DNOV004-17-OH Progesterone-engl,dt,it,es-22012014

17-OH Progesterone
Enzyme immunoassay for the quantitative determination of 17-OH progesterone in human serum or plasma
Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von 17-OH Progesteron in humanem Serum oder
Plasma
Determinazione immunoenzimatica diretta del 17-OH Progesterone nel siero o plasma umano
Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de 17-OH progesterona en suero humano o
plasma
Only for in-vitro diagnostic use
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Bibliography / Literatur / Bibliografia /
Bibliografía
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Symbols Key / Symbolschlüssel /
Legenda / Símbolos
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Summary of Test Procedure/ Kurzanleitung
Testdurchführung/ Schema della procedura/
Resumen de la técnica
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Product Number: DNOV004 (96 Determinations)
________________________________________________________________
ENGLISH
1. INTRODUCTION
17-Hydroxyprogesterone (17-OH progesterone or 17OHP) is a C-21 steroid hormone produced in the adrenal gland and
gonads, during the synthesis of glucocorticoids and sex steroids. It is derived from progesterone via 17-hydroxylase, a
P450c17 enzyme, or from 17-hydroxypregnenolone via 3β-hydroxysteroid dehydrogenase/∆5-4 isomerase. 17-OH
progesterone is a precursor of cortisol that accumulates in the case of adrenal 21-hydroxylase deficiency and decreased
after replacement therapy with cortisol. High values are found in congenital adrenal hyperplasia.
17-OHP has no defined physiologic role except as a precursor molecule.
Serum 17-OHP levels are age-dependent, with peak levels observed during fetal life and the immediate postnatal period.
During the first week of life, serum 17-OHP levels fall ~50-fold as compared to cord blood values. A small transient
increase occurs in male infants 30-60 days postnatally. Levels for both sexes remain at constant low levels during
childhood, and then progressively increase during puberty reaching adult levels of ~100 ng/dL (~3.03 nmol/l). As with
cortisol, serum 17α -OHP levels normally have an ACTH-dependent diurnal variation, with peak levels in the morning and
a nadir at night. In addition, ovarian production of 17α -OHP increases during the luteal phase of the menstrual cycle.
17-hydroxyprogesterone is a natural progestin and in pregnancy increases in the third trimester primarily due to fetal
adrenal production.
Normal levels are 3-90 ng/dl in children and in women, 15-70 ng/dl prior to ovulation, and 35-290 ng/dl during the luteal
phase.
Measurements of levels of 17-hydroxyprogesterone are useful in the evaluation of patients with suspected congenital
adrenal hyperplasia as the typical enzymes that are defective, namely 21-hydroxylase and 11β-hydroxylase, lead to a
build-up of 17-OHP. In contrast, the rare patient with 17α-hydroxylase deficiency will have very low or undetectable levels
of 17-OHP.
Elevated serum 17-OHP levels at baseline and/or after ACTH stimulation have also been reported in other forms of
adrenal hyperplasia.
2. INTENDED USE
Competitive immunoenzymatic colorimetric method for quantitative determination of 17-OH Progesterone in human
serum or plasma.
3. PRINCIPLE OF THE ASSAY
Microtiter strip wells are precoated with anti-17-OH Progesterone antibodies (solid-phase). 17-OH Progesterone in the
sample competes with added horseradish peroxidase labelled 17-OH Progesterone (enzyme-labelled antigen) for
antibody binding. After incubation a bound/free separation is performed by solid-phase washing. The immune complex
formed by enzyme-labelled antigen is visualized by adding Tetramethylbenzidine (TMB) substrate which gives a blue
reaction product. The intensity of this product is inversely proportional to the amount of 17-OH Progesterone in the
sample. Sulphuric acid is added to stop the reaction. This produces a yellow endpoint colour. Absorption at 450 nm is
read using an ELISA microwell plate reader.
4. MATERIALS
4.1. Reagents supplied
Anti-17-OH Progesterone IgG Coated Wells: 12 break-apart 8-well snap-off strips coated with anti-17-OH
Progesterone IgG; in resealable aluminium foil.
Stop Solution: 1 bottle containing 15 ml sulphuric acid, 0.15 mol/l (avoid any skin contact).
17-OH Progesterone-HRP Conjugate: 1 bottle containing 22 ml of horseradish peroxidase labelled 17OH Progesterone.
TMB Substrate Solution: 1 bottle containing 15 ml 3, 3´, 5, 5´-tetramethylbenzidine (H2O2-TMB 0.26 g/l) (avoid any
skin contact).
Wash solution 10x conc.: 1 bottle containing 50 ml of a 10x concentrated solution of phosphate buffer 0.2 M,
Proclin < 0.0015%
17-OH Progesterone control: 1 bottle containing 1 ml of a lot-specific, ready to use control solution. The
concentration is stated on the label.
17 -OH Progesterone Standards: 6 bottles, 1 ml each
Standard 0:
Standard 1:
Standard 2:
Standard 3:
Standard 4:
Standard 5
0 ng/ml
0.2 ng/ml
0,6 ng/ml
2,0 ng/ml
6,0 ng/ml
20,0 ng/ml
2
4.2. Materials supplied
1 Strip holder
1 Cover foil
1 Test protocol
1 Distribution and identification plan
4.3. Materials and Equipment needed
ELISA microwell plate reader, equipped for the measurement of absorbance at 450 nm, 620-630 nm
Manual or automatic equipment for rinsing wells
Pipettes to deliver volumes between 10 and 1000 µl
Vortex tube mixer
Distilled water
Disposable tubes
Timer
5. STABILITY AND STORAGE
The reagents are stable up to the expiry date stated on the label when stored at 2...8 °C in the dark.
6. REAGENT PREPARATION
It is very important to bring all reagents, samples and standards to room temperature (22…28°C) for at least 30 minutes
before starting the test run! At the end of the assay store the reagents immediately at 2-8° C. Avoid long exposure to
room temperature.
6.1. Coated snap-off Strips
The ready to use break apart snap-off strips are coated with anti-17-OH Progesterone IgG antibodies. Store at 2…8 °C.
Open the bag only when it is at room temperature. Immediately after removal of strips, the remaining strips should be
resealed in the aluminium foil along with the desiccant supplied and stored at 2…8 °C; stability until expiry date. Do not
remove the adhesive sheets on the unused strips.
6.2. 17-OH Progesterone HRP- Conjugate
17-OH Progesterone-HRP Conjugate is a ready to use solution.
6.3. 17-OH Progesterone Standards
The standards are ready to use and have the following concentration of 17-OH Progesterone:
Standard 0:
Standard 1:
Standard 2:
Standard 3:
Standard 4:
Standard 5
0 ng/ml
0.2 ng/ml
0,6 ng/ml
2,0 ng/ml
6,0 ng/ml
20,0 ng/ml
After first opening stable for another 6 months at 2 ÷ 8° C.
6.4. TMB Substrate Solution
The bottle contains 15 ml of a tetramethylbenzidine/hydrogen peroxide system. The reagent is ready to use and has to be
stored at 2...8°C in the dark. The solution should be colourless or could have a slight blue tinge. If the substrate turns into
blue, it may have become contaminated and should be thrown away.
6.5. Stop Solution
The bottle contains 15 ml 0.15 M sulphuric acid solution (R 36/38, S 26). This ready to use solution has to be stored at
2...8°C.
6.6. Wash Solution
Dilute the content of each vial of the "10x Conc. Wash Solution" with distilled water to a final volume of 500 ml prior to
use. For smaller volumes respect the 1:10 dilution ratio. The diluted wash solution is stable for 30 days at 2-8°C.In
concentrated wash solution it is possible to observe the presence of crystals; in this case mix at room temperature until
the complete dissolution of crystals; for greater accuracy, dilute the whole bottle of concentrated wash solution to 500 ml,
taking care to transfer completely the crystals, then mix until crystals are completely dissolved.
6.7. Control
The bottle contains 1 ml of a lot-specific, ready to use control solution.
3
7. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
The determination of 17-OH Progesterone can be performed in human plasma as well as in serum. Store the sample at 20°C if the determination is not performed on the same day as the sample collection. If samples are stored frozen, mix
thawed samples well before testing. Avoid repeated freezing and thawing.
8. ASSAY PROCEDURE
8.1. Test Preparation
Please read the test protocol carefully before performing the assay. Result reliability depends on strict adherence to the
test protocol as described. Prior to commencing the assay, the distribution and identification plan for all specimens and
controls should be carefully established on the result sheet supplied in the kit. Select the required number of microtiter
strips or wells and insert them into the holder. Pipetting of samples should not extend beyond ten minutes to avoid assay
drift. If more than one plate is used, it is recommended to repeat the dose response curve. Please allocate at least:
1 well
2 wells
2 wells
2 wells
2 wells
2 wells
2 wells
2 wells
(e.g. A1)
(e.g. B1+C1)
(e.g. D1+E1)
(e.g. F1+G1)
(e.g. H1+A2)
(e.g. B2+C2)
(e.g. D2+E2)
(e.g. F2+G2)
for the substrate blank
for standard 0
for standard 1
for standard 2
for standard 3
for standard 4
for standard 5
for control
It is necessary to determine standards and patient samples in duplicate.
Perform all assay steps in the order given and without any appreciable delays between the steps.
A clean, disposable tip should be used for dispensing each standard and each patient sample.
1.
Dispense 25 µl standards, control and samples into their respective wells. Leave well A1 for substrate blank.
2.
Add 200 µl 17-OH Progesterone-HRP Conjugate to each well. Leave well A1 for substrate blank.
3.
Cover wells with the foil supplied in the kit.
4.
Incubate for 1 hour at 37 °C.
5.
When incubation has been completed, remove the foil, aspirate the content of the wells and wash each well 3
times with 300 µl of diluted wash solution. Avoid overflows from the reaction wells. During each washing step,
gently shake the plate for 5 seconds and remove excess solution by tapping the inverted plate on an absorbent
paper towel.
Automatic washer: in case you use an automatic washer, it is advised to do 6 washing steps.
Note: Washing is critical! Insufficient washing results in poor precision and falsely elevated absorbance values.
6.
Dispense 100 µl TMB Substrate Solution into all wells.
7.
Incubate for exactly 15 min at room temperature (22…28°C) in the dark.
8.
Dispense 100 µl Stop Solution into all wells in the same order and at the same rate as for the TMB Substrate
Solution. Shake the microplate gently.
Any blue colour developed during the incubation turns into yellow.
9.
Measure the absorbance of the specimen at 450 nm against a reference wavelength of 620-630 nm or against
blank within 5 minutes.
8.2. Measurement
Adjust the ELISA Microwell Plate Reader to zero using the substrate blank in well A1.
If - due to technical reasons - the ELISA reader cannot be adjusted to zero using the substrate blank in well A1, subtract
the absorbance value of well A1 from all other absorbance values measured in order to obtain reliable results!
Measure the absorbance of all wells at 450 nm and record the absorbance values for each standard and patient sample
in the distribution and identification plan.
Where applicable calculate the mean absorbance values of all duplicates.
9. RESULTS
9.1. Calculation of results
Calculate the mean absorbance for each point of the standard curve and each sample. Plot the mean value of
absorbance of the standards against concentration. Draw the best-fit curve through the plotted points. (Four Parameter
Logistic).
Interpolate the values of the samples on the standard curve to obtain the corresponding values of the concentrations
expressed in ng/ml.
4
9.2. Reference values
The serum or plasma 17-OH Progesterone reference values are:
Children
Men
Women
follicular phase
luteinic phase
Menopause
0.2 – 0.9 ng/ml
0.2 – 2.3 ng/ml
0.2 – 1.3 ng/ml
1.0 – 4.5 ng/ml
0.2 – 0.9 ng/ml
10. QUALITY CONTROL
Each laboratory should assay controls at normal, high and low levels range of 17-OH Progesterone for monitoring assay
performance. These controls should be treated as unknowns and values determined in every test procedure performed.
Quality control charts should be maintained to follow the performance of the supplied reagents. Pertinent statistical
methods should be employed to ascertain trends. The individual laboratory should set acceptable assay performance
limits. Other parameters that should be monitored include the 80, 50 and 20% intercepts of the standard curve for run-torun reproducibility. In addition, maximum absorbance should be consistent with past experience. Significant deviation
from established performance can indicate unnoticed change in experimental conditions or degradation of kit reagents.
Fresh reagents should be used to determine the reason for the variations.
11. SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS
11.1. Precision
Intra Assay Variation
Within run variation was determined by replicate determination (20x) of three different control sera in one assay. The
within assay variability is ≤ 8,2 %.
Inter Assay Variation
Between run variation was determined by replicate measurements (10x) of three different control sera in different lots.
The between assay variability is ≤ 13,8 %.
11.2. Specificity
The cross reaction of the antibody calculated at 50% according to Abraham is shown in the following table:
17-OH Progesterone
100 %
11-Deoxycortisol
0,846 %
Progesterone
0,590 %
Pregnenolone
0,250 %
Testosterone
0,017 %
17-beta Estradiol
< 0,001 %
Aldosterone
< 0,001 %
Estriol
< 0,001 %
Estrone 3-sulfate
< 0,001 %
Spironolactone
< 0,001 %
Androstenedione
< 0,01 %
Androsterone
< 0,01 %
Corticosterone
< 0,01 %
Cortisol
< 0,01 %
Cortisone
< 0,01 %
DHEA
< 0,01 %
DHEA-S
< 0,01 %
DHT
< 0,01 %
Prednisolone
< 0,01 %
Prednisone
< 0,01 %
Cholesterol
< 0,01 %
5
11.3. Sensitivity
The lowest detectable concentration of 17-OH progesterone that can be distinguished from the zero standard is
0,05 ng/ml at the 95 % confidence limit.
11.4. Accuracy
The recovery test performed on three different samples, enriched with 6.6 - 3.3 - 1.65 - 0.83 - 0.41 ng/ml of 17-OH
Progesterone gave an average value (±SD) of 98.66% ± 5.99%.
In the dilution test three different samples were diluted 2, 4 and 8 times with standard 0; the average value (±SD) obtained
is 95.31% ± 4.88%.
11.5. Correlation
The NovaTec 17-OH Progesterone ELISA was compared to another commercially available 17-OH Progesterone ELISA
kit. 65 serum samples were tested.
The regression curve is:
Y = 1,11*X – 0,04
R2 = 0,935
The revised NovaTec 17-OH Progesterone ELISA kit was compared to the previous NovaTec 17-OH Progesterone
ELISA kit. 65 serum samples were tested.
The regression curve is:
Y = 1,31*X – 0,49
R2 = 0,90
12. LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of the specimen may affect the absorbance values.
13. PRECAUTIONS AND WARNINGS
In compliance with article 1 paragraph 2b European directive 98/79/EC the use of the in vitro diagnostic medical
devices is intended by the manufacturer to secure suitability, performances and safety of the product. Therefore the
test procedure, the information, the precautions and warnings in the instructions for use have to be strictly followed.
The use of the testkits with analyzers and similar equipment has to be validated. Any change in design, composition
and test procedure as well as for any use in combination with other products not approved by the manufacturer is
not authorized; the user himself is responsible for such changes. The manufacturer is not liable for false results and
incidents for these reasons. The manufacturer is not liable for any results by visual analysis of the patient samples.
Only for in-vitro diagnostic use by professional persons. Not for internal or external use in humans or animals.
All components of human origin used for the production of these reagents have been tested for anti-HIV 1+2
antibodies, anti-HCV antibodies and HBsAg and have been found to be non-reactive. Nevertheless, all materials
should still be regarded and handled as potentially infectious.
Do not interchange reagents or strips of different production lots.
No reagents of other manufacturers should be used along with reagents of this test kit.
Do not use reagents after expiry date stated on the label.
Use only clean pipette tips, dispensers, and lab ware.
Do not interchange screw caps of reagent vials to avoid cross-contamination.
Close reagent vials tightly immediately after use to avoid evaporation and microbial contamination.
After first opening and subsequent storage check conjugate and control vials for microbial contamination prior to
further use.
When using automatic equipment, the user has the responsibility to make sure that the kit has been appropriately
tested. To improve the performance of the kit on ELISA automatic systems, it is recommended to increase the
number of washes.
To avoid cross-contamination and falsely elevated results pipette patient samples and dispense conjugate without
splashing accurately to the bottom of wells.
Do not use heavily haemolysed or highly lipemic samples.
Maximum precision is required for dispensation of the reagents.
The TMB substrate contains an irritant, which may be harmful if inhaled, ingested or absorbed through the skin. To
prevent injury, avoid inhalation, ingestion or contact with skin and eyes.
The stop solution consists of a diluted sulphuric acid solution. Sulphuric acid is poisonous and corrosive and can be
toxic if ingested. To prevent chemical burns, avoid contact with skin and eyes.
Avoid the exposure of TMB substrate to direct sunlight, metal or oxidants. Do not freeze the solution.
This method allows the determination of 17-OH Progesterone from 0.2 – 20 ng/ml.
Treatment of the patient with cortisone, natural or synthetic steroids can impair 17-OH Progesterone determination.
Some reagents contain small amounts of Sodium Azide or Proclin 300® as preservative. Avoid the contact with skin
or mucosa.
6
Sodium Azide may be toxic if ingested or absorbed through the skin or eyes: moreover is may react with lead or
copper plumbing to form potentially explosive metal azides. If you use a sink to remove the reagents, allow scroll
through large amounts of water to prevent azide build-up.
WARNING:
Sulphuric acid irritates eyes and skin. Keep out of the reach of children. Upon contact with the eyes,
rinse thoroughly with water and consult a doctor!
13.1. Disposal Considerations
Residues of chemicals and preparations are generally considered as hazardous waste. The disposal of this kind of waste
is regulated through national and regional laws and regulations. Contact your local authorities or waste management
companies which will give advice on how to dispose hazardous waste.
14. ORDERING INFORMATION
Prod. No.:
DNOV004
17-OH Progesterone (96 Determinations)
7
DEUTSCH
1. EINLEITUNG
17-Hydroxyprogesteron (17-OH Progesteron oder 17OHP) ist ein C-21 Steroidhormon, das in den Nebennieren und
Gonaden während der Synthese von Glucocorticoiden und Sexualsteroiden produziert wird. Es wird aus Progesteron von
der 17-Hydrolase , einem P450c17 Enzym, gebildet oder aus 17 Hydroxypregnenolon durch die 3β-Hydroxysteroid.dehydrogenase/∆5-4 isomerase. 17-OH Progesteron ist eine unmittelbare Vorstufe des 11-Desoxycortisols (Compound
S, CpS). CpS wird aus 17-OH Progesteron durch Hydroxylierung des Kohlenstoffatoms C21 gebildet. Daher ist 17-OH
Progesteron ein nützlicher indirekter Parameter für 21-Hydroxylase-Enzymaktivität der Nebennierenrinde. Bei einer
angeborenen 21-Hydroxylasestörung, der häufigsten Form der kongenitalen adrenalen Hyperplasie (CAH), wird 17-OH
Progesterone im Überschuss sezerniert und deshalb im Blut in erhöhter Konzentration gefunden. Bei Patienten mit
einem 11-Hydroxylasedefekt ist es dagegen mäßig erhöht.
17–OHP hat keine definierte physiologische Aufgabe außer als Vorläufermolekül.
Die Serumkonzentrationen von 17–OHP sind altersabhängig mit einem Maximum während der fetalen Entwicklung und
der unmittelbar anschließenden postnatalen Periode. Während der ersten Lebenswochen fällt die Konzentration im
Vergleich zum Nabelschnurblut um das ca. 50-fache ab. Bei männlichen Säuglingen tritt zwischen dem 30. und 60. Tag
nach der Geburt ein kleiner transienter Anstieg auf. Die Konzentration bleibt bei beiden Geschlechtern während der
Kindheit konstant niedrig und steigt dann während der Pubertät an bis die Konzentration von Erwachsenen erreicht
(ca 1 mg/l = ca. 3,03 nmol/l).
Genau wie Cortisol zeigt 17-OHP normalerweise eine ACTH-abhängige diurnale Schwankung mit einem Maximum am
Morgen und einem Minimum in der Nacht. Zusätzlich steigt die Produktion von 17–OHP während der luteischen Phase
des Menstruationszykluses an.
17–OHP ist ein natürliches Progestin, das im ersten Trimester der Schwangerschaft aufgrund der fetalen
Nebennierenproduktion ansteigt.
Normalwerte sind 30-900 ng/l bei Kindern, 150 -700 ng/l bei Frauen vor dem Eisprung und 350-2900 ng/l während der
luteischen Phase
Die Bestimmung von 17-OH Progesteron ist hilfreich bei der Untersuchung von Patienten mit vermuteter kongenitaler
Nebennierenhyperplasie, weil die typischen Enzyme, die in einem solchen Fall defekt sind (21-Hydroxylase and 11βHydroxilase) zu einem Anstieg von 17–OHP führen. In Gegensatz dazu haben die wenigen Patienten mit einem 17αHydroxylase-Defekt eine sehr niedrige bis nicht-nachweisbare Konzentration an 17-OHP.
Erhöhte Serumkonzentrationen an der Basislinie und/oder nach ACTH-Stimulation sind bei anderen Formen der
Nebennierenhyperplasie ebenfalls berichtet worden.
2. VERWENDUNGSZWECK
Kompetitive immunoenzymatische kolorimetrische Methode für die quantitative Bestimmung von 17-OH Progesteron in
humanem Serum oder Plasma.
3. TESTPRINZIP
Die Mikrotiterplatte ist mit Antikörpern gegen anti-17-OH Progesteron beschichtet. anti-17-OH Progesteron in der Probe
konkurriert mit dem zugegebenen, Peroxidase-markierten anti-17 α OH Progesteron (Enzym-markiertes Antigen) um die
Bindung an den Antikörpern auf der Mikrotiterplatte. Ungebundene Substanzen werden bei dem anschließenden
Waschschritt entfernt. Die von dem Enzym-markierten Antigen gebildeten Immunkomplexe werden durch die Zugabe von
Tetramethylbenzidin (TMB) Substrat, welches ein blaues Reaktionsprodukt bildet, sichtbar gemacht. Die Intensität dieses
Produktes ist umgekehrt proportional zur 17-OHP-konzentration in der Probe. Die Zugabe von Schwefelsäure
(Stopplösung) beendet die Enzymreaktion und färbt das Reaktionsprodukt gelb, welches bei 450 nm nachgewiesen
werden kann.
4. MATERIAL
4.1. Mitgelieferte Reagenzien
Beschichtete Mikrotiterplatte: 12 teilbare 8er-Streifen, beschichtet mit IgG Antikörpern gegen 17-OH Progesteron;
in Aluminiumbeutel.
Stopplösung: 1 Flasche mit 15 ml Schwefelsäure, 0.15 mol/l (Hautkontakt vermeiden).
17-OH Progesteron-HRP Konjugat: 1 Flasche mit 22 ml HRP markiertem 17-OH Progesteron.
TMB Substrat Solution: 1 Flasche mit 15 ml 3, 3´, 5, 5´-tetramethylbenzidine (H2O2-TMB 0.26 g/l) (Hautkontakt
vermeiden).
Waschlösung 10x konz.: 1 Flasche mit 50 ml 10x konzentrierter Waschlösung (0.2 M Phosphatpuffer, Proclin
< 0.0015 %).
17-OH Progesteron Kontrolle: 1 Flasche mit 1 ml einer lot-spezifischen, gebrauchsfertigen Kontrolllösung. Die
Konzentration ist auf dem Etikett angegeben.
17-OH Progesteron Standards: 6 Flaschen mit je 1 ml Standardlösung:
8
Standard 0:
Standard 1:
Standard 2:
Standard 3:
Standard 4:
Standard 5
0 ng/ml
0.2 ng/ml
0,6 ng/ml
2,0 ng/ml
6,0 ng/ml
20,0 ng/ml
4.2. Mitgeliefertes Zubehör
1 selbstklebende Abdeckfolie
1 Rahmenhalter
1 Arbeitsanleitung
1 Ergebnisblatt
4.3. Erforderliche Materialien und Geräte
37°C Inkubator
Photometer mit Filtern 450 nm, 620 - 630 nm
Manuelle oder automatische Waschvorrichtung
Mikropipetten mit Einmalspitzen
Vortexer
Aqua dest.
Einmalröhrchen
Timer
5. STABILITÄT UND LAGERUNG
Die original verschlossenen Reagenzien sind bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Verfalldatum haltbar, wenn sie bei
+2…+8°C im Dunkeln gelagert werden.
6. VORBEREITUNG DER REAGENZIEN
Alle Reagenzien, Proben und Kontrollen sind vor ihrer Verwendung für mindestens 30 Minuten auf Raumtemperatur
(22…28°C) zu bringen! Nach Ende der Messung sind die Reagenzien unverzüglich wieder bei +2 - +8° C zu lagern.
Längeres Aufbewahren bei Raumtemperatur ist zu vermeiden.
6.1. Mikrotiterplatte
Die abbrechbaren Streifen sind mit IgG Antikörpern gegen 17-OH Progesteron beschichtet. Die gebrauchsfertigen
Vertiefungen sind bei 2...8°C aufzubewahren. Den Aluminiumbeutel nur öffnen, wenn er Raumtemperatur hat.
Nichtverbrauchte Vertiefungen im Aluminiumbeutel zusammen mit dem Trockenmittel sofort wieder verschließen und bei
2...8° C lagern. Die Klebefolie nicht von den unbenutzten Streifen entfernen.
6.2. 17-OH Progesteron HRP-Konjugat
Das Konjugat ist gebrauchsfertig.
6.3. 17-OH Progesteron Standards
Die Standards sind gebrauchsfertig und enthalten die folgenden Konzentrationen an 17-OH Progesteron:
Standard 0:
Standard 1:
Standard 2:
Standard 3:
Standard 4:
Standard 5
0 ng/ml
0.2 ng/ml
0,6 ng/ml
2,0 ng/ml
6,0 ng/ml
20,0 ng/ml
Nach dem ersten Öffnen sind die Standards für weitere 6 Monate bei +2…+8 °C haltbar.
6.4. TMB Substrat Lösung
Das Fläschchen enthält 15 ml eines Tetramethylbenzidin/Wasserstoffperoxidgemisches. Die gebrauchsfertige Lösung ist
bei 2...8°C vor Licht geschützt aufzubewahren. Die Lösung ist leicht hellblau. Sollte die TMB-Substratlösung dunkelblau
sein, ist sie kontaminiert und kann nicht im Test verwendet werden.
6.5. Stopplösung
Das Fläschchen enthält 15 ml 0.15 M Schwefelsäure (R36/38, S26). Die gebrauchsfertige Lösung ist bei 2...8°C
aufzubewahren.
9
6.6. Waschlösung
Die konzentrierte Waschlösung mit destilliertem Wasser auf 500 ml verdünnen. Bei kleineren Volumen bitte das 1:50
Verhältnis beachten. Die verdünnte Waschlösung ist bei 2…8°C 30 Tage haltbar. In der konzentrierten Lösung können
sich Kristalle bilden. In diesem Fall sollte die Lösung solange bei Raumtemperatur gemischt werden, bis alle Kristalle
gelöst sind. Für eine optimale Genauigkeit sollte die gesamte Menge der konzentrierten Lösung verdünnt werden. Es ist
darauf zu achten, dass die Kristalle vollständig überführt werden. Anschließend sollte bis zur vollständigen Lösung
derselben gemischt werden.
6.7. Kontrolle
Eine Flasche mit 1 ml einer lot-spezifischen, gebrauchsfertigen Kontrolllösung.
7. ENTNAHME UND VORBEREITUNG DER PROBEN
Die Bestimmung von 17-OH Progesteron kann mit Serum oder Plasma durchgeführt werden. Wenn die Bestimmung nicht
am Tag der Probenentnahme erfolgen kann, muss die Probe bei -20°C gelagert werden. Gefrorene Proben müssen nach
dem Auftauen gut gemischt werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist zu vermeiden.
8. TESTDURCHFÜHRUNG
8.1. Testvorbereitung
Gebrauchsinformation vor Durchführung des Tests sorgfältig lesen. Für die Zuverlässigkeit der Ergebnisse ist es
notwendig, die Arbeitsanleitung genau zu befolgen. Die folgende Testdurchführung ist für die manuelle Methode validiert.
Vor Testbeginn auf dem mitgelieferten Ergebnisblatt die Verteilung bzw. Position der Patientenproben und Standards auf
den Mikrotiterstreifen genau festlegen. Die benötigte Anzahl von Mikrotiterstreifen (Kavitäten) in den Streifenhalter
einsetzen. Das Pipettieren der Proben sollte maximal 10 Minuten dauern um einen Drift innerhalb des Testes zu
vermeiden. Wenn mehr als eine Mikrotiterplatte gemessen wird, wird empfohlen für jede Platte eine Standardkurve zu
erstellen.
1 Vertiefung
2 Vertiefungen
2 Vertiefungen
2 Vertiefungen
2 Vertiefungen
2 Vertiefungen
2 Vertiefungen
(z.B. A1)
(z.B. B1+C1)
(z.B. D1+E1)
(z.B. F1+G1)
(z.B. H1+A2)
(z.B. B2+C2)
(z.B. D2+E2)
Blank
für Standard 0
für Standard 1
für Standard 2
für Standard 3
für Standard 4
für Standard 5
Prinzipien der Qualitätssicherung in der Laboratoriumsmedizin erfordern zur höheren Sicherheit für Kontrollen und
Patientenproben mindestens Doppelbestimmungen.
Den Test in der angegebenen Reihenfolge und ohne Verzögerung durchführen.
Für jeden Pipettierschritt der Kontrollen und Proben saubere Einmalspitzen verwenden.
1.
Pipettiere 25 µl Standards, Kontrolle und Proben in die entsprechenden Vertiefungen mit Ausnahme des
Substratblanks.
2.
Gebe 200 µl 17-OH Progesteron-HRP Konjugat in jede Vertiefung mit Ausnahme des Substratblanks.
3.
4.
Die Streifen mit der mitgelieferten Abdeckfolie bedecken.
Inkubiere für 1 h bei 37 °C.
5.
Nach der Inkubation die Abdeckfolie entfernen und die Inkubationsflüssigkeit aus den Teststreifen absaugen.
Anschließend dreimal mit 300 µl verdünnter Waschlösung waschen. Überfließen von Flüssigkeit aus den
Vertiefungen vermeiden. Intervall zwischen Waschen und Absaugen sollte mindestens 5 sec betragen. Nach
dem Waschen die Teststreifen mit den Öffnungen nach unten kurz auf Fliesspapier ausklopfen, um die
restliche Flüssigkeit zu entfernen.
Bei der Benutzung eines automatischen Washers wird empfohlen, 6 Waschgänge durchzuführen.
Beachte: Der Waschvorgang ist wichtig, da unzureichendes Waschen zu schlechter Präzision und falsch
erhöhten Messergebnissen führt!
6.
100µl TMB-Substratlösung in alle Vertiefungen pipettieren.
7.
Inkubiere für genau 15 min bei Raumtemperatur (22 – 28°C) im Dunkeln.
8.
In alle Vertiefungen 100µl Stopplösung in der gleichen Reihenfolge und mit den gleichen Zeitintervallen wie bei
der TMB-Substratlösung Zugabe pipettieren. Mikrotiterplatte leicht schütteln. Während der Inkubation gebildete
blaue Farbe schlägt in gelb um.
9.
Die Extinktion der Lösung in jeder Vertiefung bei 450/620 nm innerhalb von 30 min nach Zugabe der
Stopplösung messen.
10
8.2. Messung
Mit Hilfe des Substratleerwertes (Blank) in A1 den Nullabgleich des Mikrotiterplatten-Photometers (ELISA-Readers)
vornehmen.
Falls diese Eichung aus technischen Gründen nicht möglich ist, muss nach der Messung der Extinktionswert der Position
A1 von allen anderen Extinktionswerten abgezogen werden, um einwandfreie Ergebnisse zu erzielen!
Extinktion aller Kavitäten bei 450 nm messen und die Messwerte der Kontrollen und Proben in das Ergebnisblatt
eintragen.
Eine bichromatische Messung mit der Referenzwellenlänge 620 nm wird empfohlen.
Falls Doppel- oder Mehrfachbestimmungen durchgeführt wurden, den Mittelwert der Extinktionswerte berechnen.
9. ERGEBNISSE
9.1. Berechnung der Ergebnisse
Berechne den Mittelwert der Absorption jedes Punktes der Standardkurve und jeder Probe. Trage die Mittelwerte der
Absorption gegen die Konzentration der Standards auf. Zeichne die am besten passende Kurve durch die Punkte (4
Parameter Fit).
Interpoliere die Werte der Proben anhand der Standardkurve, um die zugehörige Konzentration in ng/ml zu erhalten.
9.2. Referenzwerte
Kinder
Männer
Frauen
Follicularphase
luteinische Phase
Menopause
0.2 – 0.9 ng/ml
0.2 – 2.3 ng/ml
0.2 – 1.3 ng/ml
1.0 – 4.5 ng/ml
0.2 – 0.9 ng/ml
10. QUALITÄTSKONTROLLE
Jedes Labor sollte Kontrollen im normalen, hohen und niedrigen Bereich für 17OH Progesteron messen, um die
Leistungsfähigkeit des Testes zu überprüfen. Diese Kontrollen sollten wie unbekannte Proben behandelt und bei jedem
Testlauf mitbestimmt werden. Qualitätskontrollaufzeichnungen sollten geführt werden, um die Performance der gelieferten
Reagenzien zu überwachen. Um Trends erkennen zu können, sollten angemessene statistische Methoden etabliert
werden. Jedes Labor sollte Annahmekriterien für die Testperformance aufstellen. Andere Parameter, die überwacht
werden sollten, schließen den 80, 50 und 20% Abschnitt der Standardkurve für die Interassay Reproduzierbarkeit ein.
Zusätzlich sollte die maximale Absorption mit früheren Messungen konsistent sein. Signifikante Abweichungen von der
etablierten Leistungsfähigkeit können ein Indikator sein für unbemerkte Veränderungen der experimentellen Bedingungen
oder Instabilität von Kitreagenzien. Um die Ursache der Abweichung zu ermitteln sollten frische Reagenzien verwendet
werden.
11. TESTMERKMALE
11.1. Präzision
Intraassay-Varianz
Die Variation innerhalb eines Testlaufs wurde ermittelt durch die wiederholte Bestimmung (20x) von drei verschiedenen
Kontrollseren in einem Test. Die Intraassay-Varianz beträgt ≤ 8,2 %.
Interassay-Varianz
Die Variation zwischen verschiedenen Testläufen wurde ermittelt durch die wiederholte Bestimmung (10x) von drei
verschiedenen Kontrollseren in verrschiedenen Lots. Die Interassay-Varianz beträgt ≤13,8 %.
11.2. Spezifität
Die Kreuzreaktion der Antikörper bei 50% berechnet nach Abraham ist:
11
17-OH Progesteron
100 %
11-Deoxycortisol
0,846 %
Progesteron
0,590 %
Pregnenolon
0,250 %
Testosteron
0,017 %
17 beta Estradiol
< 0,001 %
Aldosteron
< 0,001 %
Estriol
< 0,001 %
Estrone 3-sulfate
< 0,001 %
Spironolactone
< 0,001 %
Androstenedion
< 0,01 %
Androsteron
< 0,01 %
Corticosteron
< 0,01 %
Cortisol
< 0,01 %
Cortison
DHEA
< 0,01 %
< 0,01 %
DHEA-S
< 0,01 %
DHT
< 0,01 %
Prednisolon
< 0,01 %
Prednison
< 0,01 %
Cholesterol
< 0,01 %
11.3. Sensitivität
Die niedrigste nachweisbare Konzentration an 17-H Progesteron, die vom Standard 0 unterschieden werden kann ist
0,05 ng/ml bei einem 95 % Konfidenzintervall.
11.4. Genauigkeit
6.6 – 3.3 – 1.65 – 0.83 -0.41 ng/ml 17-OH Progesterone wurden zu drei verschiedenen Proben zugegeben. Die
Wiederfindung lag bei durchschnittlich (± SD) bei 98,66 % ± 5,99 % in Bezug auf die Originalkonzentrationen.
Der an drei Seren durchgeführte Verdünnungstest (2 – 4 – 8fache Verdünnung) ergab einen durchschnittlichen Wert (±SD)
von 95,31% ± 4,88%.
11.5. Korrelation
Der NovaTec 17-OH Progesteron ELISA wurde verglichen mit einem anderen kommerziell erhältlichen 17-OH
Progesteron ELISA Test. 65 Serumproben wurden gemessen. Die lineare Regressionskurve wurde wie folgt berechnet:
Y = 1,11*X – 0,04
R2 = 0,935
Der neue 17-OH Progesteron Kit von NovaTec (Y) wurde verglichen mit der alten Version (X). Es wurden 65
Serumproben untersucht. Die lineare Regressionskurve wurde wie folgt ermittelt:
Y = 1,31*X – 0,49
R2 = 0,90
12. GRENZEN DES VERFAHRENS
Mikrobielle Kontamination oder wiederholtes Auftauen und Einfrieren der Proben können das Messergebnis beeinflussen.
13. SICHERHEITSMASSNAHMEN UND WARNHINWEISE
Gemäß Art. 1 Abs. 2b der EU-Richtlinie 98/79/EG legt der Hersteller die Zweckbestimmung von In-vitro-Diagnostika
fest, um deren Eignung, Leistung und Sicherheit sicherzustellen. Daher sind die Testdurchführung, die Information,
die Sicherheitsmaßnahmen und Warnhinweise in der Gebrauchsanweisung strikt zu befolgen. Bei Anwendung des
Testkits auf Diagnostika-Geräten ist die Testmethode zu validieren. Jede Änderung am Aussehen, der
Zusammensetzung und der Testdurchführung sowie jede Verwendung in Kombination mit anderen Produkten, die
der Hersteller nicht autorisiert hat, ist nicht zulässig; der Anwender ist für solche Änderungen selbst verantwortlich.
Der Hersteller haftet für falsche Ergebnisse und Vorkommnisse aus solchen Gründen nicht. Auch für falsche
Ergebnisse aufgrund von visueller Auswertung wird keine Haftung übernommen.
12
Nur für in-vitro-Diagnostik durch Fachpersonal, welches die Arbeitstechniken einwandfrei beherrscht.
Alle verwendeten Bestandteile menschlichen Ursprungs sind auf Anti-HIV-AK, Anti-HCV-AK und HBsAG nichtreaktiv getestet. Dennoch sind alle Materialien als potentiell infektiös anzusehen und entsprechend zu behandeln.
Reagenzien unterschiedlicher Chargen nicht untereinander austauschen.
Keine Reagenzien anderer Hersteller zusammen mit den Reagenzien dieses Testkits verwenden.
Nicht nach Ablauf des Verfallsdatums verwenden.
Nur saubere Pipettenspitzen, Dispenser und Labormaterialien verwenden.
Die Deckel der Fläschchen nicht vertauschen um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
Verschlusskappen der einzelnen Reagenzien nicht untereinander vertauschen.
Flaschen sofort nach Gebrauch fest verschließen, um Verdunstung und mikrobielle Kontamination zu vermeiden.
Nach dem ersten Öffnen Konjugat- und Standardfläschchen vor weiterem Gebrauch auf mikrobielle Kontamination
prüfen.
TMB Substrat keinem direkten Sonnenlicht, Metall oder Oxidantien aussetzen. Das Substrat nicht einfrieren.
Das Rekonstituieren und Pipettieren der Reagenzien erfordert maximale Präzision
Das TMB Substrat enthält einen Reizstoff, der schädlich sein kann beim Inhalieren, Verschlucken oder Hautkontakt.
Zur Vermeidung von Verletzungen sollte die Inhalation, das Verschlucken sowie Haut- und Augenkontakt vermieden
werden.
Die Stopplösung besteht aus verdünnter Schwefelsäure. Schwefelsäure ist giftig und korrosiv und kann beim
Verschlucken toxisch wirken. Zur Vorbeugung von chemischen Verbrennungen sollte der Kontakt mit Haut und
Augen vermieden werden.
Durch die Zugabe des TMB Substrates wird eine chemische Reaktion gestartet, die durch die Zugabe der
Stopplösung beendet wird. Daher sollten das TMB Substrat und die Stopplösung in der gleichen Reihenfolge
zugegeben werden, um jegliche Zeitunterschiede während der Inkubation zu vermeiden.
Zur Vermeidung von Kreuzkontamination und falsch erhöhten Resultaten Patientenproben und Konjugat sorgfältig
in die Kavitäten pipettieren.
Den Kontakt mit Reagenzien, die Wasserstoffperoxid, Schwefelsäure und Konservierungsmittel enthalten, die beim
Verschlucken toxisch sein können, vermeiden.
Nicht mit dem Mund pipettieren.
Diese Methode erlaubt die Bestimmung von 17 OH Progesteron von 0.2 –20 ng/ml.
Die Behandlung mit Kortison, natürlichen oder synthetischen Steroiden kann die 17 OH Progesteronbestimmung
stören.
Einige Reagenzien enthalten geringe Mengen an Natriumazid oder Proclin 300® als Konservierungsmittel. Der
Kontakt mit Haut und Schleimhäuten ist zu vermeiden.
WARNUNG:
Schwefelsäure reizt Augen und Haut. Nach Berührung mit den Augen gründlich mit Wasser spülen
und einen Arzt aufsuchen.
13.1. . Entsorgungshinweise
Chemikalien und Zubereitungen sind in der Regel Sonderabfälle. Deren Beseitigung unterliegt den nationalen
abfallrechtlichen Gesetzen und Verordnungen. Die zuständige Behörde informiert über die Entsorgung von
Sonderabfällen.
14. BESTELLINFORMATION
Produktnummer: DNOV004
17-OH Progesterone (96 Bestimmungen)
13
ITALIANO
1. INTRODUZIONE
17-Hydroxyprogesterone (progesterone 17-OH o 17OHP) è un ormone steroideo C-21, prodotto nella ghiandola adrenale
e nelle gonadi, durante la sintesi dei glucocorticoidi e degli ormoni steroidei. È derivato dal progesterone via 17idrossilasi, un enzima P450c17, o dal 17-idrossipregnenolone via 3β-idrossisteroidi deidrogenasi/∆5-4 isomerasi. Il 17OH
Progesterone è un precursore del cortisolo che si accumula in caso di deficit di 21-idrossilasi surrenale e si riduce dopo
terapia sostitutiva con cortisolo. Valori elevati si riscontrano nell'iperplasia surrenale congenita.
Il 17-OHP non ha un ruolo fisiologico definito tranne come molecola del precursore.
I livelli di 17-OHP sierico sono età-dipendenti, con picchi osservati durante la vita fetale ed il periodo postnatale. Durante
la prima settimana di vita, i livelli sierici di 17-OHP diminuiscono di ~50-volte rispetto ai valori sanguigni del cordone. Un
piccolo aumento transitorio si manifesta dopo la nascita nei maschi di 30-60 giorni. I livelli per entrambi i sessi rimangono
bassi e costanti durante l'infanzia ed aumentano progressivamente durante la pubertà, dove raggiungono i livelli
dell'adulto di ~100 ng/dL (~3.03 nmol/L). I livelli di 17-OHP hanno normalmente una variazione giornaliera ACTH dipendente, si individuano picchi mattutini e crolli notturni. In più, produzione ovarica di 17-OHP aumenta durante la fase
luteale del ciclo mestruale.
Il 17-OHP è una progestinico naturale e durante il terzo mese di gravidanza vi è un aumento dovuto alla produzione
adrenale fetale.
I livelli normali sono 3-90 ng/dl in bambini, nelle donne 15-70 ng/dl prima dell’ovulazione e 35-290 ng/dl durante la fase
luteale.
Le misure dei livelli del 17-OHP sono utili nella valutazione dell’iperplasia adrenale congenita dovuta alla carenza gli
enzimi tipici quali la 21-idrossilasi e 11β-idrossilasi, conducono all'accumulazione del 17-OHP.
In opposizione, raramente, il paziente con la mancanza di 17α-idrossilasi avrà livelli molto bassi o inosservabili di 17OHP.
Elevati livelli sierici basali di 17-OHP e/o dopo lo stimolo dell’ACTH sono presenti in caso di iperplasia adrenale.
2. USO PREVISTO
Metodo competitivo immunoenzimatico colorimetrico per la determinazione quantitativa della concentrazione del 17-OHProgesterone nel siero e plasma.
3. PRINCIPIO DEL TEST
Il 17-OH Progesterone (antigene) presente nel campione, compete con l’antigene marcato con perossidasi nei confronti
dell’anticorpo anti-17-OH Progesterone adsorbito su micropiastra (fase solida). La separazione libero-legato si ottiene
mediante semplice lavaggio della fase solida.
L’enzima presente nella frazione legata, reagendo con il Substrato (H2O2) ed il Cromogeno (TMB), sviluppa una
colorazione blu che vira al giallo dopo aggiunta della Stop soluzione.
L’intensità del colore sviluppato è proporzionale alla concentrazione di antigene marcato e quindi inversamente
proporzionale alla concentrazione del 17-OH-Progesterone presente nel campione.
4. MATERIALI
4.1. Reagenti forniti
Anti-17-OH Progesterone IgG coated microplate (micropiastra): 12 strisce divisibili in 8 pozzetti, anti-17-OH
Progesterone adsorbito su micropiastra; dentro una busta d’alluminio richiudibile.
Stop Solution: 1 flacone contenente 15 ml acido solforico 0.15 mol/L (evitare il contatto con la pelle)
17 -OH Progesterone-HRP Coniugate: 1 flacone contenente 22 ml 17- OH Progesterone coniugato con
Perossidasi.
TMB Substrate Solution: 1 flacone contenente 15 ml di 3,3`,5,5`-Tetrametilbenzidina (TMB, 0.26 g/l) (evitare il
contatto con la pelle).
10X Conc. Wash Solution: 1 flacone contenente 50 ml Tampone fosfato 0,2M, Proclin < 0,0015%
17-OH Progesterone Control: 1 flacone, 1 ml, pronto all’uso. La concentrazione del controllo è lotto-specifica ed è
indicata sul Foglio di Controllo
17-OH Progesterone Standards: 6 flaconi, contenenti 1 ml
Standard 0:
Standard 1:
Standard 2:
Standard 3:
Standard 4:
Standard 5
0 ng/ml
0.2 ng/ml
0,6 ng/ml
2,0 ng/ml
6,0 ng/ml
20,0 ng/ml
14
4.2. Accessori forniti
1 pellicola adesiva
1 supporto per micropiastre
1 istruzione per l’uso
1 foglio di controllo
4.3. Materiali e attrezzature necessari
Fotometro per micropiastre con filtri da 450 nm, 620-630 nm
Incubatore a 37°C
Lavatore di micropiastre
Micropipette con punte monouso (10, 100, 200, 1000 µl)
Vortex-Mixer
Provette monouso
Supporto per provette
Acqua deionizzata o distillata.
Timer
5. MODALITÀ DI CONSERVAZIONE
I reagenti devono essere conservati tra 2-8°C al riparo dalla luce. Non usare i reagenti dopo la scadenza. La data di
scadenza è stampata sull’etichetta di ogni componente e sull’etichetta esterna della confezione.
6. PREPARAZIONE DEI REAGENTI
Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (22-28°C) prima dell’uso per almeno 30 minuti. Al termine del
dosaggio riporre immediatamente tutti i reagenti a 2-8°C: evitare lunghi periodi a temperatura ambiente.
6.1. Micropiastre
I pozzetti sono separabili e sotto vuoto. Anti-17-OH Progesterone adsorbito su micropiastra. I pozzetti, pronti all’uso,
devono essere conservati tra 2-8°C. Riporre i pozzetti non utilizzati nel sacchetto con il gel essiccante di silice. Il prodotto
è stabile fino alla data di scadenza se conservato tra 2-8°C.
6.2. 17-OH Progesterone-HRP Coniugate
Il 17-OH Progesterone- Coniugato HRP è una soluzione pronta all’uso. Il flacone contiene 22 ml 17- OH Progesterone
coniugato con perossidasi. Una volta aperto, il prodotto é stabile fino alla data di scadenza se conservato tra 2-8°C.
6.3. 17-OH Progesterone Standards
I flaconi contengono 1 ml di soluzione Standard pronta all’uso con le seguenti concentrazioni:
Standard 0:
Standard 1:
Standard 2:
Standard 3:
Standard 4:
Standard 5
0 ng/ml
0.2 ng/ml
0,6 ng/ml
2,0 ng/ml
6,0 ng/ml
20,0 ng/ml
Una volta aperti sono stabili per 6 mesi 2-8°C.
6.4. TMB Substrate Solution
Il flacone contiene 15 ml di 3,3`,5,5`-Tetrametilbenzidina (TMB) e perossido di idrogeno pronto all’uso. Conservare al
buio. La soluzione é incolore o celeste chiaro. Nel caso in cui diventasse blu significa che é contaminata e non puó
essere piú usata. Una volta aperto, il prodotto é stabile fino alla data di scadenza se conservato tra 2-8°C.
6.5. Stop Solution
Il flacone contiene 15 ml di acido solforico, 015 mol/l (R36/38, S26), pronto all’uso. Una volta aperto, il prodotto é stabile
fino alla data di scadenza se conservato tra 2-8°C.
6.6. Wash Solution
Prima dell’uso, diluire il contenuto di ogni fiala di "10X Conc. Wash Solution" con acqua distillata fino al volume di 500 ml.
Per preparare volumi minori rispettare il rapporto di diluizione di 1:10. La soluzione di lavaggio diluita è stabile a 2-8°C per
almeno 30 giorni.
Nella wash soluzione concentrata è possibile osservare la presenza di cristalli; in tal caso agitare a temperatura ambiente
fino a completa dissoluzione dei cristalli; per una maggiore precisione diluire tutto il flacone della soluzione di lavaggio
concentrata a 500 ml, avendo cura di trasferire anche i cristalli, poi agitare fino a completa dissoluzione dei cristalli.
15
6.7. 17-OH Progesterone Controllo
Il flacone contiene 12 ml, pronto all’uso. La concentrazione del controllo è lotto-specifica ed è indicata sul Foglio di
Controllo.
7. PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Usare campioni di siero o plasma umano. Se il test viene fatto entro 24 ore dal prelievo i campioni possono essere
conservati tra 2-8°C. Altrimenti devono essere aliquotati e congelati tra -70 e -20°C. Evitare cicli ripetuti di
congelamento/scongelamento.
8. PROCEDIMENTO
8.1. Procedura del Test
Leggere bene le istruzioni prima di iniziare il dosaggio. Per ottenere risultati validi é indispensabile seguire esattamente le
istruzioni. Stabilire innanzitutto il piano di distribuzione ed identificazione dei campioni e standard sul foglio di lavoro
fornito con il kit. Il tempo di dispensazione dei pozzetti non deve essere superiore a (10) minuti. Inserire i pozzetti
necessari nel supporto micropiastre.
Utilizzare almeno:
1 pozzetto (e.g. A1)
2 pozzetti (e.g. B1+C1)
2 pozzetti (e.g. D1+E1)
2 pozzetti (e.g. F1+G1)
2 pozzetti (e.g. H1+A2)
2 pozzetti (e.g. B2+C2)
2 pozzetti (e.g. D2+E2)
2 pozzetti (e.g. D2+E2)
bianco
standard 0
standard 1
standard 2
standard 3
standard 4
standard 5
Controllo
È consigliato effettuare ogni analisi in duplicato.
Eseguire il test nell’ordine stabilito dalle istruzioni, senza pause.
Utilizzare puntali nuovi e puliti per ogni campione e standard.
1.
Pipettare 25 µl di standard e di campione nei relativi pozzetti. Usare il pozzetto A1 per il bianco-substrato.
2.
Pipettare 200 µl di 17-OH Progesterone-HRP in tutti i pozzetti, escludendo quello con il bianco-substrato
(blank)
3.
4.
Coprire i pozzetti con la pellicola adesiva.
Incubare 1 ora a 37°C.
5.
Allontanare la miscela di reazione. Lavare i pozzetti 3 volte con 300 µl di wash soluzione diluita (se si utilizza
un lavatore automatico, effettuare 6 lavaggi)
Nota importante: ad ogni step di lavaggio, agitare delicatamente la piastra per 5 secondi e successivamente
rimuovere l'eccesso di soluzione di lavaggio sbattendo delicatamente la micropiastra
capovolta su fogli di carta assorbente.
6.
Pipettare 100 µl di Soluzione TMB in tutti i pozzetti.
7.
Incubare precisamente per 15 min a temperatura ambiente al buio.
8.
Pipettare 100µl di Soluzione Stop in tutti i pozzetti, nello stesso ordine della soluzione TMB. Agitare
delicatamente la micropiastra. Durante l’incubazione il colore cambia dal blu al giallo.
9.
Leggere l’assorbanza (E) a 450 nm contro una lunghezza d'onda di riferimento di 620-630 nm oppure contro il
Bianco entro 5 minuti.
8.2. Misurazione
Regolare il fotometro per le micropiastre (ELISA-Reader) a zero usando il bianco (blank) in A1.
Se, per motivi tecnici, non é possibile regolare il fotometro sottrarre l’assorbanza del bianco da tutti i valori delle altre
assorbanze.
Misurare l’assorbanza di tutti i pozzetti a 450 nm e inserire tutti i valori misurati nel foglio di lavoro.
É raccomandato fare una misurazione delle densità ottiche a doppia lunghezza d’onda utilizzando i 620 nm come
lunghezza di riferimento.
Dove sono state misurate in doppio, calcolare la media delle assorbanze.
9. RISULTATI
9.1. Calcolo dei risultati
Calcolare l’estinzione media (Em) di ciascun punto della curva standard (S0 –S5) e di ogni campione. Tracciare sul grafico
delle assorbanze i valori calcolati delle estinzioni medie (Em) di ciascuno standard (S0 –S5) in funzione delle
16
concentrazioni. Tracciare la miglior curva passante per i punti standard (es: Four Parameter Logistic). Interpolare, dal
grafico, i valori di assorbanza relativi a ciascun campione e leggerne la corrispondente concentrazione in ng/ml.
9.2. Valori di riferimento
Le concentrazioni seriche o plasmatiche di 17αOH Progesterone sono comprese nei seguenti intervalli:
DONNE
fase follicolare
fase luteinica
menopausa
UOMINI
BAMBINI
0,2 - 1,3 ng/ml
1,0 - 4,5 ng/ml
0,2 - 0,9 ng/ml
0,2 - 2,3 ng/ml
0,2 - 0,9 ng/ml
10. CONTROLLO QUALITA’
Ogni laboratorio dovrebbe analizzare i campioni nella gamma dei livelli elevati, normali e bassi di 17OH Progesterone per
il controllo delle prestazioni dell’analisi. Questi campioni dovrebbero essere trattati come ignoti ed i valori determinati in
ogni test effettuato. Le tabelle di controllo qualità dovrebbero essere effettuate per seguire le prestazioni dei reagenti
forniti. Metodi statistici adeguati dovrebbero essere impiegati per accertare il trend. Il laboratorio dovrebbe fissare i limiti
di accettabilità di prestazioni dell’analisi. Altri parametri che dovrebbero essere controllati includono le intercette di 80, 50
e 20% della curva standard per valutare la riproducibilità. In più, la capacità di assorbimento massima dovrebbe essere
costante con l’esperienza precedente. La deviazione significativa dalle prestazioni stabilite può indicare il cambiamento
inosservato negli stati o nella degradazione sperimentali dei reagenti del kit. Reagenti freschi dovrebbero essere usati per
determinare il motivo delle variazioni.
11. CARATTERISTICHE DEL TEST
11.1. Precisione
Intra – Assay
La variabilità all’interno dello stesso kit è stata determinata replicando (20x) la misura di tre differenti sieri. La variabilità
intra-assay è ≤ 8,2%.
Inter - Assay
La variabilità tra kit differenti è stata determinata replicando (10x) la misura di tre differenti sieri con kit appartenenti a lotti
diversi. La variabilità inter-assay è ≤ 13,8%.
11.2. Specificità
L’anticorpo impiegato presenta le seguenti reazioni crociate,calcolate al 50% secondo Abraham:
17-OH Progesterone
100 %
11-Deossicortisolo
0,846 %
Progesterone
0,590 %
Pregnenolone
0,250 %
Testosterone
0,017 %
17b Estradiolo
< 0,001 %
Aldosterone
< 0,001 %
Estriolo
< 0,001 %
Estrone 3-solfato
< 0,001 %
Spironolactone
< 0,001 %
Androstenedione
< 0,01 %
Androsterone
< 0,01 %
Corticosterone
< 0,01 %
Cortisolo
< 0,01 %
Cortisone
< 0,01 %
DHEA
< 0,01 %
DHEA-S
< 0,01 %
DHT
< 0,01 %
Prednisolone
< 0,01 %
Prednisone
< 0,01 %
Colesterolo
< 0,01 %
17
11.3. Sensibilità
La concentrazione minima di 17OH Progesterone misurabile che può essere distinta dal Calibratore 0 è 0,05 ng/ml con
un limite di confidenza del 95%.
11.4. Accuratezza
La prova di recupero condotta su tre differenti campioni arricchiti con 6,6 - 3,3 - 1,65 - 0,83 - 0,41 ng/ml di 17OH
Progesterone ha dato un valore medio (±SD) di 98,66% ± 5,99%.
Per la prova di diluizione sono stati diluiti 3 diversi campioni 2, 4 e 8 volte con il Calibratore 0; il valore medio (±SD)
ottenuto è 95,31% ± 4,88%.
11.5. Correlazione
Il kit NovaTec 17-OH Progesterone ELISA è stato comparato con un kit disponibile in commercio. Sono stati testati 65
campioni di siero.
La curva di regressione è:
Y = 1,11*X - 0,04
R2 = 0,935
Il nuovo kit NovaTec 17-OH Progesterone ELISA è stato comparato con il precedente kit NovaTec 17-OH Progesterone
ELISA. Sono stati testati 65 campioni di siero.
La curva di regressione è:
Y = 1,31*X - 0,49
R2 = 0,90
12. LIMITAZIONI
Una contaminazione da microorganismi o ripetuti cicli di congelamento-scongelamento possono alterare i valori delle
assorbanze.
13. PRECAUZIONI E AVVERTENZE
In ottemperanza all’articolo 1, paragrafo 2 della direttiva Europea 98/79/EC, l’uso dei diagnostici medici in vitro è
inteso da parte del produttore ad assicurare la congruenza, le prestazioni e la sicurezza del prodotto. Di
conseguenza la procedura analitica, le informazioni, le precauzioni e le avvertenze contenute nelle istruzioni per
l’uso devono essere seguite scrupolosamente. L’uso dei kit con analizzatori e attrezzature similari deve essere
previamente convalidato. Qualunque cambiamento nello scopo, nel progetto, nella composizione o struttura e nella
procedura analitica, così come qualunque uso dei kit in associazione ad altri prodotti non approvati dal produttore
non è autorizzato; l’utilizzatore stesso è responsabile di questi eventuali cambiamenti. Il produttore non è
responsabile per falsi risultati e incidenti che possano essere causati da queste ragioni. Il produttore non è
responsabile per qualunque risultato ottenuto attraverso esame visivo dei campioni dei pazienti.
Solo per uso diagnostico in-vitro da eseguire da parte di personale esperto. Non per uso interno o esterno su esseri
umani o animali.
Tutti i componenti di origine umana sono stati trovati non reattivi con Anti-HIV-Ab, Anti-HCV-Ab e HBsAg.
Nonostante ciò e tutti i materiali devono comunque essere considerati potenzialmente contagiosi e infettivi.
Non scambiare reagenti e micropiastre di lotti diversi.
Non utilizzare reagenti di altri produttori insieme con i reagenti di questo kit.
Non usare dopo la data di scadenza.
Utilizzare soltanto attrezzatura pulita.
Non scambiare i tappi dei flaconi.
Richiudere i flaconi immediatamente dopo l’uso per evitare la vaporizzazione e contaminazione.
Una volta aperti e dopo relativo stoccaggio verificare i reagenti per una loro eventuale contaminazione prima
dell’uso.
Per evitare contaminazioni crociate e risultati erroneamente alti pipettare i campioni e reagenti con molta precisione
nei pozzetti.
Qualora si utilizzi strumentazione automatica, è responsabilità dell’utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato
opportunamente validato. Per migliorare le prestazioni del kit su strumentazione automatica, si consiglia di
aumentare il numero di lavaggi.
Evitare l’esposizione del reattivo TMB/H2O2 alla luce solare diretta, metalli o ossidanti. No congelare la soluzione.
Alcuni reagenti contengono piccole quantità di Proclin 300R come conservante. Evitare il contatto con la pelle e le
mucose.
Il TMB Substrato contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute.
Per prevenire lesioni, evitare l’inalazione, l’ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi.
La Stop Solution è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. L’acido solforico è velenoso e corrosivo e
può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi.
Questo metodo consente di determinare concentrazioni di 17-OH Progesterone da 0,2 ng/ml a 20 ng/ml.
La somministrazione di steroidi naturali o sintetici può alterare i livelli ematici di 17-OH Progesterone.
18
ATTENZIONE:
L’acido solforico irrita occhi e pelle! Dopo il contatto sciacquare immediatamente e abbondantemente.
Contattare un medico.
13.1. Smaltimento
In genere tutte le sostanze chimiche vengono considerate rifiuti tossici. Lo smaltimento viene regolato da leggi nazionali.
Per ulteriori informazioni contattare l’autorità locale.
14. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI
Numero del prodotto:
DNOV004
17-OH Progesterone (96 determinazioni)
19
ESPANOL
1. INTRODUCCIÓN
La 17-hidroxiprogesterona (17-OH progesterona o 17OHP) es una hormona esteroide C-21 producida en la glándula
suprarrenal ylas gónadas, durante la síntesis de glucocorticoides y esteroides sexuales. Es un derivado de la
progesterona a través de la 17-hidroxilasa, una enzima P450c17, o de la 17-hidroxipregnenolona a través del 3βhidroxiesteroide deshidrogenasa / ∆ 5-4 Isomerasa. La 17-OHP no tiene definido su papel fisiológico, excepto como una
molécula precursora. La 17OH progesterona es un precursor de cortisol que se acumula en el caso de la deficiencia de
21-hidroxilasa adrenal y disminuye después de la terapia de reemplazo con cortisol. Los valores altos se encuentran en
la hiperplasia adrenal congénita.
Los niveles séricos de 17-OHP dependen de la edad, con niveles máximos observados durante la vida fetal y el periodo
postnatal inmediato. Durante la primera semana de vida, los niveles séricos de 17-OHP caen ~ 50 veces en comparación
a los valores de sangre de cordón. Un pequeño aumento transitorio se produce en los niños varones de 30-60 días
después del nacimiento. Los niveles para ambos sexos se mantienen en niveles constantes bajos durante la infancia, y
luego aumentan progresivamente durante la pubertad alcanzando los niveles de adultos de ~100 ng / dL
(~ 3,03 nmol/ l). Como con el cortisol, los niveles séricos de 17-OHP normalmente tienen una variación diurna
dependiente de ACTH, con un pico en la mañana y el punto más bajo en la noche. Además, la producción ovárica de
17α-OHP aumenta durante la fase lútea del ciclo menstrual. La 17-hidroxiprogesterona es un progestágeno natural y
durante el embarazo aumenta en el tercer trimestre debido principalmente a producción adrenal fetal.
Los niveles normales son de 3-90 ng / dl en niños y en mujeres, 15-70 ng /dl antes de la ovulación, y 35 a 290 ng/dl
durante la fase lútea.
Las mediciones de los niveles de 17-hidroxiprogesterona son útiles en la evaluación de pacientes con sospecha de
hiperplasia suprarrenal congénita ya que las enzimas típicas que son defectuosas, es decir, 21-hidroxilasa y
11β-hidroxilasa, conducen a una acumulación de 17-OHP. Por el contrario, en raros pacientes con deficiencia de
17α-hidroxilasa se tienen niveles muy bajos o no detectables de 17-OHP.
Niveles elevados en suero de 17-OHP al inicio y/o después de la estimulación con ACTH también se han reportado en
otras formas de hiperplasia suprarrenal.
2. USO PREVISTO
Método colorimétrico inmunoenzimático competitivo para la determinación cuantitativa de 17-OH progesterona en suero
o plasma humano.
3. PRINCIPIO DEL ENSAYO
Tiras de pozos de micro titulación son pre cubiertos con anticuerpos anti-17-OH progesterona (fase sólida). La 17 α OH
progesterona en la muestra compite con la 17-OH progesterona marcada con peroxidasa de rábano picante (antígeno
marcado enzimáticamente) por la unión a los anticuerpos. Después de la incubación una separación de lo unido/libre es
realizada a la fase sólida mediante lavado. El complejo inmune formado por el antígeno marcado enzimáticamente se
visualiza mediante la adición del sustrato Tetrametilbenzidina (TMB) el cual genera un producto de reacción azul. La
intensidad de este producto es inversamente proporcional a la cantidad de 17-OH progesterona en la muestra. Se
adiciona ácido sulfúrico para detener la reacción. Esto produce un color de punto final amarillo. La absorción a 450 nm
se lee usando un lector de placa de micro pozos de ELISA.
4. MATERIALES
4.1. Reactivos suministrados
Anti-17-OH progesterona IgG Pozos recubiertos: 12 tiras separadas rompibles de 8 pozos recubiertas con anti17 α OH progesterona IgG; en bolsa de aluminio resellable.
Solución de parada: 1 botella contiene 15 ml de acido sulfúrico, 0.15 mol/l (evitar cualquier contacto con la piel).
17-OH progesterona-HRP Conjugado: 1 botella contiene 22 ml de 17-OH progesterona marcada con peroxidasa
de rábano picante.
Solución sustrato TMB: 1 botella contiene 15 ml 3,3´, 5,5´-tetramethylbenzidine (H2O2-TMB 0,26 g/l) (evitar
cualquier contacto con la piel).
Solución de lavado concentrada 10x: 1 vial de 50 ml tampón fosfato 0,2 M, Proclin < 0,0015 %
Control 17-OH progesterona: 1 botella contiene 1 ml de una solución de control específica de lote lista para usar.
La concentración está marcada en la etiqueta.
20
Estándares 17 -OH progesterona: 6 botellas, 1 ml cada una
Estándar 0: 0.0 ng/ml
Estandar 1: 0.2 ng/ml
Estandar 2: 0,6 ng/ml
Estándar 3: 2,0 ng/ml
Estandar 4: 6,0 ng/ml
Estandar 5: 20,0 ng/ml
4.2. Materiales suministrados
•
•
•
•
1 Soporte de tiras
1 Lámina de cubierta
1 Protocolo de prueba
1 Esquema de distribución e identificación
4.3. Materiales e instrumentos necesarios
Lector de placa de micro pozos de ELISA, equipado para la medición de absorbancias a 450 nm, 620-630 nm
Equipo manual o automático para el lavado de pozos
Pipetas para medir volúmenes entre 10 y 1000 ul
Vortex mezclador de tubos
Agua destilada
Tubos desechables
Cronómetro
5. ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO
Los reactivos son estables hasta la fecha de expiración escrita sobre la etiqueta cuando se almacenan de 2…8°C en la
oscuridad.
6. PREPARACION DE LOS REACTIVOS
Es muy importante llevar todos los reactivos, muestras y estándares a temperatura ambiente (22…28°C) durante al
menos 30 minutos antes de empezar la corrida! Al final del ensayo inmediatamente poner todos los reactivos a 2-8° C
para evitar largos periodos a temperature ambiente.
6.1. Tiras rompibles recubiertas
Las tiras rompibles separadas listas para usar están recubiertas con anticuerpos anti-17-OH progesterona IgG.
Almacenar a 2…8°C. Abrir la bolsa solo cuando estén a temperatura ambiente. Inmediatamente después de remover las
tiras, las tiras restantes deberán guardarse en la bolsa de aluminio junto con el desecante suministrado y almacenarse a
2…8°C; la estabilidad es hasta la fecha de expiración. No remover los papeles adhesivos de las tiras no utilizadas.
6.2. Conjugado 17-OH Progesterona-HRP
El conjugado 17-OH progesterona es una solución lista para usar.
6.3. Estándares 17-OH Progesterona
Los estándares están listos para usar y tienen las siguientes concentraciones de 17-OH progesterona:
Estándar 0:
Estándar 1:
Estándar 2:
Estándar 3:
Estándar 4:
Estándar 5:
0.0 ng/ml
0.2 ng/ml
0,6 ng/ml
2,0 ng/ml
6,0 ng/ml
20,0 ng/ml
Después del primer uso son estables por otros 6 meses a +2…+8 °C.
6.4. Solución sustrato TMB
La botella contiene 15 ml de un sistema de Tetrametilbenzidina/Peróxido de Hidrógeno. El reactivo está listo para usar y
debe ser almacenado a 2…8°C en la oscuridad. La solución debe ser incolora o puede tener una ligera tinción azul. Si el
sustrato se vuelve azul, este puede haberse contaminado y debe ser descartado.
21
6.5. Solución de Parada
La botella contiene 15 ml de solución de ácido sulfúrico 0.15 M (R36/38, S 26). Solución lista para usar debe ser
almacenada a 2…8°C.
6.6. Solución de lavado
Diluir la solución de lavado concentrada con agua destilada para alcanzar un volumen final de 500 ml antes de
emplearla. Para volúmenes más pequeños, asegúrese de respetar una relación de 1:10. La solución de lavado diluida es
estable durante 30 días si se almacena a 2...8 °C. En la solución de lavado concentrada es posible observar la presencia
de cristales. En ese caso, agitar a temperatura ambiente hasta que los cristales se disuelvan por completo. Para una
mayor precisión, diluir todo el frasco de la solución de lavado concentrada en 500 mL teniendo cuidado para transferir
también los cristales y, a continuación, agitar hasta que se disuelvan por completo.
6.7. Control
La botella contiene 1 ml de una solución de control específica de lote lista para usar.
7. RECOLECCION DE MUESTRAS Y PREPARACION
La determinación de la 17 α OH progesterona puede ser realizada tanto en plasma como en suero humanos. Almacenar
las muestras a -20°C si la determinación no va a ser realizada el mismo día de la toma de la muestra. Si las muestras
son almacenadas congeladas, mezclar bien las muestras descongeladas antes de hacer el ensayo. Evitar repetidos
ciclos de congelación y descongelación.
8. PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
8.1. Preparación de la prueba
Por favor leer el protocolo de la prueba cuidadosamente antes de realizar el ensayo. La confiabilidad de los resultados
depende de la estricta adherencia al protocolo de la prueba como se describe. Antes de comenzar el ensayo, el
esquema de distribución e identificación para todas las muestras y estándares debe ser cuidadosamente establecido en
la hoja de resultados suministrada en el kit. Seleccionar el número requerido de tiras de micro titulación o pozos e
insertarlas en el soporte. El pipeteo de las muestras no debe extenderse más de 10 minutos para evitar la deriva del
ensayo. Si se utiliza más de una placa, se recomienda repetir la curva dosis respuesta. Por favor asignar por lo menos:
1 pozo
2 pozos
2 pozos
2 pozos
2 pozos
2 pozos
2 pozos
2 pozos
(ej. A1)
(ej. B1+C1)
(ej. D1+E1)
(ej. F1+G1)
(ej. H1+A2)
(ej. B2+C2)
(ej. D2+E2)
(ej. F2+G2)
para el blanco
para estándar 0
para estándar 1
para estándar 2
para estándar 3
para estándar 4
para estándar 5
para control
Es necesario determinar los estándares y las muestras de pacientes por duplicado.
Realizar todos los pasos del ensayo en el orden dado y sin ningún retraso apreciable entre los pasos.
Se debe usar una punta limpia y desechable para el dispensado de cada estándar y de cada muestra de paciente.
1.
2.
3.
4.
Dispensar 25 µl de estándares, control y muestras en los respectivos pozos. Dejar el pozo A1 para el blanco
de sustrato.
Adicionar 200 µl de conjugado17-OH progesterona-HPR a cada pozo. Dejar el pozo A1 para el blanco de
sustrato.
Cubrir los pozos con el papel suministrado en el kit.
Incubar por 1 hora a 37°C.
Retire el contenido de cada pocillo; lavar los pocillos 3 veces con 300 µl de solución de lavado diluida (sie se
utiliza un equipo automátizado, lavar los pocillos 6 veces).
Nota importante:
Durante cada paso de lavado, agitar suavemente la placa durante 5 segundos y eliminar e
exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre una toalla de papel
absorbente.
Nota:
5.
6.
7.
El lavado es crítico! Lavados insuficientes resultan en baja precisión y valores de absorbancia
falsamente elevados.
Dispensar 100 ul de solución sustrato TMB en todos los pozos.
Incubar por exactamente 15 minutos a temperatura ambiente (22…28°C) en la oscuridad.
Dispensar 100 ul de solución de parada en todos los pozos en el mismo orden y a la misma velocidad que para
la Solución de Sustrato TMB. Mezclar suavemente la microplaca.
22
8.
Cualquier color azul desarrollado durante la incubación se volverá amarillo.
Agitar la microplaca suavemente. Leer la absorbancia (E) a 450 nm frente a una longitude de onda de
referencia de 620-630 nm o contra el blanco dentro de los primeros 5 minutos.
8.2. Medición
Ajustar el lector de placa de micro pozos a cero usando el blanco de sustrato en el pozo A1.
Si - por razones técnicas - el lector de ELISA no se puede ajustar a cero con el blanco del substrato en el pozo A1, restar
el valor de absorbancia del pocillo A1 de todos los otros valores de absorbancia medidos con el fin de obtener resultados
fiables!
Medir la absorbancia de todos los pozos a 450 nm y grabar los valores de absorbancia de cada estándar y muestra de
paciente en el esquema de distribución e identificación.
Donde aplique calcular la media de los valores de absorbancia para todos los duplicados.
9. RESULTADOS
9.1. Cálculo de Resultados
Calcular la absorbancia media para cada punto de la curva estándar y cada muestra. Graficar el valor medio de la
absorbancia de los estándares contra la concentración. Dibujar la curva de mejor ajuste a través de los puntos trazados
(ej. Cuatro parámetros Logístico).
Interpolar los valores de las muestras sobre la curva estándar para obtener los valores correspondientes de las
concentraciones expresadas en ng/ml.
9.2. Valores de Referencia
Los valores de referencia en suero o plasma para 17 α OH progesterona son:
Niños
0.2 - 0.9 ng/ml
Hombres
0.2 - 2.3 ng/ml
Mujeres Fase folicular
0.2 - 1.3 ng/ml
Fase lútea
1.0 - 4.5 ng/ml
Menopausia
0.2 - 0.9 ng/ml
10. CONTROL DE CALIDAD
Cada laboratorio debe probar controles en los rangos normal, alto y bajo de 17 OH progesterona para monitorear el
desempeño del ensayo. Esos controles deben ser tratados como desconocidos y los se deben determinar los valores en
cada procedimiento de prueba realizado. Las gráficas de control de calidad se deben mantener siguiendo el desempeño
de los reactivos suministrados. Métodos estadísticos adecuados deben ser empleados para determinar las tendencias.
El laboratorio individual debe establecer los límites de desempeño aceptables para el ensayo. Otros parámetros que
deben ser monitoreados incluyen los interceptos del 80, 50 y 20 % de la curva estándar para la reproducibilidad corrida
a corrida. En adición, la absorbancia máxima debe ser consistente con la experiencia pasada. Desviación significativa
del desempeño establecido puede indicar un cambio inadvertido en las condiciones experimentales o degradación de los
reactivos del kit. Reactivos frescos deben ser usados para determinar la razón de las variaciones.
11. CARACTERISTICAS ESPECIFICAS DE DESEMPEÑO
11.1.
Precisión
Variación Intra Ensayo
La variación dentro de la corrida fue establecida mediante la determinación (20x) de tres controles séricos diferentes en
un ensayo. La variabilidad intra ensayo es ≤ 8,2 %.
Variación Inter Ensayo
La variación entre corridas fue determinada mediante mediciones de replicas (10x) de tres diferentes controles séricos
en lotes diferentes. La variabilidad entre ensayos es ≤ 13,8 %.
23
11.2.
Especificidad
La reacción cruzada del anticuerpo calculada en el 50% de acuerdo a Abraham es:
17-OH Progesterona
11-Deoxycortisol
Progesterona
Pregnenolona
Testosterona
17b Estradiol
Aldosterona
Estriol
Estrone 3-sulfate
Spironolactone
Androstenediona
Androsterona
Corticosterona
Cortisol
Cortisona
DHEA
DHEA-S
DHT
Prednisolona
Prednisona
Cholesterol
11.3.
100 %
0,846 %
0,590 %
0,250 %
0,017 %
< 0,001 %
< 0,001 %
< 0,001 %
< 0,001 %
< 0,001 %
< 0,01 %
< 0,01 %
< 0,01 %
< 0,01 %
< 0,01 %
< 0,01 %
< 0,01 %
< 0,01 %
< 0,01 %
< 0,01 %
< 0,01 %
Sensibilidad
La concentración mínima detectable de 17-OH progesterona que puede ser distinguida del estándar 0 es 0,05 ng/ml en
el 95% del límite de confianza.
11.4.
Exactitud
La recuperación de 6,6 – 3,3 – 1,65 – 0,83 – 0,41 ng/ml de 17-OH progesterona adicionado a tres muestras diferentes
dio un valor promedio de 98,66 % ± 5,99 % con referencia a las concentraciones originales.
En el ensayo de dilución en tres muestras diferentes fueron diluidas 2, 4 y 8 veces con calibrador 0: el valor medio (± SD)
obtenido es 95,31 ± 4,88 %.
11.5.
Correlación
La ELISA 17-OH progesterona NovaTec fue comparada con otro ensayo ELISA 17-OH progesterona comercialmente
disponible. 65 muestras de suero fueron analizadas.
Se calculó la curva de regresión lineal:
Y = 1,11*X - 0,04
R2 = 0,935
El nuevo Kit de 17-OH Progesterone ELISA de NovaTec (y) fué comparado con la versión anterior (x). Se analizaron 65
muestras se suero . Se calculo la curva de regresión lineal:
Y = 1,31*X - 0,49
R2 = 0,90
12. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Contaminación bacteriana o repetidos ciclos de congelación descongelación de la muestra pueden afectar los valores de
absorbancia.
13. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS
De acuerdo con el articulo 1 parágrafo 2b de la directiva europea 98/79/EC el uso de dispositivos de diagnóstico
médico invitro está destinado por el fabricante para asegurar la idoneidad, desempeño y seguridad del producto.
Por lo tanto el procedimiento de la prueba, la información, las precauciones y advertencias en las instrucciones para
uso deben ser estrictamente seguidas. El uso de los kits de prueba con analizadores y equipos similares debe ser
validado. Cualquier cambio en el diseño, composición y procedimiento del test así como cualquier uso en
combinación con otros productos no aprobados por el fabricante no está autorizado; el usuario es responsable por
24
tales cambios. El fabricante no es responsable por falsos resultados e incidentes por estas razones. El fabricante
no es responsable de cualquier resultado por análisis visual de las muestras de pacientes.
Solo para uso diagnostico in-vitro por personal experto. No es para uso interno o externo en humanos o animales.
Todos los componentes de origen humano usados para la producción estos reactivos han sido probados para
anticuerpos anti-VIH 1+2, anticuerpos anti-VHC y HBsAg y se han encontrado como no reactivos. Sin embargo,
todos los materiales deben ser considerados y manipulados como potencialmente infecciosos.
No intercambiar reactivos o tiras de diferentes lotes de producción.
Reactivos de otros fabricantes no deben ser usados junto con reactivos de este kit de prueba.
No usar reactivos después de la fecha de expiración marcada en la etiqueta.
Usar solo puntas de pipeta, dispensadores y material de laboratorio limpios.
No intercambiar tapas rosca de viales de reactivos para evitar contaminación cruzada.
Cerrar los viales de los reactivos herméticamente inmediatamente después del uso para evitar evaporación y
contaminación microbiana.
Si utiliza un equipo automático, es responsibilidad del usuario asegurar que la metodología aplicada haya sido
debidamente validada. Para mejorar el rendimiento del kit en los sistemas automatizados de ELISA, se recomienda
aumentar el número de lavados.
Después de la primera apertura y subsecuente almacenamiento verificar los viales de controles y conjugado para
contaminación bacteriana antes de uso futuro.
Para evitar contaminación cruzada y resultados falsamente elevados pipetear las muestras de pacientes y
dispensar el conjugado sin salpicaduras exactamente en el fondo de los pozos.
No usar muestras fuertemente hemolizadas o altamente lipémicas.
Se requiere máxima precisión para el dispensado de los reactivos.
Evitar la exposición del sustrato TMB a la luz solar directa, metales u oxidantes. No congelar la solución.
El sustrato TMB contiene una sustancia irritante que puede ser nociva si es inhalada, ingerida o absorbida por la
piel. Para evitar lesiones, evite la inhalación, ingestión o contacto con la piel y los ojos.
La solución de parada consiste en una solución de ácido sulfúrico diluida. El ácido sulfúrico es venenoso y corrosivo
y puede ser tóxico si es ingerido. Para evitar quemaduras, evite el contacto con la piel y los ojos.
Este método permite la determinación de 17 OH progesterona de 0,2 - 20 ng/ml.
El tratamiento del paciente con cortisona, esteroides naturales o sintéticos pueden afectar la determinación de 17 α
OH progesterona.
Algunos reactivos contienen pequeñas cantidades de Proclin 300 ® como conservante. Evite el contacto con la piel
o mucosas.
PRECAUCION:
13.1.
El ácido sulfúrico irrita los ojos y la piel. Mantener fuera del alcance de los niños. Si entra en contacto con
los ojos, enjuagar exhaustivamente con agua y consultar con un médico!
Consideraciones de Eliminación
Residuos de químicos y preparaciones generalmente se consideran como desechos peligrosos. La eliminación de esta
clase de desechos está regulada mediante leyes y regulaciones nacionales y regionales. Contactar a sus autoridades
locales o compañías de manejo de desechos que den asesoría en como dispones los residuos peligrosos.
14. INFORMACION PARA PEDIDOS
Prod. No.:
DNOV004
17-OH Progesterone (96 Determinaciones)
25
BIBLIOGRAPHY/ LITERATUR/ BIBLIOGRAFIA/ BIBLIOGRAFÍA
Wisdom G.B. (1976) Clin. Chem. 22 (8), 1243 – 1255.
De Villa G.O. et al. (1972) J. Clin. Endoc. Metab. 35, 458.
Hubl W. et al. (1982) Endokrinologie 79 (2), 165
Arakawa H., Maeda M. and Tsuji A. (1982) Chem. Pharm. Bull. Tokyo 30 (8), 3036.
Riad-Fanny D., Read G.F., Walker R.F. and Griffiths K. (1982) Endocr. Reviews 3 (4), 304 – 367.
26
Symbols Key/ Symbolschlüssel/ Explication des symboles / Legenda / Símbolos/ Tabela de símbolos
Manufactured by / Hergestellt von/ Fabriqué par/ Prodotto da/ Fabricado por / Fabricado por
In Vitro Diagnostic Medical Device/ In Vitro Diagnosticum/ Dispositif médical de diagnostic in
vitro/ Diagnostico in vitro/ Producto para diagnóstico In vitro /
Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro
Lot Number/ Chargenbezeichnung/ Numéro de lot/ Lotto/ Número de lote / Número de lote
Expiration Date/ Verfallsdatum/ Date de péremption/ Scadenza/ Fecha de caducidad /
Data de Validade
Storage Temperature/ Lagertemperatur/ Température de conservation/ Temperatura di
conservazione / Temperatura de almacenamiento / Temperatura de Armazenamento
Keep away from sunlight / Vor direkter Sonneneinstrahlung schützen /
Protéger de rayonnement solaire / Mantener alejado de la luz solar
CE Mark/ CE-Zeichen/ Marquage CE / Marchio CE/ Marca CE / Marca CE
Catalogue Number/ Katalog Nummer/ Référence du catalogue/ Numero di codice/
Número de Catálogo / Número de Catálogo
Consult Instructions for Use/ Gebrauchsanweisung beachten/ Consulter la notice d’utilisation/
Consultare le istruzioni/ Consulte las Instrucciones de Uso /
Consultar as Instruções de Utilização
Microplate/ Mikrotiterplatte/ Microplaque/ Micropiastra/ Microplaca / Microplaca
Conjugate/ Konjugat/ Conjugué/ Coniugato/ Conjugado / Conjugado
Control/ Kontrolle/ contrôle / controllo / control / controle/ controlo
CALl
Calibrator resp. Standard/ Kalibrator bzw. Standard/ Callibrateur resp Etalon /
Calibratore ossia Standard / Calibrador o bien Estándar
Stop solution/ Stopplösung/ Solution d’arrêt/Soluzione bloccante / Solução de paragem
TMB Substrate solution/ TMB-Substratlösung/ Substrat TMB/ soluzione substrato TMB/
solución substrato TMB / Solução substrato TMB
Washing solution 10x concentrated/ Waschlösung 10x konzentriert/ Solution de lavage
concentré 10 x/ soluzione di lavaggio concentrazione x10/ solución de lavado concentrado x10 /
Solução de lavagem concentrada 10x
Contains sufficient for “n” tests/ Ausreichend für “n” Tests/ Contenu suffisant pour “n” tests/
Contenuto sufficiente per “n” saggi/ Contenido suficiente para ”n” tests /
Conteúdo suficiente para “n” testes
27
SCHEME OF THE ASSAY
17-OH-Progesterone
Test Preparation
Prepare reagents and samples as described.
Establish the distribution and identification plan for all specimens and controls on the
result sheet supplied in the kit.
Select the required number of microtiter strips or wells and insert them into the holder.
Assay Procedure
Substrate blank
Standard 0 - 5
Control
Sample
Standard 0 - 5
-
25 µl
-
-
Control
-
-
25 µl
-
Sample
-
-
-
25 µl
Conjugate
-
200 µl
200 µl
200 µl
Cover wells with foil supplied in the kit
Incubate for 1 h at 37 °C
Wash each well three times with 300 µl diluted wash solution.
If you use an automated equipment, wash each well six times.
TMB Substrate
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
Incubate for exactly 15 min at room temperature in the dark
Stop Solution
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
Shake the microplate gently.
Photometric measurement at 450 nm/620-630 nm
NovaTec Immundiagnostica GmbH
Technologie & Waldpark
Waldstr. 23 A6
D-63128 Dietzenbach, Germany
Tel.: +49 (0) 6074-48760 Fax: +49 (0) 6074-487629
Email : [email protected]
Internet: www.NovaTec-ID.com
DNOV004-engl,dt,it,es-23012014-CS
28

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