Nitrat / Nitrit redüksiyonu testleri

Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir.
ULUSAL MİKROBİYOLOJİ
STANDARTLARI (UMS)
Nitrat/Nitrit Redüksiyonu Testi
Hazırlayan Birim
Klinik Bakteriyoloji Tanı Standartları Çalışma Grubu
Onaylayan Birim
Türkiye Halk Sağlığı Kurumu
Kategori
Bakteriyoloji
Bölüm
Test Prosedürleri
Standart No
B-TP-15
Sürüm No
1.1
Onay tarihi
01.01.2015
Geçerlilik tarihi
01.01.2018
Sürüm no Tarih
Değişiklik
Nitrat / nitrit redüksiyonu testi
İÇİNDEKİLER
KAPSAM VE AMAÇ............................................................. 3
KISALTMALAR VE TANIMLAR .............................................. 3
GENEL BİLGİ ................................................................... 3
TEKNİK BİLGİLER ............................................................. 4
1
2
3
4
Test için asgari laboratuvar koşulları................................ 4
Testin uygulanması ....................................................... 5
Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması4 ..................... 6
Olası sorunlar/kısıtlılıklar ............................................... 8
EKLER............................................................................. 9
Ek-1 Test besiyerleri ve reaktiflerinin hazırlanması4............... 9
Ek-2 Nitrat/Nitrit redüksiyonu değerlendirme algoritması ..... 10
KAYNAKLAR ................................................................... 11
Sayfa 2 / 11
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-15 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Nitrat / nitrit redüksiyonu testi
Kapsam ve Amaç
Bakterilerin nitratı (NO3ˉ) nitrite (NO2) indirgeyebilmeleri önemli bir özelliktir ve
bu özellikten klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında yaygın bir şekilde yararlanılır.
Test başlıca nonfermentatif bakterilerin, Moraxella, Neisseria, Haemophilus türleri
örneğinde olduğu gibi güç üreyen gram negatiflerin ayrımında tercih edilir (1,2).
Corynebacterium türlerinin tanımlanmasında ve Corynebacterium diphtheriae‟nin
biyotiplendirmesinde de nitrat redüksiyonu biyokimyasal tanı setinin önemli bir
parçasıdır. Bu UMS‟de nitrat/nitrit redüksiyon testlerinin doğru uygulanması ve
yorumlanması için bir prosedür verilmesi hedeflenmiştir.
Kısaltmalar ve Tanımlar
Durham
tüpü
Küçük özel tüpler; ters pozisyonda sıvı besiyeri tüpleri içine
konarak gaz üretiminin değerlendirilmesinde kullanılır.
Karsinojen
Kansere neden olabilen etken ya da madde, kanserojen
Genel Bilgi
Bakteriler nitratları nitritlere veya daha ileri yıkım ile amonyak, nitrojen gazı (N2),
hidroksilamin gibi maddelere dönüştürebilirler. Nitrat redüksiyonu organizmanın
oksijenini nitratlardan temin etmek durumunda kaldığını (anaerob solunum)
gösterir. Bir organizmanın nitrat redüksiyon yeteneğini saptamak için nitrat
buyyon kullanılır.
Nitrat redüksiyonuna ortamda nitriti tespit ederek karar verilebileceği gibi,-tam
yıkım gerçekleştiğinde- nitrat veya nitritin ortamda gösterilememesi ile de
karar verilebilir.
Nitritlerin varlığı, ortama sülfanilik asit ve -naftilamin eklendiğinde kırmızı
diazonyum bileşiğinin oluşumu ile anlaşılır. Gaz üretimi, eğer besiyeri içinde
Durham tüpü mevcut ise gözlenebilir (3,4).
Kırmızı renk oluşmadığı durumda iki olasılıktan söz edilebilir: i) nitrat
indirgenmemiştir veya ii) bu reaktiflerin gösteremeyeceği ileri son ürünler
meydana gelmiş, yani nitrat tam indirgenmiştir.
Olasılıklardan hangisinin geçerli olduğunu anlamak için tüpe çinko tozu eklenir
ve indirgenmemiş nitrat ile reaksiyona girmesi beklenir; çinko tozu kalan nitratı
nitrite indirgeyecek ve kırmızı renk gelişecektir ki, bu durumda organizma için
nitrat testi negatif demektir. Eğer ortamda nitrat kalmamışsa (daha önce bakteri
tarafından tamamen yıkılmış olması nedeniyle) çinko tozu eklenmesi ile kırmızı
renk oluşmaz; bu da testin nitrat ve nitrit redüksiyonu için pozitif olduğunu
gösterir (4).
Özetle testin değerlendirilmesi iki safhalıdır: birinci safhada nitrat buyyon içeren
bakteri üremiş tüpe katılan reaktiflerle kırmızı renk oluşursa pozitif; oluşmaz ise,
çinko tozu katıldıktan sonra kırmızı renk oluşması negatif, oluşmaması pozitif
olarak değerlendirilir.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-15 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 3 / 11
Nitrat / nitrit redüksiyonu testi
Teknik Bilgiler
1 Test için asgari laboratuvar koşulları
1.1. Laboratuvar güvenliği
Bu UMS‟de bahsi geçen organizmalar ile ilgili işlemler asgari BGD2 laboratuvar
şartlarında gerçekleştirilmelidir. Bütün kültürler enfeksiyöz kabul edilmeli ve
daima standart önlemler uygulanmalı, önlemler risk değerlendirmesi ile de
desteklenmelidir. Aerosol oluşturması muhtemel tüm laboratuvar çalışmaları bir
biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir (ayrıca bkz. “Ulusal Laboratuvar
Güvenliği Rehberi”).
1.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri
Bu UMS‟yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) testten önce, amaçlanan kullanım
ile ilgili eğitim almış olmalı; (ii) uygulamaya tüm yönleriyle aşina olmalı, ve; (iii)
daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır.
1.3. Örnek, Besiyeri, Reaktif, Donanım
Test mikroorganizmaları

Gram negatif çomaklar ve gram negatif koklar, kokobasiller (Neisseria
spp, Haemophilus spp, Bordetella spp gibi)

Sporsuz, gram pozitif çomak bakteriler – Corynebacterium sp

Anaerob mikroorganizmalar
Besiyeri, Reaktif






Nitrat ve nitrit buyyonlar – Laboratuvarda hazırlamak için bkz. Ek-1.
Nitrat diskleri – anaerob mikroorganizmalar için (ticari olarak mevcut).
Nitrat tabletleri – besiyerleri ve reaktifler için (ticari olarak mevcut)
%0.8‟lik sülfanilik asit (Nit-1) - hazırlamak için bkz. Ek-1.
%0.5‟lik -naftilamin (Nit-2) - hazırlamak için bkz. Ek-1.
Çinko metal tozu
Diğer gereç, donanım



Cam tüpler, burgu kapaklı; besiyeri için (16x125 mm)
Durham tüpleri
Öze, tek kullanımlık veya nikrom
1.4. Kalite kontrol

Her yeni besiyeri lotu kullanıma sokulmadan önce pozitif ve negatif
kalite kontrol suşları ile test edilmelidir.

Reaktiflerin yeni lotları besiyeri inoküle edilmeden doğrudan reaktiflerin
ilave edilmesi ile test edilir (önce sulfanilik asit ve -naftilamin, sonra
çinko tozu). Kırmızı renk elde ediliyorsa kullanıma sokulabilir.
Sayfa 4 / 11
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-15 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Nitrat / nitrit redüksiyonu testi

Besiyeri tüpleri kullanım öncesi kontaminasyon yönünden incelenir.
Bulanıklık görülen tüpler atılır.

Kalite kontrol organizmaları (4):
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 – nitratı nitrojen gazına kadar
indirger; nitrat-pozitif, nitrit pozitif; gaz-pozitif
Escherichia coli ATCC 25922 – nitratı nitrite kadar indirger; nitrat
pozitif; gaz negatif
Acinetobacter baumannii ATCC 19606 – nitratı indirgemez; nitrat
negatif
Campylobacter jejuni ATCC 33560 (alternatif pozitif kontrol) – nitrat
pozitif
2 Testin uygulanması
2.1. Tüp metodu
Uygulama ve değerlendirme basamakları için Ek-2‟yi de inceleyiniz!
ÖNEMLİ: İnokülasyondan önce buyyon incelenir; Durham tüpleri içinde
gaz kabarcığı varsa tüp altüst edilerek çıkarılmalıdır.

Bir nitrat buyyon tüpü alınır; test edilecek bakterinin tek düşmüş
kolonisinden veya saf kültür pasajından öze ile alınan inokulum ya da
bir gecelik buyyon kültüründen 1-2 damla inokulum besiyeri tüpüne
ekilir.
NOT 1: Güç üreyen organizmalar (Neisseria spp, Bordetella spp gibi)
test edilmek isteniyorsa önce yoğun süspansiyon (McFarland No.6-8)
hazırlanır; nitrat buyyona inokülasyon bu süspansiyondan (1-2 damla)
yapılır.
NOT 2: Eğer inkübasyon süresinin sonunda nitrat redüksiyonu
gözlenmez ise bakterinin nitrit redüksiyonunu test etmek amacıyla aynı
şekilde nitrit buyyona ekimi yapılmalıdır. Eğer nitrat pozitif ise nitrit
buyyon kültürüne gerek yoktur!

İnokülasyon yapılmış tüpler inkübasyona kaldırılır. Nonfermenter gram
negatif çomaklar 25-30°C‟de; diğer organizmalar 35°C‟de inkübe
edilmelidir. Bazı organizmalar için 2-5 gün inkübasyon gerekebilir.
Campylobacter 35°C‟de, mikroaerofil ortamda ve 72 saat inkübe
edilmelidir.

Yeterli inkübasyon süresi geçtiğinde tüpler incelenir; üremenin
varlığına ve Durham tüpü içinde gaz olup olmadığına bakılır; not edilir.
Tüpte görünür bir üreme yoksa reaktifler ilave edilmez! İnkübasyon
uzatılır.

Eğer gaz mevcut, fakat organizma KIA ya da TSI‟de glikozu fermente
etmemiş ise reaktifler katılmaz; çünkü test nitrat ve nitrit redüksiyonu
ve gaz oluşumu bakımından pozitif olarak kabul edilir.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-15 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 5 / 11
Nitrat / nitrit redüksiyonu testi

Eğer gaz mevcut değilse veya organizma glikoz fermenter, gram
negatif bir çomak ise (ör., Enterobacteriaceae) buyyondan 1 mL alınıp
küçük bir tüpe aktarılır; üzerine 2-3 damla Nit-1 damlatılır.
Çalkalayarak iyice karıştırılır.

Sonra 2-3 damla Nit-2 ilave edilip tekrar karıştırılır. 1-2 dakika içinde
kırmızı renk oluşup oluşmadığı gözlenir.

Eğer kırmızı renk gözlenmiyorsa, nitrat tüpüne, ince bir spatül ucu ile
küçük bir miktar çinko tozu ilave edilir.
NOT: Çinko tozu nitrit tüpüne konmaz!

Yaklaşık 10 dakika içinde kırmızı renk gelişip gelişmediği değerlendirilir.

Eğer nitrat veya nitrit indirgenmemiş ise veya gaz üretimi yoksa
kalan buyyon yeniden inkübasyona kaldırılır ve 48 saat sonra yeniden
test edilir. Nitrit buyyondaki kültürler ise 5. güne kadar izlenmelidir.
2.2. Disk metodu (sadece anaeroblar için kullanılır)

Bakterinin üremesini iyi destekleyen bir agar besiyerine test edilecek
organizma pasajlanır ve yoğun ekim alanına bir nitrat diski yerleştirilir.
Anaerob şartlarda 24-48 saat inkübe edilir.

İnkübasyon sonunda disk plak yüzeyinden alınır ve temiz bir Petri
kabına konur. Üzerine sırasıyla birer damla Nit-1 ve Nit-2 eklenir. Eğer
bir kaç dakika içinde renk değişimi olmaz ise üzerine küçük bir miktar
çinko tozu ilave edilir ve 5 dakikaya kadar izlenir.
2.3. Hızlı metot

Bir tüpe 0.5 mL buyyon konur. Organizma yoğun bir şekilde inoküle
edilir.

2 saat 35°C‟de inkübe edilir.

Nit-1 ve Nit-2 ilave edilir; kırmızı renk gelişimi açısından izlenir.
Standart test gibi yorumlanır.
3 Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması4
Sonuçların değerlendirilmesi ve yorumu karmaşık gelebilir. Aşağıda
açıklanarak verilmiş olup, ayrıca Tablo-1 ve Ek-2‟den yararlanılabilir:
Gaz pozitif durum
Durham tüpünde gaz kabarcıkları varsa, tek bir kabarcık bile olsa
(fermentatif, gram negatif çomak bakteriler hariç), reaktif eklenmesine
gerek yoktur ve sonuç aşağıdaki gibi yorumlanır:

Nitrat tüpü – nitrat redüksiyon pozitif, nitrit redüksiyon pozitif, gaz
pozitif

Nitrit tüpü – nitrit redüksiyon pozitif, gaz pozitif
Sayfa 6 / 11
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-15 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Nitrat / nitrit redüksiyonu testi
Gaz negatif durum
Gaz kabarcığı yok ise redüksiyonun değerlendirilmesi için Nit-1, Nit-2
eklenir. Gaz-negatif olan fermentatif ve nonfermentatif gram negatif
çomaklar için reaksiyonlar aşağıdaki gibi yorumlanır:

Nitrat tüpünde;
(a) Nit-1, Nit-2 sonrası kırmızı renk gelişmesi: nitrat redüksiyon pozitif,
nitrit redüksiyon negatif
(b) Nit-1, Nit-2 sonrası kırmızı renk gelişmemesi ve çinko tozu
eklenmesi ile de kırmızı renk gelişmemesi: nitrat redüksiyon
pozitif, nitrit redüksiyon pozitif

Nitrit tüpünde; Nit-1, Nit-2 eklenmesinden sonra rengin değişmemesi:
nitrit redüksiyon pozitif
Negatif sonuçlar (son okuma ≥48 saat)

Nitrat tüpünde – Nit-1, Nit-2 eklendikten sonra renk değişimi
olmaması ve çinko tozu ile kırmızı renk gelişmesi: nitrat redüksiyon
negatif

Nitrit tüpünde – Nit-1, Nit-2 eklendikten sonra kırmızı renk oluşması:
nitrit redüksiyon negatif
Tablo 1. Nitrat ve nitrit redüksiyon testlerinin yorumu için özet tablo.
Reaktif
Nit-1 ve Nit-2
ilavesi sonrası
Reaks.
Kırmızı
Besiyeri
Anlamı
Nitrat
Nitratın nitrite indirgendiğini gösterir
(bakteri nitrat-pozitif)
Nitrit
Nitritin indirgenmediğini gösterir
(bakteri nitrit-negatif)
Çinko ilavesi
sonrası*
Kırmızı
Nitrat
Nitratın indirgenmediğini gösterir
(bakteri nitrat-negatif)
Çinko ilavesi
sonrası
Renk yok
Nitrat
Nitratın nitrojen gazına kadar indirgendiğini
gösterir. Durham tüpünde de gaz gözlenmelidir.
(bakterinin nitrat ve nitrit redüksiyon testleri pozitif)
Nit-1 ve Nit-2
ilavesi sonrası
Kırmızı,
(Durham
tüpünde
gaz ile
birlikte)
Nitrat
a) nonfermentatifler için gazın varlığı (reaktif
eklenmesine bile gerek olmadan); nitratın nitrite
ve nitrojen gazına indirgendiğini gösterir
(bakteri nitrat- ve nitrit-pozitif)
b) fermentatifler için; gaz nitrojene bağlı değildir sadece nitrat indirgenmiştir
(bakteri nitrat-pozitif, nitrit-negatif)
* Nitrit buyyona çinko eklenmez!
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-15 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 7 / 11
Nitrat / nitrit redüksiyonu testi
4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar

Enterobacteriaceae„de gaz üretimi gözlenir; ancak bu nitratredüksiyonuna değil hidrojen gazı üretimine bağlıdır.

Besiyerinde üreyemeyen organizmalar hatalı negatif sonuç elde
edilmesine neden olabilirler.

Pozitif bir testte elde edilen renk çabuk solabileceğinden renk
reaksiyonları hızla değerlendirilmelidir.

Tüplerin ekiminden önce gaz kabarcıkları tam uzaklaştırılamamış ise
gaz oluşumu yönünden yanlış pozitif olarak hatalı yoruma neden olur.

Nit-1 ve Nit-2 eklendiğinde soluk pembe bir renk oluşabilir; bu bir
pozitif sonuç değildir.

Negatif nitrit reaksiyonu ile birlikte negatif çinko redüksiyonu (renk
değişimi olmaması), nitratın nitrit seviyesinin ötesinde indirgendiğinin
muhtemel işaretidir. Nitrit indirgenmesinin son ürünü genellikle azot
gazıdır, ancak diğer son ürünler de oluşabilir.

Aşırı çinko tozu yanlış pozitif nitrit indirgenmesi reaksiyonu verebilir.

Pozitif reaksiyonların çoğu 12-24 saat içinde gözlenir, ancak, 5 güne
kadar uzayabilen durumlar vardır.
Sayfa 8 / 11
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-15 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Nitrat / nitrit redüksiyonu testi
Ekler
Ek-1 Test besiyerleri ve reaktiflerinin
hazırlanması4
Nitrat Besiyeri* (sıvı)
Pepton
veya güç üreyen bakteriler için
2.0 g
Kalp infüzyon buyyonu
2.5 g
Potasyum nitrat
Distile/deiyonize su
0.2 g
100 mL
Nitrit Besiyeri (sıvı)
Kalp infüzyon buyyonu
Potasyum nitrit
Distile/deiyonize su
2.5 g
0.01 - 0.1 g
100 mL
Her iki besiyerinin de hazırlanması aynıdır. Maddeler karıştırılır. İçlerine Durham tüpleri
konmuş burgu kapaklı tüplere 3-4 mL alikotlar halinde dağıtılır.
121°C‟de 15 dk otoklavlanır. Raf ömürleri 6 aydır. Tüpler besiyeri adı ve son kullanma
tarihleri yazılarak etiketlenir; 2-8°C‟de saklanır.
Nit-1 Reaktifi (%0.8‟lik Sulfanilik asit)
Sülfanilik asit
Distile su
Glasiyal asetik asit
0.8 g
70 mL
30 mL
Sülfanilik asit suya eklenir, karıştırılır; eritmek için ısıtılır. Soğutulduktan sonra asetik esit
eklenir. Raf ömrü 3aydır. Etiketlenir ve 2-8°C‟de saklanır.
Nit-2 Reaktifi (%0.5‟lik N,N-Dimetil--naftilamin)
N,N dimetil--naftilamin
Distile su
Glasiyal asetik asit
0.5 g
70 mL
30 mL
Asit suya eklenir; -naftilamin katılır. Raf
ömrü 3 aydır. 2-8°C‟de saklanır.
*
Güvenlik uyarısı!
-naftilamin potansiyel
karsinojendir. Laboratuvarda
hazırlamak yerine piyasadan
hazır reaktif olarak temin
edilmesi önerilir.
Burada formüller 100 mL besiyeri/reaktif için verilmiştir. Laboratuvar kendi tüketim hızına göre hazırlayacağı
besiyeri/reaktif miktarına karar vermelidir.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-15 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 9 / 11
Nitrat / nitrit redüksiyonu testi
Ek-2 Nitrat/Nitrit redüksiyonu değerlendirme
algoritması
Test edilecek bakteriyi
İnoküle et
Nitrit
buyyon
Nitrat
buyyon
Adımlar çinko ekleme
aşamasına kadar aynıdır.
Çinko eklenmez!
İnkübe et
Yok
Var
Üreme
GAZ(+)
GAZ(-)
(üremiş buyyondan bir
tüpe 1 ml aktar; sonra)
Nit-1, Nit-2 ekle!
KIA/TSI‟de glukoz
nonfermenter ise
KIA/TSI‟de glukoz
fermenter ise
Reajen eklenmez!
(üremiş buyyondan bir
tüpe 1 mL aktar; sonra)
KARAR
Nitrat (+)
Nitrit (+)
Glukoz
fermenter
veya
nonfermenter
Nit-1, Nit-2 ekle!
Kırmızı (+)
Kırmızı (-)
KARAR
Kırmızı (+)
Kırmızı (-)
KARAR
Çinko ekle!
Nitrit (-)
Nitrit (+)
İnkübasyonu
uzat
Nitrat (+)
Nitrit (-)*
Kırmızı (+)
Kırmızı (-)
KARAR
İnkübasyonu
uzat
Nitrat (-)
Nitrat (+)
Nitrit (+)
* Gaz(+), glukoz-fermenter ise Enterobacteriaceae üyesi olma olasılığı yüksektir. Bunlarda
gaz nitratın son ürün azota kadar yıkılması ile değil, hidrojen oluşumu ile meydana gelir.
Şekil 1. Nitrat ve nitrit redüksiyon testlerinin uygulanması ve sonuçların yorumu için şematik
diyagram (Kaynak: Akbaş E. Henüz yayınlanmamış doküman. 2012)
Sayfa 10 / 11
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-15 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Nitrat / nitrit redüksiyonu testi
Kaynaklar
1
Janda WM, Knapp JS. Neisseria and Moraxella catarrhalis. In: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen
JH, Pfaller MA, Yolken RH (eds). Manual of Clinical Microbiology. 8th ed., ASM Press, Washington
D.C. 2003, p. 585–608.
2
Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC, Jr. (eds). The
Enterobacteriaceae. Chart 3-2: Nitrate reduction. In: Color Atlas and Textbook of Diagnostic
Microbiology. 4th ed., J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA. 1992, p. 172-3.
3
MacFaddin JF. Biochemical Tests for the Identification of Medical Bacteria. 3rd ed., The
Lippincott, Williams & Wilkins Co., Philadelphia, PA. 2000, p. 348–358.
4
York MK, Traylor MM, Hardy J, Henry M. Biochemical tests for the identification of aerobic
bacteria. Nitrate/Nitrite Reduction Test. In: Garcia LS, Isenberg HD (eds). Clinical Microbiology
Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C. 2007, p. 3.17.35.1 3.17.35.4
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-15 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 11 / 11

Download Report