MOLEKÜLER YÖNTEMLERİN KLİNİK MİKOLOJİDE KULLANIMI. NE ZAMAN, NEREDE, NE KADAR? Dr. Mehmet Ali SARAÇLI GATA T. Mikrobiyoloji AD. • Kjell Kleppe • H. Gobind Khorana Karry Mullis 2/26 İnvazif fungal enfeksiyonlar • • • • Önemli mortalite/morbidite nedeni Candida spp. (C.albicans (C.albicans)) Aspergillus spp Cryptococcus neoformans, neoformans, Glomeromycota (eski adı zigomycota; Rhizopus Rhizopus,, Mucor,.. Mucor,..), ), Fusarium,, Acremonium, Penicillium, Fusarium Scedosporium spp spp.. 3/26 CANDIDA CİNSİ • Nozokomiyal dolaşım sistemi enfeksiyonlarının %8%8-9 etkeni (4. sırada) • ~%50 olguda antemortem kültür negatif • Geleneksel yöntemlerle tür tanımlaması en az 22-4 gün alır • Moleküler tanı 66-8 saat • >100 Candida türü – Panfungal PCR → Pan Candida PCR → Multipleks PCR – PCR → Türe özgün prob hibridizasyon – PCR → Dizi analizi • fks1 mutasyonu → Ekinokandin erg mutasyonları → ergosterol inhibitörleri (Azol, allilamin, tiokarbamat, morfolinler) 4/26 • 54 çalışma/ 4,694 hasta/ 963 ispatlanmış, muhtemel veya olası invazif kandidoz • Test duyarlılığı: – Kandidemi %100 – İnvazif kandidoz şüphesi %95 • Test özgüllüğü: >%90 • Test performansını etkileyen faktörler – Tam kan kullanılması – rRNA veya P450 gen bölgesinin hedef alınması • İspatlanmış/olası invazif kandidozda – PCR pozitifliği: %85 (78-91) 5/26 – Kan kültür pozitifliği %38 (29-46) ASPERGILLUS CİNSİ • Toksik/alerjik hastalıklar, sistemik/invazif enfeksiyonlar, aspergilloma • %40 mortalite (Yüksek riskli gruplarda) • >300 Aspergillus türü; >%90 A.fumigatus – A.terreus, A.terreus, A.flavus, A.ustus A.ustus,, A.alliaceus A.alliaceus,, A.lentulus, A.udagawae, … – 7 alt cins → 18 bölüm (kompleks veya grup) • TANI – GELENEKSEL: Makroskopik/mikroskopik morfoloji • Yetersiz kalabilir – MOLEKÜLER: • Alt cins/bölüm düzeyinde tanımlama: rRNA ITS gen bölgeleri • Tür düzeyinde: rRNA LSU D1/D2, 18S rRNA ve kalmodülin gen bölgeleri • Standardize değil • Mycassay Mycassay--Aspergillus kit (Myconostica, İngiltere): Cins6/26 • Nested Aspergillus PCR: 5 tür – A.fumigatus, A.flavus, A.niger, A.terreus, A.nidulans • Histolojik olarak ispatlanmış invazif Aspergilloz: 20 olgu • PCR pozitif: %70 • Galaktomannan antijen pozitif: %60 Asp. Asp. Asp. Asp. 5 (5’-GATAACGAACGAGACCTCGG-3’) 8 (5’-TGCCAACTCCCCTGAGCCAG-3’), 384-bp 1 (5’-CGGCCCTTAAATAGCCCGGTC-3’) 7 (5’-CCTGAGCCAGTCCGAAGGCC-3’) 357-bp 7/26 • ITS PCRPCR-Reverse line blot assay • 5 Aspergillus spp. (A.fumigatus, A.flavus, A.niger, A.terreus, A.nidulans) • 7 Mucorales (Mucor heimalis, heimalis, Mucor racemosus, Mucor cercinelloidea, racemosus, cercinelloidea, Rhizopus arrhizus, arrhizus, Rhizopus microsporus,, Rhizomucor pusillus, microsporus pusillus, Absidia corymbifera) • 98 klinik izolat – 41 klinik materyal • Duyarlılık %85.4 (kültür duyarlılığı: %53.7) 8/26 CRYPTOCOCCUS CİNSİ • Akciğerlerde primer enfeksiyon → menenjit • C.neoformans ve C.gattii önemli – C.laurentii ve C.albidus • Serotip A (C.neoformans var. grubii grubii)) • Serotip D (C.neoformans var. neoformans neoformans)) • Serotipler B ve C (C.gattii C.gattii)) → Sağlıklı kişilerde de patojen • Makrofajlarca öldürülemez (%30(%30-40 mortalite) • Kültür ve mikroskopi duyarlılığı: %50%50-80 • Seroloji: Yalancı pozitiflikler 9/26 • RT RT--PCR analitik duyarlılığı: 1 genom/ml BOS SERUM İDRAR n-PCR EIA LAT Kültür Pozitif (46) 46 46 46 44 Negatif (30) 30 30 26 30 Pozitif (35) 35 35 35 ------ Negatif (30) 30 30 28 ------ Pozitif (28) 28 28 28 22 Negatif (30) 30 30 30 30 LAT’ da yalancı pozitiflik; pozitiflik; kültürde yalancı negatiflik sorundur • nPCR analitik duyarlılığı 10 hücre/ml • 4-8 haftalık tedavi sonrasında 4 örnekte EIA negatif, nPCR pozitif kalmıştır 10/26 PNEUMOCYSTIS JIROVECII • P.carinii: P.carinii: Tüm memelilerde (Kuş ve değişken vücut sıcaklıklı hayvanlar hariç) • P.jirovecii P.jirovecii:: İnsanlarda • <4 yaş, >%75 seropozitiflik • İmmun baskılanmış/yetmez kişilerde ölümcül pnömoni • Geleneksel yöntemler: – Sürekli kültürü yok. – Mikroskopi, immunfloresan/histokimyasal teknikler uygulanıyor – Antijen testleri sınırlı katkı sağlarsağlar- Antikor testleri epidemiyolojik • Moleküler yöntemler – – – – Tanısal: rDNA LSU, major yüzey glikoprotein genleri İlaç direnci: Dihidropteorat sentaz gen mutasyonu Özgüllük ve duyarlılık: >%90 MycAssay Pneumocystis kit (Myconostica, İngiltere) 11/26 KLİNİK/RADYOLOJİK/BİYOK. RT--PCR RT PCP PCP DEĞİL POZİTİF 13 9 NEGATİF 1 87 14 96 1 olguda PCP gelişmiş (6 hafta içinde) PPV: %59; NPV: %99 12/26 MycAssay Pneumocystis kit (Myconostica, İngiltere) SONUÇ OLARAK 13/26 FUNGAL ENFEKSİYONLARDA TANI • Kültür altın standarttır. Ama; – Uzun süre alır – Duyarlılığı düşüktür – Kültür şartlarından etkilenir • Moleküler tanı yardımcıdır. – Hızlıdır ve duyarlılığı yüksektir – Sınırlı düzeyde tür tanımlamasına izin verir – Mutasyonlardan etkilenir – Duyarlılık çalışmalarına tam olarak olanak vermez 14/26 MOLEKÜLER TANI YÖNTEMLERİ • • • • • • Gerçek zamanlı PCR PCR-- dizi analizi PCR PCR--mikroarray PCR PCR--EIA PCR PCR--RFLP PCR PCR--”melting curve” analizi PCR • Ev yapımı/standardize değil • Ticari değil – Microseq D2 LSU: Applied Biosystems (Invitrogen)(Invitrogen)-1113 tür – SeptiFast M grade: Roche lightcyclerlightcycler- 5 Candida spp+ spp+A.fum A.fum – MycAssay Pneumocystis/Aspergillus kit (Myconostica, İng) • EORTC/MSG* tanı kriteri değil 15/26 * European Organisation for Research and Treatment of Cancer/ Mycoses Study Group MOLEKÜLER TANI ENDİKASYONLARI • • • • • • Sürekli kültürü yapılamayan türler (Pneumocystis jirovecii, jirovecii, Lacazia loboi) loboi) Kültürü uzun süren türleri (endemik mikoz etkenleri, dermatofitler) Fenotipik karakteristiklerin yetersiz kaldığı türler/durumlar Epidemiyolojik çalışmalar Deneyimli mikoloji uzmanının bulunmadığı laboratuarlar İlaç direnci ve genotip/prognoz için öngörüde bulunmak 16/26 MOLEKÜLER ANTİFUNGAL DUYARLILIK TESTİ???? 17/26 Candida krusei Flukonazol dirençli Candida krusei Candida lusitaniae Flusitozine dirençli Pseudallescheria boydii Fusarium türleri Amfoterisin B dirençli Candida glabrata Flukonazol azalmış duyarlı Candida lusitaniae Aspergillus terrreus Aspergillus ustus Aspergillus lentulus Petromyces alliaceus Azollara azalmış duyarlı Azollar, amfoterisin B ve ekinokandinlere azalmış duyarlı 18/26 MOLEKÜLER EPİDEMİYOLOJİ 19/26 TİPLENDİRMENİN KULLANIM ALANLARI • Salgınların – Varlığının ispatlanması – Kaynağın tanımlanması – Yayılma yollarının belirlenmesi – Kontrol önlemlerinin etkinliğinin incelenmesi • Nüks/ reenfeksiyon ayırımı, • Mevcut/yeni ortaya çıkan klonların ortaya konması, • Translokasyon/ kolonize tür ayırımı 20/26 Moleküler Epidemiyolojik Yöntem Değerlendirme Kriterleri • • • • • • Tiplendirebilirlik Tekrarlanabilirlik Ayırt edebilirlik gücü Uygulama kolaylığı Yorumlama kolaylığı ...maliyet, olanaklar, ... 21/26 • • • • • 1996-1997 199654 ilden 634 güvercin dışkı örneği 17 ilden 28 örnekte üreme 26 köken - 24 karyotip 17 Aα Aα- 4 Da – 3 Dα Dα - 1 Aa/Dα Aa/Dα- 1 ? 22/26 23/26 Menenjit • dışkı kültürü • nazofaringeal sürüntü • serebrospinal sıvı Pankreatik psödokist • kan • abse 24/26 • drenaj sıvısı 1. DSMZ 70403 2. GATA-Prostatik sıvı 3. Erciyes-Kan 4. Hacettepe-Kan 5. GATA-Kan 6. GATA-Kan 7. GATA-Kan 25/26 • 4 endoftalmit • 1 fungemi • 10/2003-6/2004 26/26 TEŞEKKÜRLERİMLE MUTU BİR AMPLİFİKASYON 27/26
© Copyright 2024 Paperzz
