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03-Preparazione campioni 2DE

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IL CAMPIONE
9 Deve essere denaturato, ma non modificato nelle sue
caratteristiche di “carica” (pI)
9 Può essere applicato in un qualsiasi punto del supporto
TIPICA SOLUZIONE DI LISI/APPLICAZIONE CAMPIONE
agente denaturante
UREA 6M
TIOUREA 2M
TRIBUTILFOSFINA 2 Mm
riducente
o DITIOTREITOLO 100 Mm
CHAPS 2%
detergente NON IONICO
SULFOBETAINA 3-10 2%
ANFOLITI 0.5-2%
N.B.
PRIMA DELL’USO AGGIUNGERE:
BLUE DI BROMOFENOLO
INIBITORI DI PROTEASI
…..
Metodi di lisi “blandi”
METODO DI LISI
PROCEDURA GENERALE
APPLICAZIONE
Lisi Osmotica
Risospendere le cellule in una
soluzione ipo-osmptica
Cellule del sangue,
cellule tissutali in coltura
Congelamento/Scongelamento
Congelare rapidamente il
campione in Azoto liquido e
scongelare. Ripetere.
Cellule batteriche,
cellule tissutali in coltura
Lisi con Detergenti
Risospendere le cellule in una
soluzione di lisi contenente
detergente. I campioni possono
essere direttamente lisati nella
soluzione di reidratazione delle
strip per 2D-E.
Se fosse necessario l’uso di SDS:
•diluire il campione con una
soluzione contenente un eccesso di
detergente non ionico o
zwitterionico
•Precipitare le proteine in acetone
Cellule tissutali in coltura
Lisi Enzimatica
Trattare le cellule con l’enzima in
una soluzione iso-osmotica
Tessuti vegetali,
cellule batteriche,
cellule di lievito/funghi
(Può essere usato prima di un eventuale
frazionamento subcellulare)
(possono essere effettuati più cicli)
(i detergenti facilitano la solubilizzazione
delle membrane cellulari e la liberazione del
contenuto cellulare)
(Si usa con cellule dotate di parete.
•Lisozima→Batteri
•Cellulasi o Pectinasi→cellule vegetali
•Liticasi→Lievito
•…..)
Metodi di lisi “vigorosi”
METODO DI LISI
PROCEDURA GENERALE
APPLICAZIONE
Sonicazione
Sonicare la sospensione cellulare per tempi
brevi e ripetere per più cicli (per evitare
surriscaldamento).
Raffreddare il campione fra un ciclo e
l’altro.
Sospensioni cellulari
Celle a Pressione
Mettere la sospensione cellulare nella
French Pressure Cell refrigerata. Applicare la
pressione e recuperare il lisato.
Microrganismi con
parete cellulare
(batteri, alghe, lieviti)
Grinding
Tessuti o cellule vengono refrigerati in
azoto liquido e ridotti ad una polvere fine.
Il processo può essere favorito
dall’aggiunta di Al2O3 o sabbia.
Tessuti solidi,
microrganismi
Omogeneizzazione Meccanica
Frammentare il tessuto. Aggiungere
tampone di omogeneizzazione freddo (520 volumi) ed omogeneizzare brevemente.
Filtrare o centrifugare.
Tessuti solidi
Omogeneizzazione con sferette di
vetro
Sospendere le cellule in un uguale volume
di soluzione di lisi. Aggiungere le sferette
di vetro freddo (1-3 g per g di cellule).
Agitare per 1 min e raffreddare (1 min).
Ripetere da 2 a 4 volte.
Sospensioni cellulari,
microrganismi
(Gli ultrasuoni distruggono le cellule
determinando rottura delle membrane.
Bisogna sempre evitare il surriscaldamento
del campione e la formazione di schiuma )
(French Pressure Cell; le cellule si rompono
grazie al passaggio forzato (applicando
un’elevata pressione) attraverso on piccolo
orifizio.
(La lisi delle cellule può essere ottenuta per
disgregazione con mortaio e pestello o altro)
(Omogenizzatori Dounce o Potter vetro/vetro o teflon/vetro- sia manualmente
che con apparecchi elettrici. )
(un “vortice” di sferette di vetro induce la
rottura meccanica della parete cellulare)
NON SEMPRE É NECESSARIA UN’ANALISI “COMPLETA”
• Si deve analizzare una specifica popolazione proteica (es.:
proteine mitocondriali, proteine nucleari….):
FRAZIONAMENTO SUBCELLULARE
• Si devono rimuovere contaminanti specifici (es.: Sali,
detergenti, acidi nucleici, lipidi….):
PRECIPITAZIONE SELETTIVA
• Si devono analizzare proteine sottoespresse o gruppi specifici
di proteine (es.: proteine fosforilate, proteine glicosilate…..):
ARRICCHIMENTO SPECIFICO
OMOGENATO FEGATO
FRAZIONAMENTO
SUBCELLULARE DA
FEGATO DI RATTO
1.000 g per 10’
Sedimento
Sovranatante
NUCLEI
3.300 g per 10’
Sedimento
MITOCONDRI
Sovranatante
16.300 g per 10’
Sedimento
Sovranatante
FRAZIONE
LISOSOMIALE
100.000 g per 10’
Sedimento
FRAZIONE
MICROSOMALE
Sovranatante finale
CITOPLASMA
PRECIPITAZIONE SELETTIVA DELLE PROTEINE:
•
•
•
•
•
•
Solfato d’Ammonio
Acido Tricloroacetico (TCA)
Acetone
TCA in Acetone
Acetato d’Ammonio in Metanolo + Estrazione in Fenolo
altro…..
Problemi:
9 La precipitazione può essere incompleta (“perdita di proteine”)
9 Le proteine si risospendono con difficoltà
9 La sostanza usata per precipitare le proteine può introdurre
ioni che interferiscono con l’IEF
9 I tempi per ottenere la precipitazione possono essere lunghi
“ARRICCHIMENTO SPECIFICO”
™ Coimmunoprecipitazione (Adams et al. 2002, eg. Anti p53
antibody)
™ Coprecipitazione (Seraphin et al. 2003, eg. V5 epitope)
™ Cromatografia di affinità (Einarson and Orlinick 2002, eg. GST fusion
protein)
™ Isolamento di complessi multiproteici stabili
(eg. Nuclear pore complexes, ribosome complexes, and spliceosomies)
™
Altro….
Tali metodi possono essere usati in alternativa o in
aggiunta al frazionamento cellulare
ESEMPIO DI “ARRICCHIMENTO” DI
FOSFOPEPTIDI/FOSFOPROTEINE
EQUALIZER BEADS o PROTEOMINER
La presenza di proteine overespresse (es. Albumina nel
siero) causa una difficile identificazione di proteine
mediamente o poco espresse.
I ProteoMiner sono miscele di resine cromatografiche in
cui le fasi leganti sono PEPTIDI SINTETICI, costruiti
secondo chimica combinatoriale (combinatorial ligand
libraries composed by hexapeptides). Essi sono
potenzialmente in grado di legare “quasi tutte” le proteine
presenti in un campione biologico.
Applicando campioni biologici complessi ai ProteoMiner, le proteine
presenti in abbondanza satureranno subito i propri siti d’affinità e
l’eccesso di proteina verrà rimosso attraverso semplici lavaggi.
Parallelamente le proteine mediamente o poco espresse si
concentreranno (legandosi anch’esse ai propri siti di affinità).
I campioni possono essere applicati più volte.
Diminuiscono le differenze quantitative fra le varie
proteine presenti e i loro livelli di concentrazione tendono
ad “equalizzarsi”
Trattamento con Proteominer
• Le proteine “più
abbondanti” si diluiscono
“PRIMA”
• Le proteine “meno
abbondanti” si concentrano
“DOPO”
“PRIMA”
“DOPO”
ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE
PRIMA DIMENSIONE:
isoelettrofocalizzazione
(separazione delle proteine in
base al loro
PUNTO ISOELETTRICO)
Strisce di gel di acrilammide con
gradienti
immobilizzati
di
pH
(Immobiline dry strip) vengono
sovrapposte alla soluzione contenente
il campione in appositi contenitori di
ceramica (holder).
Prima della corsa elettroforetica
necessario effettuare una fase di
strip; entrambi i processi possono
degli holder. L’intero sistema
controllata.
vera e propria è
reidratazione delle
avvenire all’interno
è a temperatura
EQUILIBRAZIONE STRIP (1D
2D)
Una volta effettuata la PRIMA DIMENSIONE, ogni strip deve essere
equilibrata in un tampone opportuno, prima di procedere con la
SECONDA DIMENSIONE
L’equilibrazione della strip dopo la prima dimensione si
realizza si solito in due fasi in una soluzione tampone (pH 8.8)
contenente urea, glicerolo, SDS, blu di bromofenolo:
- Prima fase ⇒ DTT (10 mg/ml)
- Seconda fase ⇒ iodoacetammide (25 mg/ml)
n.b.: L’alchilazione dei gruppi sulfidrilici impedisce che si formino
ponti disolfuro intra e intercatena. Talvolta può essere opportuno
eseguire tale processo prima della prima dimensione.
Allestimento e preparazione dei gel di acrilammide per la
SECONDA DIMENSIONE
Cassetta di vetro
con spaziatori (di
solito 1 mm o 1,5 mm)
in cui viene fatto
polimerizzare il gel
Caster in cui è possibile inserire più cassette (in questo tipo fino a 6) per il loro
riempimento SIMULTANEO (importante al fine della RIPRODUCIBILITA’).
Formatore di gradiente. Una pompa a flusso
costante garantisce la corretta entrata della
soluzione di acrilammide nelle cassette.
Terminata la polimerizzazione dei gel (4-5 h),
le cassette vengono trasferite in un apposito
supporto che verrà inserito nella vasca
elettroforetica per la seconda dimensione.
Assemblaggio dell’apparecchio per la
SECONDA DIMENSIONE
Blocco delle cassette. Un sistema di guarnizioni
garantisce l’esclusivo contatto della parte superiore
dei gel con il tampone contenuto nella “vasca
superiore” (CATODO) che si viene a formare.
L’intero apparato viene trasferito nella vasca
elletroforetica vera e propria. La parte inferiore
dei gel risulta in contatto con il tampone
contenuto nella vasca esterna (ANODO).
L’intero apparato viene collegato ad
un sistema di refrigerazione (per
mantenere costante la temperatura
durante
la
corsa)
e
ad
un
alimentatore. Gli ioni del tampone
garantiscono il passaggio della
corrente attraverso i gel.
La
POTENZA è il fattore limitante per
questo tipo di elettroforesi (≤ 5 Watt
per gel).
METODI DI RIVELAZIONE DI PROTEINE SUL GEL
Coomassie Brillant Blue R-250:
Fissaggio e colorazione: comassie 0.1% in 40% metanolo e 10% ac. Acetico.
Decolorazione: 40% metanolo e 10% ac. Acetico.
Tempo di colorazione / decolorazione: da 15 min a 1-2 ore.
Sensibilità: fino a 0.1 µg di proteina.
COMPATIBILE CON TECNICHE DI SPETTROMETRIA DI MASSA
Comassie Brillant Blue G-250 colloidale:
Modalità simili alla precedente metodica.
Viene usata una soluzione colloidale di Coomassie G250 (soluzione di Coomassie in
Acido Fosforico + Solfato di Ammonio, miscelata con metanolo preima dell’uso)
Sensibilità più elevata (5-10 volte)
COMPATIBILE CON TECNICHE DI SPETTROMETRIA DI MASSA
COLORAZIONE CON ARGENTO
le bande proteiche si visualizzano sul gel grazie alla differenza dei potenziali redox
tra i siti occupati dalle proteine e quelli liberi
condizioni
acide
AgNO3 + proteina
Ag+
proteina
condizioni
alcaline
formaldeide
Ag
Ag+
proteina
proteina
Fissaggio: 40% metanolo e 10% ac.
acetico
Tempo di colorazione: circa 16 ore
Sensibilità: fino a 1 ng di proteina
acido formico
9 SVILUPPO DEL COLORE TEMPO-DIPENDENTE: “RISPOSTA” NON LINEARE
9NON COMPATIBILE CON TECNICHE DI SPETTROMETRIA DI MASSA!!!
METODICA MODIFICATA ESCLUDENDO IL FISSAGGIO CON GLUTARALDEIDE
COMPATIBILE CON TECNICHE DI SPETTROMETRIA DI MASSA
SYPRO®Ruby
Tipo di rivelazione basata su probe molecolari fluorescenti
Fissaggio in 40% etanolo e 10% ac. acetico per circa 3 ore
Colorazione: incubazione nel colorante per circa 3 ore
Rivelazione:
eccitazione max 280 e 450 nm emissione max 610 nm
rapida visualizzazione con transilluminatore UV (300 nm)
Sensibilità:
elevata risoluzione (1 ng) e buona linearità nella risposta.
Altri …………..
Colorazione con Argento
Colorazione con Coomassie
80 µg proteine (lisato cellulare totale)
600 µg proteine (lisato cellulare totale)
DIVERSA QUANTITA' DI PROTEINE NEL CAMPIONE
Un sovraccarico di proteine nel gel determina perdita di risoluzione ed
aumento del “rumore di fondo”
INTERFERENZE DA ACIDI NUCLEICI NEL CAMPIONE
Striature sul gel indicano solitamente la presenza di impurezze.
COLORAZIONI “SPECIFICHE"
9 Colorazione per fosfoproteine
9 Colorazione per glicoproteine
9 Altre ……….
9 Rivelazione “Immunospecifica” (western blot)
Phosphoprotein Stain
Visualization of total protein
phosphoproteins in a 2-D gel
and
Proteins from a Jurkat T-cell
lymphoma line cell lysate were
separated by 2-D gel electrophoresis
and stained with Pro-Q Diamond
phosphoprotein
gel
stain
(blue)
followed by SYPRO Ruby protein gel
stain (red). After each dye staining,
the gel was imaged and the resulting
composite
image
was
digitally
pseudocolored and overlaid.
T.H. Steinberg et al., Global quantitative phosphoprotein analysis using
Multiplexed Proteomics technology, Proteomics 2003, 3, 1128-1144
Glycoprotein Gel Stain
Detection of glycoproteins and total protein on an SDS-polyacrylamide gel
using the Pro-Q Fuchsia Glycoprotein Gel Stain Kit.
CandyCane glycoprotein molecular weight standards containing
alternating glycosylated and nonglycosylated proteins were
electrophoresed through a 13% polyacrylamide gel. After
separation, the gel was stained with SYPRO Ruby protein gel stain
to detect all eight marker proteins (left). Subsequently, the gel
was stained by the standard periodic acid–Schiff base (PAS)
method in the Pro-Q Fuchsia Glycoprotein Gel Stain Kit to detect
the glycoproteins alpha2-macroglobulin, glucose oxidase, alpha1glycoprotein and avidin.
Pro-Q™ Glycoprotein Stain (DDAO phosphate)
Molecular Formula: C15H18Cl2N3O5P (MW 422.20)
WESTERN BLOT
Trasferimento elettroforetico orizzontale da
GEL a MEMBRANA MACROPOROSA
Membrana macroporosa: PVDF; Nitrocellulosa.
Procedura di immuno-rivelazione
1 - blocco dei siti liberi sulla membrana
2 - incubazione con anticorpi primari (diretti verso la proteina di
interesse)
3 - lavaggio
4 - incubazione con anticorpi secondari (diretti verso i primari)
associati con HRP o altro…
5 - lavaggio
6 - incubazione con substrato
7 - rivelazione
Ab secondario
ECL
enhanced chemiluminescence
proteina
Peracido
HRP
acido amminoftalico
forma ossidata
dell'enzima
+
luminolo
+
enhancer
Ab primario
LUCE
luce
2H2 O2
2H2O
perossidasi
enhancer
O
2O-
O
NH
OH
NH
OH
NH 2 O
luminolo
NH 2 O
N2
acido amminoftalico
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