Lezione 13 - DiSTABiF

Corso di Laurea in Farmacia
Insegnamento di
BIOCHIMICA
Angela Chambery
Lezione 13
Cromatografia ed elettroforesi
Concetti chiave:
• Il comportamento cromatografico di una proteina è influenzato da alcune sue proprietà
quali carica ionica, polarità, dimensione e capacità di legarsi a un ligando.
• L'elettroforesi su gel e le sue varianti separano le proteine in base alla carica, alla
dimensione e al punto isoelettrico.
Cromatografia
Il processo della cromatografia (dal greco chòma, colore e gràphein, scrivere) si basa su
interazioni tra una miscela di sostanze da frazionare sciolte in un liquido (fase mobile) ed
una matrice solida porosa (fase stazionaria).
K=
[Astaz]
[Amob]
Cromatogramma
Per registrare il cromatogramma all’uscita della colonna cromatografica si può misurare
l’Abs a 280 nm (aa aromatici) o a 214/220 nm (legami peptidici) in funzione del tempo o del
volume di eluizione.
Cromatografia
La cromatografia fu introdotta da Tswett nel 1903 che separò i pigmenti solubilizzati da
piante usando sostanze adsorbenti solide.
Carotenoidi
Xantofille
Clorofilla a
Clorofilla b
Si può usare una colonna di vetro riempita con particelle di argilla o una fase stazionaria
costituita da materiale granulare (gel di silice, allumina attiva, etc.) adeso su una lastrina di
vetro (cromatografia su strato sottile). L’eluente utilizzato era etere di petrolio.
Cromatografia a scambio ionico
Nella cromatografia a scambio ionico le molecole cariche si legano a gruppi immobilizzate
sulla matrice (cellulosa o agarosio).
Analita carico
Analita carico
Resine a scambio cationico
negativamente (anione)
positivamente (catione)
Resina a scambio anionico
Resina a scambio cationico
Struttura
Resine a scambio anionico
Struttura
Cromatografia a scambio ionico
Le proteine ed altri polielettroliti che hanno gruppi carichi possono legarsi a scambiatori di
cationi o di anioni.
L’affinità per una proteina per lo scambiatore dipende dalla presenza di altri ioni che
competono con la proteina per il legame allo scambiatore e dal pH della soluzione che
influenza la carica netta della proteina.
Cromatografia a scambio ionico
Per l’eluizione si può sfruttare la competizione per i siti di legame con altri gruppi ionici
aumentando la concentrazione di sale dell’eluente. In alternativa è possibile variare il pH
per modificare lo stato ionico delle molecole legate.
Cromatografia a scambio ionico
Cromatografia per gel filtrazione
La cromatografia per gel filtrazione (esclusione molecolare o setaccio molecolare) le
molecole sono separate in base alle loro dimensioni e alla loro forma. La fase stazionaria è
formata da granuli di gel contenenti pori di dimensioni variabili.
Legami crociati nel polimero di
poliacrilammide che costituisce
la matrice del gel
Cromatografia per gel filtrazione
Le molecole grandi percorrono la colonna più rapidamente di quelle piccole che
attraversano i pori entrando nei granuli.
Cromatografia per gel filtrazione
Per molecole separate da in un ambito di dimensioni dei pori esiste una relazione lineare
tra il volume di eluizione di una sostanza e il logaritmo della sua massa molecolare
(assumendo che le molecole abbiano formule simili).
Assorbimento a 280 nm
Blu destrano
V0
Sali
Vi
Volume di eluizione
Volume della colonna
E’ dunque possibile utilizzando proteine a peso molecolare noto, stimare la sua massa
molecolare conoscendo il suo volume di eluizione.
Cromatografia per affinità
• Nella cromatografia per affinità una molecola
(ligando) che si lega specificamente alla
proteina di interesse è legata covalentemente
alla matrice inerte della fase stazionaria.
Matrice
L
Proteina
• La proteina bersaglio viene recuperata
variando la forza ionica del tampone in modo
tale da eluire la proteina dalla matrice.
• A differenza degli altri tipi di cromatografia
non si basa sulle differenze nelle proprietà
fisiche delle molecole da separare, ma sfrutta le
interazioni altamente specifiche delle molecole
biologiche.
Cromatografia per affinità
Esempio di cromatografia per affinità di una proteina che lega il glucosio. L’eluizione può
essere effettuata mediante l’aggiunta di glucosio che compete con il ligando
immobilizzato sulla fase stazionaria per il legame alla proteina.
Cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC)
L’HPLC impiega sistemi automatizzati con campioni applicati in modo preciso, velocità di
flusso controllate, mantenute ad alte pressioni, una matrice di plastica del diametro
compreso tra 3 e 300 µm e rivestiti di uno strato uniforme di materiale cromatografico.
Ciò migliora enormemente la risoluzione e la riproducibilità della separazione diminuendo
il tempo di esecuzione.
Cromatografia HPLC a fase inversa (RP-HPLC)
L’RP-HPLC sfrutta le interazioni idrofobiche tra le molecole proteiche e la matrice
cromatografica contenente gruppi idrofobici (es. C4, C8, C18). I gruppi apolari delle
proteine interagiscono con la matrice idrofobica. L’eluizione viene effettuata aumentando
la percentuale del solvente apolare in maniera tale che le proteine più idrofiliche vengono
eluite prima.
Analita di interesse
Fase mobile polare
Polare
Apolare
Fase stazionaria apolare
Sistemi di solventi comunemente utilizzati:
Fase acquosa: Acqua + 0.1% TFA/acido formico
Fase organica: Acetonitrile
Dialisi
La dialisi consente di effettuare il cambio del tampone tra un passaggio cromatografico e
l’altro. Una soluzione concentrata è separata dal solvente mediante una membrana
semipermeabile (solo le piccole molecole possono diffondere attraverso i pori della
membrana).
All’equilibrio, le concentrazioni delle molecole piccole sono equivalenti su entrambi i lati
della memrana, le macromolecole rimangono all’interno.
Monitoraggio della purificazione
Unità internazionale (UI) di un enzima: quantità di enzima in grado di convertire una µM
di substrato in prodotto in un minuto
Attività specifica=
Unità enzimatiche
mg di proteine totali
Grado di purificazione=
attività specifica della frazione
attività specifica iniziale
U o mg di proteina di interesse nella frazione
Resa =
X 100
U o mg di proteina di interesse nell’omogenato
Monitoraggio della purificazione
Monitoraggio della purificazione
In un buon processo di separazione l’attività specifica aumenta
Elettroforesi
L’elettroforesi è la migrazione di ioni in un campo elettrico. L’elettroforesi di proteine
utilizza di norma supporti costituiti da gel di poliacrilammide (PAGE) che separano le
proteine in base alle dimensioni ed alla carica delle molecole. È un supporto molto usato
perché ha una porosità omogenea e riproducibile.
Elettroforesi
Il gel di poliacrilammide è un copolimero cross-linked della acrilammide. Il gel si prepara per
polimerizzazione di una soluzione di un monomero monofunzionale, l'acrilammide (CH2=CH-CO-NH2),
e uno bifunzionale, la N,N'-metilen-bis-acrilammide (CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2).
La polimerizzazione avviene per mezzo di una reazione a catena dovuta all'aggiunta di ammonio
persolfato e della base N,N,N',N'-tetrametiletilendiammina (TEMED). Il TEMED catalizza la
decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero. In questo
modo si formano catene di acrilammide tenute insieme da legami crociati di bis-acrilammide.
SDS-PAGE
Nell’elettroforesi in presenza di SDS, le proteine sono denaturate mediante l’aggiunta del
detergente sodio dodecil solfato (SDS) che denatura le proteine conferendo a tutte una
carica netta negativa.
[CH3-(CH2)10-CH2-OSO3-]Na+
- - - - - - - - -- ---
Interagisce con le proteine in un rapporto costante di circa 1.4 g SDS ogni g di proteina. Le
cariche negative dell’SDS mascherano la carica intrinseca della proteina conferendo a tutte
un rapporto carica/massa simile. La separazione avviene quindi mediante filtrazione su gel
in base alla massa delle proteine.
Colorazione
Per visualizzare le proteine si ricorre a colorazioni specifiche
C2H 5
C2H5
CH2 N
C
O3S
N
CH3
CH2
SO3
N
H 5 C2
Nitrato d’argento (1-2 ng)
C2 H5
Ponceau S (100–1,000 ng)
Coomassie Blue (50-500 ng)
SDS-PAGE
Mediante SDS-PAGE è possibile determinare la massa molecolare delle proteine. La
mobilità relativa (migrazione) è in questo caso direttamente proporzionale al logaritmo
della sua massa molecolare. E’ possibile costruire rette di calibrazione utilizzando proteine
con peso molecolare noto.
SDS-PAGE
Mediante SDS-PAGE è possibile determinare la composizione in subunità di una proteina
multimerica. In presenza di un agente riducente (DTT o Mecaptoetanolo) si ha la rottura
dei ponti disolfurici e la separazione su gel delle subunità.
Proteina dimerica con
Proteina con una subunità
due subunità
C
A
B
SDS e Mercaptoetanolo
Elettroforesi su gel di poliacrilammide
Gel di poliacrilammide
SDS-PAGE
Mediante SDS-PAGE è possibile monitorare l’andamento della purificazione e verificare il
livello di purezza della proteina di interesse.
Focalizzazione isoelettrica
Per isoelettrofocalizzazione (IEF) o focalizzazione isoelettrica si intende un processo per il
quale le proteine si separano su un supporto solido, molto spesso un gel, in base al loro
punto isoelettrico. Questa tecnica elettroforetica viene quindi utilizzata sia per la
separazione di proteine che per determinarne il loro punto isoelettrico.
Sul gel viene creato un gradiente di pH grazie a miscele di anfoliti che, una volta applicato
un campo elettrico, si dispongono tra anodo e catodo conferendo in quel punto un pH
uguale al loro pI.
2D-PAGE
Nell'elettroforesi bidimensionale, tecnica elettroforetica utilizzata nel campo della
proteomica per separare miscele proteiche complesse, le proteine sono separate in due
dimensioni sfruttando principi fisici differenti. Nel caso dell'elettroforesi bidimensionale, i
principi più utilizzati sono il punto isoelettrico e il peso molecolare.
Proteomica differenziale
Mediante l’utilizzo dei metodi di indagine proteomica è possibile effettuare un’analisi
quali/quantitativa delle proteine differenzialmente espresse in processi fisiologici e fisiopatologici.

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