Veterinary Bacteriology and
Mycology (3142304) : Lab-10
(1)
(2)
(3)
( )
(4)
(5)
(6)
(7)
Carbohydrate Fermentation Tests
วัตถุประสงค :
n แบคทีเรียสามารถใช้ (ferment)
carbohydrates (sugars)
n มักเป็นคุณสมบัติของ gram -ve bacteria
หลักการ :
n อาหารเลีย
้ งเชื้อ peptone มีส่วนประกอบ
single fermentable CHO (lactose, sucrose, หรือ glucose)
n มี phenol red เป็น pH
pH--indicator (Phenol red broth)
n “Durham tube” ในหลอดอาหารเลี้ยงเชื้อใช้ดักแก๊สที่เกิดขึ้น
ในขณะ fermentation
Carbohydrate Fermantation
Amino Acid Decarboxylation
Nitrate Reduction
Starch Hydrolysis
Casein Digestion
Gelatin Hydrolysis
Lecithovitellin (LV
(LV)) Reaction
(18 ส.ค. 2554)
รศ.น.สพ.ดร. ธงชัย เฉลิมชัยกิจ
Acid-Base Indicators
pH Indicators
Methyl violet
Malachite green
Methyl orange
Congo red
Bromocresol green
Methyl red
Bromocresol purple
Bromthymol blue
Phenol red
Phenolphthalein
Alizarin yellow R
n
เชื้อที่ใชทดสอบ
E. coli
Enterobacter cloacae
Citrobacter diversus
n
อาหารเลี้ยงเชื้อ
1% lactose broth with Durham
tube จํานวน 3 หลอด
n
อานผล : หลังจาก inoculate เชื้อและ
24--48 ชม
ชม..
incubate 37 OC 24
pH Range
0.0-1.6
0.2-1.8
3.2-4.4
3.0-5.0
3.8-5.4
4263
4.2-6.3
5.2-6.8
6.0-7.6
6.8-7.4
8.2-10.0
10.1-13.0
Alkaline
Blue
Blue/Green
Yellow
Red
Blue
Yellow
Purple
Blue
Red
Red
Orange/Red
http://en.wikipedia.org/wiki/PH_indicator
www.carlton.paschools.pa.sk.ca/chemical/equilibrium/abindicators.htm
Carbohydrate Fermentation : Lab. Materials
Acid
Yellow
Yellow
Red
Violet
Yellow
Red
Yellow
Yellow
Yellow
Colourless
Yellow
Carbohydrate Fermentation : Lab. Results
(1) Control
(2) S. aureus
(3) P. vulgaris
(4) P. aeruginosa
(5) E. coli
Page 1
Lactose
1 2 3 4 5
Sucrose
1 2 3 4 5
Glucose
1 2 3 4 5
Negative
Acid
Negative
Negative
Acid, Gas
Negative
Acid
Acid, Gas
Negative
Negative
Negative
Acid
Acid, Gas
Negative
Acid, Gas
Amino Acid Decarboxylation Tests
Amino Acid Decarboxylation Tests
หลักการ :
n อาหารเลีย
้ งเชื้อมีส่วนประกอบ 1 % amino acid
(Lysine,, Ornithine หรือ Arginine
(Lysine
Arginine))
มี bromcresol purple เป็น pH
pH--indicator (5
(5.2-6.8)
วัตถุประสงค :
n แบคทีเรียสามารถ decarboxylate amino acids
{Decarboxylation = ขบวนการแยก carboxyl group (COOH)
COOH)
จาก amino acid ทําให้เกิด amine และ carbon dioxide
dioxide}}
n
R-decarboxylase
R-CH
CH--NH2-COOH
R-CH2-NH2 + CO2
LysineLysine
decarboxylase
Cadaverine (diamine)
L-Lysine
OrnithineOrnithine
decarboxylase
Putrescine (diamine
diamine))
L-Ornithine
n
n
Arginine--decarboxylase Putrescine (diamine)
L-Arginine Arginine
Amino Acid Decarboxylation Tests : Lab.Materials
เชื้อที่ใชทดสอบ
E. coli
Citrobacter diversus
Klebsiella aerogenes
n อาหาร
อาหารเลี
เลี้ยงเชื้อ
วัตถุประสงค :
n เพื่อดูความสามารถของแบคทีเรียในเรื่อง nitrate reduction
หลักการ :
n อาหารเลีย
้ งเชื้อ Trypticase nitrate broth
_
_
Nit t reductase
d t
NO + 2H+ Nitrate
NO
Amino acid decarboxylase medium
3
Control = 3 tubes (ไม่
(ไม่มี amino acid)
Lysine = 3 tubes
Ornithine = 3 tubes
Arginine = 3 tubes
n Inoculate เชื้อ และ
และเติ
เติม liquid parraffin
อ่านผลหลังจาก incubate 37 OC 4-6 วัน
z
z
Amine มีคุณสมบัติเป็นด่าง ; + ve=
ve = มีสีม่วง
ถ้าไม่มีขบวนการ decarboxylation
- ve = อาหารเลี้ยงเชื้อมีสีเหลือง
Nitrate Reduction Test
n
Nitrate Reduction Test : Lab. Materials
สภาพกรดเป็
สภาพกรดเปนปจจยสาคญในการ
นปัจจัยสําคัญในการ decarboxylation
ดังนั้นในสภาพ
ในสภาพ anaerobic จะช่วยการ fermentation
ทําให้เกิดสภาพ
สภาพกรดขึ
กรดขึ้นก่อน
n
NH2
2
e-
หลัง incubation 24-48 ชม. เติม
Sulfanilic acid และ a-naphthylamine
NH2
+
N=N
+ HNO2
H2O +
SO3H
SO3H
NH2
Sulfobenzene azoα-naphthylamine
(Cherry red color)
Nitrate Reduction Test : Lab. Procedure & Results
หลัง incubate 24-48 ชม., เติม sulfanilic acid
5 หยด และ α-naphthylamine 5 หยด, เขย่า
n ถ้าอาหารเลี้ยงเชื้อเปลี่ยนเป็นสีแดง = + ve test
(แบคทีเรียสามารถ reduce nitrate)
n
เชื้อที่ใชทดสอบ
E. coli
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Corynebacterium xerosis
อาหารเลยงเชอและ
อาหารเลี
้ยงเชื้อและ Reagents
Nitrate broth จํานวน
2 หลอด
Solution A (sulfalidinic acid) 1 ขวด
Solution B (a-naphthylamine) 1 ขวด
Zinc dust
1 ขวด
n
n
Page 2
-ve
+ve
-ve
ผล -ve เพราะเชื้อไม่ได้ใช้ NO3
แต่ก็อาจเป็น False -ve ? เนื่องจากเชื้ออาจ
เปลีย่ น NO2 ไปเป็นรูปแบบอื่นๆ หมดแล้ว
กรณีที่ไม่มีสีแดงเกิดขึ้นหลังจากเติม nitrite test reagents
(Sulfanilic acid และ a-naphthylamine) แสดงว่า :
Testing for Unaltered Nitrate
หลังจากการเติม zinc powder ปริมาณเล็กน้อย
ในหลอดที่ให้ผล - ve
Pseudomonas aeruginosa : positive
(1) Nitrate ไม่ได้ถูกใช้ (no reduction process) หรือ
(2) Nitrate ถูก reduced
_ จนได้ผลผลิตอื่นที่เกินขั้นของ nitrite
NO2
NH3 หรือ
_
_
+
2NO + 10 + 12H
N + 6H O
3
e
NO3
2
2
เติม zinc dust เล็กน้อย +2
_
+ Zn
Reducing agent
(no color change) เพราะแบคทีเรียได้เปลี่ยน
Nitrate เป็ป็น NH3 และ N2 ไปแล้
ไป ้ว
Corynebacterium xerosis : negative
(color change to red) เพราะ NO3 ที่มีอยู่ถูก
Reduced ด้วย Zn+2 เป็น NO2 แล้วทําปฏิกิรยิ า
กับ Nitrite Test Reagents
_
NO2
STARCH HYDROLYSIS TEST (ต่อ)
STARCH HYDROLYSIS TEST
Method :
1. Inoculate B. subtilis and E. coli on each of starch agar plate
2. Incubate at 37 OC for 24 hrs.
Purpose :
To determine the ability of the organism to produce
“amylase enzyme” which digests or hydrolyses starch
(long-chain carbohydrates or complex sugars)
Interpretation :
Flood the cultures with Lugol
Lugol’ss
solution, ทิ้งไว้ 5-10 นาที
Materials :
1. Bacillus subtilis (Gram +ve)
2. Escherichia coli (Gram -ve)
Positive
Clear zone around colonies
Media & Reagents :
Negative
1. Two starch agar plates
2. Lugol’s iodine solution
No clear zone around colonies
CASEIN DIGESTION TEST (ต่อ)
CASEIN DIGESTION TEST
Method :
1. Spot inoculation of A. hydrophila and E. coli on each
of casein agar plates
2. Incubate at 37 OC for 24 hrs.
Purpose :
To determine the ability of organisms to produce
caseinase (proteinase)
proteinase) enzyme which digest casein
Materials :
Interpretation :
(1) Escherichia coli
(2) Bacillus subtilis
Positive
Clear zone around colonies
Media & Reagents :
Negative
Two casein agar plates (5 % skim milk, peptone and
beef extract)
No clear zone around colonies
Page 3
GELATIN HYDROLYSIS TEST (ต่อ)
GELATIN HYDROLYSIS TEST
Method :
Purpose :
ศึกษาคุณสมบัติของแบคทีเรียที่มี gelatinase enzyme ซึ่งสามารถย่อย
(hydrolyse) gelatin, as a sole source of protien
Interpretation :
Before reading,
g flood the cultures with Acid Mercuric Chloride,
Chloride,
leaving for 5-10 minutes
Materials :
(1) Escherichia coli (Gram -ve)
(2) Aeromonas hydrophila (Gram -ve)
Negative
No clear zone around colony
Media & Reagents :
(1) Gelatin agar plates
(2) Acid mercuric chloride solution
Positive
Clear zone around colony
Interpretation LV-Reaction :
LECITHOVITELLIN REACTION
Zone of opalescent (Milky) around colony indicated
Lecithinase activity against lecithovitellin in egg yolk
z Precipitation around colony indicated Lipase activity
z
Purpose of LV-Reaction :
z
To determine the ability of the organisms to produce
lecithinase or/and lipase (lecithinase & lipase activities)
Materials :
1. Inoculate by cross streaking of A. hydrophila
and E. coli on each of gelatin plates
2. Incubate at 37 OC for 24 hrs.
(1) Vibrio parahaemolyticus
(2) Bacillus cereus
(3) Bacillus subtilis
Media & Reagents : Two egg yolk agar plates
Method :
(1) Spot inoculate A. hydrophila, B. cereus, and B. subtilis
on each of LV-agar plate
(2) Incubate at 37 OC for 24 hrs.
LV-Reaction -ve
LV-Reaction +ve
(Lecuthinase activity)
LV-Reaction +ve
(Lipase activity)
มีคาํ ถามไหมครับ ?
พบกันที่ Lab.ครับ
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-toc.html
Page 4