РАДОВИ
BIBLID: 0370-8179, 136(2008) 9-10, p. 476-480
DOI: 10.2298/SARH0810476M
UDC: 616.311.2:612.313]-093
IDENTIFIKACIJA PARODONTOPATOGENIH
MIKROORGANIZAMA PCR TEHNIKOM
Radovan MILIÆEVIÆ1, Gavrilo BRAJOVIÆ2, Nataša NIKOLIÆ-JAKOBA3,
Branka POPOVIÆ4, Dušan PAVLICA5, Vojislav LEKOVIÆ3, Jelena MILAŠIN4
1Deèja
klinika, Klinièki centar Niš, Niš;
za fiziologiju, Stomatološki fakultet, Univerzitet u Beogradu, Beograd;
3Klinika za parodontologiju i oralnu medicinu, Stomatološki fakultet, Univerzitet u Beogradu, Beograd;
4Institut za humanu genetiku, Stomatološki fakultet, Univerzitet u Beogradu, Beograd;
5Institut za mikrobiologiju, Stomatološki fakultet, Univerzitet u Beogradu, Beograd
2Institut
KRATAK SADRŽAJ
Uvod Epidemiološki podaci iz čitavog sveta ukazuju na veliku rasprostrawenost gingivitisa i parodontopatije,
oboqewa potpornog aparata zuba. U etiopatogenezi oboqewa parodoncijuma kqučnu ulogu igraju različiti rodovi
Gram-negativnih bak terija, ponajviše striktnih anaeroba.
Ciq rada Ciq rada je bio da se ispita postojawe genoma glavnih parodontopatogenih mikroorganizama – Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Eikenella corrodens, Treponema denticola, Tanerella forsythia i Prevotella intermedia – u različitim uzorcima poreklom iz usne dupqe pacijenata s klinički dijagnostikovanom parodontopatijom.
Metod rada Kao biološki materijal u kojem je dokazivano postojawe DNK mikroorganizama korišćeni su zubni
plak, tkivo zapaqene gingive i pquvačka. Za otkrivawe bak terijskog genoma primewena je multipleks tehnika reakcije lančanog umnožavawa (engl. polymerase chain reaction – PCR), odnosno simultana amplifikacija gena dve različite bak terije.
Rezultati S mawom ili većom učestalošću, u svim ispitanim uzorcima utvrđeno je postojawe parodontopatogenih
mikroorganizama. U zubnom plaku osoba obolelih od parodontopatije najčešći je bio genom vrste Treponema denticola. U tkivu parodoncijuma otkriveno je u najvećem procentu postojawe genoma vrsta Tannerella forsythia i Treponema
denticola, što je odlika hroničnog oblika parodontopatije, a u pquvački ispitanika dominirale su Treponema denticola i Eikinella corrodens. Najmawe ukupno postojawe bak terija je zapaženo u pquvački.
Zakqučak Primeweni metod PCR ima veliku osetqivost i specifičnost. Brzo i precizno otkrivawe mikroorganizama je veoma važno za pravovremeno dijagnostikovawe infekcije, a samim tim i za prevenciju i lečewe parodontopatija. U svakodnevnoj kliničkoj praksi optimalan biološki materijal za dokazivawe parodontopatogena kod osoba obolelih od parodontopatije je zubni plak, koji se smatra pouzdanim pokazateqem zastupqenosti pojedinih bakterija u obolelom parodoncijumu.
Kqučne reči: zubni plak; pquvačka; parodoncijum; parodontopatogeni mikroorganizmi; PCR
UVOD
Epidemiološki podaci iz èitavog sveta ukazuju
na veliku rasprostrawenost gingivitisa i parodontopatije, oboqewa potpornog aparata zuba. Smatra se
da su ovo, pored karijesa, najèešæa oboqewa kod qudi,
jer se dijagnostikuju kod veæine odraslih osoba, ali
i kod jedne treæine dece. Zapaqewska oboqewa parodoncijuma glavni su uzrok gubitka zuba posle èetrdeset pete godine [1].
Zubni plak, èiji najznaèajniji deo èine mikroorganizmi, glavni je etiološki faktor nastanka oboqewa potpornog aparata zuba [1]. Patogena aktivnost
bakterija zubnog plaka, otpornost organizma domaæina i sistemski i lokalni faktori rizika doprinose
nastanku i razvoju oboqewa parodoncijuma [2].
U zdravom parodoncijumu najviše je Gram-pozitivnih mikroorganizama, dok tokom razvoja parodontopatije dominaciju preuzimaju Gram-negativne, pretežno striktno anaerobne vrste, mada mogu da
se jave i tzv. fakultativni anaerobi [3, 4]. Posebno
se svojim parodontopatogenim potencijalom istièu
476
sledeæe bakterije: Porphyromonas gingivalis, Prevotella
intermedia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Treponema denticola, Tanerella forsythia i Eikenella corrodens. Svaka od ovih vrsta raspolaže velikim brojem
faktora virulencije (delovi æelijske graðe, agresivni enzimi, egzotoksini i endotoksini), pomoæu kojih doprinosi nastanku i razvoju oboqewa potpornog
aparata zuba. Prilikom poremeæaja homeostaze parodontnog tkiva ove vrste ispoqavaju svoj patogeni potencijal, izazivajuæi oboqewe. Bakterije i wihovi
proizvodi stimulišu zapaqewe, što dovodi do povišenog oslobaðawa proinflamatornih medijatora,
kao što su citokini i prostaglandini, koji deluju
štetno na parodontno tkivo [5, 6].
CIQ RADA
Ciq rada je bio da se primenom tehnike PCR (engl.
polymerase chain reaction – reakcija lanèanog umnožavawa) prepoznaju najèešæe parodontopatogene bakterije (P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, E. corrodens,
SRPSKI ARHIV ZA CELOKUPNO LEKARSTVO
TABELA 1. Sekvence prajmera za otkrivawe mikroorganizama, specifične temperature hibridizacije i dužina očekivanih amplikona.
TABLE 1. Sequences of specific primers used for PCR, annealing temperatures and size of expected PCR products.
Mikroorganizam
Microorganism
Sekvence prajmera
Sequences of specific primers
P. gingivalis
A. actinomycetemcomitans
T. forshythia
P. intermedia
CAA TAC TCG TAT CGC CCG TTA TTC
CAC TTA AAG GTC CGC CTA CGT GC
GTA GAG CTT ACA CTA TAT CGC AAA CTC CTA
GTT GCG TGC ACT CAA GTC CGC C
CTA ATA CCG CAT ACG TCC TAA G
CTA CTA AGC AAT CAA GTT GCC C
TAA TAC CGA ATG TGC TCA TTT ACA T
TCA AAG AAG CAT TCC CTC TTC TTC TTA
E. corrodens
T. denticola
Specifična temperatura
hibridizacije
Annealing
temperatures
55°C
55°C
53°C
53°C
Dužina očekivanih
amplikona
Size of expected
PCR products
400 bp
600 bp
840 bp
660 bp
55°C
800 bp
60°C
316 bp
TABELA 2. Temperaturni profil PCR.
TABLE 2. Cycling profiles for PCR reactions.
Početna denaturacija
Initial denaturation
3 min.
95°C
35 ciklusa (tri koraka) / 35 cycles (three steps)
Denaturacija
Hibridizacija
Elongacija
Denaturation
Annealing
Extension
1 min.
1 min.
1-1.30 min.
94°C
55-60°C
72°C
T. denticola, T. forsythia, P. intermedia) i utvrdi wihova zastupqenost u razlièitim uzorcima materijala
prikupqenim od pacijenata s klinièki dijagnostikovanom parodontopatijom.
METOD RADA
U istraživawe je ukquèeno 90 pacijenata sa dijagnozom parodontopatije koji su leèeni u Klinici za parodontologiju i oralnu medicinu Stomatološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu. Kao izvor materijala za analizu korišæeni su uzorci zubnog plaka (od 35 pacijenata), zapaqenog tkiva gingive
(od 25 pacijenata) i nestimulisane pquvaèke (od 30
pacijenata). Zubni plak prikupqan tokom uklawawa
zubnog kamenca i tkivo gingive uzeto posle hirurške intervencije stavqani su u sterilne ependorfepruvete uz dodavawe 50-100 μl sterilne dejonizovane vode. Nestimulisana pquvaèka (1-2 ml) takoðe je
prikupqana u sterilne epruvete i zatim centrifugirana pri brzini od 3.000 obrtaja u minu ti. Izolacija eventualno prisutne bakterijske DNK vršena je
tretirawem uzoraka proteinazom K na temperaturi
od 56°C tokom 30 minu ta, nakon èega je sledila inaktivacija enzima zagrevawem uzoraka na temperaturi
od 94°C tokom 15 minu ta. Tako pripremqeni materijal èuvan je na 20°C do PCR analize.
Uzorci zubnog plaka i tkiva gingive su ispitani na postojawe mikroorganizama P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, T. forsythia, P. intermedia, E. corrodens i T. denticola, dok su u uzorcima pquvaèke posledwe bakterije izostavqene. Za primenu PCR tehnike korišæene su poznate sekvence prajmera. Multipleks PCR tehnika, koja omoguæava simultanu amplifikaciju razlièitih genskih sekvenci uz korišæewe nekoliko parova prajmera, upotrebqena je za
otkrivawe P. gingivalis i A. actinomycetemcomitans.
Krajwa elongacija
Final extension
7 min.
72°C
Ovom tehnikom odreðen je i par bakterija P. intermedia i T. forsythia. Standardnom tehnikom PCR, koja
podrazumeva korišæewe jednog para prajmera, identifikovane su u zasebnim reakcijama E. corrodens i
T. denticola. Sekvence svih prajmera i dužine oèekivanih amplikona prikazane su u tabeli 1.
PCR je raðena u zapremini od 25 μl, a reakciona
smesa je bila sledeæeg sadržaja: sterilna voda, PCR
pufer, 2,5 mM MgCl2, 200 μM dNTP, 5 μM prajmeri,
0,1 U Taq polimeraze, 4 μl uzorka s pretpostavqenom
bakterijskom DNK. Temperaturni profil izvoðewa
PCR prikazan je u tabeli 2.
Proizvodi PCR analizirani su elektroforezom
na 8% poliakrilamidnom gelu u jednom TBE puferu,
pri konstantnom naponu struje od 200 V tokom 60 minu ta. Za vizuelizaciju amplifikovanih fragmenata
DNK, gel je bojen etidijum-bromidom i osvetqen UV
transiluminatorom.
REZULTATI
Postojawe elektroforetskih traka oèekivane dužine na gelu oznaèavalo je pozitivan nalaz (Slika
1). Procenat pozitivnih uzoraka na jednu bakteriju
ili više wih bio je: 94,1% (33 pacijenta od 35) u grupi zubnih plakova, 64% (16 od 25 pacijenata) u grupi
gingivnog tkiva i 53,3% (16 od 30 pacijenata) u gru-
SLIKA 1. Poliakrilamidni gel sa trakama koje odgovaraju P. gingivalis (400 bp) i A. actinomycetemcomitans (600 bp).
FIGURE 1. Polyacrilamide gel with bands corresponding to P. gingivalis (400 bp) and A. actinomycetemcomitans (600 bp).
477
SRPSKI ARHIV ZA CELOKUPNO LEKARSTVO
TABELA 3. Zastupqenost različitih sojeva bakterija u biološkom materijalu.
TABLE 3. Distribution of different types of bacteria in biological materials.
Vrsta bakterije
Bacterial species
P. gingivalis
A. actinomycetemcomitans
E. corrodens
T. denticola
T. forsythia
P. intermedia
Zubni plak
Dental plaque
(N=35)
28.5%
22.7%
31.4%
77.1%
37.1%
31.4%
Tkivo parodoncijuma
Periodontal tissue
(N=25)
12%
12%
4%
28%
32%
12%
Pquvačka
Saliva
(N=30)
3.3%
6.7%
36.7%
40%
-
Zubni plak
Dental plaque
(N=35)
Tkivo parodoncijuma
Periodontal tissue
(N=25)
Pquvačka
Saliva
(N=30)
33 (94.1%)
16 (64%)
16 (53.3%)
13 (37.1%)
9 (36%)
8 (26.7%)
7 (20%)
5 (20%)
7 (23.3%)
8 (22.8%)
2 (8%)
1 (3.3%)
5 (14.2%)
-
-
TABELA 4. Broj ispitanika „pozitivnih” na različite bakterije.
TABLE 4. Number of positive patients in relation to different types of bacteria.
Broj ispitanika
Number of patients
Ukupan broj „pozitivnih”
Total number of positive
„Pozitivni” na jednu bakteriju
Positive for one bacteria
„Pozitivni” na dve bakterije
Positive for two bacteria
„Pozitivni” na tri bakterije
Positive for three bacteria
„Pozitivni” na četiri bakterije
Positive for four bacteria
pi uzoraka pquvaèke. U zubnom plaku dominirala je
T. denticola (77%), u tkivu gingive, pored T. denticola
(28%), u relativno visokom procentu otkrivena je i
T. forsythia (32%), dok su u pquvaèki najèešæe bile T.
denticola (40 %) i E. corrodens (36,7%). Rezultati po tipovima ispitivanih bakterija i korišæenog biološkog materijala prikazani su u tabeli 3. Uporedni
pregled zastupqenosti parodontopatogena u sve tri
vrste materijala uzetog od pacijenata s parodontopatijama dat je u tabeli 4.
DISKUSIJA
Ovo istraživawe je prvi pokušaj analize zastupqenosti razlièitih sojeva parodontopatogenih mikroorganizama kod osoba obolelih od parodontopatije u našoj populaciji primenom metoda PCR. Bez
obzira na to što je dugo godina poznato koji su mikroorganizmi najèešæe odgovorni za nastanak oboqewa potpornog aparata zuba, wihova uèestalost može da pokazuje geografske, etnièke i rasne varijacije, kao i promene zavisne od naèina održavawa oralne higijene, specifiènosti životnih navika ishrane, konzumirawa alkohola i duvana i dr.
U analiziranom materijalu T. denticola je bila najèešæa bakterija, koja je otkrivena u èak 77% uzoraka zubnog plaka koji su prikupqeni od pacijenata s klinièki dijagnostikovanom parodontopatijom. Ovi rezultati su u skladu s podacima iz literature za razlièite
delove sveta. Tako su, na primer, Takeuši (Takeuchi) i
saradnici [7] otkrili T. denticola u zubnom plaku više
od 70% ispitanika obolelih od parodontopatije u japanskoj populaciji. Slièno tome, u radovima Sikeire
Mlaðeg (Siqueira Jr) i Rokasa (Rocas) [8] ove oralne spi-
478
rohete su kod zapaqewskih oboqewa parodontnih tkiva u brazilskoj populaciji izolovane u 78% sluèajeva.
U 28% uzoraka tkiva parodoncijuma ispitanika
našeg istraživawa takoðe je otkrivena T. denticola,
što se objašwava èiwenicom da genom ove vrste, zahvaqujuæi stvarawu proteaza, može inficirati æelije mekih tkiva gingivnog sulkusa, odnosno parodontnog xepa [9]. Piters (Peters) i saradnici [10] su
dokazali da oralne treponeme mogu direktno prodreti u æelije epitela gingivnog sulkusa, gingivnog xepa, odnosno parodontnog xepa, a ne samo da se nalaze u biofilmu na površini zuba. Treba pomenu ti da
su neka istraživawa obavqena posledwih godina u
svetu pokazala da ne postoji direktna korelacija izmeðu kvantitativne zastupqenosti vrste T. denticola
i stepena izraženosti klinièkih simptoma, ali je
pouzdano dokazano weno uèešæe u nastanku i razvoju oboqewa parodontnog tkiva [11].
Kod skoro jedne treæine (28,5%) uzoraka zubnog
plaka u našem istraživawu dokazan je genom vrste
P. gingivalis. Ovaj nalaz je u skladu s rezultatima studija koje su se bavile ovom problematikom i koje ukazuju na znaèajno uèešæe ove vrste u etiopatogenezi
parodontopatija [12]. Postojawe genoma vrste A. actinomycetemcomitans, etiološkog uzroènika lokalizovane juvenilne parodontopatije i uèesnika u razvoju parodontopatije kod odraslih osoba, zabeleženo je u 22,8% uzoraka zubnog plaka; ovi nalazi su takoðe u skladu s rezultatima studija drugih autora [13,
14]. Ispitivawa osoba s klinièki zdravim parodoncijumom pokazala su da je postojawe ove vrste u uzorcima zubnog plaka neznatno (oko 2%) [15].
Za razliku od zubnog plaka, u uzorcima tkiva zapaqene gingive dokazano je mawe prisustvo vrsta P.
gingivalis i A. actinomycetemcomitans (12%). Ovo se mo-
SRPSKI ARHIV ZA CELOKUPNO LEKARSTVO
že objasniti èiwenicom da je ovde reè o vrstama koje
nemaju izraženu osobinu invazivnosti, odnosno sposobnosti razmnožavawa u tkivima. U uzorcima pquvaèke genom vrsta P. gingivalis i A. actinomycetemcomitans zabeležen je u vrlo malom procentu, što se može tumaèiti spirajuæim efektom pquvaèke i zastupqenošæu supstanci s antimikrobnim delovawem u
woj. Rezultati koji su u saglasnosti s našim nalazima dobijeni su i u istraživawu Onišija (Ohnishi)
[16]. Istraživawa koja su obavqena u svetu uglavnom
su pokazala malu uèestalost ovih vrsta kod osoba s
klinièki zdravim parodontnim tkivom [7].
U zubnom plaku osoba ukquèenih u naše istraživawe genom E. corrodens dokazan je u 31,4% sluèajeva, dok
je wegov pozitivan nalaz u tkivu parodoncijuma bio
svega 4%. U istraživawu Mulalija (Mullally) i saradnika [13] ova Gram-negativna bakterija je izolovana
kod 42,2% odraslih osoba obolelih od parodontopatije. Inaèe, ona pripada grupi parodontopatogena s izraženim stepenom virulencije, a otkrivena je i u ekstraoralnim infekcijama, kao što je endokarditis.
Odnedavno se smatra da vrsta T. forsythia takoðe
ima znaèajnu ulogu u nastanku i razvoju oboqewa parodoncijuma [8]. I ovde je u pitawu Gram-negativni,
striktno anaerobni bacil, koji postoji u zrelom zubnom plaku i dubokim parodontnim xepovima. U tkivu gingive i zubnom plaku ispitanika našeg istraživawa genom T. forsythia je zabeležen u visokom procentu, što govori u prilog èiwenici da je ova vrsta
snabdevena velikim brojem razlièitih faktora virulencije koji joj daju izraziti parodontopatogeni
potencijal [17, 18]. Osim T. forsythia, i genom vrste
P. intermedia pokazuje relativno visoku uèestalost u
ispitivanim uzorcima. Neki autori smatraju da ove
dve vrste deluju sinergistièki [13].
U sva tri ispitivana biološka materijala utvrðeno je znaèajno postojawe parodontopatogenih mikroorganizama, a zabeležene uèestalosti pojedinih
bakterija se uklapaju u relativno široke opsege frekvencija koje nudi svetska literatura. Dokazivawe
postojawa parodontopatogenih mikroorganizama u
parodontnim tkivima doprinosi preciznijoj dijagnozi, odreðivawu terapije i prognozi daqeg toka oboqewa parodoncijuma. Leèewe parodontopatija je znaèajno i u prevenciji nekih sistemskih bolesti, posebno oboqewa kardiovaskularnog sistema. Pojedine
vrste parodontopatogenih mikroorganizama dovedene su u direktnu vezu s aterosklerozom, a wihovo prisustvo dokazano je u ateromatoznom plaku krvnih sudova. Za otkrivawe bakterija moguæe je koristiti tehniku PCR jer je ona, u odnosu na standardne mikrobiološke analize, veoma osetqiva, specifièna i brza.
ZAKQUČAK
Sa stanovišta primene rezultata PCR analize
oralne mikroflore u klinièkoj praksi, zubni plak
je najpouzdaniji pokazateq zastupqenosti pojedinih
bakterija u obolelom parodoncijumu. Ovaj metod se
može primeniti u epidemiološkim studijama, dijagnostikovawu, nadzoru i iskorewivawu parodontopatogenih mikroorganizama.
ZAHVALNICA
Ovaj rad finansiran je sredstvima projekta broj
1454042 Ministarstva za nauku i zaštitu životne
sredine Republike Srbije.
LITERATURA
1. Đajić D, Đukanović D, Stanić S, Kovačević K. Bolesti usta, parodontologija, atlas. Beograd: Elit Medica; 2001.
2. Samaranayake LP. Essential Microbiology for Dentistry. Philadelphia: Elsevier Ltd.; 2002.
3. Beikler T, Schnitzer S, Abdeen G, Ehmke B, Eisenacher M, Flemmig
TF. Sampling strategy for intraoral detection of periodontal pathogens before and following periodontal therapy. J Periodontol 2006;
77(8):1323-32.
4. Rudney JD, Chen R, Pan Y. Endpoint quantitative PCR assays for
Bacteroides forsythus, Porphyromonas gingivalis and Actinobacillus
actinomycetemcomitans. J Periodontal Res 2003; 38:465-70.
5. Gomes BP, Pinheiro ET, Gade-Neto CR, et al. Microbiological
examination of infected dental root canals. Oral Microbiol and
Immunol 2004; 19:71-6.
6. Jacinto RC, Gomes BP, Ferraz CC, Zaia AA, Filho FJ. Microbiological
analysis of infected root canals from symptomatic teeth with periapical periodontitis and the antimicrobial susceptibility of some
isolated anaerobic bacteria. Oral Microbiol and Immunol 2003;
18:285-92.
7. Takeuchi Y, Umeda M, Sakamoto M, Benno Y, Huang Y, Ishikawa I.
Treponema socranskii, Treponema denticola, and Porphyromonas
gingivalis are associated with severity of periodontal tissue destruction. J Periodontol 2001; 72(10):1354-63.
8. Siqueira JF Jr, Rocas IN. Bacteroides Forsythus in primary endodontic infections as detected by nested PCR. J Endod 2003; 29:390-3.
9. Okuda K, Ishihara K, Nakagawa T, Hirayama A, Inayama Y, Okuda
K. Detection of Treponema denticola in atherosclerotic lesion. J
Clin Microbiol 2001; 39:1114-7.
10. Peters S, Valdez M, Rivere R, Thomas DD. Adherence to and
penetration through endothelial cells by oral treponemes. Oral
Microbiol Immunol 1999; 14:379-3.
11. Jung IY, Choi BK, Kum KY, et al. Molecular epidemiology and association of putative pathogens in root canal infection. J Endod 2000;
26:599-4.
12. Foschi F, Cavrini F, Montebugnoli L, Stashenko P, Sambri V, Prati C.
Detection of bacteria in endodontic samples by Polymerase chain
reaction assays and association with defined clinical sings in Italian
patients. Oral Microbiol Immunol 2005(5); 20:289-95.
13. Mullally BH, Dace B, Shelburne CE, Wolff LF, Coulter WA. Prevalence of periodontal pathogens in localized and generalized forms
of early-onset periodontitis. J Periodontal Res 2000; 35(4):232-41.
14. Taylor-Robinson D, Aduse-Opoku J, Sayed P, Slaney J.M, Thomas
BJ, Curtis MA. Oro-dental bacteria in various atherosclerotic arteries. Eur J Clin Microbial Infec Dis 2002; 21:755-7.
15. Malheiros Vde J, Avila Campos MJ. Detection of pathogens from
periodontal lesions. Rev Saude Publica 2004; 38(5):723-8.
16. Ohnishi M. Quantitative analysis of periodontal pathogens in
aggressive periodontitis patients in Japanese population. Kokubyo
Gakkai Zasshi 2006; 73:70-8.
17. Feng XH, Zhang L, Meng HX, Xu L, Chen ZB, Shi D. Prevalence
of putative periodontal microorganisms in Chinese patients with
aggressive periodontitis. Zhonghua Kou Qiang YI Xue Za Zhi
2006(6); 41:344-7.
18. Okada M, Hayashi F, Nagasaka N. PCR detection of 5 putative periodontal pathogens in dental plaque samples from children 2 to 12
years of age. J Clin Periodontol 2001; 28:576-82.
479
SRPSKI ARHIV ZA CELOKUPNO LEKARSTVO
IDENTIFICATION OF PERIODONTOPATHOGEN MICROORGANISMS BY PCR TECHNIQUE
Radovan MILIĆEVIĆ1, Gavrilo BRAJOVIĆ2, Nataša NIKOLIĆ-JAKOBA3,
Branka POPOVIĆ4, Dušan PAVLICA5, Vojislav LEKOVIĆ3, Jelena MILAŠIN4
1Childrens’ Hospital, Clinical Centre of Niš, Niš;
of Physiology, School of Dentistry, University of Belgrade, Belgrade;
3Department of Periodontology and Oral Medicine, School of Dentistry, University of Belgrade, Belgrade;
4Department of Human Genetics, School of Dentistry, University of Belgrade, Belgrade;
5Department of Microbiology, School of Dentistry, University of Belgrade, Belgrade
2Department
INTRODUCTION Periodontitis is an inflammatory disease of the
supporting tissues of teeth and is a major cause of tooth loss in
adults. The onset and progression of periodontal disease is attributed to the presence of elevated levels of a consortium of
pathogenic bacteria. Gram negative bacteria, mainly strict anaerobes, play the major role.
OBJECTIVE The present study aimed to assess the presence of
the main types of microorganisms involved in the aetiopathogenesis of periodontal disease: Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Eikenella corrodens, Treponema denticola, Tanerella forsythia and Prevotella intermedia in different samples collected from the oral cavity of 90 patients diagnosed with periodontitis.
METHOD Bacterial DNA detection was performed in diverse biological materials, namely in dental plaque, gingival tissue and
saliva, by means of multiplex PCR, a technique that allows simultaneous identification of two different bacterial genomes.
RESULTS In the dental plaque of the periodontitis patients,
Treponema denticola dominated. In the gingival tissue, Tannerella forsythia and Treponema denticola were the microbiota most
* Rukopis je dostavqen Uredništvu 18. 7. 2007. godine.
480
frequently detected, whilst in saliva Treponema denticola and
Eikenella corrodens were found with the highest percentage.
CONCLUSION The identification of microorganisms by multiplex
PCR is specific and sensitive. Rapid and precise assessment of different types of periodontopathogens is extremely important for
early detection of the infection and consequently for the prevention and treatment of periodontal disease. In everyday clinical practice, for routine bacterial evaluation in patients with periodontal disease, the dental plaque is the most suitable biological
material, because it is the richest in periodontal bacteria.
Key words: dental plaque; saliva; periodontal tissue; periodontopathogens; PCR
Jelena MILAŠIN
Stomatološki fakultet
Univerzitet u Beogradu
Dr Subotića 8, 11000 Beograd
Tel.: 011 2644 943
E-mail: [email protected]