Bakteri ve Mantarların MALDI TOF ile Tanımlanması Tanıl Kocagöz Mikroorganizmaların Tanımlanmasında Spektroskopik Yöntemler Çağrı Ergin Nükleik Asit Temelli Mikroorganizma Tanımlama Yöntemleri Barış Otlu Prof. Dr. TANIL KOCAGÖZ MALDI TOF  Matrix Assisted Laser Desorption Ionization  Time Of Flight  Matriks: örneğin karıştırıldığı, molekülleri iyonize eden kimyasal  Lazer: Morötesi (Ultraviyole)  Dezorpsiyon: Moleküllerin lazer ışını ile ısıtılıp buharlaştırılarak yüzeyden ayrılması (havalanması)  İyonizasyon: Moleküllerin matriks kimyasalından proton alarak yüklü hale gelmesi  Time of Flight: Örneklerin yüzeyden saptayıcıya kadar uçtuğu sırada geçen süre. Matriks  Zayıf asit çözeltisidir. Kolayca proton (H+) verir.  Lazer ışınını tutup ortamın ısınmasını da bu maddenin sağladığı düşünülmektedir.  Ortamın ısınması molekküllerin buharlaşması ve yüzeyden ayrılmasını sağlar  Matriks maddesi hidrojen iyonlarını (H+) hücrelerden gelen moleküllere aktararak onların (+) yüklü hale gelmesini sağlar Lazer ile Dezorpsiyon ve İyonizasyon  İyonizasyon morötesi ışınlar ile sağlanıyor  Diğer iyonizasyon yöntemleri DNA, protein gibi biyopolimerleri parçalayabildiğinden MALDI yumuşak bir iyonizasyon yöntemi olarak değerlendiriliyor  Moleküllerin bütünlüğünün korunması incelemenin güvenilirliği açısından çok önemli Uçuş Süresi  İyonize olup havalanan moleküller aygıtın tüpü içerisindeki yüksek elektrik gerilimi nedeni ile bulundukları yüzeyden algılayıcıya doğru hızlandırılırlar.  İncelenen moleküllerin ağırlığı ne kadar az ise hızlanma o kadar fazla, algılayıcıya ulaşma süresi o kadar kısa olur.  Moleküllerin uçuş sırasında hava molekülleri ile çarpışmasını ortadan kaldırmak için incelemenin yapıldığı tüpün içindeki hava boşaltılarak vakum oluşturulur. Reflektron MALDI TOF KULLANIM ALANLARI  Biyokimya; organik kimya; polimer kimyası; mirobiyoloji Bakteri ve Mantar Türlerinin Belirlenmesinde MALDI TOF  Van Veen ve ark. 2010 yılında yoğun bir mikrobiyoloji laboratuvarında yaptıkları çalışmada hem bakterilerin hem de mayaların türlerini büyük bir doğruluk oranı ile saptayabilmişlerdir. MALDI TOF un doğru saptama oranı (%92), klasik biyokimyasal testlerin doğru saptama oranından (%83).  Bakterilerin önceden yıkama ve parçalama işlemi uygulanmadan doğrudan MALDI TOF plağına yüklenebileceğini doğrulayan birçok çalışma yayınlanmıştır.  Justesen ve ark. anaerop bakterilerin MALDI TOF ile tür saptanması üzerine yaptıkları çalışmada bu yöntemin alışılmış tür saptama yöntemlerinden daha doğru sonuçlar vermesine karşın doğru tür saptama düzeyi %67,2’de kalmıştır.  Bir bakteri türünden tanımlanan MALDI TOF biçemleri, değerlendirme programlarına ne kadar çok tanıtılırsa, bu bakteri türünün doğru tanımlanma oranı o ölçüde artmaktadır.  Mikobakteriler ve dermatofitler için standardizasyon çalışmaları devam etmektedir. Mikobakteriler için de MALDI TOF biçemleri konusunda bilgi bankasının zenginleştirilmesi gerekmektedir. MALDI TOF ile Hızlı Antibiyotik Duyarlılık Testi  Mikroorganizmaların türünün saptanması yanında MALDI TOF ile hızlı antibiyotik duyarlılık testlerinin yapılması da kuramsal olarak olanaklı görünmektedir. Bir süre antibiyotiksiz ve antibiyotikli besiyerinde bekletilen bakterinin MALDI TOF biçemleri karşılaştırılarak aralarında farklılık olup olmadığı belirlenebilir. Biçemlerin farklılığı bakterinin antibiyotiğe duyarlı olduğunu gösterirken benzerliği dirençli olduğunu gösterebilir. Kaynaklar  Wikipedia: Matrix-assisted laser desorption/ionization: http://en.wikipedia.org/wiki/Matrixassisted_laser_desorption/ionization  Seng P, Drancourt M, Gouriet F, La Scola B, Fournier PE, Rolain JM, Raoult D. Ongoing Revolution in Bacteriology: Routine Identification of Bacteria by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry. Clin. Inf. Dis. 2009, 49:543-551  Van Veen, SQ, Claas ECJ, Kuijper EJ. High-Throughput Identification of Bacteria and Yeast by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry in Conventional Medical Microbiology Laboratories. J. Clin. Microbiol. 2010, 48:900-907  Highly Efficient Classification and Identification of Human Pathogenic Bacteria by MALDITOF MS. Hsieh SY, Tseng CL, Lee YS, Kuo AJ, Sun CF, Lin YH, Chen JK. Molecular & Cellular Proteomics. 2007, 7.2:449-456  Justesen US, Holm A, Knudsen E, Andersen LB, Jensen TG,1 Kemp M, Skov MN, Gahrn-Hansen B, Møller JK. Species Identification of Clinical 1 Isolates of Anaerobic Bacteria: a Comparison of Two Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry Systems. J. Clin. Microbiol. 2011, 10 (doi:10.1128/JCM.05788-11)  El Khe´chine A, Couderc C, Flaudrops F, Raoult D, Drancourt M. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification of Mycobacteria in Routine Clinical Practice. PLOS, 2011, (6)9:e24720  Theel ES, Hall L, Mandrekar J, Wengenack NL. Dermatophyte Identification Using MatrixAssisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry. J. Clin. Microbiol. 2011, 9 (doi:10.1128/JCM.01280-11)