Corso integrato di Genetica e Biologia Molecolare GENETICA a.a.2014-2015 Pier Franco Pignatti 15.10.2014 Lezioni N. 13-14 Mutazioni e malattie genetiche (Neri-Genuardi cap. 2) Puntiformi, ins/del, CNVs Mutazione: una definizione Mutazione: una alterazione della sequenza del DNA rispetto al normale Polimorfismo : una variante con frequenza > 1% nella popolazione NOTA: in medicina è invalso l’uso di chiamare “mutazione” una variazione del DNA ritenuta causa di patologia, e “polimorfismo” una variazione del DNA non ritenuta causa di patologia Mutazione: caratteristiche Insorgenza: casuale, preadattativa Sede: somatica, germinale Livello: genica, cromosomica, genomica Meccanismo: sostituzione, inserzione, ripetizione, inversione, espansione, delezione, riarrangiamento Cause: endogene, esogene Effetti evolutivi: neutra, svantaggiosa, vantaggiosa Stima diretta della frequenza di mutazione La stima diretta è probabilmente una sottostima a causa di: penetranza incompleta, fenocopie, eterogeneità genetica, non paternità, “polimorfismi”, riparazione, letalità… Thompson & Thompson Genetics in Medicine, Saunders 1986 Livello e frequenza di mutazione * Se un gamete ha 21.000 geni, allora il 2-21% dei gameti avrà almeno una nuova mutazione genica (21.000/100.000 = 0.21; 21.000/1.000.000 = 0.021) Thompson & Thompson Genetics in Medicine, Saunders 1986 * Frequenza di mutazione: stime recenti Il tasso di mutazione per sostituzione di base nella linea germinale è circa 10-8 per coppia di basi per generazione (sequenziamento ad alta densità di 2 trii padre, madre, figlio). Ogni figlio avrebbe perciò circa 60 nuove mutazioni (The 1000 Genomes Project, Nature 28 ottobre 2010). Stima di 70 nuove mutazioni per genoma umano diploide per ogni generazione (Roach JC et al 2010) Ogni persona ha circa 250-300 varianti con perdita di funzione in geni annotati, cioè in circa l’1% di tutti i geni, e 50-100 varianti precedentemente implicate in malattie ereditarie (WGS di 179 individui). Stima di 400 varianti dannose e circa 2 mutazioni probabile causa di malattia per persona (Xue Y et al 2012) Tipi di mutazione Strutturali : sostituzione nucleotidica, inserzioni, delezioni, inversioni, duplicazioni, riarrangiamenti Regolative : trascrizionali o post-trascrizionali, nel promotore o in altre sequenze di regolazione, modificazione dello splicing Mutazioni con perdita di funzione Per la maggior parte dei prodotti genici la quantità esatta non è essenziale: la maggior parte delle mutazioni con perdita di funzione produce fenotipi recessivi, il che significa che una persona che abbia una sola copia funzionale del gene sarà fenotipicamente normale. In alcuni casi però il 50% del livello normale non è sufficiente per la funzione normale: persone eterozigoti per una mutazione con perdita di funzione mostrano un fenotipo che è perciò ereditato come un carattere dominante. Questo si chiama aploinsufficenza. Perdita di funzione Read A e D Donnai, New Clinical Genetics 2° ed. Scion 2011 Mutazioni con guadagno di funzione Mutazioni con guadagno di funzione sono più rare. Determinano fenotipi dominanti Es: Acondroplasia e Malattia di Huntington Fenotipi dominanti anche nel caso in cui il prodotto dell’allele mutato interferisca con la funzione del prodotto normale: effetto dominante negativo Es: Osteogenesi Imperfetta Strachan e Read 4th ed Effetto dominante negativo in OI I difetti del gene COL1A1 sono più gravi perché il collagene tipo I ha 2 catene alfa-1 e 1 catena alfa-2. Quindi le mutazioni di alfa-1 determinano il 75% di eterotrimeri anomali come indicato in Figura, mentre le mutazioni di alfa-2 producono il 50% di eterotrimeri anomali. Il codice genetico Codoni aa 1 2 2 9 3 1 4 5 6 3 61 20 3 X 64 20 Mutazioni puntiformi Sinonima o silente Sostituzione conservativa Sostituzione non conservativa Terminazione Scivolamento del modulo di lettura Guttmacher e Collins, NEJM 2002 Mutazioni per sostituzione di base :Pi, : Pu, transizioni, transversioni Mutazione di sostituzione di AA o Missenso: betas-globina in falcemia o drepanocitosi Transversione GAG>GTG (p.6 Glu>Val) Read-Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007 Mutazione di terminazione o Nonsenso: HBB p.Gln39X in beta°-talassemia Transizione CAG>TAG Read-Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007 Farmaco anti terminazione prematura 25 MAGGIO 2014 - L’Agenzia europea dei medicinali (EMA) ha dato l’approvazione condizionale alla commercializzazione di Translarna TM (Ataluren) per il trattamento della distrofia muscolare di Duchenne e della Fibrosi Cistica con mutazione non senso (nmDMD e nmCF). Mutazione da delezione di 1 nucleotide o Frameshift in gene GJB2 e sordità AR 6G 5G c.35delG gene connessina 26 (GJB2) Read-Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007 Degradazione dell’mRNA da mutazione nonsenso o Nonsense Mediated Decay (NMD) Se il codone di Terminazione Prematura (PTC) è nella zona rossa, l’Exon Junction Complex (EJC) non si stacca e l’mRNA è degradato. Es: NMD degrada maggior parte mRNA BRCA1 con PTC Read-Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007 Varianti strutturali Le varianti strutturali a volte sono implicate in patologie, più spesso rappresentano semplici differenze interindividuali. Le piccole inserzioni e delezioni (indels) rappresentano la forma più abbondante di variazione genetica umana Check E, “Human genome: patchwork people”, Nature 2005 Delezioni esoniche in DMD e BMD Read-Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007 CNVs o Copy Number Variants CNVs o Copy Number Variants: tratti di DNA ripetuti più lunghi di 1 kb che mostrano differenze del numero di copie nella popolazione normale Espressione diversa dei geni con diverso numero di copie Possibile associazione con malattie Mappa ad alta risoluzione di 20 europei e 20 africani per CNVs: frequenza >5% Conrad DF et al Nature 2009 CNVs in Autismo Trovate 277 CNVs, delle quali 13 ricorrenti, in 427 pazienti. ACRD: Autism Chromosome Rearrangement Database (Marshall CR et al. 2008) La ricerca delle CNV fa parte ormai della valutazione diagnostica iniziale di malattie dello spettro autistico ed altre malattie con ritardo mentale e dello sviluppo Crossing-over fra sequenze alleliche Scambio reciproco: sono prodotti geni di fusione senza ins/del Read e Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007 Crossing-over fra sequenze non alleliche A: crossing over diseguale (UEC) B: scambio diseguale fra cromatidi fratelli (UESCE) Sono prodotte inserzioni e delezioni Read e Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007 Crossing-over diseguale in emoglobinopatie Cr. 11p15.5 Emoglobine Lepore Harris, Genetica Biochimica Umana, Zanichelli 1972 C-o diseguale in geni per la visione dei colori Xq 28: 1 copia gene pigmento rosso e 1-3 copie verde Connor e Ferguson-Smith Essential Medical Genetics Blackwell 1993 Dosaggio genico in CMT1A e HNPP Il gene PMP22 (cr.17) codifica per il componente principale della mielina. Ripetizioni a basso numero di copie (REP) fiancheggiano il gene. CMT1A: Polineuropatia demielinizzante di Charcot-Marie-Tooth tipo 1A HNPP: Neuropatia ereditaria con paralisi da pressione Lupski JR, “Genomic disorders ten years on” 2009 FISH per il gene PMP22 in CMT1A e HNPP Fluorescent In Situ Hybridization con sonda (rosso) per la regione 17p11.2 contenente il gene PMP22 e con sonda (verde) di riferimento per il cromosoma 17. a) duplicazione del gene in CMT1A; b) delezione del gene in uno dei due cromosomi 17 in HNPP Neri e Genuardi, Genetica umana e medica, Elsevier Masson 2010 Mechanism, Prevalence, and More Severe Neuropathy Phenotype of the Charcot-MarieTooth Type 1A Triplication CGH FISH NCV: nerve conduction velocity. CGH: Comparative Genomic Hybridization. Liu P et al, AJHG, 6.3.2014 Conversione genica Scambio non reciproco Connor e Ferguson-Smith, Essential Medical Genetics, Blackwell 1993 Ricombinazione gene CYP21 Geni CYP21 e C4 del complemento duplicati nella regione HLA. 21A: pseudogene. 21B: gene espresso steroido-21-idrossilasi. Mutazioni 21B: iperplasia surrenale congenita con diminuita produzione di cortisolo. Tre forme: con perdita di sali (inattivazione genica), semplice virilizzante (attività enzimatica ridotta a circa il 2%), o non classica attenuata con inizio tardivo solo nelle femmine (attività enzimatica ridotta a circa 10%-75%) Microconversione nel gene CYP21 Strachan e Read, Genetica Umana Molecolare, UTET 2000 Inversione Lewin B, Il Gene, Zanichelli 1985 Inversione gene F8 ed emofilia Rettangoli rossi: sequenza nell’introne 22 e due copie invertite a monte del gene. Nella meiosi maschile non c’è partner: si può formare un’ansa con due copie appaiate con lo stesso orientamento. La ricombinazione produce una inversione cromosomica di circa 500 kb che interrompe il gene. Il 40% dei casi gravi di emofilia A è provocato da inversione Trasposizione I trasposoni sono stati scoperti da Barbara McClintock nel mais negli anni ’40. Premio Nobel nel 1983 Trasposizione replicativa Es: il retrotrasposone L1 si può inserire nei geni F-VIII o DMD: inattivazione inserzionale Variazioni in gemelli MZ da retrotrasposizione con inserzione di L1 Gemelli geneticamente identici al concepimento, ma alla nascita i loro cervelli sono diversi a causa di nuove inserzioni L1 che avvengono durante lo sviluppo del sistema nervoso centrale nel feto. In relazione ai geni bersaglio ed ai neuroni colpiti dalle inserzioni, i gemelli possono essere diversi nella funzione o disfunzione cerebrale Martin SL, “Developmental biology: Jumping-gene roulette”, Nature 2009
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