遗 传 学 报 ２
４　（
３
）　：　２
７
８－　２
８１
，　１
９
９
７
Ａｃｔ
ａ　Ｇｅ
ｎ　ｅｄｃａ　Ｓｉ
ｎ　ｉ
ｃａ
王百合单条染色体和染色体片段的分离
胡赞民 崔丽华 王兰岚 李良才 陈正华
（
中国科学院遗传研究所 北京
摘要
１
０
０１
０１
）
本研究利用显微操作器建立了简单、有效地分离王百合单条染色体和染色体片段
并将其放入Ｅ
ｐｐ
ｅ
ｎ
ｄ
ｏ
ｒ
ｆ
管中的方法。与前人方法相比，主要改进之处在于：（
１
）制片简单。不
需要对盖片硅化处理，压片在载片和盖片之间进行。（
２
）所需设备简单。 不需要倒置显微
镜，
不需要拉针仪，微细玻璃针可在酒精灯微火上拉制。（
３
）操作简单，效率高。在标本上加
一滴无菌水即可将染色体挑出。 在 ２ｈ之内，用微细玻璃针可挑出 ６
－１
０条王百合染色体。
关键词
王百合，染色体微切割，染色体分离
分离单个染色体及染色体片段对基因组结构的研究、基因的分离及物理图谱的构建
等方面具有重大意义。 目前分离染色体的方法 主要有两种，即流式细胞计法和显微操作
法。这两种方法用于人类及动物染色体分离已较为成熟［
［
２
，　３
，　５
，　６
，
川。然而在植物染色体分
离方面，方法尚不够成熟，仍需进一步探索。利用显微操作分离植物染色体并进行 ＤＮＡ
克隆始于Ｓ
ａ
ｎ
ｄ
ｅ
ｒ
ｙ等［
１
８
１
的工作，迄今只有几篇类似报道［
４
，
９
］
。究其原因主要是分离的染色
体难以用于体外 ＤＮＡ克隆的操作，而是在显微镜下很小体积反应液（
１
－２
ｎ
１
）中提取染色
体ＤＮＡ、酶切、连接等，因此难以广泛应用。最近Ａｌ
ｂ
ａ
ｎ
ｉ
等［
［
＇
１
，　Ｐ
ｉ
ｃ
ｈ等［
［
７
］
创立了将植物
染色体放人 Ｅ
ｐ
ｐ
ｅ
ｎ
ｄ
ｏ
ｒ
ｆ管中并进行Ｐ
ＣＲ扩增反应的方法，这在植物染色体微切割和微克
隆研究方面是一个突破。然而前人均采用气干的或用石蜡油覆盖的染色标本在倒置显微
镜下挑取染色体 ，这种方法受实验室设备 的限制，而且重复性差、难 以掌握。下面介绍
我们实验室经反复实验，在前人工作基础上改进的一种简单、快速分离单个植物染色体
和染 色体片段 的技术。
１ 材料和方法
１
．
１ 实验材料
实验材料选用王百合（
Ｌｉ
ｈ
ｕｍ　ｒ
ｅ
ｇａｌ
ｅ　Ｗｉ
ｌ
ｓ
ｏ
ｎ）
，取自中国科学院植物所植物园。王百
合染色体为大型染色体，２
ｎ
＝２
４４
１．
２ 实验方法
１．
２．１ 染色体标本制备
取百合种子，２５℃下萌发。待约 １
０天后长出 １
－２ｃ
ｍ根时，
用 ０．
０１
７
％ 的秋水仙素处理 ２３ｈ，卡诺 固定液 （
９５％ 乙醇 ３：冰乙酸 １
）固定 １
０ｒ
ｎｉ
ｎ后转人
７０％ 乙醇中 ４℃保存待用。取根于 ２％ 果胶酶与 ２％ 纤维素酶 １：１比率的混合液中 ３　７１
Ｃ
酶解 ３
ｈ，蒸馏水洗净后取根尖分生组织少许，卡宝品红染色、压片。镜检后于液氮中速
本文于 １
９９６－０３
－２２收到，１
９９６－０５－２９修 回
３期
胡赞 民等 ：王百合单条染 色体和染 色体 片段 的分离
２７９
冻，用刀片揭掉盖片。将含有材料的载片放人 ７０％乙醇中脱水 ５
ｍｉ
ｎ，气干后用于显微操
作。
１．
２．
２ 染色体 的切割
用 自制的直径 １　－２ｍｍ 的玻棒，在 Ｌｅ
ｉ
ｔ
ｚ拉针仪上或酒精灯微
火上拉制尖端直径 １
－３
ｐｍ的微细玻璃针，并将其下弯约 １
２
００（
指针尖与操纵杆之间的角
度）。
在 Ｌｅ
ｉ
ｔ
ｚ显微操作器 （
Ｃｏ
ｄｅ
－
Ｎｏ．　９　３　３１
１
４）帮助下，于 Ｌｅ
ｉ
ｔ
ｚ　Ｌａ
ｂ
ｏ
ｒ
ｌ
ｕ
ｘ　２显微镜下 ｌ　０
Ｘ
目镜 Ｘ　ｌ
ｏｘ物镜明视野 内前后移动玻璃针尖切割百合染色体。
１．
２．
３ 染 色体和染 色体片段 的分离
在含有染色体和染色体片段 的载片上滴加一小
滴无菌水，用上述微细玻璃针轻轻触动染色体和染色体片段。待染色体和染色体片段脱
离载片后使其吸附在玻璃针尖上，轻轻移动玻璃针尖 出液面。将玻璃针尖折断并将其及
其上的染色体一起放人 ０．
５
ｍｌ的含有蛋白酶 Ｋ反应液的 Ｅｐｐ
ｅ
ｎ
ｄ
ｏ
ｒ
ｆ管中，４℃保存备用。
２ 结果与讨论
按照上述程序可成功地在 ２
ｈ之内将 ６
－１
０条染色体或染色体片段放人 Ｅｐ
ｐ
ｅ
ｎ
ｄｏ
ｒ
ｆ管
中，其过程如 图版 １
－１
－６所示 。在玻璃针初出液 面时，有时染 色体 会脱落，为了证明染
色体未脱落可重新将玻璃针尖浸人无菌水 中，在显微镜下仍可观察到染色体吸附在玻璃
针尖上。为了减少水滴的表面张力 ，可在水滴 中加一滴无水 乙醇，这样染色体的丢失率
将会 降低。
上述分离染色体的方法与以往 的方法相 比有 以下两点不同之处 。（
１）制片简单。在以
往的方法中，制片前需要对盖片硅化处理，压片在两个盖片间进行［
［
１
，　ｌ
ｏ
］
。这无疑增加了
压片的难度 。本程序压片仍在载片和盖片间进行，与染色体常规压法无区别。（
２）
气干后
的标本只适用于染色体切割，而挑取染色体或染色体片段在仅加无菌水的条件下即可进
行。前人的工作在挑取染色体时常以气干后的标本进行｛
［
１
｝
或将气干后的标本浸在石蜡油
中进行［
［
ｉ
ｏ
ｎ
。以气干的标本挑取染色体时，由于染色体与玻片间的粘附力太大常常挑不
动，或只能将染色体弄断挑取染色体一部分， 比较费时，费力。从覆盖石蜡油的标本 中
取出染色体还需要用氯仿和乙醇去掉石蜡油〔
ｉ
ｏ
ｎ
０
按照上述程序进行 显微操作时需注意 以下几点： （
１）固定 时间不能太长。 ＿
ｒ诺 固定
液对 ＤＮＡ具有一定的破坏作用，时间太长不利于染色体 ＤＮＡ的扩增和克隆，卡诺固定
液固定 ｌ
ｈ之内，染色体挑出后仍可作为底物扩增出ＤＮＡ［
１
１　ｏ　（
２
）
乙醇脱水后的标木适于
染色体切割，不适于挑取整条染色体。在具有无菌水的条件下，微细玻璃针尖端具有粘
附力，可把染色体粘附在针尖上。（
３
）
在液滴中挑取染色体的时间不能太长 （
不能超过
２０ｍｉ
ｎ）。细胞与染色体吸水时间长了，与玻片间的粘附力减弱，常常把细胞、细胞 团或
儿个染色体 一起挑在针尖上。（
４）细胞压得越薄越好，最好能将染色体压出细胞质。如果
太厚 ，易把整个细胞或细胞 的一部分挑起 ，或挑不 动染色体。 （
５）染色体应分散 良好，
否则易把 ２条 以上染色体挑起 。（
６）玻璃针尖不能太细 （
尖端直径不小于染色体直径）。如
果针尖太细 ，挑不动染色体 ，而且染色体也不易吸附在针尖上。
本程序简单易行 ，不需倒置显微镜 ，不需拉针仪 ，仅在明视野 ｌ
ｏｘ物镜下用手工拉
制的玻璃针即可完成挑取染色体和染色体片段的工作。利用本程序可直接挑出王百合染
色体中容易辨认的 Ａ（
最大，中部着色粒染色体）
、Ｂ（
长度仅次于 Ａ染色体，近中部着丝
粒染色体）及 Ｊ（
最小 ，端部着丝粒染色体）对染色体。对于其他染色体可先挑 出来，然后
２
８
０
遗
传
学
报
２
４卷
通过核型分析确定其属于哪一条染色体。然而本程序只适挑取较大染色体，因为上述操
作条件不能使用更高放大倍数的物镜镜头。利用此方法建立单个染色体和染色体片段文
库 的工作正在进行 中。
致谢 本研究得到德 国洪堡基金会的支持。感谢李．
＃学先生在制片技术上的指导。感谢
张金政先生提供 王百合种子
参
考
文
献
１
Ａｌ
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２３一１３１
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９，　３３８：　３４８３５０
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．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｔ
．
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９９３，　１
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０１
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１９
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４
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７
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ｎｉ
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ａ
ｔ
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ｒ
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ｔ
ｅ
ｒ
ｉ
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ｉ
ｃ
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ｏｌ
ｌ
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ｓ
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ｓ
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ｔ
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ｉ
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ｙ．　Ｃｈｒ
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ｌ
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，　ｎｏｔ　ｗｉ
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ｏｎ，　Ｃｈｒ
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ｓ
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ｉ
ｏｎ
３期
胡赞民等 ：
王百合单条染色体和染色体片段的分离
图
版
说
２８１
明
１
－６，
利用显微操作器分离单条王百合染色体及染色体片段的过程。（
１）挑取染色体之前根尖有丝分
裂细胞中期染色体 （
２
４条）
，（ｘ３５
６）
．　（
２
）　１中箭头所指染色体被挑出后的中期染色体，（　Ｘ　３
５
６）
．　（
３）
一条染色体被切割成 ３段的中期染色体分裂相，（　ｘ　３
６９
）．　（
４）　３中箭头所指染色体片段被挑出之后中期
染色体分裂相，（　ｘ　３
６
９）
．　（
５）
在无菌水中将一条染色体吸附在玻璃针上，（　Ｘ　２１
４）
．　（
６）
将染色体挑出液
面后染色体仍粘附在玻璃针上，（　ｘ　２１
４）
Ｅｘｐｌ
ａ
ｎａ
ｔ
ｉ
ｏｎ　ｏｆ　Ｐｌ
ａ
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１
－６
．　Ｔｈ
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ｔ　ｉ
ｎ
ｄ
ｉ
ｃ
ａ
ｔ
ｅ
ｄ　ｂ
ｙ　ｔ
ｈ
ｅ　ａ
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ｒ
ｏ
ｗｈ
ｅ
ａ
ｄ　ｉ
ｎ　３
ｗａ
ｓ　ｅｍｏ
ｒ
ｖ
ｅ
ｄ（ｘ　３
６
９
）。 （
５
）　Ａ　ｃ
ｈ
ｒ
ｏ
ｍｏ
ｓ
ｏ
ｍｅ　ｗａ
ｓ　ａ
ｄ
ｈ
ｅ
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ｄ　ｔ
ｏ　ｔ
ｈ
ｅ　ｇ
ｌ
ａ
ｓ
ｓ　ｎ
ｅ
ｅ
ｄ
ｌ
ｅ　ｉ
ｎ　ａｄ
ｉ
ｓ
ｔ
ｉ
ｌ
ｌ
ｅ
ｄ　ｗａ
ｔ
ｅ
ｒ　ｄ
ｒ
ｏ
ｐ
（ｘ　２１
４）
．　（
６）　Ｔｈ
ｅ　ｃ
ｈｒ
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ｍｏｓ
ｏｍｅ　ｉ
ｎ　５　ｗａ
ｓ　ｓ
ｔ
ｉ
ｌ
ｌ　ａ
ｄｈ
ｅｒ
ｅ
ｄ　ｏｎ　ｔ
ｈｅ　ｇｌ
ａ
ｓ
ｓ　ｎ
ｅｅ
ｄｌ
ｅ　ａｆ
ｔ
ｅｒ　ｔ
ｈｅ　ｎｅ
ｅｄｌ
ｅ　ｗａ
ｓ　ｔ
ａｋｅ
ｎ　ｏｕｔ
ｏｆ　ｔ
ｈｅ　ｄｉ
ｓ
ｔ
ｉ
ｌ
ｌ
ｅ
ｄ　ｗａ
ｔ
ｅ
ｒ　ｄｒ
ｏｐ（ｘ　２１
４）
胡赞民等：
王百合单条染色体和染色体片段的分离
ＨＵ　Ｚａｎｍｉ
ｎ　ｅｔａｌ
：　Ｉ
ｓ
ｏｌ
ａｔ
ｉ
ｏｎ　ｏｆ　Ｓｉ
ｎｇｌ
ｅ　Ｃｈｒ
ｏｍｏｓ
ｏｍｅｓ　ａｎｄ　Ｃｈｒ
ｏｍｏｓｏｍａｌ　Ｆｒ
ａｑｍｅｎｔ
ｓ　ｏｆ　Ｌｉ
ｌ
ｉ
ｕｍ　ｒ
ｅｇａｌ
ｅ
图版 Ｉ
Ｐｌ
ａｔ
ｅ　Ｉ