Articles in PresS. Am J Physiol Cell Physiol (September 14, 2005). doi:10.1152/ajpcell.00364.2005
1
Ch a n g e s i n i n t r a c e l l u l a r e l e c t r o l y t e c o n c e n t r a t i o n s du r i n g a p o p t o s i s i n du c e d by U V
i r r a di a t i o n o f h u m a n m y e l o bl a s t i c (U 937) c e l l s .
F
A r r e bo l a
1,2
W a r l e y 1.
1
, E
E le c tr o n
F e r n a n de z -S e g u r a 2, A
M ic r o s c o p y
Ca m p o s 2, P V
Cr e s p o 2, J N
S k e p p e r 3, A
U n i t , KCL D e p a r t m e n t o f O p h t h a l m o l o g y , Th e R a y n e
I n s t i t u t e , S t . Th o m a s ’ H o s p i t a l , Lo n do n S E 1 7E H .
2
D e p a r t m e n t o f H i s t o l o g y , S c h o o l o f M e di c i n e , U n i v e r s i t y o f G r a n a da , G r a n a da ,
S p a in .
3
M u l t i -i m a g i n g Ce n t r e , U n i v e r s i t y o f Ca m br i dg e , D e p a r t m e n t o f A n a t o m y , Te n n i s
Co u r t R o a d, Ca m br i dg e CB 2 3D Y .
R u n n i n g H e a d: S u bc e l l u l a r e l e m e n t c o n c e n t r a t i o n s du r i n g a p o p t o s i s .
Ke y w o r ds : s o di u m , p o t a s s i u m , c h l o r i de , c e l l s h r i n k a g e .
A ddr e s s fo r c o r r e s p o n de n c e :
D r A W a r le y
CU I Ki n g ’ s Co l l e g e Lo n do n
N e w H u n t’s H o u se
G u y ’ s Ca m p u s
Lo n do n S E 1 1U L
E m a i l : a l i c e .w a r l e y @ k c l .a c .u k
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2
A B S TR A CT
D e c r e a s e s i n t h e i n t r a c e l l u l a r c o n c e n t r a t i o n s o f bo t h K+ a n d Cl - h a v e be e n i m p l i c a t e d
i n p l a y i n g a m a j o r r o l e i n t h e p r o g r e s s i o n o f a p o p t o s i s , bu t l i t t l e i s k n o w n a bo u t t h e
t e m p o r a l r e l a t i o n s h i p be t w e e n de c r e a s e s i n e l e c t r o l y t e c o n c e n t r a t i o n a n d t h e k e y
e v e n t s i n a p o p t o s i s a n d t h e r e i s n o i n fo r m a t i o n a bo u t h o w s u c h de c r e a s e s a ffe c t
di ffe r e n t i n t r a c e l l u l a r c o m p a r t m e n t s . E l e c t r o n p r o be X-r a y m i c r o a n a l y s i s w a s u s e d t o
de t e r m i n e c h a n g e s i n e l e m e n t c o n c e n t r a t i o n s (N a , P , Cl a n d K) i n n u c l e u s , c y t o p l a s m ,
a n d m i t o c h o n dr i a i n U 937 c e l l s u n de r g o i n g U V -i n du c e d a p o p t o s i s . I n a l l
c o m p a r t m e n t s t h e i n i t i a l s t a g e s o f a p o p t o s i s w e r e c h a r a c t e r i s e d by de c r e a s e s i n [ K]
a n d [ Cl ] . Th e l a r g e s t de c r e a s e s i n t h e s e e l e m e n t s w e r e i n t h e m i t o c h o n dr i a a n d
o c c u r r e d be fo r e t h e r e l e a s e o f c y t o c h r o m e c . I n i t i a l de c r e a s e s i n [ K] a n d [ Cl ] a l s o
p r e c e de d a p o p t o t i c c h a n g e s i n t h e n u c l e u s . I n t h e l a t e r s t a g e s o f a p o p t o s i s t h e [ K]
c o n t i n u e d t o de c r e a s e w h e r e a s t h a t o f Cl be g a n t o i n c r e a s e t o w a r ds c o n t r o l l e v e l s a n d
w a s a c c o m p a n i e d by a n i n c r e a s e i n [ N a ] . I n t h e n u c l e u s t h e s e i n c r e a s e s c o i n c i de d
w i t h p o l y (A D P -r i bo s e ) p o l y m e r a s e c l e a v a g e , c h r o m a t i n c o n de n s a t i o n , a n d D N A
l a dde r i n g . Th e c y t o p l a s m w a s t h e c o m p a r t m e n t l e a s t a ffe c t e d, t h e p a t t e r n o f c h a n g e o f
Cl w a s s i m i l a r t o t h o s e i n o t h e r c o m p a r t m e n t s bu t t h e de c r e a s e i n [ K] w a s n o t
s i g n i fi c a n t u n t i l a ft e r a c t i v e c a s p a s e -3 w a s de t e c t e d. O u r r e s u l t s s u p p o r t t h e c o n c e p t
t h a t n o r m o t o n i c c e l l s h r i n k a g e o c c u r s e a r l y i n a p o p t o s i s , a n d de m o n s t r a t e t h a t
c h a n g e s i n t h e i n t r a c e l l u l a r c o n c e n t r a t i o n s o f K a n d Cl p r e c e de a p o p t o t i c c h a n g e s i n
t h e c e l l c o m p a r t m e n t s s t u di e d.
3
I N TR O D U CTI O N
A p o p t o s i s p l a y s a k e y r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f c e l l n u m be r s a n d i s i m p o r t a n t i n
de v e l o p m e n t , i n r e m o de l l i n g a n d i n i m m u n o l o g i c a l p r o c e s s e s . A p o p t o s i s w a s
o r i g i n a l l y c h a r a c t e r i z e d m o r p h o l o g i c a l l y by c h a n g e s t h a t t a k e p l a c e w i t h i n t h e dy i n g
c e l l s ; t h e s e i n c l u de bl e bbi n g o f c e l l m e m br a n e , c e l l s h r i n k a g e , c o n de n s a t i o n a n d
fr a g m e n t a t i o n o f c h r o m a t i n , a n d fo r m a t i o n o f m e m br a n e -bo u n d a p o p t o t i c bo di e s .
Th e s e m o r p h o l o g i c a l a l t e r a t i o n s a r e a c c o m p a n i e d by i n t e r n u c l e o s o m a l c l e a v a g e o f
g e n o m i c D N A (49) du e t o t h e a c t i v a t i o n o f c y t o p l a s m i c p r o t e o l y t i c e n z y m e s , t h e
c a s p a s e s (53).
S e v e r a l l i n e s o f e v i de n c e h a v e s u g g e s t e d t h a t a l t e r a t i o n s i n t h e t r a n s m e m br a n e
g r a di e n t s o f K+ p l a y a m a j o r r o l e i n a p o p t o s i s (31, 52). R e du c t i o n o f t h e K+
e l e c t r o c h e m i c a l g r a di e n t by i n c r e a s i n g e x t r a c e l l u l a r K+ i n h i bi t s a p o p t o s i s i n du c e d by
di ffe r e n t a p o p t o t i c i n du c e r s (5, 7, 38). A l s o p h a r m a c o l o g i c a l bl o c k a de o f K+ c h a n n e l s
by 4-a m i n o p y r i di n e (4-A P ), t e t r a e t h y l a m m o n i u m (TE A ), B a
, q u i n i n e o r c l o fi l i u m ,
2+
p r e v e n t s c e l l de a t h i n du c e d by di ffe r e n t s t i m u l i i n s e v e r a l c e l l u l a r s y s t e m s (19, 41, 42,
47). Th e e ffl u x o f K+ a n d t h e c o n c o m i t a n t de c r e a s e o f i n t r a c e l l u l a r K+ a c t i v a t e k e y
e v e n t s i n t h e a p o p t o s i s c a s c a de s u c h a s c a s p a s e c l e a v a g e (14, 33, 38), c y t o c h r o m e c -
de p e n de n t fo r m a t i o n o f t h e a p o p t o s o m e (6) a n d a c t i v a t i o n o f e n do n u c l e a s e s (14).
Th e de m o n s t r a t i o n t h a t l o s s o f c e l l v o l u m e , t e r m e d a p o p t o t i c v o l u m e de c r e a s e (A V D )
i s c o u p l e d t o r e g u l a t e d v o l u m e de c r e a s e (R V D ) fa c i l i t a t i o n s u g g e s t e d t h e p a r t i c i p a t i o n
o f o t h e r m o n o v a l e n t i o n s s u c h a s Cl - i n p r o m o t i n g a p o p t o t i c e v e n t s l e a di n g t o c e l l
de a t h (19, 24). I n t h i s c o n t e x t , s o m e s t u di e s de m o n s t r a t e d a n a c t i v a t i o n o f v o l u m e -
s e n s i t i v e o u t w a r dl y r e c t i fy i n g Cl - c u r r e n t s i n r e c e p t o r - a n d m i t o c h o n dr i o n -m e di a t e d
a p o p t o s i s i n di ffe r e n t c e l l l i n e s (37, 22, 34). Th e Cl - c h a n n e l bl o c k e r s 4,4di s o t h i o c y a n a t e o s t i l be n e -2,2’ –di s u l fo n i c a c i d (D I D S ), 4-a c e t a m i do -4’ -
i s o t h i o c y a n a t o s t i l be n e -2,2’ -di s u l fo n i c a c i d (S I TS ) a n d 5-n i t r o -2-(3-
p h e n y l p r o p y l a m i n o )-be n z o i c a c i d (N P P B ) i n h i bi t e d Cl - c u r r e n t a n d i n du c e d a
s i g n i fi c a n t de l a y o r i n h i bi t i o n o f s o m e a p o p t o t i c e v e n t s s u c h a s a p o p t o t i c v o l u m e
de c r e a s e , c y t o c h r o m e c r e l e a s e , c a s p a s e -3 a c t i v a t i o n a n d D N A fr a g m e n t a t i o n (19, 47,
30, 29). Ta k e n t o g e t h e r , t h e s e s t u di e s s u g g e s t e d t h a t a l t e r a t i o n s i n t h e t r a n s m e m br a n e
4
g r a di e n t s a n d i n t r a c e l l u l a r c o n c e n t r a t i o n s o f t h e p h y s i o l o g i c a l l y i m p o r t a n t i o n s , K+
a n d Cl -, p l a y a p i v o t a l r o l e i n t h e r e g u l a t i o n , p r o g r e s s i o n a n d e x e c u t i o n o f a p o p t o s i s .
H o w e v e r , t h e m a j o r i t y o f p a p e r s t o da t e h a s fo c u s e d o n t h e s t u dy o f t h e r o l e o f a
s i n g l e i o n i n a p o p t o s i s , a n d do n o t g i v e i n fo r m a t i o n o n t h e s i m u l t a n e o u s
c o m p a r t m e n t a t i o n o f di ffe r e n t i o n s w i t h i n i n di v i du a l c e l l s . I n a ddi t i o n , t h e r e i s n o
c l e a r de fi n i t i o n o f t h e t e m p o r a l r e l a t i o n s h i p be t w e e n c h a n g e s i n t o t a l e l e c t r o l y t e
c o m p o s i t i o n , m a i n l y K+, Cl - a n d N a
+
a t c e llu la r le v e l w ith k e y e v e n ts o fa p o p to s is
s u c h a s c y t o c h r o m e c r e l e a s e , c a s p a s e -3 a c t i v a t i o n , c h r o m a t i n c o n de n s a t i o n a n d D N A
fr a g m e n t a t i o n . I n o u r o p i n i o n , t h i s i s fu n da m e n t a l l y a m e t h o do l o g i c a l p r o bl e m
be c a u s e t h e t e c h n i q u e s u s e d ba s e d o n t h e u s e o f fl u o r e s c e n t dy e s a r e n o t a bl e t o
r e s o lv e th is is s u e .
E l e c t r o n p r o be X-r a y m i c r o a n a l y s i s (E P XM A ) i s a q u a n t i t a t i v e t e c h n i q u e ba s e d o n
a n a l y s i s o f t h e e l e m e n t -s p e c i fi c X-r a y s g e n e r a t e d i n a s p e c i m e n by t h e e l e c t r o n be a m
i n a n e l e c t r o n m i c r o s c o p e a n d i s a t e c h n i q u e c o m p l e m e n t a r y t o fl u o r e s c e n t i o n -
bi n di n g dy e s (1) bu t w h i c h g i v e s a ddi t i o n a l i n fo r m a t i o n . E P XM A a l l o w s a n a l y s i s o f
m o r e t h a n o n e e l e m e n t a t t h e s a m e t i m e i n i n di v i du a l c e l l s a n d, w h e n c r y o s e c t i o n e d
m a t e r i a l i s a n a l y s e d, i t i s p o s s i bl e t o r e c o g n i z e a n d a n a l y z e t h e e l e c t r o l y t e
c o n c e n t r a t i o n i n s i n g l e , s p e c i fi c s u bc e l l u l a r c o m p a r t m e n t s , i .e . t h e n u c l e u s , c y t o p l a s m
a n d m i t o c h o n dr i a (45). H o w e v e r , t h e r e a r e fe w w o r k s t h a t h a v e u s e d t h i s t e c h n i q u e t o
a n a l y z e c h a n g e s i n t h e e l e m e n t a l c o m p o s i t i o n i n a p o p t o t o i c c e l l de a t h (35, 10, 32). I n
a ddi t i o n , E P XM A h a s n o t be e n u s e d t o da t e t o de t e r m i n e t h e c h a n g e s i n e l e c t r o l y t e
c o n c e n t r a t i o n i n s u bc e l l u l a r c o m p a r t m e n t s du r i n g a p o p t o s i s .
Th e s t u dy o f i n t r a c e l l u l a r c o m p a r t m e n t s i s e s p e c i a l l y i m p o r t a n t fo r m i t o c h o n dr i a a s
t h e y a r e t h o u g h t t o p l a y a p i v o t a l r o l e i n i n i t i a t i n g t h e e x e c u t i o n p h a s e . Th e
i n t e r m e m br a n e s p a c e o f m i t o c h o n dr i a c o n t a i n s v a r i o u s a p o p t o g e n i c p r o t e i n s i n c l u di n g
c y t o c h r o m e c , a p o p t o s i s -i n du c t o r fa c t o r (A I F ), a n d S m a c / D I A B LO , t h e r e l e a s e o f
w h i c h i s a c e n t r a l , c o o r di n a t i n g s t e p i n m a n y a p o p t o t i c p a t h w a y s (21). I n p a r t i c u l a r ,
t h e r e l e a s e t h e c y t o c h r o m e c fa c i l i t a t e s t h e fo r m a t i o n o f a p o p t o s o m e t h a t r e s u l t s i n t h e
a c t i v a t i o n o f e ffe c t o r c a s p a s e s (c a s p a s e -3, -6, a n d -7) (18). H o w e v e r , t h e m e c h a n i s m
o f c y t o c h r o m e c r e l e a s e i s n o t y e t c l e a r l y u n de r s t o o d, s u g g e s t i n g t h a t v a r i o u s di ffe r e n t
m e c h a n i s m s m a y be i n v o l v e d (17). S e v e r a l s t u di e s s u g g e s t i n i t i a l s w e l l i n g o f t h e
5
m i t o c h o n dr i a a n d s u bs e q u e n t m e c h a n i c a l r u p t u r e o f t h e o u t e r m i t o c h o n dr i a l
m e m br a n e w i t h r e l e a s e o f p r o t e i n s . I n c o n t r a s t , o t h e r s t u di e s r e p o r t e d p e r m e a bi l i t y
t r a n s i t i o n (P T)-r e l a t e d c h a n g e s i n t h e m i t o c h o n dr i a l m e m br a n e p o t e n t i a l (∆ψm) t h a t
i n du c e m i t o c h o n dr i a l s w e l l i n g (13, 11, 39). E v i de n c e t h a t a l t e r a t i o n s i n m i t o c h o n dr i a l
i o n h o m e o s t a s i s m i g h t u n de r l i e t h e r e l e a s e o f c y t o c h r o m e c i s p r o v i de d by a c t i o n s o f
t h e bc l -2 fa m i l y o f p r o t e i n s . Th e a n t i a p o p t o t i c p r o t e i n bc l -2 i s k n o w n t o p r e v e n t
r e l e a s e o f c y t o c h r o m e c fr o m t h e m i t o c h o n dr i a (15). R e c e n t l y , s t u di e s o n
m i t o c h o n dr i a i s o l a t e d fr o m H L-60 c e l l s u n de r g o i n g e t o p o s i de i n du c e d a p o p t o s i s
s h o w e d t h a t bc l -2 u p r e g u l a t e d m i t o c h o n dr i a l p o t a s s i u m
e ffl u x v i a t h e K+/ H
+
e x c h a n g e r a n a c t i o n t h a t w o u l d s t a bi l i s e v o l u m e u n de r c o n di t i o n s o f K+ u p t a k e ,
w h e r e a s t B i d w h i c h i s p r o -a p o p t o t i c s t i m u l a t e d K+ u p t a k e i n t o t h e m i t o c h o n dr i a a n d
s u bs e q u e n t c y t o c h r o m e c r e l e a s e (9). D e s p i t e t h e i n s i de -n e g a t i v e ∆ψm r e p r e s e n t i n g t h e
m a j o r fo r c e dr i v i n g fo r m i t o c h o n dr i a l i o n a c c u m u l a t i o n , a n d v o l u m e h o m e o s t a s i s
be i n g de p e n de n t o n t i g h t l y r e g u l a t e d i o n fl u x e s (4), t o t h i s da t e t h e r e i s n o i n fo r m a t i o n
a bo u t e l e c t r o l y t e c o n c e n t r a t i o n s i n m i t o c h o n dr i a du r i n g a p o p t o s i s .
F o r t h i s r e a s o n w e u s e d E P XM A t o i n v e s t i g a t e t h e a l t e r a t i o n s i n e l e c t r o l y t e
c o n c e n t r a t i o n s a t c e l l u l a r a n d s u bc e l l u l a r l e v e l s , i .e . i n s e c t i o n s o f U 937 c e l l s a n d i n
m i t o c h o n dr i a n u c l e u s , a n d c y t o p l a s m , du r i n g a p o p t o t i c c e l l de a t h i n du c e d by
u l t r a v i o l e t (U V ) i r r a di a t i o n . U V -i r r a di a t i o n i s i de a l fo r t h e p u r p o s e o f t h i s s t u dy
be c a u s e i t i n du c e s a p o p t o s i s r a p i dl y i n e s s e n t i a l t h e e n t i r e c e l l p o p u l a t i o n (> 90% )
t h u s m i n i m i s i n g t h e v a r i a bi l i t y i n t h e c e l l s s t u di e d. A ddi t i o n a l l y , w e e x a m i n e d t h e
r e l a t i o n s h i p be t w e e n t h e t i m e s e q u e n c e o f e l e c t r o l y t e c h a n g e s a t c e l l u l a r a n d
s u bc e l l u l a r l e v e l s w i t h t h e c h a r a c t e r i s t i c e v e n t s o f a p o p t o s i s a s c y t o c h r o m e c r e l e a s e ,
c a s p a s e -3 a c t i v a t i o n , c h r o m a t i n c o n de n s a t i o n a n d D N A fr a g m e n t a t i o n .
M A TE R I A LS A N D M E TH O D S
Reagents and antibodies.
R P M I 1640 m e di u m , fo e t a l bo v i n e s e r u m (F B S ), bo v i n e s e r u m a l bu m i n (B S A ) L-
g l u t a m i n e , H o e c h s t 33342, p h o s p h a t e bu ffe r e d s a l i n e (P B S ), p i p e r a z i n e -N , N -bi s [ 2-
e t h a n e s u l p h o n i c a c i d ] (P I P E S ), Tr i s -H Cl , e t h y l di a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d (E D TA ),
Tr i t o n X-100, R N a s e , p r o t e i n a s e K, a g a r o s e , e t h i di u m br o m i de a n d p r o p i di u m
i o di de
6
(P I ), w e r e o bt a i n e d fr o m S i g m a (P o o l e D o r s e t , U K). M o n o c l o n a l a n t i bo dy fo r t h e
l a r g e fr a g m e n t (17/ 19 k D a ) o f a c t i v a t e d c a s p a s e -3 r e s u l t i n g fr o m c l e a v a g e a dj a c e n t t o
A s p 175 (Ce l l S i g n a l i n g Te c h n o l o g y , B e v e r l y , M A ) w a s u s e d t o de t e c t a c t i v e
c a s p a s e -3, t h e s e c o n da r y a n t i bo dy w a s a bi o t i n y l a t e d a n t i -r a bbi t I g G (M a s t e r
D i a g n o s t i c , G r a n a da , S p a i n ). A m o n o c l o n a l a n t i bo dy fo r t h e l a r g e fr a g m e n t (89 k D a )
o f h u m a n P A R P (p o l y (A D P -r i bo s e ) p o l y m e r a s e ) p r o du c e d by c a s p a s e c l e a v a g e
a dj a c e n t t o A s p 214 (Ce l l S i g n a l l i n g Te c h n o l o g y , B e v e r l y , M A ) w a s u s e d t o de t e c t
P A R P c l e a v a g e , t h e s e c o n da r y a n t i bo dy w a s a bi o t i n y l a t e d a n t i -r a bbi t I g G (M a s t e r
D i a g n o s t i c ). F o r t h e de t e c t i o n o f c y t o c h r o m e c a n d a c t i v e c a s p a s e -3 u s i n g c o n fo c a l
m i c r o s c o p y a m o n o c l o n a l a n t i bo dy w h i c h r e c o g n i z e d r e s i de 62 o f c y t o c h r o m e c
(P h a r M i n g e n ) w a s u s e d w i t h A LE XA 488-l a be l l e d g o a t a n t i -m o u s e a n t i bo dy
(I n v i t r o g e n Lt d., P a i s l e y , U K) a s t h e s e c o n da r y a n t i bo dy . A c t i v e c a s p a s e -3 w a s
l a be l l e d w i t h a r a bbi t p o l y c l o n a l a n t i bo dy (P r o m e g a , S o u t h a m p t o n , U K) a n d
v i s u a l i s e d w i t h g o a t a n t i -r a bbi t s e c o n da r y a n t i bo dy c o n j u g a t e d t o A LE XA -568
(I n v i t r o g e n Lt d.).
C el l l ine and cu l tu r e conditions.
Th e h u m a n m o n o bl a s t o i d c e l l l i n e U 937 o bt a i n e d fr o m E u r o p e a n Co l l e c t i o n o f Ce l l
Cu l t u r e (E CA CC, P o r t o n D o w n , U K) w a s u s e d t h r o u g h o u t t h i s s t u dy . U 937 c e l l s
w e r e g r o w n i n a n t i bi o t i c -fr e e R P M I 1640 m e di u m
a n d 2m M
s u p p l e m e n t e d w i t h 10%
(v / v ) F B S
L-g l u t a m i n e a n d m a i n t a i n e d i n a h u m i di fi e d i n c u ba t o r a t 37°C i n a n
a t m o s p h e r e o f 5%
CO
2
in a ir .
I ndu ction of ap op tosis.
A p o p t o s i s w a s i n du c e d i n U 937 c e l l s by e x p o s u r e t o U V B i r r a di a t i o n . Ce l l s (1x 106
c e l l s / m l ) w e r e s e e de d i n t o 75 c m
t o a do s e o f 72 J / c m
2
o f 302 n m
2
t i s s u e c u l t u r e fl a s k s , a n d e x p o s e d 2 c m
U V B fr o m a t r a n s i l l u m i n a t o r B TX 20-M
fr o m
be l o w
(U V I t e c ,
Ca m br i g e , E n g l a n d) fo r 10 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e . Ce l l s w e r e r e t u r n e d t o 37 °C a n d
s a m p l e s w e r e r e m o v e d a t a p p r o p r i a t e t i m e p e r i o ds .
7
A ssessm ent of ap op tosis.
Th e fl u o r e s c e n t dy e H o e c h s t 33342 w a s u s e d t o v i s u a l i s e t h e m o r p h o l o g i c a l fe a t u r e s
o f t h e n u c l e i . Ce l l s w e r e c o l l e c t e d a n d fi x e d i n 8%
bu ffe r e d fo r m a l de h y de fo r 30 m i n
a t r o o m t e m p e r a t u r e . A ft e r fi x a t i o n , c e l l s w e r e w a s h e d i n P B S (p H 7.4) a n d i n c u ba t e d
fo r 30 m i n a t 37 º C i n P B S c o n t a i n i n g H o e c h s t 33342 (5 µg / m l ). Ce l l s w e r e dr o p p e d
o n t o a N e u ba u e r c h a m be r a n d v i s u a l i s e d i n a Le i t z La bo r l u x 12 e p i fl u o r e s c e n c e
m i c r o s c o p e (Le i c a M i c r o s y s t e m s , M i l t o n Ke y n e s , U K) u s i n g a n e x c i t a t i o n
w a v e l e n g t h o f 355-425 n m a n d a l o n g p a s s fi l t e r o f 470 fo r e m i s s i o n . Th e c e l l s w e r e
e v a l u a t e d o n t h e ba s i s o f t h e i r n u c l e a r m o r p h o l o g y , n o t i n g t h e p r e s e n c e o f
h o m o g e n e o u s c h r o m a t i n , c o n de n s e d c h r o m a t i n a n d fr a g m e n t e d n u c l e i . F l u o r e s c e n c e
i m a g e s w e r e a c q u i r e d u s i n g a Le c i a D C100 di g i t a l c a m e r a (Le i c a M i c r o s y s t e m s ) a n d
p r o c e s s e d w i t h A do be P h o t o de l u x e (A do be S y s t e m s , S a n J o s e , CA ).
I n t e r n u c l e o s o m a l D N A c l e a v a g e w a s a n a l y z e d by e l e c t r o p h o r e s i s o n a g a r o s e g e l s .
Ce l l s w e r e w a s h e d t w i c e w i t h i c e -c o l d P B S a n d di g e s t e d fo r 15 m i n a t 4 º C w i t h l y s i s
bu ffe r c o n t a i n i n g 20 m M
Tr i s -H Cl (p H 7.5), 2 m M
E D TA a n d 0.4%
Tr i t o n X-100.
Ce l l l y s a t e s w e r e c e n t r i fu g e d a t 13,000 g fo r 15 m i n a n d i n c u ba t e d w i t h 100 µ g / m l
p r o t e i n a s e K a n d 60 µ g / m l R N a s e fo r 3 h o u r s a t 55 º C. D N A w a s e x t r a c t e d w i t h a n
e q u a l v o l u m e o f p h e n o l / c h o r o fo r m / i s o a m y l a l c o h o l (25: 24: 1) a n d p r e c i p i t a t e d w i t h
0.1 v o l u m e s o f 3M
s o di u m
a c e t a t e a n d 2 v o l u m e s a bs o l u t e e t h a n o l o v e r n i g h t a t -20
º C. Th e s a m p l e s w e r e c e n t r i fu g e d a t 13,000 g fo r 15 m i n a n d D N A p e l l e t s w e r e dr i e d,
di s s o l v e d i n di s t i l l e d w a t e r a n d a n a l y s e d by e l e c t r o p h o r e s i s o n 1.2%
G e l s w e r e s t a i n e d w i t h 1 µ g / m l e t h i di u m
t r a n s i l l u m i n a t o r B TX 20-M
a g a ro s e g e ls .
br o m i de a n d v i s u a l i z e d i n a 302 n m
U V B
(U V I t e c ). I m a g e s w e r e a c q u i r e d u s i n g a di g i t a l c a m e r a
CCD -I r i s S S C-M 370CE (S o n y Co r p ., J a p a n ).
F o r t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y t h e c e l l s w e r e fi x e d i n 4%
M
P I P E S bu ffe r p H 7.2. Th e c e l l s w e r e w a s h e d, p o s t fi x e d i n 1%
g l u t a r a l de h y de i n 0.1
o s m i u m t e t r o x i de ,
de h y dr a t e d i n a g r a de d s e r i e s o f a l c o h o l s a n d e m be dde d i n S p u r r ’ s r e s i n . Th i n
s e c t i o n s w e r e c u t u s i n g a Le i c a U CT u l t r a m i c r o t o m e (Le i c a M i c r o s y s t e m s ) m o u n t e d
o n c o p p e r g r i ds s t a i n e d w i t h l e a d c i t r a t e a n d u r a n y l a c e t a t e , a n d v i e w e d i n a P h i l i p s
CM 100 (P h i l i p s , E i n dh o v e n , Th e N e t h e r l a n ds ) e l e c t r o n m i c r o s c o p e .
8
C asp ase-3 cl eav age and P A RP cl ev eage.
E x p r e s s i o n o f c l e a v e d c a s p a s e -3 a n d P A R P w a s a s s a y e d by i m m u o c y t o c h e m i s t r y a n d
c a r r i e d o u t u s i n g t h e M LI N K s a t r e p t a v i di n -bi o t i n -i m m u n o p e r o x i da s e k i t (M a s t e r
D i a g n o s t i c ). B r i e fl y , c e l l s w e r e w a s h e d w i t h P B S , dr o p p e d o n t o p o l y -L-l y s i n e c o a t e d
s l i de s a n d fi x e d w i t h 10%
bu ffe r e d fo r m a l de h y de fo r 25 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e .
S a m p l e s w e r e t h e n w a s h e d t w i c e w i t h P B S , p e r m e a bi l i z e d w i t h 0.2%
Tr i t o n X-100 i n
P B S fo r 10 m i n a n d w a s h e d t w i c e w i t h P B S . Ce l l s w e r e i n c u ba t e d i n bl o c k i n g bu ffe r
fo r 1 h a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d i n c u ba t e d i n p r i m a r y a n t i bo dy di l u t e d a t 1: 100 i n
bl o c k i n g bu ffe r o v e r n i g h t a t 4 º C. Ce l l s w e r e t h e n i n c u ba t e d i n bi o t i n y l a t e d s e c o n da r y
a n t i bo dy fo r 1 h i n a da r k a n d h u m i d c h a m be r a t r o o m t e m p e r a t u r e , w a s h e d w i t h P B S ,
fo l l o w e d by i n c u ba t i o n i n s t r e p t a v i di n -bi o t i n -p e r o x i da s e c o m p l e x fo r 10 m i n i n a
da r k , h u m i d c h a m be r a t r o o m t e m p e r a t u r e . Th e p e r o x i da s e r e a c t i o n w a s v i s u a l i z e d
w i t h 0.05%
di a m i n o be n z i di n e a n d 0.01%
h y dr o g e n p e r o x i de . S l i de s w e r e v i s u a l i s e d
i n a m i c r o s c o p e N i k o n O p t i P h o t -2, i m a g e s w e r e a c q u i r e d u s i n g a di g i t a l c a m e r a
Ca n o n P o w e r S h o t S 40 a n d p r o c e s s e d w i t h A do be P h o t o de l u x e (A do be S y s t e m s )
M easu r em ent of cy toch r om e c cr el ease.
Th e t r a n s l o c a t i o n o f c y t o c h r o m e c fr o m
m i t o c h o n dr i a w a s e v a l u a t e d by
i m m u n o c y t o fl u o r e s c e n c e . Ce l l s w e r e r i n s e d o n c e w i t h P B S a n d fi x e d fo r 25 m i n u t e s
i n 0.2%
0.15 M
fo r m a l de h y de i n 0.15 M
P I P E S bu ffe r a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d w a s h e d i n
P I P E S bu ffe r . A ft e r fi x a t i o n c e l l s w e r e p e l l e t a n d i n c u ba t e d w i t h a n t i -
c y t o c h r o m e c a n t i bo dy di l u t e d 1: 25 i n P B S , a n d a n t i c a s p a s e -3 di l u t e d 1: 100
i n c u ba t e d i n 3%
bo v i n e s e r u m a l bu m i n (B S A ) fo r 18 h a t 20 º C. E x c e s s a n t i bo dy
bi n di n g w a s r e m o v e d by w a s h i n g w i t h P B S t w i c e fo r fi v e m i n . Th e s e c o n da r y
a n t i bo di e s di l u t e d 1: 100 i n P B S , 3%
B S A , w a s a dde d a n d i n c u ba t e d fo r 1 h a t r o o m
t e m p e r a t u r e . Ce l l s w e r e w a s h e d w i t h P B S , i n c u ba t e d w i t h P B S c o n t a i n i n g 500 n g / m l
o f H o e c h s t a n d w a s h e d w i t h P B S . F i n a l l y , c e l l s w e r e m o u n t e d o n t o m i c r o s c o p e s l i de
u s i n g F l u o r o G u a r d A n t i fa de R e a g e m e n t (B i o -R a d La bo r a t o r i e s Lt d., H o r t fo u ds h i r e ,
U K) a n d a n a l y z e d u s i n g v e c t o r s h i e l d a n t i fa de r e a g e n t (V e c t o r l a bo r a t o r i e s ,
P e t e r bo r o u g h , U K) a n d a n a l y s e d u s i n g a Le i c a TCS -A O B S -S P 2 l a s e r s c a n n i n g
m i c r o s c o p e u s i n g a 405 n m
a n d a 568n m
l a s e r l i n e t o e x c i t e H o e c h s t , a 488n m
l i n e fo r A LE XA -568.
l i n e fo r A LE XA 488
9
El ectr on p r obe X -r ay m icr oanal y sis.
F o r E P XM A c o n t r o l a n d U V i r r a di a t e d c e l l s w e r e r e m o v e d fr o m t h e c u l t u r e m e di u m .
Th e c e l l s w e r e p e l l e t e d i n a m i c r o c e n t r i fu g e a t 10,000 g fo r 60 s e c . D r o p s o f t h e t h i c k
s u s p e n s i o n w e r e t r a n s fe r r e d o n t o e i t h e r a l u m i n i u m
s p e c i m e n p i n s o r w e dg e s o f
M i l l i p o r e fi l t e r p a p e r a n d c r y o fi x e d by p l u n g i n g i n t o l i q u e fi e d p r o p a n e u s i n g a
R e i c h e r t KF 80 p l u n g e -fr e e z i n g a p p a r a t u s . Th e fr o z e n dr o p l e t s w e r e s t o r e d u n de r
l i q u i d n i t r o g e n u n t i l r e q u i r e d fo r s e c t i o n i n g . Cr y o s e c t i o n s (250 n m t h i c k ) w e r e c u t a t -
120°C u s i n g a R M C c r y o u l t r a m i c r o t o m e . Th e c r y o s e c t i o n s w e r e c o l l e c t e d o n t o
P i o l o fo r m -c o v e r e d 100 h e x a g o n a l m e s h e l e c t r o n m i c r o s c o p e g r i ds , p l a c e d i n a br a s s
g r i d c a r r i e r a n d t r a n s fe r r e d u n de r l i q u i d n i t r o g e n t o t h e p r e -c o o l e d s t a g e o f a n E m i t e c h
K775 fr e e z e -dr i e r . Th e s e c t i o n s w e r e fr e e z e -dr i e d o v e r n i g h t u s i n g c o n t r o l l e d
c o n di t i o n s a n d c o a t e d w i t h c a r bo n w i t h o u t br e a k i n g t h e v a c u u m
(46).
Th e s e c t i o n s w e r e a n a l y z e d i n a Z e i s s E M 10 e l e c t r o n m i c r o s c o p e fi t t e d w i t h a n
O x fo r d I n s t r u m e n t s E D S de t e c t o r . Ce l l s fo r a n a l y s i s w e r e s e l e c t e d a c c o r di n g t o
m o r p h o lo g ic a l c r ite r ia ,c e lls th a t w e r e e le c tr o n lu c e n t o r s h o w e dla r g e a r e a s o fic e
c r y s t a l da m a g e , c h a r a c t e r i s t i c s o f n e c r o s i s , w e r e a v o i de d. A s e l e c t e d a r e a o f, n u c l e u s ,
c y t o p l a s m , m i t o c h o n dr i o n o r a n a r e a i n c l u di n g a l l c e l l u l a r c o m p a r t m e n t s c e l l w a s
a n a l y z e d i n p o i n t m o de fo r 60 s e c o n ds l i v e -t i m e a t 80 k V a c c e l e r a t i n g v o l t a g e a n d 1
n A be a m
c u r r e n t i n S TE M
m o de a t a m bi e n t t e m p e r a t u r e . S p e c t r a w e r e c o l l e c t e d a n d
p r o c e s s e d u s i n g P G T e Xc a l i bu r s o ft w a r e . Q u a n t i fi c a t i o n w a s a c h i e v e d by u s e o f t h e
c o n tin u u m
n o r m a l i z a t i o n p r o c e du r e o f H a l l a s de s c r i be d i n (44) w i t h r e fe r e n c e t o
s t a n da r ds c o m p o s e d o f g e l a t i n c o n t a i n i n g k n o w n a m o u n t s o f i n o r g a n i c s a l t s (43). Th e
n u m be r o f c e l l s a n a l y s e d w a s c o n t r o l 72, 15 m i n 76, 30 m i n 65, 60 m i n 62, 90 m i n 70
a n d 120 m i n 63, c e l l s w e r e a n a l y s e d fr o m
fo u r i n de p e n de n t e x p e r i m e n t s .
S tatistical anal y sis
D a t a w e r e e x p r e s s e d a s m e a n ± s t a n da r d e r r o r o f t h e m e a n (S E M ) a n d w e r e c o m p a r e d
u s i n g Kr u s k a l -W a l l i s O n e w a y a n a l y s i s o f v a r i a n c e o n r a n k s . W h e n s i g n i fi c a n t
di ffe r e n c e s w e r e fo u n d t h e s e w e r e c o m p a r e d a g a i n s t c o n t r o l v a l u e s u s i n g D u n n ’ s
10
m e t h o d. p v a l u e s l e s s t h a n 0.05 w e r e c o n s i de r e d s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t . Th e
s t a t i s t i c a l l y a n a l y s i s w a s p e r fo r m e d u s i n g S i g m a s t a t s t a t i s t i c a l s o ft w a r e (S y s t a t
S o ft w a r e , Lo n do n , U K).
R E S U LTS
U l t r a s t r u c t u r a l a n a l y s i s by t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y s h o w e d c o n t r o l c e l l s
w i t h a r o u n de d n u c l e u s w i t h a t h i n r i m
o f e l e c t r o n de n s e h e t e r o c h r o m a t i n u n de r l y i n g
t h e n u c l e a r m e m br a n e . Th e m o r e e l e c t r o n l u c e n t e u c h r o m a t i n w a s e v e n l y di s p e r s e d
t h r o u g h o u t t h e n u c l e u s . Th e i r m i t o c h o n dr i a a p p e a r e d n o r m a l a n d w e r e di s p e r s e d
th r o u g h o u t th e c y to p la s m
w i t h n o p r e fe r e n t i a l l o c a t i o n (F i g . 1A ). A ft e r 60 a n d 90
m i n u t e s U V t r e a t m e n t c e l l s s h o w e d c h r o m a t i n c o n de n s e d a t t h e p e r i p h e r y o f t h e
n u c l e u s (F i g . 1B ) a n d t h e a p p e a r a n c e o f fr a g m e n t e d n u c l e i (F i g . 1C). A ft e r 120 m i n o f
U V -i r r a di a t i o n U 937 c e l l s s h o w e d a l l t h e s t r u c t u r a l m a r k e r s o f a p o p t o s i s de s c r i be d
be fo r e , i n a ddi t i o n s o m e c e l l s s h o w i n g s i g n s o f s e c o n da r y n e c r o s i s w e r e be g i n n i n g t o
a p p e a r (F i g 1D ). Th e c o m p a r t m e n t s t h a t w e w i s h e d t o a n a l y s e , n u c l e u s , m i t o c h o n dr i a
a n dc y to p la s m
w e r e c l e a r l y v i s i bl e i n t h e s e c t i o n s o f u n t r e a t e d U 937 c e l l s (F i g 1E ),
a n d m o r p h o l o g i c a l fe a t u r e s o f a p o p t o s i s s u c h a s t h e p r e s e n c e o f c o n de n s e d c h r o m a t i n
c o u l d be s e e n i n c r y o s e c t i o n s o f a p o p t o t i c U 937 c e l l s (F i g 1F ).
C h anges in el em ental content ex p r essed as th e su m of al l com p ar tm ents in th e section
ar ea.
E l e m e n t c o n c e n t r a t i o n s o bt a i n e d fr o m t h e g l o ba l a n a l y s i s o f w h o l e a r e a s o f t h e c e l l s
s e c t i o n s a r e s h o w n i n F i g 2. Th e r e w e r e n o s i g n i fi c a n t di ffe r e n c e s i n t h e
c o n c e n t r a t i o n s o f e i t h e r m a g n e s i u m o r s u l p h u r t h r o u g h o u t t h e t i m e c o u r s e s t u di e d.
Co n c e n t r a t i o n s o f N a i n i t i a l l y r e m a i n e d l e v e l bu t be g a n t o i n c r e a s e a t 90 m i n u t e s , t h i s
i n c r e a s e be c a m e s i g n i fi c a n t 120 m i n u t e s a ft e r t h e i n du c t i o n o f a p o p t o s i s . Th e m a j o r
c h a n g e s w e r e s e e n i n t h e e l e m e n t s P , Cl a n d K. Th e r e w a s a n i n i t i a l de c r e a s e i n t h e
c o n c e n t r a t i o n o f P c o m p a r e d t o c o n t r o l t h a t be c a m e s i g n i fi c a n t by 30 m i n a ft e r
e x p o s u r e t o U V i r r a di a t i o n , P c o n c e n t r a t i o n s r e m a i n e d l e v e l w i t h n o fu r t h e r de c r e a s e
o c c u r r i n g . Th e r e w a s a n i n i t i a l s i g n i fi c a n t de c r e a s e i n Cl a t 15 m i n u t e s a ft e r e x p o s u r e
t o U V l i g h t , a t i m e p o i n t be fo r e s t r u c t u r a l c h a n g e s a s s o c i a t e d w i t h a p o p t o s i s w e r e
11
de t e c t e d. Th e c o n c e n t r a t i o n o f t h i s e l e m e n t r e m a i n e d l o w u n t i l t h e 60 m i n u t e t i m e
p o i n t , a ft e r t h i s t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h i s e l e m e n t i n c r e a s e d s o t h a t by t h e e n d o f t h e
e x p e r i m e n t i t w a s s l i g h t l y a bo v e t h e i n i t i a l v a l u e , t h i s i n c r e a s e a n d t h e c o n c o m i t a n t
i n c r e a s e i n [ N a ] o c c u r r e d a ft e r n u c l e i c o n t a i n i n g c o n de n s e d c h r o m a t i n w e r e de t e c t e d.
Th e c o n c e n t r a t i o n o f K fe l l s t e a di l y t h r o u g h o u t t h e e x p e r i m e n t a l p e r i o d. Th e de c r e a s e
i n c o n c e n t r a t i o n o f t h i s e l e m e n t be c o m i n g s i g n i fi c a n t l y l o w e r t h a n t h a t i n c o n t r o l c e l l s
a t 30 m i n u t e s a ft e r t h e o n s e t o f a p o p t o s i s , be fo r e m a n y o f t h e s i g n i fi c a n t fe a t u r e s o f
a p o p t o s i s w e r e de t e c t e d.
C h anges in m itoch ondr ia of U 9 3 7 cel l s af ter U V indu ced ap op tosis.
Th e g r e a t e s t c h a n g e s i n e l e m e n t c o n c e n t r a t i o n s o c c u r r e d m o s t r a p i dl y i n t h e
m i t o c h o n dr i a t h a n i n o t h e r c o m p a r t m e n t s (F i g 3A ). Th e c o n c e n t r a t i o n o f N a r e m a i n e d
s t a bl e u n t i l 60 m i n u t e s a ft e r U V t r e a t m e n t , a l t h o u g h t h e r e w a s a n o n -s i g n i fi c a n t
de c r e a s e i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h i s e l e m e n t a t 15 m i n u t e s (fr o m 123 t o 96 m m o l / k g ).
A ft e r t h i s t i m e [ N a ] be g a n t o r i s e fr o m 96 t o 265 m m o l / k g be i n g s i g n i fi c a n t o n l y a t
120 m i n u t e s (p < 0.01). I n t h e m i t o c h o n dr i a t h e c o n c e n t r a t i o n s o f M g a n d S di d n o t
c h a n g e s i g n i fi c a n t l y t h r o u g h o u t t h e a p o p t o t i c p e r i o d (da t a n o t s h o w n ). Th e
c o n c e n t r a t i o n o f P de c r e a s e d p r o g r e s s i v e l y a ft e r t h e o n s e t o f a p o p t o s i s (fr o m 588 t o
472 m m o l / k g ), t h i s de c r e a s e be c o m i n g s i g n i fi c a n t a t 30 m i n u t e s a ft e r U V i r r a di a t i o n
(p < 0.05) a n d r e a c h i n g i t s m a x i m u m
dr o p a n d s i g n i fi c a n c e (p < 0.001) a t 60 m i n u t e s .
A ft e r t h i s t i m e p o i n t [ P ] r e c o v e r e d s l i g h t l y w i t h o u t r e a c h i n g t h e c o n c e n t r a t i o n fo u n d
i n c o n t r o l m i t o c h o n dr i a (499 m m o l / k g v e r s u s 588 m m o l / k g ). O f a l l o f t h e
c o m p a r t m e n t s , t h e m i t o c h o n dr i a s h o w e d t h e m o s t r a p i d a n d m o s t s i g n i fi c a n t de c r e a s e
i n [ Cl ] , a ft e r 15 m i n u t e s t h e r e w a s a v e r y s i g n i fi c a n t de c r e a s e (p < 0.001) w h i c h
r e p r e s e n t e d j u s t o v e r h a l f o f t h e t o t a l c o n c e n t r a t i o n (70 m m o l / k g v e r s u s 146 m m o l / k g )
o f t h e e l e m e n t i n t h i s o r g a n e l l e . A l t h o u g h t h e l o w c o n c e n t r a t i o n o f Cl w a s m a i n t a i n e d
t h r o u g h o u t t h e s t a r t o f t h e a p o p t o t i c p r o c e s s i t be g a n t o i n c r e a s e s l i g h t l y (86 m m o l / k g
a t 30 m i n u t e s , p < 0.001; a n d 94 m m o l / k g a t 60 m i n u t e s p < 0.01), a n d by 90 a n d 120
m i n u t e s a ft e r U V i r r a di a t i o n [ Cl ] w a s s i m i l a r t o t h a t i n c o n t r o l c e l l s .
Th e c o n c e n t r a t i o n o f p o t a s s i u m de c r e a s e d s t e a di l y by 30 m i n u t e s a ft e r i r r a di a t i o n , t h e
de c r e a s e w a s s i g n i fi c a n t c o m p a r e d t o c o n t r o l c e l l s (412 m m o l / k g c o m p a r e d t o 531
m m o l / k g ), a ft e r t h i s [ K] r e m a i n e d s t e a dy a n d t h e n be g a n t o de c r e a s e a g a i n a ft e r 90
12
m i n u t e s r e a c h i n g a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 362 m m o l / k g a t t h e fi n a l t i m e p o i n t o f 120
m in u te s .
Th e r e l e a s e o f c y t o c h r o m e c fr o m t h e m i t o c h o n dr i a i s c o n s i de r e d t o p l a y a p i v o t a l r o l e
i n t h e a p o p t o t i c p r o c e s s . W e t h e r e fo r e de t e r m i n e d t h e t i m e c o u r s e o f c y t o c h r o m e c
r e l e a s e t o de t e r m i n e i t s r e l a t i o n s h i p w i t h t h e c h a n g e s i n e l e m e n t a l c o n c e n t r a t i o n .
Ce l l s w e r e a l s o s t a i n e d w i t h a n a n t i a c t i v e c a s p a s e -3, a n d w i t h H o e s c h t t o e n a bl e
c o r r e l a t i o n be t w e e n c y t o c h r o m e c r e l e a s e , a c t i v a t i o n o f c a s p a s e -3 a n d n u c l e a r
de g r a da t i o n . Th e t i m e c o u r s e fo r t h e r e l e a s e o f c y t o c h r o m e c fr o m
m i t o c h o n dr i a o f
U 937 c e l l s a ft e r U V i n du c e d a p o p t o s i s i s s h o w n i n F i g 3B . Co n t r o l c e l l s s h o w e d a
r o u n de d n u c l e u s w i t h a h o m o g e n o u s di s p e r s i o n o f c h r o m a t i n a s s h o w n by H o e c h s t
33342 s t a i n i n g . S t a i n i n g fo r c y t o c h r o m e c s h o w e d a p u n c t a t e di s t r i bu t i o n t h r o u g h o u t
th e c y to p la s m
du e t o i t s r e t e n t i o n w i t h i n t h e m i t o c h o n dr i a . Th e s a m e p a t t e r n o f
s t a i n i n g w a s o bs e r v e d 15 m i n u t e s a ft e r t r e a t m e n t w i t h U V l i g h t a t i m e p o i n t a t w h i c h
s i g n i fi c a n t c h a n g e s i n Cl h a d a l r e a dy o c c u r r e d. A t 30 m i n u t e s a ft e r U V i r r a di a t i o n
t h e r e w a s a de c r e a s e i n t h e p u n c t a t e g r e e n s t a i n fo r c y t o c h r o m e c a bo u t 60%
o fth e
c e l l s bu t t h e n u c l e i r e m a i n e d r o u n de d i n fo r m a n d s h o w e d a h o m o g e n o u s di s t r i bu t i o n
o f c h r o m a t i n . A t t h e 60 m i n u t e s t i m e p o i n t t h e p u n c t a t e g r e e n s t a i n di s a p p e a r e d
c o m p l e t e l y fr o m t h e m a j o r i t y o f c e l l s i n di c a t i n g t h a t r e l e a s e o f c y t o c h r o m e c fr o m t h e
m i t o c h o n dr i a w a s c o m p l e t e . I n a ddi t i o n , a t t h i s t i m e p o i n t a c t i v e c a s p a s e -3 w a s
de t e c t e d i n t h e c y t o p l a s m a n d H o e c h s t s t a i n i n g s h o w e d t h e a p p e a r a n c e o f m a r g i n a t e d
c h r o m a t in s ta in in th e m a jo r it y o fth e n u c le i.F r a g m e n te dc h r o m a tin w a s a p p a r e n t in
t h e n u c l e u s a ft e r 120 m i n u t e s (F i g 3B ).
N u cl ear ch anges in U V l igh t-indu ced ap op tosis in U 9 3 7 cel l s.
E l e m e n t c o n c e n t r a t i o n s i n t h e n u c l e u s a r e s h o w n i n F i g 4A . Th e [ N a ] r e m a i n e d s t a bl e
u n t i l 60 m i n u t e s a ft e r U V t r e a t m e n t , a ft e r t h i s t i m e t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h i s e l e m e n t
be g a n t o r i s e fr o m t h e ba s e l e v e l o f 99 m m o l / k g t o 288 m m o l / k g . Th e c o n c e n t r a t i o n
o f t h i s e l e m e n t w a s s i g n i fi c a n t l y h i g h e r t h a n i n c o n t r o l c e l l s a t 90 a n d 120 m i n u t e s
a ft e r i r r a di a t i o n . Th e c o n c e n t r a t i o n s o f M g a n d S di d n o t c h a n g e s i g n i fi c a n t l y
t h r o u g h o u t t h e a p o p t o t i c p e r i o d (da t a n o t s h o w n ). Th e [ P ] w a s r e du c e d a ft e r t h e o n s e t
o f a p o p t o s i s , bu t t h i s r e du c t i o n w a s s l i g h t a n d o n l y s h o w e d s t a t i s t i c a l s i g n i fi c a n c e a t
t h e 30 m i n u t e s t i m e p o i n t (p < 0.05) w h e n i t fe l l fr o m 548 t o 489 m m o l / k g . Th e [ Cl ]
13
fe l l i m m e di a t e l y , w i t h i n 15 m i n u t e s i t h a d de c r e a s e d fr o m 173 t o 99 m m o l / k g a n d i t
r e m a i n e d s i g n i fi c a n t l y l o w e r t h a n c o n t r o l v a l u e s a t 30 a n d 60 m i n u t e s a ft e r U V
t r e a t m e n t (p < 0.001). A ft e r t h i s t i m e p o i n t [ Cl ] i n c r e a s e d a g a i n i n p a r a l l e l w i t h t h e
i n c r e a s e i n [ N a ] , by 120 m i n u t e s a ft e r i r r a di a t i o n t h e c o n c e n t r a t i o n (211 m m o l / k g )
w a s h ig h e r th a n c o n tro l v a lu e s .
Th e [ K] de c r e a s e d s t e a di l y t h r o u g h o u t t h e p r o g r e s s i o n o f a p o p t o s i s (590 t o 422
m m o l / k g ) w i t h a p l a t e a u i n t h e c o n c e n t r a t i o n be t w e e n 30 a n d 60 m i n u t e s a ft e r U V
i r r a di a t i o n . Th e de c r e a s e i n c o n c e n t r a t i o n o f t h i s e l e m e n t be c a m e s t a t i s t i c a l l y
s i g n i fi c a n t (p < 0001) a t 30 m i n u t e s a ft e r U V i r r a di a t i o n . A n a l y s i s o f t h e c o m p a r t m e n t s
o f t h e n u c l e u s , t h e c o n de n s e d c h r o m a t i n a n d t h e n o n -c o n de n s e d c h r o m a t i n s h o w e d
t h a t t h e s e c o m p a r t m e n t s h a d a c o m p o s i t i o n s i m i l a r t o t h a t o f t h e n u c l e u s (da t a n o t
s h o w n ).
A p o p t o t i c c h a n g e s i n du c e d i n t h e n u c l e u s o f U 937 c e l l s by U V i r r a di a t i o n a r e s h o w n
i n F i g 4B , a n d g r a p h i c a l l y i n F i g 4C. Th e s e r e s u l t s a g r e e w i t h o u r p r e v i o u s fi n di n g s
(10) a n d t h e r e s u l t s fr o m e l e c t r o n m i c r o s c o p y s t u di e s . Th e e v a l u a t i o n o f t h e n u c l e a r
m o r p h o l o g y s t a i n e d w i t h H o e c h s t 33342 s h o w e d c o n t r o l c e l l s h a d a r o u n de d n u c l e u s
w i t h a h o m o g e n o u s di s p e r s i o n o f c h r o m a t i n . Cl e a r c h a n g e s i n t h e m o r p h o l o g y o f t h e
n u c l e u s w i t h t h e a p p e a r a n c e o f m a r g i n a t e d c o n de n s e d c h r o m a t i n be c a m e a p p a r e n t 60
m i n u t e s a ft e r t r e a t m e n t w i t h U V (29% ). Th e n u m be r o f c e l l s s h o w i n g m a r g i n a t e d
c h r o m a t i n c o n t i n u e d t o i n c r e a s e u n t i l 90 m i n u t e s a ft e r t r e a t m e n t (61% ). A ft e r t h i s
t i m e p o i n t t h e n u m be r o f c e l l s w i t h c o n de n s e d c h r o m a t i n de c r e a s e d (53% ) bu t t h e r e
w a s a s t e a dy i n c r e a s e i n t h e n u m be r o f c e l l s s h o w i n g fr a g m e n t e d n u c l e i (38% ) a n d a t
t h i s s t a g e 91%
o fc e lls w e r e a p o p to tic .
Th e D N A l a dde r t e c h n i q u e s h o w e d t h a t t y p i c a l i n t e r n u c l e o s o m a l D N A c l e a v a g e
o c c u r r e d du r i n g U V -i n du c e d a p o p o t o t i c c e l l de a t h . D N A l a dde r s fi r s t be c a m e v i s i bl e
60 m i n u t e s a ft e r t r e a t m e n t w i t h U V l i g h t , t h e l a dde r s w e r e m o r e p r o m i n e n t 90
m i n u t e s a ft e r t r e a t m e n t a n d w e r e s t i l l p r e s e n t a t 120 m i n u t e s a ft e r U V i r r a di a t i o n (F i g
4D ).
W e a s s a y e d fo r t h e a p p e a r a n c e o f c l e a v e d P A R P i n t h e n u c l e u s a s a c o n s e q u e n c e o f
a c t i v e c a s p a s e -3 a c t i v i t y . W h e r e a s c l e a v e d P A R P w a s n o t de t e c t e d i n c o n t r o l c e l l s
(F i g 4E ), t h e n u m be r o f n u c l e i e x p r e s s i n g t h e c l e a v e d fo r m o f t h i s e n z y m e i n c r e a s e d
14
a ft e r U V i r r a di a t i o n . Lo w l e v e l s o f c l e a v e d P A R P w e r e de t e c t e d be t w e e n 15 a n d 30
m i n u t e s a ft e r U V t r e a t m e n t (2 a n d 8% , r e s p e c t i v e l y , F i g 4E ). Th e r e w a s a s i g n i fi c a n t
i n c r e a s e i n t h e n u m be r o f n u c l e u s p o s i t i v e fo r c l e a v e d P A R P a t 60 m i n u t e s a ft e r U V
i r r a di a t i o n (65% ) a n d t h i s n u m be r i n c r e a s e d a t 90 m i n u t e s a ft e r t r e a t m e n t w i t h U V
(90% ) a n d w a s m a i n t a i n e d (85% ) a t 120 m i n u t e s a ft e r U V t r e a t m e n t (F i g 4E ).
O u r r e s u l t s fo r a n a l y s i s o f t h e n u c l e u s t h u s s h o w t h a t t h e de c r e a s e s i n Cl a n d K
p r e c e de t h e m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s , D N A fr a g m e n t a t i o n a n d P A R P c l e a v a g e a n d t h a t
t h e s e c h a n g e s i n t h e n u c l e a r c o m p a r t m e n t o c c u r i n t h e t i m e p e r i o d w h e n [ Cl ] h a d
be g u n t o i n c r e a s e ba c k t o w a r ds c o n t r o l l e v e l s a n d t h e i n t r a n u c l e a r [ N a ] w a s a l s o
r is in g .
C h anges in th e cy top l asm of U 9 3 7 cel l s af ter U V l igh t-indu ced ap op tosis.
Th e c y t o p l a s m w a s t h e c o m p a r t m e n t l e a s t a ffe c t e d by t h e i n du c t i o n o f a p o p t o s i s . Th e
c o n c e n t r a t i o n s o f t h e di ffe r e n t e l e m e n t s i n t h i s c o m p a r t m e n t a t t h e di ffe r e n t t i m e
p o i n t s a ft e r t h e i n du c t i o n o f a p o p t o s i s a r e s h o w n i n F i g 5A . Th e r e w a s a n i n i t i a l
s i g n i fi c a n t de c r e a s e (p < 0.05) i n [ N a ] a t 15 m i n u t e s a ft e r t h e i n du c t i o n o f a p o p t o s i s
fr o m 162 t o 119 m m o l / k g bu t , a ft e r t h i s t i m e p o i n t , t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h i s e l e m e n t
be g a n t o i n c r e a s e (119 t o 398 m m o l / k g ) w i t h s t a t i s t i c a l s i g n i fi c a n c e be i n g r e a c h e d a t
120 m i n u t e s (p < 0.001). A l t h o u g h t h e r e w e r e v a r i a t i o n s i n t h e c o n c e n t r a t i o n s o f S a n d
P du r i n g t h e c o u r s e o f a p o p t o s i s , w i t h a de c r e a s e i n [ P ] a t 60 m i n u t e s a ft e r t h e o n s e t
o f a p o p t o s i s (fr o m 650 t o 550 m m o l / k g ), t h e s e c h a n g e s w e r e n o t s t a t i s t i c a l l y
s i g n i fi c a n t . Th e c o n c e n t r a t i o n o f Cl de c r e a s e d w i t h i n 15 m i n u t e s a ft e r t h e o n s e t o f
a p o p t o s i s fr o m 200 t o 129 m m o l / k g , t h i s de c r e a s e w a s s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t
(p < 0.001). Th e l o w c o n c e n t r a t i o n s o f Cl w e r e m a i n t a i n e d u p t o 60 m i n u t e s a ft e r U V
i r r a di a t i o n , bu t a t 90 m i n u t e s [ Cl ] be g a n t o i n c r e a s e s o t h a t by 120 m i n u t e s [ Cl ] w a s
s l i g h t l y h i g h e r t h a n i n c o n t r o l c e l l s . Th e c o n c e n t r a t i o n o f K fe l l t h r o u g h o u t t h e
e x p e r i m e n t a l p e r i o d (fr o m 651 t o 483 m m o l / k g ), t h i s fa l l be c o m i n g s t a t i s t i c a l l y
s i g n i fi c a n t a ft e r 90 m i n u t e s (p < 0.01), a n d r e a c h e d i t s l o w e s t c o n c e n t r a t i o n a t 120
m i n u t e s (p < 0.05).
A m a j o r h a l l m a r k i n a p o p t o s i s i s t h e a p p e a r a n c e o f a c t i v e c a s p a s e -3 i n t h e c y t o p l a s m .
W e t h e r e fo r e a s s a y e d fo r t h e a p p e a r a n c e o f t h i s e n z y m e . W h e r e a s a c t i v e c a s p a s e -3
w a s n o t de t e c t e d i n c o n t r o l c e l l s t h e n u m be r o f c e l l s e x p r e s s i n g t h e a c t i v e fo r m o f t h i s
15
e n z y m e i n c r e a s e d a ft e r U V i r r a di a t i o n . Lo w l e v e l s o f a c t i v e c a s p a s e -3 w e r e de t e c t e d
be t w e e n 15 a n d 30 m i n u t e s a ft e r U V t r e a t m e n t (5 a n d 20 % , r e s p e c t i v e l y ). Th e r e w a s
a s i g n i fi c a n t i n c r e a s e i n t h e n u m be r o f c e l l s p o s i t i v e fo r a c t i v e c a s p a s e -3 a t 60
m i n u t e s a ft e r U V i r r a di a t i o n (73% ) a n d t h i s n u m be r i n c r e a s e d a t 90 m i n u t e s a ft e r
t r e a t m e n t w i t h U V (99% ) a n d w a s m a i n t a i n e d (96% ) a t 120 m i n u t e s a ft e r U V
t r e a t m e n t (F i g 5B a n d a l s o F i g 3B ). Th u s o u r r e s u l t s s h o w t h a t t h e a p p e a r a n c e o f
a c t i v e c a s p a s e -3 i s p r e c e de d by a s i g n i fi c a n t de c r e a s e i n c y t o p l a s m i c [ Cl ] bu t n o t [ K] .
D I S CU S S I O N
W e h a v e p r e v i o u s l y u s e d U V t r e a t m e n t t o s t u dy e l e m e n t c h a n g e s i n w h o l e U 937 c e l l s
du r i n g t h e l a t e r s t a g e s o f a p o p t o s i s (10). Th e a dv a n t a g e o f t h i s m o de l be i n g t h a t
a p o p o t o s i s i s i n du c e d r a p i dl y i n a l m o s t t h e e n t i r e c e l l p o p u l a t i o n , g i v i n g a r e l a t i v e l y
s y n c h r o n o u s p o p u l a t i o n o f c e l l s fo r s t u dy . H e r e w e h a v e u s e d E P XM A fo r t h e
a n a l y s i s o f c r y o s e c t i o n e d U 937 c e l l s , t h i s a l l o w e d s i m u l t a n e o u s de t e r m i n a t i o n o f t h e
e l e m e n t s o f i n t e r e s t , s o di u m , m a g n e s i u m , p h o s p h o r u s , c h l o r i de a n d p o t a s s i u m
a l s o a l l o w e d u s t o de t e r m i n e h o w a n y c h a n g e s a ffe c t e d di ffe r e n t s u bc e l l u l a r
a n d
c o m p a r t m e n t s . I n a ddi t i o n , w e h a v e de t e r m i n e d c y t o c h r o m e c r e l e a s e , P A R P
c l e a v a g e , de g r a da t i o n o f D N A , a n d a c t i v a t i o n o f c a s p a s e -3 s o t h a t t h e r e s u l t s
p r e s e n t e d h e r e e n a bl e di r e c t c o r r e l a t i o n be t w e e n c h a n g e s i n c e l l u l a r e l e m e n t a l c o n t e n t
a n d w e l l -r e c o g n i z e d m a r k e r s o f a p o p t o t i c p r o g r e s s .
G l obal el em ental concentr ations w h er e th e anal y sed ar ea incl u des al l cel l
com p ar tm ents.
Th e r e s u l t s fr o m t h e a n a l y s e s t h a t i n c l u de d a l l c e l l c o m p a r t m e n t s w i l l be c o n s i de r e d
fi r s t s i n c e t h e s e e x e m p l i fy o c c u r r e n c e s i n t h e o t h e r i n di v i du a l c e l l u l a r c o m p a r t m e n t s ,
a n d c a n be m o s t c l o s e l y r e l a t e d t o w o r k i n w h i c h i o n i c c o n c e n t r a t i o n s h a v e be e n
s t u di e d i n w h o l e c e l l s . Th e m a j o r fi n di n g o f t h i s s t u dy i s t h a t de c r e a s e s i n t h e
c o n c e n t r a t i o n s o f bo t h p o t a s s i u m
a n d c h l o r i de o c c u r r e d v e r y e a r l y i n t h e a p o p t o t i c
p r o c e s s a n d t h a t t h e p a t t e r n o f t h e r e s p o n s e o f t h e s e t w o e l e m e n t s di ffe r e d. Th e [ K]
c o n t i n u e d t o de c r e a s e t h r o u g h o u t a p o p t o s i s w h e r e a s t h e [ Cl ] i n c r e a s e d i n t h e l a t e r
s t a g e s , t h i s r i s e o c c u r r i n g a ft e r m a n y o f t h e m a n i fe s t a t i o n s o f t h e l a t e r s t a g e s o f
a p o p t o s i s be c a m e a p p a r e n t . O u r r e s u l t s a r e i n a g r e e m e n t w i t h o t h e r s t u di e s t h a t h a v e
16
u s e d E P XM A fo r t h e de t e r m i n a t i o n o f e l e m e n t c h a n g e s i n a p o p t o s i s . D e c r e a s e s i n
[ Cl ] o f 27%
a n d [ K] o f 50%
h a v e be e n r e c o r de d i n w h o l e U 937 c e l l s a ft e r t h e
i n du c t i o n o f a p o p t o s i s i n U 937 c e l l s by U V i r r a di a t i o n o r s t a u r o s p o r i n e (10, 3) bu t
t h e s e r e s u l t s w e r e r e c o r de d fo r s i n g l e t i m e p o i n t s l a t e r i n t h e a p o p t o t i c p r o c e s s w h e n
i n di c a t o r s o f t h e e x e c u t i o n s t a g e s u c h a s c o n de n s a t i o n o f c h r o m a t i n w e r e a l r e a dy
a p p a r e n t . O u r r e s u l t s s h o w t h a t t h e de c r e a s e s i n [ Cl ] a n d [ K] o c c u r v e r y e a r l y i n t h e
a p o p t o t i c p r o c e s s a n d p r e c e de a l l o f t h e o t h e r m a n i fe s t a t i o n s t h a t w e s t u di e d. S i m i l a r
fi n di n g s h a v e be e n r e p o r t e d fo r m o n o c y t e / m a c r o p h a g e s e x p o s e d t o LD L w h e r e
de c r e a s e s i n bo t h [ Cl ] a n d [ K] w e r e s h o w n t o p r e c e de D N A de g r a da t i o n e s t i m a t e d by
TU N E L l a be l l i n g (35).
Th e r e s u l t s fr o m E P XM A a r e a l s o i n l i n e w i t h t h o s e fr o m o t h e r t e c h n i q u e s t h a t h a v e
be e n u s e d t o s t u dy i o n i c a c t i v i t y a ft e r t h e o n s e t o f a p o p t o s i s . A c t i v a t i o n o f K+
c h a n n e l s a n d o f Cl - c h a n n e l s h a s be e n r e p o r t e d a ft e r a p o p t o t i c s t i m u l a t i o n i n a n u m be r
o f di ffe r e n t c e l l t y p e s (16, 41, 22, 31, 47, 25, 29, 37). O u r r e s u l t s p r o v i de e v i de n c e
t h a t s u c h a c t i v a t i o n l e a ds t o l o s s o f bo t h i n t r a c e l l u l a r p o t a s s i u m
a n d c h l o r i de .
A p o p t o t i c c e l l s de c r e a s e i n v o l u m e . Th e a p p e a r a n c e o f t h e s h r u n k e n p y k n o t i c c e l l s
be i n g o n e o f t h e c h a r a c t e r i s t i c s t h a t l e d t o t h e fi r s t de s c r i p t i o n s o f a p o p t o s i s , h o w e v e r ,
i n i t i a l l y i t w a s c o n s i de r e d t h a t t h i s s h r i n k a g e w a s a s s o c i a t e d w i t h t h e l a t e r s t a g e s .
H e r e w e s h o w t h a t i n U 937 c e l l s t h e c o n c e n t r a t i o n s o f bo t h p o t a s s i u m
a n d c h l o r i de
de c r e a s e i m m e di a t e l y a ft e r U V i r r a di a t i o n , t h e l o s s o f t h e s e t w o e l e m e n t s o n a m o l e
fo r m o l e ba s i s be i n g m o r e o r l e s s e q u i v a l e n t . B e c a u s e t h e i n i t i a l i n t r a c e l l u l a r [ Cl ] i s
lo w c o m p a r e dto th a t o fp o ta s s iu m ,w h e n th e r e s u lts a r e e x p r e s s e do n a p e r c e n ta g e
ba s i s t h e s e c h a n g e s r e s u l t i n a m u c h h i g h e r de c r e a s e o f Cl c o m p a r e d t o t h a t o f
p o t a s s i u m (a l o s s o f 40%
Cl c o m p a r e d w i t h 16%
fo r K a ft e r 30 m i n u t e s , s e e Ta bl e 1).
Th i s p a t t e r n o f l o s s o f Cl i s c h a r a c t e r i s t i c o f c e l l s u n de r g o i n g i s o t o n i c c e l l s h r i n k a g e
(27). M a e n o e t a l (19) s h o w e d t h a t , i n a n u m be r o f di ffe r e n t c e l l t y p e s , i n du c t i o n o f
a p o p t o t i c c e l l de a t h w a s c o u p l e d w i t h fa c i l i t a t i o n o f R V D a n d t h a t v o l u m e de c r e a s e
w a s a n e a r l y e v e n t i n t h e a p o p t o t i c p r o c e s s . Th e r e s u l t s p r e s e n t e d h e r e s u p p o r t t h e s e
i de a s a n d a l s o p r o v i de di r e c t e v i de n c e , w i t h o u t o u t t h e n e e d t o p r o v o k e a h y p o t o n i c
c h a l l e n g e , t h a t a n a p o p t o t i c s t i m u l u s , U V i r r a di a t i o n , i n du c e s i m m e di a t e i s o t o n i c
s h r i n k a g e i n U 937 c e l l s .
17
M itoch ondr ia.
A n u m be r o f i o n t r a n s p o r t e r s h a v e be e n i de n t i fi e d bo t h i n i n n e r a n d o u t e r
m i t o c h o n dr i a l m e m br a n e s bu t l i t t l e i s k n o w n a bo u t t h e i r r o l e s e i t h e r i n i n t a c t c e l l s o r
i n t h e a p o p t o t i c p r o c e s s . O u r r e s u l t s fr o m t h e a n a l y s e s t h a t i n c l u de d a l l c e l l
c o m p a r t m e n t s i n di c a t e t h a t c e l l s h r i n k a g e i s a n i m m e di a t e e ffe c t o f U V -i n du c e d
a p o p t o s i s i n U 937 c e l l s . W e a l s o s h o w a n i m m e di a t e a n d r a p i d de c r e a s e i n Cl i n t h e
m i t o c h o n dr i a , a de c r e a s e o f 52%
a ft e r 15 m i n u t e s c o m p a r e d t o t h e c o n t r o l c e l l s , t h a t
i s m u c h g r e a t e r t h a n o c c u r s i n t h e o t h e r c e l l u l a r c o m p a r t m e n t s . I t i s p o s s i bl e t h a t t h e
o bs e r v e d de c r e a s e r e p r e s e n t s t h e r e s u l t o f U V i n du c e d a c t i v a t i o n o f i o n t r a n s p o r t e r s
s i m i l a r t o t h o s e a c t i v a t e d i n t h e p l a s m a m e m br a n e w i t h r e s u l t i n g e ffe c t s o n
m i t o c h o n dr i a l v o l u m e . I t h a s be e n s u g g e s t e d t h a t e ffl u x o f Cl t h r o u g h t h e i n n e r
m e m br a n e a n i o n c h a n n e l (I M A C) a c t s a s a s a fe g u a r d a g a i n s t e x c e s s i v e m i t o c h o n dr i a l
s w e l l i n g (28) a n d i s a c t i v e u n de r a l k a l i n e c o n di t i o n s i n t h e m i t o c h o n dr i a l m a t r i x . Th e
de c r e a s e i n Cl t h a t w e de s c r i be h e r e c o u l d r e fl e c t a n a t t e m p t t o s t a bi l i s e m i t o c h o dr i a l
v o l u m e a n d i s c o m p a t i bl e w i t h t h e i de a t h a t du r i n g a p o p t o s i s l o s s o f v o l u m e c o n t r o l
by t h e m i t o c h o n dr i a l e a ds t o c y t o c h r o m e c r e l e a s e .
Th e s i t u a t i o n fo r m i t o c h o n dr i a l K i s n o t q u i t e s o s t r a i g h t fo r w a r d. K+ c h a n n e l s h a v e
be e n i de n t i fi e d o n t h e i n n e r m i t o c h o n dr i a l m e m br a n e a n d o p e n i n g o f t h e s e c h a n n e l s
w o u l d be e x p e c t e d t o l e a d t o i n fl u x o f K a n d s w e l l i n g o f t h e m i t o c h o n dr i a (12), o u r
r e s u l t s i n s t e a d s h o w a s t e a dy de c r e a s e i n [ K] . U n de r c o n t r o l c o n di t i o n s m i t o c h o n dr i a l
[ K] i s k n o w n t o be h i g h (12, 4) s o t h a t n e t K t r a n s p o r t w o u l d h a v e l i t t l e o v e r a l l e ffe c t
o n t h e m a t r i x c o n c e n t r a t i o n bu t a g r e a t e r e ffe c t o n m a t r i x v o l u m e (12). I t i s t h e r e fo r e ,
p e r h a p s , n o t s u r p r i s i n g t h a t a n i n c r e a s e i n m i t o c h o n dr i a l [ K] w a s n o t de t e c t e d. I n
a ddi t i o n , t h e fi r s t t i m e p o i n t t h a t w e i n v e s t i g a t e d i s 15 m i n u t e s a ft e r e x p o s u r e t o U V
l i g h t . S i g n i fi c a n t di s r u p t i o n o f m i t o c h o n dr i a l s t r u c t u r e a n d a de c r e a s e i n
m i t o c h o n dr i a l m e m br a n e p o t e n t i a l w e r e s h o w n t o o c c u r w i t h i n 30 s e c o n ds i n U 937
c e l l s a ft e r t r e a t m e n t w i t h do l y i c h y l m o n o p h o s p h a t e t o i n du c e a p o p t o s i s (51) i t m a y
t h e r e fo r e be n e c e s s a r y t o i n v e s t i g a t e e a r l i e r t i m e p o i n t s fo r a n i n c r e a s e i n
m i t o c h o n dr a l [ K] t o be de t e c t e d.
O u r r e s u l t s s h o w t h a t c y t o c h r o m e c l o s s o c c u r s v e r y r a p i dl y i n m o s t o f t h e c e l l s a n d
t h i s o c c u r s a r o u n d 30 m i n u t e s a ft e r U V i r r a di a t i o n . P r i o r t o t h i s t i m e p o i n t t h e p a t t e r n
18
o f c h a n g e i n t h e e l e m e n t s Cl a n d K be g i n s t o di ffe r . A t 30 m i n u t e s t h e [ Cl ] w a s
g r e a t e r t h a n a t t h e 15 m i n u t e t i m e p o i n t a n d t h e i n c r e a s e i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h i s
e l e m e n t c o n t i n u e d t h r o u g h o u t t h e r e m a i n de r o f t h e e x p e r i m e n t w h e r e a s [ K] c o n t i n u e d
t o de c r e a s e a l t h o u g h i t r e m a i n e d s t e a dy be t w e e n t h e 30 a n d 60 m i n u t e t i m e p o i n t s .
Th e i n c r e a s e i n m i t o c h o n dr i a l [ Cl ] w a s a c c o m p a n i e d by a g r a du a l i n c r e a s e i n [ N a ] i n
t h e l a t e r s t a g e s o f a p o p t o s i s a ft e r r e l e a s e o f c y t o c h r o m e c h a s o c c u r r e d t h e s e v a l u e s
p r o ba bl y r e p r e s e n t e q u i l i br a t i o n o f m i t o c h o n dr i a l i o n c o n c e n t r a t i o n s w i t h t h e
s u r r o u n di n g c y t o p l a s m .
I n t h e m i t o c h o n dr i a t h e r e w a s a l o s s o f P t h a t be c a m e s i g n i fi c a n t a t 30 m i n u t e s a ft e r
U V -i r r a di a t i o n , a ft e r c y t o c h r o m e c r e l e a s e . Th i s p r o ba bl y r e fl e c t s a l o s s o f h i g h
e n e r g y p h o s p h a t e fr o m t h i s c o m p a r t m e n t .
N u cl eu s.
Th e r e s u l t s p r e s e n t e d h e r e fo r t h e n u c l e a r c o m p a r t m e n t s h o w t h a t t h e c h a n g e s i n
i n t r a n u c l e a r i o n c o n c e n t r a t i o n s o c c u r m u c h e a r l i e r t h a n t h e o v e r t m a n i fe s t a t i o n s o f
n u c l e a r da m a g e , P A R P c l e a v a g e , D N A l a dde r i n g a n d c h r o m a t i n c o n de n s a t i o n . Th e
m a i n c h a n g e s a r e t h e de c r e a s e i n c h l o r i de c o n c e n t r a t i o n t h a t o c c u r s w i t h i n 15 m i n u t e s
o f U V i r r a di a t i o n a n d t h e s t e a dy l o s s o f p o t a s s i u m
th r o u g h o u t th e p e r io do fa p o p to s is .
A de c r e a s e i n i n t r a c e l l u l a r [ Cl ] h a s be e n i m p l i c a t e d a s a c o -fa c t o r i n t h e a c t i v a t i o n o f
D F F e n do n u c l e a s e t h a t i s r e s p o n s i bl e fo r i n t e r n u c l e o s o m a l fr a g m e n t a t i o n o f D N A
(30), a n d t h e s e a u t h o r s s u g g e s t e d t h a t t h e de c r e a s e i n Cl du e t o s h r i n k a g e l a t e i n
a p o p t o s i s fa v o u r e d e n do n u c l e a s e a c t i v a t i o n . I n c o n t r a s t , w e h a v e s h o w n h e r e t h a t t h e
de c r e a s e i n [ Cl ] i s a n e a r l y e v e n t , w i t h t h e [ Cl ] r e t u r n i n g t o w a r ds c o n t r o l v a l u e s i n t h e
l a t e r s t a g e s . N e v e r t h e l e s s , t h e [ Cl ] r e m a i n s be l o w t h e v a l u e i n c o n t r o l c e l l s i n t h e
p e r i o d be t w e e n 15 t o 60 m i n u t e s a ft e r U V i r r a di a t i o n , t h e p e r i o d du r i n g w h i c h P A R P
c l e a v a g e o c c u r s a n d s o c o u l d p r o v i de a n i n t r a n u c l e a r e n v i r o n m e n t t h a t i s fa v o u r a bl e
fo r c h r o m a t i n de g r a da t i o n .
I t h a s be e n s u g g e s t e d t h a t h i g h i n t r a n u c l e a r [ K] i s e s s e n t i a l fo r h i g h o r de r s t r u c t u r e i n
m a m m a l i a n c h r o m o s o m e s (36). H e r e w e s h o w t h a t t h e r e i s a n i n i t i a l de c r e a s e i n
i n t r a n u c l e a r [ K] bu t t h a t t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h i s i o n r e m a i n s l e v e l t h r o u g h t h e p e r i o d
be t w e e n 30 a n d 60 m i n u t e s a ft e r U V i r r a di a t i o n w h e n t h e r e i s a m a j o r i n c r e a s e i n t h e
19
n u m be r o f c e l l s p o s i t i v e fo r P A R P a n d w h e n t h e D N A be c o m e s m o r e fr a g m e n t e d a s
e v i de n c e by t h e a p p e a r a n c e o f l a dde r e d D N A . Th e [ K] fa l l s a g a i n i n t h e l a t e r s t a g e s ,
90 a n d 120 m i n u t e s a ft e r U V i r r a di a t i o n s u g g e s t i n g t h a t D N A i s r e l e a s e d a s c h r o m a t i n
de g r a de s .
I n t h e n u c l e u s t h e r e w a s a s l i g h t de c r e a s e i n [ P ] t h a t w a s s i g n i fi c a n t a t t h e p < 0.05
l e v e l 30 m i n u t e s a ft e r U V i r r a di a t i o n . I n t h e n u c l e u s t h e de t e c t e d P i s m o s t l i k e l y a
c o n s titu e n t o fD N A .O u r r e s u lts s u g g e s t th a t th e r e is n o g r e a t lo s s o fn u c le a r m a te r ia l
du r i n g t h e c o u r s e o f c h r o m a t i n c o n de n s a t i o n .
C y top l asm .
I n th e c y to p la s m
t h e c o n c e n t r a t i o n s o f [ Cl ] a n d [ K] bo t h de c r e a s e a ft e r U V
i r r a di a t i o n . Th e m a j o r de c r e a s e i n Cl o c c u r s i n t h e fi r s t 15 m i n u t e s a ft e r t h e a p o p t o t i c
s t i m u l u s . A s i n o t h e r c o m p a r t m e n t s , a ft e r 30 m i n u t e s t h e [ Cl ] be g i n s t o i n c r e a s e
c o m p a r e d t o t h e p r e v i o u s t i m e p o i n t w h i l s t s t i l l r e m a i n i n g s i g n i fi c a n t l y l o w e r t h a n
t h a t o f c o n t r o l c e l l s , w h e r e a s [ K] c o n t i n u e s t o de c r e a s e a n d, u n l i k e t h e m i t o c h o n dr i a
a n d n u c l e u s , t h i s de c r e a s e do e s n o t p l a t e a u a t t h e 60 m i n u t e t i m e p o i n t bu t c o n t i n u e s
a t a s t e a dy r a t e . Th e i n i t i a l de c l i n e i n bo t h o f t h e s e e l e m e n t s i s p r o ba bl y a r e s u l t o f t h e
o p e n i n g o f K+ a n d Cl - c h a n n e l s i n r e s p o n s e t o U V i r r a di a t i o n a s h a s be e n p r e v i o u s l y
r e p o r t e d (41). Th e c o n c e n t r a t i o n o f N a a l s o be g i n s t o i n c r e a s e a t 30 m i n u t e s a ft e r U V
t r e a t m e n t . Th e c h a n g i n g p a t t e r n a t 30 m i n u t e s i n di c a t e s t h a t t h e m e c h a n i s m s fo r
t r a n s p o r t o f t h e s e i o n s c h a n g e s a r o u n d t h i s t i m e p o i n t . Th e c e l l s w e r e s u bj e c t t o a n
i n t e n s e do s e o f U V i r r a di a t i o n i n a n a t t e m p t t o i n du c e a p o p t o s i s i n a s y n c h r o n o u s
m a n n e r a n d i t i s p o s s i bl e t h a t t h e i n c r e a s e i n [ Cl ] , a n d p a r a l l e l i n c r e a s e i n [ N a ] ,
r e p r e s e n t th e o c c u r r e n c e o fn e c r o s is a s a la te s ta g e o fa p o p to s is in c e lls in c u ltu r e .
H o w e v e r w e fe e l t h a t t h i s i s n o t a l i k e l y e x p l a n a t i o n . U n fi x e d p o r t i o n s o f t h e c e l l s
u s e d fo r e x p e r i m e n t a t i o n w e r e r o u t i n e l y t r e a t e d w i t h Tr y p a n bl u e t o a s s e s s v i a bi l i t y .
Th e r e s u l t s o bt a i n e d w e r e s i m i l a r t o t h o s e p u bl i s h e d p r e v i o u s l y (10). Th e c e l l s
e x c l u de d t h e dy e i n di c a t i n g a l a c k o f p e r m e a bl i s a t i o n o f t h e p l a s m a m e m br a n e a s
w o u l d o c c u r i n n e c r o s i s . I n a ddi t i o n , e l e c t r o n l u c e n t c e l l s s h o w i n g o v e r t
m a n i fe s t a t i o n s o f n e c r o s i s w e r e n o t a n a l y s e d. A s i m i l a r p a t t e r n o f c h a n g e o f t h e s e
e l e m e n t s h a s be e n r e p o r t e d i n m o n o c y t e m a c r o p h a g e s a ft e r a p o p t o s i s i n du c e d by
o x i di z e d LD L, bu t p o s s i bl e m e c h a n i s m s u n de r l y i n g t h e c h a n g e s w e r e n o t di s c u s s e d
20
(35). S e v e r a l s t u di e s h a v e s h o w n t h a t o u a ba i n m i g h t i n du c e a p o p t o s i s i n di ffe r e n t c e l l
t y p e s (20, 23, 50). I n a ddi t i o n , a n i n c r e a s e i n [ N a ] i n U 937 c e l l s 5 h o u r s a ft e r
s t a u r o s p o r i n e i n du c e d a p o p t o s i s w a s s h o w n t o be a s s o c i a t e d w i t h de c r e a s e d N a / K
A TP a s e a c t i v i t y (2). A s i m i l a r m e c h a n i s m
o p e r a t i n g a ft e r U V i n du c e d a p o p t o s i s
w o u l d a c c o u n t fo r t h e r e s u l t s p r e s e n t e d h e r e .
S t u di e s u s i n g c e l l fr a c t i o n s h a v e s h o w n t h a t h i g h [ K] a c t e d t o s u p p r e s s a c t i v a t i o n o f
c a s p a s e s a n d D N A de g r a da t i o n (14) s u g g e s t i n g t h a t , i n i n t a c t c e l l s , K l o s s s h o u l d
o c c u r be fo r e t h e s e e v e n t s a r e de t e c t e d. H e r e w e s h o w t h a t , a l t h o u g h t h e de c r e a s e i n K
i n t h e n u c l e u s p r e c e de s t h e a p p e a r a n c e o f D N A de g r a da t i o n , t h e l o s s o f K fr o m t h e
c y t o p l a s m do e s n o t r e a c h s i g n i fi c a n t l e v e l s u n t i l a ft e r a c t i v a t i o n o f c a s p a s e -3,
s u g g e s t i n g t h a t a l o s s o f c y t o p l a s m i c K do e s n o t c o n t r o l c a s p a s e a c t i v a t i o n i n o u r
e x p e r i m e n t a l s y s t e m . O u r r e s u l t s , h o w e v e r a r e n o t i n c o m p l e t e di s a g r e e m e n t w i t h t h e
i de a t h a t a de c r e a s e i n c y t o p l a s m i c [ K] i s n e c e s s a r y fo r c a s p a s e a c t i v a t i o n s i n c e , i n
l a t e r s t u di e s (40), c a s p a s e i n h i bi t o r s w e r e fo u n d t o be l e s s e ffe c t i v e i n p r e v e n t i n g c e l l
s h r i n k a g e a n d K+ l o s s a ft e r U V -m e di a t e d i n du c t i o n o f a p o p t o s i s i n J u r k a t T
l y m p h o c y t e s w h e n c o m p a r e d t o F a s r e c e p t o r -i n du c e d a p o p t o s i s .
I t i s p e r h a p s n o t s u r p r i s i n g t h a t , i n t h e c y t o p l a s m , t h e l o w e r e d [ K] o n l y r e a c h e s
s i g n i fc a n c e a t l a t e r s t a g e s . Th e s i g n i fi c a n t de c r e a s e s i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h i s
e l e m e n t o c c u r e a r l i e s t i n t h e m i t o c h o n dr i a a n d n u c l e u s , p o t a s s i u m
th e s e c o m p a r t m e n ts m u s t n e c e s s a r ily p a s s th r o u g h th e c y to p la s m
t h a t i s l o s t fr o m
t o e x i t fr o m t h e c e l l .
I n s t u di e s o n de x a m e t h a s o n e t r e a t e d l y m p h o c y t e s (8) i t w a s s h o w n t h a t s h o w n t h a t
br e a k do w n o f m i t o c h o n dr i a l m e m br a n e p o t e n t i a l o c c u r s be fo r e l o s s o f t h e p l a s m a
m e m br a n e p o t e n t i a l . A l t h o u g h t h e r e a s o n fo r t h i s w a s n o t c l e a r , t h e a u t h o r s s u g g e s t e d
t h a t s u bt l e c h a n g e s i n K+ fl u x e s m i g h t be i n v o l v e d i n t h e i n du c t i o n p h a s e o f a p o p t o s i s
w i t h m a j o r l o s s e s o f t h i s i o n o c c u r r i n g l a t e r i n t h e de g r a da t i o n p h a s e . O u r r e s u l t s
c o n fi r m
s u c h a p a t t e r n o f K l o s s . W e fo u n d t h a t de c r e a s e s i n [ K] o c c u r e a r l i e s t i n t h e
m i t o c h o n dr i a , bu t be c a u s e t h e m i t o c h o n dr i a r e p r e s e n t o n l y a s m a l l fr a c t i o n o f t h e c e l l
v o l u m e s u c h c h a n g e s w o u l d a l m o s t c e r t a i n l y n o t be de t e c t e d w h e n p o t a s s i u m
c o n c e n tr a tio n is m e a s u r e din w h o le c e lls .
I n s u m m a r y o u r da t a s h o w s t h a t i n U 937 c e l l s u n de r g o i n g U V i n du c e d a p o p t o s i s
de c r e a s e s i n i n t r a c e l l u l a r c o n c e n t r a t i o n s o f Cl a n d K p r e c e de o t h e r m a n i fe s t a t i o n s o f
21
a p o p t o s i s a n d t h a t t h e p a t t e r n o f e l e c t r o l y t e l o s s c h a n g e s du r i n g t h e c o u r s e o f
a p o p t o s i s . W e a l s o s h o w t h a t t h e p a t t e r n o f e l e c t r o l y t e l o s s a ffe c t s i n t r a c e l l u l a r
c o m p a r t m e n t s di ffe r e n t l y . A s i g n i fi c a n t de c r e a s e i n [ Cl ] o c c u r s i n a l l c o m p a r t m e n t s .
I n t h e m i t o c h o n dr i a t h i s p r e c e de s c y t o c h r o m e c r e l e a s e . I n t h e n u c l e u s s i g n i fi c a n t
de c r e a s e s i n t h e c o n c e n t r a t i o n s o f bo t h Cl a n d K o c c u r be fo r e n u c l e a r fr a g m e n t a t i o n i s
de t e c t e d. Th e c y t o p l a s m
i s t h e c o m p a r t m e n t t h a t i s t h e l e a s t a ffe c t e d by l o s s o f
p o t a s s i u m a l t h o u g h t h e r e i s a s t e a dy de c r e a s e i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h i s e l e m e n t t h i s
de c r e a s e do e s n o t be c o m e s i g n i fi c a n t u n t i l l a t e i n t h e e x e c u t i o n p h a s e .
TE XT F O O TN O TE S
E P XM A m e a s u r e s e l e m e n t c o n c e n t r a t i o n s a n d c a n n o t de t e c t o x i da t i o n s t a t e s , fo r t h i s
r e a s o n t h e o x i da t i o n s t a t e i s n o t g i v e n w h e n r e fe r r i n g t o m i c r o a n a l y t i c a l r e s u l t s .
A CKN O W LE D G E M E N TS
Th i s w o r k w a s s u p p o r t e d by g r a n t s fr o m Th e W e l l c o m e Tr u s t (R e f. 0578811) a n d
S p a n i s h M i n i s t r y o f H e a l t h (F I S P I 02622), F A r r e bo l a w a s s u p p o r t e d by g r a n t s fr o m
U n i v e r s i t y o f G r a n a da a n d S p a n i s h M i n i s t r y o f E du c a t i o n a n d S c i e n c e (P F 00
33380884).
22
R E F E R E N CE S
1. A n d e r s s o n
C
R o o m a n s G M . D e t e r m i n a t i o n o f c h l o r i de e ffl u x by X-r a y
a n d
m i c r o a n a l y s i s v e r s u s M Q A E -fl u o r e s c e n c e . M icr osc Res T ech 59: 531-535, 2002.
2. A r r e b o l a F , C a n i z a r e s F J , C u b e r o M A , C r e s p o P V , W
S e g u r a
E . B ip h a s ic
be h a v i o r o f c h a n g e s
in
a r le y A , F e r n a n d e z -
e le m e n ta l c o m p o s it io n
s t a u r o s p o r i n e i n du c e d a p o p t o s i s . A p op tosis ( in p r ess) .
du r i n g
3. A r r e b o l a F , Z a b i t i S , C a n i z a r e s F J , C u b e r o M A , C r e s p o P V , a n d F e r n a n d e z S e g u r a E . Ch a n g e s i n i n t r a c e l l u l a r s o di u m , c h l o r i n e a n d p o t a s s i u m
c o n c e n tr a tio n s
i n s t a u r o s p o r i n e - i n du c e d a p o p t o s i s . J C el l P h y siol 204: 500-507, 2005.
4. B e r n a d i P , S c o r r a n o L , C o l o n n a R , P e t r o n i l l i V
a n d D i L i s a T . M i t o c h o n dr i a
a n d c e l l de a t h . M e c h a n i s t i c a s p e c t s a n d m e t h o do l o g i c a l i s s u e s . Eu r J B ioch em
264: 681-701, 1999.
5. B o r t n e r C D , H u g h e s F M , a n d C i d l o w s k i J A . A
p r i m a r y r o l e fo r K+ a n d N a
+
e ffl u x i n t h e a c t i v a t i o n o f a p o p t o s i s . J B iol C h em 272: 32436-32442, 1997.
6. C a i n
K , L a n g la is C , S u n
X -M , B r o w n
D G , a n d
C o h e n
G M . P h y s io lo g ic a l
c o n c e n t r a t i o n o f K i n h i bi t c y t o c h r o m e c-de p e n de n t fo r m a t i o n o f t h e a p o p t o s o m e .
+
J B iol C h em 276: 41985-41990, 2001.
7. D a l l a p o r t a B , H i r s c h T , S u s i n S A , Z a m z a m i N , L a r o c h e t t e N , B r e n n e r C ,
M a r z o I , a n d K r o e m e r G .P o ta s s iu m
l e a k a g e du r i n g t h e a p o p t o t i c de g r a da t i o n
p h a s e . J I m m u nol 160: 5605-5615, 1998.
8. D a l l a p o r t a B , M a r c h e t t i P , d e P a b l o M A , M a i s s e C , D u c H -T , M e t i v i e r D ,
Z a m z a m i N , G e u s k e n s M , a n d K r o e m e r G . P l a s m a m e m br a n e p o t e n t i a l i n
t h y m o c y t e a p o p t o s i s . J I m m u nol 162: 6534-6542, 1999.
23
9. E l i s e e v R A , S a l t e r J D , G u n t e r K K
a n d G u n t e r T E . B c l -2 a n d t B i d p r o t e i n s
c o u n t e r -r e g u l a t e m i t o c h o n dr i a l p o t a s s i u m t r a n s p o r t . B ioch im B iop h y s A cta 1604:
1-5, 2003
10. F e r n á n d e z -S e g u r a E , C a ñ i z a r e s F J , C u b e r o M A , W
a r le y A , a n d C a m p o s A .
Ch a n g e s i n e l e m e n t a l c o n t e n t du r i n g a p o p t o t i c c e l l de a t h s t u di e d by e l e c t r o n p r o be
X-r a y m i c r o a n a l y s i s . Ex p C el l Res 253: 454-462, 1999.
11. G a o
W
, P u
Y , L u o
K Q , a n d
D C . Te m p o r a l r e l a t i o n s h i p
C h a n g
be t w e e n
c y t o c h r o m e c r e l e a s e a n d m i t o c h o n dr i a l s w e l l i n g du r i n g U V -i n du c e d a p o p t o s i s i n
l i v i n g H e La c e l l s . J C el l S ci 114: 2855-2862, 2001.
12. G a r l i d
K D . Ca t i o n
tr a n s p o rt in
B iop h y s A cta 1275: 123-126, 1996.
13. H e i s k a n e n
K M ,
B h a t
M B ,
W
m i t o c h o n dr i a -t h e
a n g
H -W
,
p o ta s s iu m
M a
J ,
a n d
c y c l e . B ioch im
N ie m in e n
A L .
M i t o c h o n dr i a l de p o l a r i z a t i o n a c c o m p a n i e s c y t o c h r o m e c r e l e a s e du r i n g a p o p t o s i s
i n P C6 c e l l s . J B iol C h em 274: 5654-5658, 1999.
14. H u g h e s F M , B o r t n e r C D , P u r d y
G D , a n d
C i d l o w s k i J A . I n t r a c e l l u l a r K+
s u p p r e s s e s t h e a c t i v a t i o n o f a p o p t o s i s i n l y m p h o c y t e s . J B iol C h em
30576, 1997.
15. K l u c k R M , B o s s y -W
c y t o c h r o m e -c fr o m
e tz e l E , G r e e n D R
272: 30567-
a n d N e w m e y e r D D . Th e r e l e a s e o f
m i t o c h o n dr i a : a p r i m a r y s i t e fo r bc l -2 r e g u l a t i o n o f a p o p t o s i s .
S cience 275: 1132-1136, 1997.
16. K r i c k
S , P la t o s h y n
O , S w e e n e y M , K im
H , Y u a n
J X J . A c t i v a t i o n o f K+
c h a n n e l s i n du c e s a p o p t o s i s i n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s . A m
P h y siol 280: C970-C979, 2001.
17. K r o e m e r G
519, 2000.
J P h y siol C el l
a n d R e e d J C . M i t o c h o n dr i a l c o n t r o l o f c e l l de a t h . N at M ed 6: 513-
24
18. L i P , N i j h a w a n D , B u d i h a r d j o I , S r i n i v a s u l a S M , A h m a d M , A l n e m r i E S , a n d
W
a n g
X . Cy t o c h r o m e c a n d dA TP -de p e n de n t fo r m a t i o n o f A p a f-1/ c a s p a s e -9
c o m p l e x i n i t i a t e s a n d a p o p t o t i c p r o t e a s e c a s c a de . C el l 91: 479-489, 1997.
19. M a e n o E , I s h i z a k i Y , K a n a s e k i T , H a z a m a A , a n d O k a d a Y . N o r m o t o n i c c e l l
s h r i n k a g e be c a u s e o f di s o r de r e d v o l u m e r e g u l a t i o n i s a n e a r l y p r e r e q u i s i t e t o
a p o p t o s i s . P r oc N atl A cad S ci U S A 97: 9487-9492, 2000.
20. M a n n C L , B o r t n e r C D , J e w e l l C M
a n d C i d l o w s k i J A . G l u c o c o t i c o i d –i n du c e d
p l a s m a m e m br a n e de p o l a r i z a t i o n du r i n g t h y m o c y t e a p o p t o s i s : a s s o c i a t i o n w i t h
c e ll
s h r in k a g e
a n d de g r a da t i o n
o f th e
Endocr inol ogy 142: 5059-5068, 2001.
21. M a r t i n o u J C
N a + / K+ -a de n o s i n e
tr ip h o s p h a ta s e .
a n d G r e e n D R . B r e a k i n g t h e m i t o c h o n dr i a l ba r r i e r . N at Rev M ol
C el l B iol 2: 63-67, 2001.
22. N i e t s c h H H , R o e M W , F i e k e r s J F , M o o r e A L , a n d L i d o f s k y S D . A c t i v a t i o n o f
p o ta s s iu m
a n d c h l o r i de c h a n n e l s by t u m o r n e c r o s i s fa c t o r α. R o l e i n l i v e r c e l l
de a t h . J B iol C h em 275: 20556-20561, 2000.
23. N o b e l C S I , A r o n s o n J , v a n d e n D o b b e l s t e e n D J , S l a t e r A F G . I n h i bi t i o n o f
N a +/ K+-A TP a s e m a y be o n e m e c h a n i s m
c o n t r i bu t i n g t o p o t a s s i u m
e ffl u x a n d c e l l
s h r i n k a g e i n CD 95-i n du c e d a p o p t o s i s . A p op tosis 5: 153-163, 2000.
24. O k a d a Y , M a e n o E . A p o p t o s i s , c e l l v o l u m e r e g u l a t i o n a n d v o l u m e -r e g u l a t o r y
c h l o r i de c h a n n e l s . C om p B ioh cem P h y siol A 130: 377-383, 2001.
25. O k a d a Y , M a e n o E , S h i m i z u T , M a n a b e K , M o r i S , a n d N a b e k u r a T . D u a l
r o l e s o f p l a s m a l e m m a l c h l o r i de c h a n n e l s i n i n du c t i o n o f c e l l de a t h . P f l u ger s A r ch
Eu r J P h y siol 448: 287-295, 2004
25
26. O k a d a
Y , M a e n o
E , S h im iz u
T , D e z a k i K , W
a n g
J , a n d
M o r is h im a
S .
R e c e p t o r -m e di a t e d c o n t r o l o f r e g u l a t o r y v o l u m e de c r e a s e (R V D ) a n d a p o p t o t i c
v o l u m e de c r e a s e (A V D ). J P h y siol 532: 3-16, 2001.
27. O ’ N e i l l W
C . P h y s i o l o g i c a l s i g n i fi c a n c e o f v o l u m e -r e g u l a t o r y t r a n s p o r t e r s . A m
J
P h y siol C el l P h y siol 276: C995-C1011, 1999.
28. O ’ R o u r k e
B . P a th o p h y s io lo g ic a l a n d p r o te c tiv e
c h a n n e l s . J P h y siol 529: 23-36, 2000.
29. P o r c e l l i A M , G h e l l i A , Z a n n a
r o le s
o f m i t o c h o n dr i a l i o n
C , V a le n t e P , F e r r o n i S , a n d
R u g o lo
M .
A p o p t o s i s i n du c e d by s t a u r o s p o r i n e i n E CV 304 c e l l s r e q u i r e s c e l l s h r i n k a g e a n d
u p r e g u l a t i o n o f Cl - c o n du c t a n c e . C el l D eath D if f er 11: 655-662, 2004.
30. R a s o l a A , F a r D F , H o f m a n P , a n d R o s s i B . La c k o f i n t e r n u c l e o s o m a l D N A
fr a g m e n t a t i o n i s r e l a t e d t o Cl - e ffl u x i m p a i r m e n t i n h e m a t o p o i e t i c c e l l a p o p t o s i s .
F A S EB J 13: 1711-1723, 1999.
31. R e m i l l a r d C V
a n d Y u a n J X J . A c t i v a t i o n o f K+ c h a n n e l s : a n e s s e n t i a l p a t h w a y
i n p r o g r a m m e d c e l l de a t h . A m
2004.
J P h y siol L u ng C el l M ol P h y siol 286: L49-L67,
32. S a l i d o M , V i l c h e s J , L o p e z A , a n d
R o o m a n s G M . X-r a y m i c r o a n a l y s i s o f
e t o p o s i de -i n du c e d a p o p t o s i s i n t h e P C-3 p r o s t a t i c c a n c e r c e l l l i n e . C el l B iol I nt 25:
499-508, 2001.
33. S e g a l M S a n d B e e m
E . E ffe c t o f p H , i o n i c c h a r g e , a n d o s m o l a l i t y o n c y t o c h r o m e
c-m e di a t e d c a s p a s e -3 a c t i v i t y . A m
2001.
34. S h i m i z u
T , N u m a ta T , a n d
J P h y siol C el l P h y siol 281: C1196-C1204,
O k a d a Y . A
r o le o f r e a c t iv e o x y g e n s p e c ie s in
a p o p t o t i c a c t i v a t i o n o f v o l u m e -s e n s i t i v e Cl - c h a n n e l . P r oc N atl A cad S ci U S A
101: 6770-6773, 2004.
26
35. S k e p p e r J N , K a r y d i s I , G a r n e t t M R , H e g y i L , H a r d w i c k
M it c h in s o n
M J ,
a s s o c ia te d w ith
a n d
e a r ly
C a r y
sta g e s
N R B . Ch a n g e s i n
o f a p o p to s is
in
S J , W
a r le y
A ,
e le m e n ta l c o n c e n tr a tio n s a r e
h u m a n
m o n o c y t e -m a c r o p h a g e s
e x p o s e d t o o x i di z e d l o w -de n s i t y l i p o p r o t e i n : a n X-r a y m i c r o a n a l y t i c a l s t u dy . J
P ath ol 188: 100-106, 1999.
36. S t r i c k R , S t r i s s e l P L , G a v r i l o v K , a n d L e v i -S e t t i R . Ca t i o n –c h r o m a t i n bi n di n g
a s
s h o w n
by
io n
m ic r o s c o p y
is
e s s e n t ia l
c h r o m o s o m e s . J C el l B iol 155: 899-910, 2001.
37. S z a b ò I , L e p p l e -W
fo r
th e
stru c tu ra l
in te g r it y
o f
ie n h u e s A , K a b a , K N , Z o r a t t i, M , G u lb in s E , a n d L a n g F .
Ty r o s i n e k i n a s e -de p e n de n t a c t i v a t i o n
o f a c h l o r i de c h a n n e l i n
CD 59-i n du c e d
a p o p t o s i s i n T l y m p h o c y t e s . P r oc N atl A cad S ci U S A 95: 6169-6174, 1998.
38. T h o m p s o n G J , L a n g l a i s C , C a i n K , C o n l e y E C , a n d C o h e n G M . E l e v a t e d
e x t r a c e l l u l a r [ K+] i n h i bi t s de a t h -r e c e p t o r - a n d c h e m i c a l -m e di a t e d a p o p t o s i s p r i o r
t o c a s p a s e a c t i v a t i o n a n d c y t o c h r o m e c r e l e a s e . B ioch em J 357: 137-145, 2001.
39. v o n
A h se n
O , R e n k e n
C , P e r k in s G , K lu c k
R M , B o s s y -W
e tz e l E , a n d
N e w m a y e r D D . P r e s e r v a t i o n o f m i t o c h o n dr i a l s t r u c t u r e a n d fu n c t i o n a ft e r B i d- o r
B a x -m e di a t e d c y t o c h r o m e c r e l e a s e . J C el l B iol 150: 1027-1036, 2000.
40. V u C C Q , B o r t n e r C D
a n d C i d l o w s k i J A . D i ffe r e n t i a l i n v o l v e m e n t o f i n i t i a t o r
c a s p a s e s i n a p o p t o t i c v o l u m e de c r e a s e a n d p o t a s s i u m
e ffl u x du r i n g F a s - a n d U V -
i n du c e d c e l l de a t h . J B iol C h em 276: 37602-37611, 2001.
L . A n u l t r a v i o l e t -a c t i v a t e d K+ c h a n n e l m e di a t e s
41. W
a n g L , X u
42. W
a n g X , X ia o A Y , I c h in o s e T , a n d
D , D a i W
, L u
a p o p t o s i s o f m y e l o bl a s t i c l e u k e m i a c e l l s . J B iol C h em 274: 3678-3685, 1999.
a n a lo g s o n
Y u
S P . E ffe c t s o f t e t r a e t h y l a m m o n i u m
a p o p t o s i s a n d m e m br a n e c u r r e n t s i n
P h ar m acol Ex p T h er 295: 524-530, 2000.
c u ltu r e d c o r tic a l n e u r o n s . J
27
43. W
a r l e y A . S t a n da r ds fo r t h e a p p l i c a t i o n o f X-r a y m i c r o a n a l y s i s t o bi o l o g i c a l
44. W
a r l e y A . Ch a p t e r 8 i n X-r a y m i c r o a n a l y s i s fo r bi o l o g i s t s . V o l 16 i n t h e s e r i e s
s p e c i m e n s . J M icr osc 157: 135-147, 1990.
P r a c t i c a l M e t h o ds i n E l e c t r e o n M i c r o s c o p y (e d A M
P r e s s , 1997.
45. W
G l a u e r t ) Lo n do n : P o r t l a n d
a r l e y A . M i c r o s c o p y – B i o m e di c a l A p p l i c a t i o n s i n E n c y c l o p a e di a o f
A n a l y t i c a l S c i e n c e , S e c o n d E di t i o n (e ds P J W o r s fo l d, A To w n s h e n d a n d CF
P o o l e ) E l s e v i e r , O x fo r d V o l p p 41-50, 2005.
46. W
a r l e y A a n d S k e p p e r J N . Lo n g fr e e z e -dr y i n g t i m e s a r e n o t n e c e s s a r y du r i n g
t h e p r e p a r a t i o n o f t h i n s e c t i o n s fo r X-r a y m i c r o a n a l y s i s . J M icr osc 198: 116-123,
2000.
47. W
e i L , X i a o A Y , J i n C , Y a n g A , L u Z Y , Y u S P . E ffe c t s o f c h l o r i de a n d
p o t a s s i u m c h a n n e l bl o c k e r s o n a p o p t o t i c c e l l s h r i n k a g e a n d a p o p t o s i s i n c o r t i c a l
n e u r o n s . P f l u ger s A r ch Eu r J P h y siol 448: 325-334, 2004.
48. W
u L , X i a o A Y , J i n C , Y a n g A , L u Z Y a n d Y u S P . E ffe c t s o f c h l o r i de a n d
p o t a s s i u m c h a n n e l bl o c k e r s o n a p o p t o t i c c e l l s h r i n k a g e a n d a p o p t o s i s i n c o r t i c a l
n e u r o n s . P f l u ger s A r ch Eu r J P h y siol 448: 325-334, 2004.
49. W
y l l i e A H , K e r r J F , a n d C u r r i e A R . Ce l l de a t h : t h e s i g n i fi c a n c e o f a p o p t o s i s .
I nt Rev C y tol 68: 251-306, 1980.
50. X i a o A Y , W
a n g X Q , Y a n g A , Y u
S P . S l i g h t i m p a i r m e n t o f N a +,K+-A TP a s e
s y n e r g i s t i c a l l y a g g r a v a t e s c e r a m i de - a n d β -a m y l o i d-i n du c e d a p o p t o s i s i n c o r t i c a l
n e u r o n s . B r ain Res 955: 253-259, 2002.
51. Y a s u g i E , U e m u r a I , K u m a g a i T , N i s h i k a w a Y , Y a s u g i S , a n d Y u o A .
D i s r u p t i o n o f m i t o c h o n dr i a i s a n e a r l y e v e n t du r i n g do l i c h y l m o n o p h o s p h a t e –
i n du c e d a p o p t o s i s i n U 937 c e l l s . Z ool og S ci 19: 7-13, 2002.
28
52. Y u S P , C a n z o n i e r o L M T , a n d C h o i D W
O p C el l B iol 13: 405-411, 2001.
. I o n h o m e o s ta s is a n d a p o p to s is . C u r r
53. Z i m m e r m a n n K C , B o n z o n C , a n d G r e e n D R . Th e m a c h i n e r y o f p r o g r a m m e d
c e l l de a t h . P h ar m acol T h er 92: 57-70, 2001.
29
L e g e n d s fo r F ig u r e s
F i g u r e 1 . E ffe c t o f U V i r r a di a t i o n o n t h e u l t r a s t r u c t u r e o f U 937 c e l l s . A p o p t o s i s w a s
i n du c e d by U V i r r a di a t i o n a s de s c r i be d i n m a t e r i a l s a n d m e t h o ds . S a m p l e s t a k e n a t
v a r i o u s t i m e p o i n t s w e r e e i t h e r p r o c e s s e d fo r e l e c t r o n m i c r o s c o p y (A -D ), o r c r y o fi x e d
a n d c r y o s e c t i o n e d fo r m i c r o a n a l y s i s (E , F ). U n t r e a t e d c e l l s s h o w e d n o r m a l
m o r p h o l o g y (A ) m a r g i n a t i o n o f c h r o m a t i n be c a m e a p p a r e n t a ft e r 60m i n u t e s (B ) a n d
fr a g m e n t a t i o n o f t h e n u c l e i be g a n t o a p p e a r a t 90 m i n u t e s a ft e r i r r a di a t i o n (C). A ft e r
120 m i n u t e s a s m a l l p e r c e n t a g e o f c e l l s s h o w e d s e c o n da r y n e c r o s i s (D ) c h a r a c t e r i s e d
by e l e c t r o n l u c e n t c y t o p l a s m . I n c r y o s e c t i o n s o f u n t r e a t e d c e l l s (E ) t h e n o r m a l
m o r p h o l o g i c a l fe a t u r e s , c y t o p l a s m , n u c l e i a n d m i t o c h o n dr i a w e r e c l e a r l y a p p a r e n t ,
a n d i n c r y o s e c t i o n s o f U V i r r a di a t e d c e l l s (F ) m a r g i n a t i o n o f t h e c h r o m a t i n w a s
c l e a r l y s e e n . N = n u c l e u s , M = m i t o c h o n dr i a , a r r o w de n o t e s m a r g i n a t e d c h r o m a t i n .
B a r : 5 µm .
F i g u r e 2 . Co n c e n t r a t i o n s (m m o l e s / k g dr y w e i g h t ) o f e l e m e n t s i n w h o l e s e c t i o n s o f
U 937 c e l l s a t di ffe r e n t t i m e p o i n t s a ft e r t h e o n s e t o f a p o p t o s i s i n du c e d by U V
i r r a di a t i o n . Ce l l s w e r e p r e p a r e d fo r E P XM A a s de s c r i be d i n m a t e r i a l s a n d m e t h o ds
a n d fo r a n a l y s i s t h e a r e a s c a n n e d w a s e n l a r g e d t o c o v e r t h e w h o l e s e c t i o n o f t h e c e l l
bu t w i t h t h e s c a n n e d a r e a r e m a i n i n g w i t h i n t h e bo r de r s o f t h e c e l l * p < 0.05, **
p < 0.01, *** p < 0.001 c o m p a r e d t o c o n t r o l v a l u e s .
F i g u r e 3 . E l e m e n t c o n c e n t r a t i o n s a n d c y t o c h r o m e c r e l e a s e i n m i t o c h o n dr i a o f U 937
c e l l s u n de r g o i n g U V -i n du c e d a p o p t o s i s . (A ) Co n c e n t r a t i o n s (m m o l / k g dr y w e i g h t ) o f
di ffe r e n t e l e m e n t s i n t h e m i t o c h o n dr i a o f U 937 c e l l s a t di ffe r e n t t i m e p o i n t s a ft e r t h e
o n s e t o f a p o p t o s i s i n du c e d by U V i r r a di a t i o n * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001
c o m p a r e d t o c o n t r o l v a l u e s . (B ) Cy t o c h r o m e c r e l e a s e a n d a c t i v e c a s p a s e -3. S a m p l e
r e c o r ds fr o m c o n fo c a l l a s e r s c a n n i n g m i c r o s c o p y o f U 937 c e l l s u n de r g o i n g U V -
i n du c e d a p o p t o s i s . Cy t o c h r o m e -c s t a i n i n g (g r e e n ) s h o w s a p u n c t a t e fo r m
in c o n tr o l
c e l l s , t h e s t a i n i n g w a s s l i g h t l y de c r e a s e d a t 30 m i n a ft e r U V e x p o s u r e a n d w a s l o s t i n
t h e l a t e r s t a g e s o f t h e a p o p t o t i c p r o c e s s (90 a n d 120 m i n ). S t a i n i n g fo r a c t i v e c a s p a s e 3 w a s r a r e l y p r e s e n t i n c o n t r o l c e l l s o r a t 30 m i n bu t be c a m e a p p a r e n t i n t h e m a j o r i t y
o f c e l l s by 60 m i n . S t a i n i n g w i t h H o e s c h t 33342 s h o w e d t h a t t h e c h r o m a t i n h a d a
30
di s p e r s e di s t r i bu t i o n i n c o n t r o l c e l l s a n d a t 15 m i n u t e s bu t by 90 m i n u t e s h a d be g u n t o
c o n de n s e o n t h e n u c l e a r m a r g i n , by 120 m i n fr a g m e n t a t i o n o f c h r o m a t i n w a s
de t e c t e d. Th r e e s e p a r a t e e x p e r i m e n t s w e r e u n de r t a k e n .
F i g u r e 4 . Ch a n g e s i n t h e n u c l e u s o f U 937 c e l l s u n de r g o i n g U V i n du c e d a p o p t o s i s .
(A ) Co n c e n t r a t i o n s (m m o l / k g dr y w e i g h t ) o f di ffe r e n t e l e m e n t s i n t h e n u c l e i o f U 937
c e l l s a t di ffe r e n t t i m e p o i n t s * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 c o m p a r e d t o c o n t r o l
v a l u e s . (B ) Ch a n g e s i n n u c l e a r m o r p h o l o g y s e e n a t t h e l i g h t m i c r o s c o p e l e v e l a ft e r
s t a i n i n g by H o e s c h t 33342. Co n t r o l c e l l s s h o w e d a h o m o g e n e o u s di s t r i bu t i o n o f
c h r o m a t i n w i t h i n t h e n u c l e u s w h e r e a s c e l l s t h a t h a d be e n i n c u ba t e d fo r 90 m i n
s h o w e d c o n de n s a t i o n o f c h r o m a t i n a t t h e n u c l e a r bo r de r s . (C) Th e t i m e c o u r s e o f
c h a n g e s i n t h e n u m be r o f c e l l s s h o w i n g c h a n g e s i n n u c l e a r m o r p h o l o g y t h e s e r e s u l t s
a r e t h e m e a n s o f fi v e di ffe r e n t e x p e r i m e n t s . (D ) D N A fr a g m e n t a t i o n i n du c e d by U V
i r r a di a t i o n a s de t e r m i n e d by a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . D N A l a dde r i n g be g a n t o
be c o m e a p p a r e n t a t 60 m i n u t e s a ft e r e x p o s u r e t o U V l i g h t , a n d w a s m o r e p r o m i n e n t a t
90 a n d 120 m i n u t e s a ft e r U V e x p o s u r e . (E ) E x p r e s s i o n o f P A R P i n U 937 c e l l s a ft e r
U V i r r a di a t i o n . Th e %
o f P A R P p o s i t i v e c e l l s i n c r e a s e d be t w e e n 30 a n d 60 m i n u t e s
a ft e r U V i r r a di a t i o n , t h i s s h a r p i n c r e a s e p r e c e de d t h a t o f c e l l s s h o w i n g c h r o m a t i n
c o n de n s a t i o n (c o m p a r e t o F i g 4C). Th e r e s u l t s a r e t h e m e a n fr o m t h r e e s e p a r a t e
e x p e rim e n ts .
F i g u r e 5 . Ch a n g e s i n t h e c y t o p l a s m
o f U 937 c e l l s u n de r g o i n g U V -i n du c e d a p o p t o s i s .
(A ) Co n c e n t r a t i o n s (m m o l / k g dr y w e i g h t ) o f di ffe r e n t e l e m e n t s i n t h e c y t o p l a s m
U 937 c e l l s a t di ffe r e n t t i m e p o i n t s a ft e r t h e o n s e t o f a p o p t o s i s i n du c e d by U V
i r r a di a t i o n * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 c o m p a r e d t o c o n t r o l v a l u e s . (B )
A p p e a r a n c e o f c e l l s s h o w i n g a c t i v e c a s p a s e -3 a ft e r t h e o n s e t o f U V i n du c e d
a p o p t o s i s . Th e r e s u l t s a r e t h e m e a n fr o m 3 s e p a r a t e e x p e r i m e n t s .
o f
31
Ta bl e 1. Ch a n g e s i n t h e c o n c e n t r a t i o n s o f Cl a n d K a ft e r U V i r r a di a t i o n o f U 937 c e l l s
e x p r e s s e da s %
Ti m e
(m i n )
de c r e a s e fr o m t h e c o n t r o l v a l u e .
%
M i t o c h o n dr i a
Cy t o p l a s m
de c r e a s e
N u c le u s
Ce l l s e c t i o n
Cl
K
Cl
K
Cl
K
Cl
K
15
52
12
35
5
37
4
32
8
60
35
20
33
17
37
16
32
0
30
90
120
-
41
2
-*
-
24
29
32
-
-
40
12
5
19
-*
26
-
-
43
16
9
22
-*
28
-
-
40
16
2
24
-*
26
30
*N o t e t h a t by 120 m i n a ft e r i r r a di a t i o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f Cl h a d r e t u r n e d t o c o n t r o l
v a lu e s .
32
F ig u r e 1
33
F ig u r e 2
34
F ig u r e 3
35
F ig u r e 4 A
36
F ig u r e 4 B
37
F ig u r e 5