4B MED gio 30 ottobr..

L’analisi di singoli ribosomi mentre traducono un
mRNA rivelano che la traduzione avviene attraverso
cicli di traslocazione e successive pause con una
durata media di 2,8 sec
La traslocazione di un codone si verifica in meno di
0,1 sec
La lunghezza delle pause dipende dalla struttura
secondaria dell’mRNA; la forza applicata dal
ribosoma destabilizza la struttura secondaria e
diminuisce la durata della pausa, ma non influisce sui
tempi della traslocazione
Following translation by single ribosomes one codon at a time - Nature 452, 598-603 (3 April 2008) doi:10.1038/nature06716 - Jin-Der Wen, Laura Lancaster, Courtney Hodges, Ana-Carolina Zeri, Shige H. Yoshimura, Harry F.
Noller, Carlos Bustamante & Ignacio Tinoco
I ribosomi in stallo possono essere dissociati in subunità, il
peptidil-tRNA nella subunità 60S viene ubiquitinato da Ltn1 e
Cdc48, il tRNA viene staccato e la proteina viene inviata ai
proteasomi per la degradazione
Questi meccanismi possono
offrire una certa protezione
contro gli effetti deleteri che
derivano dall'accumulo di
proteine mal ripiegate e
aggregate
Il sistema RQC elimina le proteine aberranti
che si formano dalla traduzione di mRNA aberranti
Protein degradation: Ensuring quality at the ribosome - Nature Reviews Molecular Cell Biology 14, 1 (January 2013) |
doi:10.1038/nrm3499 - Katharine H. Wrighton
Protein quality control systems associated with no-go and nonstop mRNA surveillance in yeast - Genes Cells. 2013
Nov 21. doi: 10.1111/gtc.12106. [Epub ahead of print] - Matsuda R, Ikeuchi K, Nomura S, Inada T.
Molecular biology: RNA lost in translation - David Tollervey - Nature 440, 425-426(23 March 2006) - doi:10.1038/440425a
La traduzione del ribosoma avviene con un
meccanismo complesso che coinvolge
l'interazione coordinata di diversi acidi nucleici
e proteine
L'accumulo intracellulare di proteine mal
ripiegate in inclusioni amiloidi, tipico di molte
malattie neurodegenerative è una conseguenza
del fallimento dei meccanismi di controllo
della qualità delle proteine sintetizzate
Real-time tRNA transit on single translating ribosomes at codon resolution - Nature 464, 1012-1017 (15 April 2010) |
doi:10.1038/nature08925 – Uemura et al.
Misfolded proteins partition between two distinct quality control compartments - Nature 454, 1088-1095 (28 August 2008)
- doi:10.1038/nature07195 - Daniel Kaganovich, Ron Kopito & Judith Frydman
Le proteine del citosol che sono non
funzionanti o danneggiate verranno
inviate alla distruzione nei proteasomi
Il particolare che accomuna le proteine
non funzionanti è quello di avere regioni
idrofobiche esposte sulla superficie
Il processo di demolizione chiama in
causa l’ubiquitina e gli enzimi che la
legano alle proteine da demolire
Le funzioni chaperon della Hsp70 (heat shock
protein 70) dipendono dalle interazioni tra il
dominio che lega ATP ed il dominio che lega la
proteina substrato
La presenza di ATP legato regola l'affinità per
le proteine, le proteine che vengono legate
provocano l’idrolisi dell’ATP
Le Hsp70 esistono in almeno due stati
conformazionali per legare le proteine mal
avvolte e per assisterle nell’assumere la corretta
conformazione
Hsp70 chaperone dynamics and molecular mechanism - Trends Biochem Sci. 2013 Oct;38(10):507-14. doi:
10.1016/j.tibs.2013.08.001 - Mayer MP.
Una proteina mal avvolta o danneggiata presenta regioni idrofobiche esterne
La proteina Hsp70 lega le proteine mal
avvolte ed idrolizza ATP per assisterle
nel raggiungere la conformazione
corretta senza regioni idrofobiche esterne
Hsp70 chaperone dynamics and molecular mechanism - Trends Biochem Sci. 2013 Oct;38(10):507-14. doi:
10.1016/j.tibs.2013.08.001 - Mayer MP.
La Hsp70 può intervenire per tentare di districare aggregati
proteici indesiderati, fornendo alla proteina rilasciata la possibilità
di ripiegarsi in modo corretto
Diverse Hsp70s possono
lavorare sullo stesso
aggregato proteico
contemporaneamente
Hsp70 chaperone dynamics and molecular mechanism - Trends Biochem Sci. 2013 Oct;38(10):507-14. doi:
10.1016/j.tibs.2013.08.001 - Mayer MP.
Le proteine mal avvolte e danneggiate vengono sequestrate in
due compartimenti intracellulari
La ripartizione delle proteine nei due compartimenti per il
controllo di qualità sembra dipendere dal loro status di
ubiquitinazione e dallo stato di aggregazione
Le proteine mal ripiegate ed ubiquinate si accumulano in un
compartimento vicino al nucleo (juxtanuclear) dove si
concentrano i proteasomi
Le proteine che invece formano aggregati caotici sono
sequestrate in strutture perivacuolari. La huntingtina ed i prioni
sono preferenzialmente indirizzati al compartimento
perivacuolare
Real-time tRNA transit on single translating ribosomes at codon resolution - Nature 464, 1012-1017 (15 April 2010) |
doi:10.1038/nature08925 – Uemura et al.
Misfolded proteins partition between two distinct quality control compartments - Nature 454, 1088-1095 (28 August 2008)
- doi:10.1038/nature07195 - Daniel Kaganovich, Ron Kopito & Judith Frydman
Il proteasoma è il principale macchinario
proteolitico che si trova nel citoplasma e
nel nucleo delle cellule eucariotiche
Curr Opin Struct Biol. 2014 Feb;24:156-64. doi: 10.1016/j.sbi.2014.02.002. Epub 2014 Mar 14.
Inobe & Matouschek - Paradigms of protein degradation by the proteasome
La struttura molten globule espone
gruppi idrofobici all’esterno
Il pathway ubiquitina/proteasoma degrada migliaia di proteine, sia importanti
come fattori di trascrizione e regolatori del ciclo cellulare, oppure proteine mal
ripiegate da eliminare per impedire la loro aggregazione e tossicità. Una
proteina poliubiquitinata viene comunemente indirizzata al proteasoma.
Nel proteasoma sono presenti recettori
per l’ubiquitina che consentono di legare
le proteine da demolire.
Come mostrato nella parte a destra,
le ATPasi all'interno del proteasoma
srotolano la proteina da demolire e la traslocano nel nucleo
20S del proteasoma dove i siti proteolitici la riducono a piccoli
peptidi che vengono rilasciati mentre l’ubiquitina viene normalmente riciclata.
Origin and function of ubiquitin-like proteins - Mark Hochstrasser – Nature 458, 422-429(26 March 2009) - doi:10.1038/nature07958
Progetto Proteoma Umano
Il genoma umano contiene circa 21 mila geni che
codificano per proteine
Il trascrittoma umano contiene oltre 100 mila
trascritti
Il proteoma umano contiene oltre un milione di
proteine
Questo evidente aumento di complessità dipende
sia dallo splicing alternativo che dalle
modificazioni post-traduzionali delle proteine
Le modificazioni post-traduzionali (PTM =
glicosilazione, fosforilazione, acetilazione e
metilazione, ecc.) delle proteine sono usate dalle
cellule eucarioti per diversificare le funzioni
delle proteine e coordinare dinamicamente le
loro reti di signalling.
Difettosa PTM è associata a numerosi disturbi
dello sviluppo ed a patologie umane. Questo
mette in evidenza l'importanza delle PTM nel
mantenere in buona salute la cellula.
Cell Res. 2014 Feb;24(2):143-60. doi: 10.1038/cr.2013.151. Epub 2013 Nov 12. Wang et al. - Protein posttranslational modifications and regulation of pluripotency in human stem cells
Figura 1 – Nelle cellule eucariotiche le proteine possono essere
modificate dopo la traduzione mediante una grande varietà di
meccanismi sia reversibili che irreversibili.
La struttura, la stabilità
e la funzione delle
proteine nelle cellule
possono essere
modificate
dinamicamente dalla
PTM.
Nella figura sono
rappresentati quattro
tipi di PTM
(glicosilazione, fosforilazione, acetilazione e metilazione).
La N- e la O-glicosilazione delle proteine
avviene nel RER e nell'apparato di Golgi
Le vie del signalling regolate dalla fosforilazione di proteine sono coinvolte
nello sviluppo embrionale e nella regolazione delle staminali pluripotenti.
Molti recettori per fattori di crescita sulla membrana cellulare sono protein
chinasi che, quando legano il ligando, si attivano ed avviano una cascata
di fosforilazioni che regolano la traslocazione e l'attività di diversi fattori di
trascrizione e quindi l'espressione dei geni per la pluripotenza o per il
differenziamento.
Queste vie di trasduzione del segnale sono altamente interattive tra loro e
sono influenzate da altre proteine sulla membrana o nel citosol.
Diverse protein fosfatasi (come PTEN e SHP2) controllano negativamente
la fosforilazione proteica e giocano ruoli critici nella modulazione del
signalling e nel differenziamento delle staminali pluripotenti.44
Le azioni antagoniste di HAT e HDAC sono necessari per regolare l'acetilazione di istoni e proteine non istoniche in molti tipi di cellule di
mammifero e umane. Le HAT trasferiscono gruppi acetile sulle proteine target, le HDAC rimuovono i gruppi acetile. Lo stato di acetilazione degli
istoni influisce sulla struttura della cromatina e determina l'accessibilità delle regioni dei promotori al macchinario trascrizionale e quindi
l'attivazione dell'espressione genica.
Nello stato pluripotente, le cellule hanno livelli più elevati di acetilazione degli istoni ed una maggiore accessibilità della cromatina per il
macchinario di trascrizione.
Nella cellula, le
metilazioni di
arginina e
lisina sono
catalizzate da
metiltrasferasi
differenti
(PRMT e
PKMT)
Modificazioni post-traduzionali del core di istoni di un nucleosoma per acetilazione, metilazione
e fosforilazione. Alcuni lisine (ad esempio, H3K4, H3K9 e H3K27) possono essere modificate
sia per acetilazione che metilazione. La trimetilazione H3K4 e H3K27 origina una marcatura
divalente della cromatina che si trova nei siti di inizio di trascrizione di molti geni coinvolti nel
committement e nel differenziamento di hPSC indifferenziate. In generale, i geni indotti durante
il differenziamento delle hPSC conservano la marcatura H3K4, mentre i geni silenziati durante
il differenziamento conservano la marcatura H3K27. La fosforilazione di residui di amminoacidi
(ad esempio, H3S10 e H3S28) in prossimità di quelle lisine potrebbe influenzare il loro switch
metilazione-acetilazione.
I filamenti intermedi (IF) sono strutture del citoscheletro e del
nucleoscheletro che forniscono resistenza meccanica
consentendo alle cellule di far fronte allo stress.
I filamenti intermedi includono le lamine nucleari e varie proteine
del citoplasma (cheratine, vimentina, desmina, neurofilamenti,
ecc.) che sono funzionalmente regolate da modificazioni
post-traduzionali (PTM).
I progressi della proteomica evidenziano l'enorme complessità
e le potenzialità di regolazione delle PTM delle proteine degli
IF, tra cui fosforilazione, glicosilazione, sumoilazione,
acetilazione e prenilazione.
Nat Rev Mol Cell Biol. 2014 Mar;15(3):163-77. doi: 10.1038/nrm3753. Snider & Omary - Posttranslational modifications of intermediate filament proteins: mechanisms and functions.
L’ubiquitinazione è un processo di modificazione post-traduzionale che è
implicato nella regolazione della risposta immunitaria innata e adattativa.
Sia l’ubiquitinazione che la deubiquitinazione giocano un ruolo cruciale
non solo durante lo sviluppo del sistema immunitario, ma anche
nell'orchestrazione della risposta immunitaria per garantire il corretto
funzionamento dei diversi tipi di cellule che costituiscono il sistema
immunitario.
Conclusione - L'ubiquitinazione (e la deubiquitinazione) di proteine chiave
nelle pathway di signalling dei recettori è essenziale per suscitare una
risposta immunitaria adeguata ma limitata. Difetti di ubiquitinazione sono
stati implicati nella patogenesi di una varietà di malattie, tra cui
autoimmunità, autoinfiammazione ed immunodeficienza, sottolineando
l'importanza della sua stretta regolazione e controllo.
Siamo lontani dal comprendere pienamente questi processi al punto da poter
intervenire terapeuticamente per il trattamento di malattie e condizioni
patologiche in cui il sistema immunitario non agisce al massimo delle sue
capacità, o entro i suoi limiti fisiologicamente definiti.
EMBO Rep. 2014 Jan;15(1):28-45. doi: 10.1002/embr.201338025. Epub 2013 Dec 27. Zinngrebe et al.
- Ubiquitin in the immune system
Ubiquitina ed Ubiquitinazione
L’ubiquitinazione è una modificazione post-traduzionale energiadipendente in cui la piccola proteina ubiquitina (appena 76
amminoacidi) viene legata covalentemente ad uno o più residui di
lisina di una proteina substrato. Il processo di ubiquitinazione è
una sequenza di tre eventi noti come attivazione, coniugazione e
legatura, che coinvolge tre diversi enzimi:
• E1, lega su di l’ubiquitina con un legame tioestere usando
l’energia dell’idrolisi di ATP
• E2 catalizza il trasferimento dell’ubiquitina da E1 alla
cisteina presente nel suo sito attivo
• E3 lega la glicina C-terminale dell’ubiquitina ad un residuo
di lisina di una proteina bersaglio che può essere anche una
ubiquitina, con formazione di un legame ubiquitinaubiquitina.
L’ubiquitina ha sette residui di lisina e quindi ha la possibilità di
formare sette diversi tipi di collegamenti, K6, K11, K27, K29,
K33, K48 e K63.
Ubiquitina, piccola proteina di 76 ammino acidi
Legata con un legame isopeptidico (fra il gruppo amminico ε
della lisina (K) ed il gruppo carbossilico della glicina 76
dell’ubiquitina
Nelle catene di ubiquitina possono essere usate
tante lisine interne: K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63
Altra possibilità è il legame tra il gruppo amminico α
della metionina N‐terminale (M1) ed il gruppo
carbossilico della glicina 76
Esistono anche ulteriori possibilità di legame che consentono
un complesso signalling in vari sistemi, come quello
immunitario
Il fatto che il genoma umano codifichi per solo due E1, ma
almeno 38 E2 e più di 600 E3, rende il processo di
ubiquitinazione molto vario e complesso, ma anche molto
specifico.
I diversi punti
di legame
dell’ubiquitina
svolgono
differenti
funzioni
fisiologiche:
REAZIONI DI UBIQUITINAZIONE
Ub
E1
attiva l’Ubiquitina
E3
lega una o più Ubiquitine
alla Proteina da
distruggere
Ub
E2
coniuga una o più
Ubiquitine
La malattia di Huntington è una malattia neurodegenerativa
ereditaria dominante causata dall’espansione della tripletta CAG
nel gene della huntingtina, caratterizzata dall’accumulo di
aggregati di proteine con la coda di poliglutammine nei neuroni
L’arricchimento anomalo di inclusioni con proteine
ubiquitinate, caratteristica diagnostica comune ad altre
malattie neurodegenerative come Alzheimer e Parkinson,
suggerisce che la disfunzione nel metabolismo dell’ubiquitina
può contribuire alla patogenesi di queste malattie
Poiché la modificazione delle proteine per aggiunta di catene di
poliubiquitina regola molti processi cellulari essenziali, tra cui la
degradazione delle proteine, il ciclo cellulare, la trascrizione, la
riparazione del DNA ed il traffico di vescicole, la perturbazione di
questo meccanismo di segnalazione rischia di avere gravi
conseguenze per la funzione neuronale e la sopravvivenza
Global changes to the ubiquitin system in Huntington's disease - Nature 448, 704-708 (9 August 2007) doi:10.1038/nature06022 - Bennett et al.
La propagazione cellula-cellula di
proteine mal ripiegate si verifica in tutte le
malattie neurodegenerative?
Una recente ricerca dimostra la propagazione
della huntingtina mutante in colture di sezioni
Lug 2014 sottili di cervello in vivo, estendendo in tal
modo il processo di propagazione cellulacellula di proteine mal ripiegate anche alla
malattia di Huntington.
Nel complesso, i nostri risultati suggeriscono che la
propagazione transneuronale della huntingtina
mutante potrebbe essere costituire un importante e
sottovalutato contributo alla fisiopatologia della
malattia di Huntington
Nat Neurosci. 2014 Aug;17(8):1064-72. doi: 10.1038/nn.3761. Epub 2014 Jul 13. Pecho-Vrieseling et al. Transneuronal propagation of mutant huntingtin contributes to non-cell autonomous pathology in
neurons
•Legare ad una lisina di una proteina una singola ubiquitina oppure una
catena di ubiquitine (monoubiquitazione e poliubiquitinazione) permette
l’interazione con un sottoinsieme di domini (UBD) in proteine bersaglio e con
enzimi deubiquitinanti.
•Segnali che provengono dal contesto, come la localizzazione cellulare in
cui si verifica la modificazione, possono contribuire a determinare le
conseguenze fisiologiche della mono- e poli-ubiquitinazione.
Origin and function of ubiquitin-like proteins - Mark Hochstrasser – Nature 458, 422-429(26 March 2009) doi:10.1038/nature07958
•Catene di ubiquitina legate alla lisina 48 sono comunemente associate
all’interazione con il proteasoma ed alla degradazione della proteina, ma
possono anche regolare la trascrizione nel nucleo.
•Catene di ubiquitina legate alla lisina 63 intervengono nella trasduzione del
segnale, nel traffico di vescicole, nell’endocitosi e nella riparazione del DNA.
•La monoubiquitiazione specifica regola quasi tutti questi processi e la
trascrizione genica modulata dalla cromatina.
Origin and function of ubiquitin-like proteins - Mark Hochstrasser – Nature 458, 422-429(26 March 2009) doi:10.1038/nature07958
L’ubiquitinazione è una modificazione
post-traduzionale cruciale che regola molti
processi cellulari negli eucarioti, incluse le
risposte infiammatorie, il traffico endocitico
ed il ciclo cellulare.
L’ubiquitinazione ha anche un ruolo
centrale nella modulazione dei sistemi di
difesa degli eucarioti. Ci sono crescenti
evidenze sul fatto che molti batteri patogeni hanno imparato a
sfruttare a loro beneficio i sistemi che usano ubiquitina.
In questa review sono descritte le modalità con le quali batteri
patogeni umani colpiscono l’ubiquitinazione per sovvertire e
manipolare I sistemi di difesa dell’ospite, speso utilizzando il
mimetismo molecolare di proteine batteriche effettrici secrete.
Queste strategie consentono ai batteri patogeni di
massimizzare la funzione effettrice e di ottenere nutrienti,
promuovendo così la proliferazione dei batteri.
Mag 2014

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