,7
19,0
82,0
2,5
5,5
78,6
3,4
4,8
85,6
2,1
3,5
74,3
3,1
7,1
0,6 mg. 0,4 mg. 0,2 mg. 0,1 mg
5,7
6,8
8,6
7,8
21,7
14,6
9,7
13,3
72,6
5,0
6,0
78,6
5,2
5,2
82,5
2,1
2,1
78,1
2,1
4,2
Le tableau ci-dessous (Tableau 3) resume les resultats obtenus. Comme on
peut facilement le remarquer, le traitement avec la PX est tres bien supporte par
les embryons, raeme a la dose de 1 mg. Les ecarts des valeurs en pour-cent entre
les doses maximales et minimales sont toujours tres modestes, soit en ce qui
concerne la mortalite precoce ou tardive des embryons, soit en ce qui concerne
la frequence des hypodeveloppes ou des malformes; les valeurs obtenues se
rapprochent toujours des valeurs observees dans les series de controle. Par
consequent, les conclusions que Ton peut tirer ne peuvent etre que positives,
c'est-a-dire que la PX doit etre consideree, au moins pour les doses que nous
avons employees, comme absolument inoffensive.
Action de la DPX et de la PX associees en differents rapports et injectees avant
et apres 24 heures d'incubation
Afin de nous assurer que les effets obtenus par l'administration de DPX dans
le premier et le deuxieme groupe d'experiences sont vraiment determines par
la DPX, nous avons realise un quatrieme groupe d'experiences qui servirait de
contre-epreuve biologique: a savoir, nous avons associe a la DPX des doses
bien determinees de PX, son antagoniste, capable d'en neutraliser les effets
lorsqu'elle est administree simultanement. Les deux substances ont ete injectees
dans les rapports 1:1,1:10 et 1:100. La dose de DPX a ete maintenue constante
a 1 mg.; la PX a ete ajoutee respectivement aux doses de 1 mg., 0,1 mg. et
46
G. CONTI et G. MILIO
0,01 mg. Les deux substances ont ete injectees soit avant l'incubation, soit
apres 24 heures, apres avoir ete dissoutes ensemble dans 0,1 cc de liquide de
Tyrode. Le tableau ci-dessous (Tableau 4) nous montre les resultats obtenus.
Quant aux series de controle, nous avons employe les series qui nous avaient
servi au cours des experiences precedentes en prenant en consideration l'effet de
1 mg. de DPX injecte avant et 24 heures apres l'incubation.
En ce qui concerne la mortalite precoce, les chiffres de la premiere ligne nous
indiquent clairement que l'association des deux antagonistes dans le rapport 1:1
montre les resultats les plus favorables; et cela, soit que l'association soit
injectee avant l'incubation, soit que les antagonistes soient injectes 24 heures
apres. En comparant ces valeurs avec celles des series de controle injectees
avec 1 mg. de DPX, on observe que, dans le premier cas (DPX administree
TABLEAU 4
Traitement avec le complexe DPX-PX
Contrdles
A
r
avant Vincub
0/
/o
DPXO DPX24
14,7
Mortalite precoce 44,1
Mortalite tardive 40,2
48,0
Vivants le 21eme
15,7
37,3
jour
Hypodeveloppes
21,1
13,8
Malformes
8,8
14,9
(
A
apres 24 heures
r
1:1
13,0
28,3
1:10
27,2
23,8
1:100
22,0
32,9
1:1
15,2
21,8
1:10
30,9
14,8
1:100
20,0
24,5
58,7
8,8
13,7
49,0
7,4
11,9
45,1
12,7
12,7
63,0
6,4
9,0
54,3
7,7
4,6
55,5
8,0
6,6
DPXO = Embryons traites avec 1 mg de DPX dissous dans 0,1 cc. de liquide de Tyrode,
avant l'incubation.
DPX24 = Embryons traites avec 1 mg. de DPX dissous dans 0,1 cc. de liquide de Tyrode,
apres 24 heures.
avant l'incubation), le taux eleve de mortalite (44,1 %) est sensiblement reduit
par l'adjonction de PX; une telle reduction de la mortalite atteint des valeurs
maximales dans le rapport 1:1, la reduction de la mortalite est inferieure dans
les rapports 1:10 et 1:100. Dans le deuxieme cas, par contre (DPX injectee
apres 24 heures d'incubation), on n'observe aucune reduction de la mortalite;
bien au contraire, avec les rapports 1:10 et 1:100, on remarque meme une
augmentation de la mortalite par rapport au traitement avec la DPX seule.
Ces donnees nous indiquent que la DPX injectee avant l'incubation est directement responsable du taux eleve de mortalite precoce, et que ce taux peut etre
sensiblement reduit par Padministration simultanee d'une dose adequate de
PX. Mais cela nous montre egalement que lorsque la DPX est administree
apres 24 heures d'incubation, le taux de mortalite precoce qu'elle provoque
peut etre lie a des causes independantes d'une action inhibitrice specifique: en
effet, ce taux de mortalite, qui d'ailleurs n'est pas du tout eleve, n'est pas reduit
par l'administration simultanee de DPX.
Des considerations analogues peuvent etre faites au sujet des chiffres relatifs
Vitamine et antivitamine 2?6 et Vembryon de poulet
Al
a la mortalite tardive. Meme dans ce cas, l'adjonction de PX est capable de
reduire plus ou moins largement le taux de mortalite et cela, soit que les traitements associes soient faits avant l'incubation, soit qu'ils le soient apres 24 heures
d'incubation; dans ce dernier cas, la reduction de la mortalite parait meme
parfois plus importante.
L'efficacite de l'association de la PX a la DPX se trouve encore confirmee
en observant les valeurs indiquant le pour-cent des embryons capables d'arriver
a Peclosion: on remarque que les trois rapports sont capables de reduire 1'effet
inhibiteur provoque par la DPX seule.
L'effet antagoniste de la PX vis-a-vis de la DPX est encore temoigne par la
reduction sensible du pour-cent des embryons hypodeveloppes que Ton observe
dans les differents rapports.
Enfin, en ce qui concerne le nombre de malformes, ce groupe d'experiences
ne nous apporte pas de donnees significatives. Mais cela se comprend bien, en
tenant compte du fait qu'aucune des deux substances, injectee separement, n'a
revele d'effets teratogenes aux doses que nous avons employees.
En definitive, ce groupe d'experiences nous permet de tirer les conclusions
suivantes:
(a) L'adjonction de PX a la DPX reduit sensiblement le taux de mortalite
precoce et de mortalite tardive provoquee par le traitement avec la DPX
seule. Par consequent, le taux de survie augmente notablement.
(b) Pour neutraliser le taux eleve de mortalite precoce provoque par la DPX
injectee avant l'incubation, il est necessaire d'utiliser une concentration
de PX elevee: dans nos experiences, le rapport 1:1 s'est revele le plus
efficace. Pour neutraliser le taux de mortalite tardive et pour faire
baisser le taux des embryons hypodeveloppes, meme des concentrations
inferieures de PX (1:10 et 1:100) se sont revelees largement suffisantes.
Considerations sur le pouvoir teratogene de differents solvants, de la DPX et
de la PX
Dans des recherches precedentes, nous avons etudie l'action de differents
solvants sur le developpement de l'embryon de poulet. Avoir etabli l'absence
de pouvoir teratogene de la part de ces solvants, representait une donnee
fondamentale qui nous a permis d'examiner, par la suite, le pouvoir teratogene
de substances dissoutes dans ces solvants. Les renseignements que nous en
avons tires sont lies a un critere quantitatif et ce critere, a lui seul, nous parait
encore insuffisant pour exclure un pouvoir teratogene eventuel; pour rendre un
tel jugement plus valable, il ne faut pas negliger le critere qualitatif; a savoir,
il faut preciser s'il existe un lien d'interdependance entre l'administration d'une
substance donnee et l'apparition de malformations bien determinees, se repetant
avec une certaine frequence et Constance. Dans ce but, nous avons compare
les resultats fournis par tous les groupes d'experiences que nous avons realises,
48
G. CONTI et G. MILIO
et cela, en considerant, non seulement les pour-cents totaux des malformes, mais
egalement et surtout en etudiant les pour-cents partiels des differents types de
malformations. II est evident qu'une telle comparaison ne pourra qu'etre
globale, c'est-a-dire realisee sur le total des embryons traites avec toutes les
substances et sans plus tenir compte ni de la dose employee ni de l'epoque a
laquelle la substance a ete injectee. Dans le tableau qui suit (Tableau 5), on
remarque que les valeurs en pour-cent sont tres semblables entre elles et ne
s'eloignent pas beaucoup des valeurs obtenues chez les embryons de controle
n'ayant subi aucun traitement. Le tableau montre done d'une maniere tres
claire qu'aucune des deux substances, DPX et PX, et qu'aucun des trois solvants
n'a d'effet teratogene.
TABLEAU 5
Nombre
d'embryons
Traitement
traites
473
Controles
374
Piqure
Eau dist.
1031
1034
Sol. physiol.
1241
Tyrode
DPX
914
522
PX
556
DPX-PX
N. reel
d'embryons
malformes
25
17
46
56
84
68
26
44
N.en %
d'embryons
malformes
5,3
4,6
4,5
5,4
6,7
7,5
4,9
7,9
En tenant compte, toutefois, que la DPX a provoque, dans bien des cas, un
taux eleve de mortalite precoce, et en tenant compte egalement des difficultes
que Ton rencontre pour etablir avec certitude l'existence de malformations chez
les embryons morts au cours des trois premiers jours, nous avons fait d'autres
calculs. Ceux-ci ont ete faits en tenant compte seulement des embryons qui
avaient survecu au-dela du troisieme jour apres le traitement. Comme on le
remarque dans le Tableau 6, les pour-cents des malformes restent toujours tres
bas et presentent des valeurs qui sont assez semblables a celles des embryons de
controle.
TABLEAU 6
Traitement
Controles
Piqure
Eau dist.
Sol. physiol.
Tyrode
DPX
PX
DPX-PX
Nombre d'embryons
vivants a partir
du 3eme jour
440
359
735
111
902
749
485
437
Nombre d'embryons malformes
a partir du 3eme jour
N. reel
25
17
46
50
73
66
24
43
A
N.en %
5,7
4,7
6,3
6,8
8,1
8,8
5,0
10,0
Vitamine et antivitamine B§ et Vembryon de poulet
49
Nous avons enfin realise un autre calcul, en tenant compte du type de
malformation presente par chaque embryon. Ce calcul implique des difficultes,
etant donne que seul un nombre restreint d'embryons presentent des malformations isolees. La plupart des malformations se sont presentees en association
avec une ou plussieurs autres malformations, il en est resulte, dans certains cas,
TABLEAU 7
Cadre synoptique des differents types de malformations observes chez les embryons
de controle et chez les embryons traites avec les solvants physiologiques, la DPX
et la PX
Brachygnathie sup. et inf.
Retroversion du bee inf.
Bee croise
Bee de perroquet
Micro- et anophtalmie mono- et bilat
Deviation du bee
Anencephalie, exencephalie
Deviation de la colonne vert.
Spina bifida
Celosomie
Ectrosomie
Ectromelie
Brachymelie
Hemimelie
Phocomelie
Symelie
Ectrodactylie
Gueule de loup
Anourie
Oedeme
Kystes des plumes
Anomalies de la position des pattes
Monstres doubles
Autres monstruosites
C = Controles.
P = Piqure.
ED = Eau distillee.
C
16
0
8
12
52
0
48
0
0
20
0
8
0
0
0
0
0
0
0
4
0
0
0
0
p
0
5
23
12
53
0
23
0
0
41
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
12
ED
11
11
13
15
38
0
19
2
2
35
0
0
0
2
0
0
2
0
0
4
0
0
0
4
SP
7
4
19
7
50
0
23
7
0
19
0
0
0
0
0
0
2
0
0
4
2
6
0
2
TY
4
4
18
11
39
1
27
2
0
46
1
0
0
1
0
1
0
0
0
1
0
0
0
5
DPX
4
9
7
17
28
6
25
4
1
19
0
0
0
0
2
0
0
4
0
9
0
0
3
0
PX
4
15
8
35
12
0
16
4
0
20
0
0
4
0
0
0
0
0
0
16
0
0
0
0
DPXPX
2
11
18
7
23
2
16
5
0
41
0
0
0
2
0
0
0
0
2
10
0
5
0
5
SP == Solution physiologique.
TY= Liquide de Tyrode
des images monstrueuses tres complexes. Par consequent, les embryons presentant plusieurs malformations figurent deux ou plusieurs fois sous le nom
des malformations correspondantes.
Tous les chiffres du Tableau 7 represented des pour-cents qui se rapportent
au total des malformes obtenus avec le traitement correspondant a la colonne
respective. Par exemple, le chiffre de 8 dans la rubrique des bees croises, chiffre
observe chez les embryons de controle, correspond a 8 % de 25 embryons trouves
malformes parmi les embryons de controle.
4
50
G. CONTI et G. MILIO
Comme les chiffres du tableau le montrent, pour aucune des substances
employees, il n'existe de frequence specifique d'un type de malformation. II
existe, il est vrai, des types de malformations qui se repetent plus frequemment
que d'autres, mais cette frequence n'est pas liee au traitement par une seule
substance puisque la malformation se repete de facon generale avec toutes les
substances employees (voir par exemple les malformations des yeux, la celosomie, l'anencephalie). L'un des exemples de malformation specifique pourrait
etre represents par les monstres doubles qui—sur le total des embryons malformes—existent seulement chez les embryons traites avec la DPX. Mais, mis
a part le nombre insignifiant de cas (2), il y a d'autres considerations qui nous
montrent que cette malformation ne doit pas etre consideree comme specifique
pour la DPX. Cette malformation est liee, en effet, a une deviation des processus
normaux de segmentation de l'oeuf, se realisant a des phases tres precoces du
developpement. Dans notre cas, les deux embryons ont ete injectes avec la
DPX 24 heures apres le debut de l'incubation; il est done vraisemblable que,
lorsque le traitement fut realise, la segmentation anormale avait deja debute.
La gueule de loup est une autre variete de malformation qui pourrait avoir
une valeur specifique. Nous ne l'avons constatee que chez des embryons traites
avec la DPX. Dans ce cas, cependant, la valeur est trop basse (le 4 % du total
des malformes provoques par la DPX) pour considerer cette malformation
comme specifique de la substance.
En definitive, les valeurs rapportees dans le dernier tableau confirment les
conclusions tirees des deux tableaux precedents: la DPX et la PX, comme les
trois solvants, ne semblent reveler aucune action teratogene specifique.
RESUME
1. L'antivitamine B 6 (DPX) exerce un effet inhibiteur sur le developpement
de l'embryon de poulet.
2. Un tel effet inhibiteur se manifeste a la dose de 1 mg. et il est plus ou
moins marque et plus ou moins precoce. L'effet inhibiteur se traduit par la
mort precoce des embryons ou par l'arret ou un retard du developpement, qui,
dans bien des cas, est suivi par la mort de l'embryon a un stade plus avance.
3. L'effet inhibiteur parait d'autant plus marque que la periode du traitement
est plus precoce: l'intensite maximale s'observe en administrant la DPX avant
l'incubation.
4. La vitamine B6 (PX) doit etre consideree comme absolument inoffensive
pour le developpement de l'embryon de poulet.
5. L'adjonction de PX a la DPX reduit sensiblement le taux de mortalite
precoce et de mortalite tardive provoque par le traitement avec la DPX seule.
6. La vitamine B 6 , l'antivitamine B 6 et les trois solvants etudies (eau distillee,
solution physiologique et liquide de Tyrode) n'ont pas revele d'action teratogene
specifique sur l'embryon de poulet.
Vitamine et antivitamine B6 et Vemhryon de poulet
51
SUMMARY
The action of vitamin B^ and its antivitamin upon the development of the fowl
embryo
1. Antivitamin B 6 (deoxypyridoxine) has an inhibitory effect upon the
development of the fowl embryo.
2. This effect, which occurs with doses of 1 -0 mg., may be shown by early
death, or by arrested or delayed development which in many cases is followed
by death at later stages.
3. The effect is greater the earlier the administration of the antivitamin. The
greatest effect was obtained after administration to the egg before incubation.
4. Vitamin B 6 is without adverse effect upon the development of the fowl
embryo.
5. Joint administration of vitamin B 6 and antivitamin B 6 reduces the early
and the late mortality produced by the antivitamin alone.
6. Vitamin Bg, antivitamin B 6 , and the three solvents used (distilled water,
physiological saline and Tyrode solution) showed no specific teratogenic
activity.
REMERCIEMENTS
Ces recherches ont ete faites grace a un subside du Fonds national suisse de la recherche
scientifique et de la Fondation E. Barell.
Nous remercions le departement des recherches medicates de la HofFmann-La Roche SA,
Bale, qui nous a fourni les substances utilisees au cours de ces recherches.
BIBLIOGRAPHIE
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(Manuscrit regu le 8 Fevrier 1965)