Ess. Deriv. Agr., 74, 63-66

ESSENZE DERIVATI AGRUMARI
Ess. Deriv. Agr., 74, 63-66 (2004)
Pubblicato dalla Stazione Sperimentale per l’Industria delle Essenze e dei Derivati dagli Agrumi (www.ssea.it)
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Indagine genetico-molecolare RAPD-PCR
su popolazioni calabresi di peperoncino piccante
(Capsicum annuum ssp.)
Vincenzina Galtieri, Bruna Laratta, Paola Minasi e Luigi De Masi*
Laboratorio Tecnologie Biochimiche e Microbiologiche, Stazione Sperimentale per l’Industria delle Essenze e dei Derivati dagli Agrumi (SSEA), Via Gen.
Tommasini, 2 - 89127 Reggio Calabria, Italy
RIASSUNTO
SUMMARY
La caratterizzazione genetico-molecolare di alcune popolazioni
calabresi di peperoncino piccante (Capsicum annuum ssp.) è stata
effettuata mediante la metodica del "DNA polimorfico amplificato arbitrariamente" (Random Amplified Polymorphic DNA,
RAPD) basata sulla reazione a catena della polimerasi
(Polymerase Chain Reaction, PCR). Inizialmente è stata valutata
la procedura estrattiva del DNA genomico da foglie di peperoncino su di un totale di otto popolazioni. Successivamente, sono
state stabilite le condizioni ottimali per l'amplificazione tramite
RAPD-PCR del DNA estratto, saggiando singolarmente tre Taq
DNA polimerasi di differenti ditte fornitrici (Applied
Biosystems, Eppendorf e Promega), con un unico primer arbitrario ed in presenza di quattro distinte concentrazioni di DNA stampo. Il Frammento di Stoffel dell'enzima Taq DNA polimerasi
(Applied Biosystems) è stato l'unico che ha mostrato profili di
amplificazione RAPD riproducibili al variare della concentrazione di DNA.
The genetic-molecular characterization of some Calabrian ecotypes of hot pepper (Capsicum annuum ssp.) has been effected
through the methodic of the Random Amplified Polymorphic
DNA (RAPD) based on the Polymerase Chain Reaction technique (PCR). Initially, the evaluation of the extraction method of
the genomic DNA from pepper leaves on a total of eight populations has been. Successively, the optimal conditions for the
amplification of the extracted DNA have been established
through RAPD-PCR, testing three Taq DNA polymerases of different suppliers (Applied Biosystems, Eppendorf and Promega),
with an only arbitrary primer and in presence of four separate
DNA concentrations. The Stoffel Fragment of the Taq DNA polymerase enzyme (Applied Biosystems) has shown reproducibility
of the RAPD amplification profiles varying DNA concentration.
Parole chiave: Capsicum annuum, peperoncino piccante, cultivar, estrazione del DNA, RAPD-PCR, tipizzazione del DNA.
Key words: Capsicum annuum, hot pepper, cultivar, DNA
extraction, RAPD-PCR, DNA fingerprint.
INTRODUZIONE
Il peperoncino piccante (Capsicum spp.), appartenente alla famiglia delle Solanaceae, è una spezia di
rilevante valore economico originaria della zona tropicale dell'America centro-meridionale. Il genere
Capsicum è suddiviso in cinque specie e Capsicum
annuum, la prima ad essere importata in Europa, ne
rappresenta la più importante come diffusione e utilizzo industriale e famigliare. In Italia la produzione
è concentrata soprattutto nel Meridione, dove sono
coltivate decine di popolazioni che si differenziano
per la forma, le dimensioni ed il colore delle bacche
oltre che per il grado di piccantezza (Siviero, 2002).
Comunemente, le cultivar sono classificate sulla base
delle caratteristiche agro-morfologiche e di resistenza a malattie, dal momento che limitate sono le informazioni esistenti da un punto di vista genetico
(Arnedo-Andres et al., 2002; Ilbi, 2003). D'altra
parte, indagini biochimiche riguardanti sia studi del
polimorfismo proteico dei semi che delle varianti
*
Author for correspondance :
e-mail: [email protected]
isoenzimatiche di cv di peperoncino hanno dato scarsi risultati (Belletti et al., 1992; Lucchese et al., 1999;
Odeigah et al., 1999). Le recenti tecniche geneticomolecolari, basate sulla reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction, PCR) (Mullis e
Faloona, 1987), hanno consentito lo screening e la
determinazione della variabilità genetica esistente tra
gli organismi direttamente a livello del DNA (Henry,
1997). I marcatori molecolari accertano le variazioni
fra genotipi diversi identificando differenze nelle
sequenze di basi che costituiscono il DNA genomico
e forniscono perciò un'impronta digitale molecolare
della varietà (DNA fingerprint). Fra tali marcatori, il
"DNA polimorfico amplificato arbitrariamente"
(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD) rappresenta uno dei metodi più diffusi per identificare
polimorfismi. Esso si basa sulla reazione PCR convenzionale, servendosi di una variante che prevede
l'impiego di un unico oligonucleotide random, cioè
progettato senza alcuna conoscenza della sequenza di
DNA bersaglio, che funge da primer forward e
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reverse per la regione che deve essere amplificata
(Mullis e Faloona, 1987; Welsh e McClelland, 1990;
Williams et al., 1990). Attualmente i marcatori
RAPD risultano essere strumento indispensabile per
lo studio della biodiversità vegetale ed animale nonché per la risoluzione di controversie di natura tassonomica (Prince et al., 1995; Karp et al., 1996; Henry,
1997; De Masi et al., 2003; Galtieri et al., 2004).
Sulla scorta di queste considerazioni si è ritenuto
opportuno iniziare un programma di studio per la
determinazione delle caratteristiche geneticomolecolari, attraverso analisi RAPD, di peperoncino calabrese. La regione Calabria, infatti, rappresenta la connaturale sede di crescita e diffusione, sottoforma di
diverse popolazioni, di questa ricercata spezia.
In sintesi, il presente lavoro ha previsto le seguenti
fasi: (a) messa a punto della procedura d'estrazione e
di purificazione del DNA genomico dalle foglie di
peperoncino su un totale di otto campioni; (b) studio
dell'andamento della reazione RAPD-PCR utilizzando tre Taq DNA polimerasi di diversa provenienza
(Applied Biosystems, Eppendorf e Promega). Il lavoro di ottimizzazione svolto rappresenta la parte preliminare dello studio, che proseguirà con le reazioni di
amplificazione RAPD-PCR su tutti i campioni in
esame impiegando altri primer arbitrari. In tal modo
è possibile ottenere informazioni particolareggiate
sulla variazione genetica esistente, utili per identificare le popolazioni di peperoncino piccante.
MATERIALI E METODI
Materiale vegetale
Nel corso del 2002 l'Accademia Italiana del
Peperoncino (www.peperoncino.org) di Diamante
(CS) ha reperito i semi di 16 popolazioni di peperoncino piccante provenienti dalla provincia di Cosenza
(comuni di Belvedere, Bisignano, Buonvicino,
Diamante, S. Maria del Cedro, Verbicaro e Maierà) e
di 3 popolazioni da Reggio Calabria (Terreti). La
semina di questi ecotipi, effettuata nel 2003 presso il
Campo Sperimentale della SSEA-RC, ha consentito
di selezionare otto popolazioni in base alle loro caratteristiche agro-morfologiche (Tab. 1). Al fine di effetTabella 1- Popolazioni di peperoncino calabrese in studio.
N.
Provenienza
1
2
3
4
5
6
7
8
Verbicaro (CS)
S. Maria del Cedro (CS)
Bisignano (CS)
Diamante (CS)
Belvedere (CS)
Maierà (CS)
Terreti (RC)
Terreti (RC)
Numerazione
interna (Ni)
1
3
5
10
13
14
17
18
tuare l'estrazione del DNA sono state prelevate giovani foglie da ciascuna delle otto popolazioni-campione oggetto del presente studio e congelate nel più
breve tempo possibile a -80°C.
Isolamento del DNA genomico
Il DNA genomico delle otto popolazioni di peperoncino in studio (Tab. 1) era estratto in accordo alla
procedura descritta da De Masi et al. (2002). In
breve, 0,15 g di foglia per pianta provenienti da 10
piante di ciascuna popolazione, erano unite in un
unico campione omogeneo per un totale di 1,5 g. Tale
campione composito era poi polverizzato in mortaio
in presenza di azoto liquido e quindi sospeso in un
tampone di lisi preriscaldato a 60°C (200 mM TrisHCl pH 8, 1,4 M NaCl, 2% (p/v) CTAB, 20 mM
EDTA pH 8, 2% (v/v) 2-mercaptoetanolo e 5 mM
acido ascorbico). La miscela era quindi incubata a
60°C per almeno 30 minuti e sottoposta ad un trattamento con cloroformio-butanolo (24:1). Alla fase
acquosa, recuperata dopo centrifugazione a 13.000g,
era aggiunto un eguale volume di isopropanolo freddo, per consentire la precipitazione degli acidi nucleici. Successivamente, il pellet era sospeso con etanolo
al 70% e poi disciolto in H2O bidistillata sterile.
Ciascun campione era trattato con 5 g/mL di RNasi
A per 1 ora a 37°C al fine di eliminare l'RNA
coestratto. Infine il DNA era precipitato con 1/10 di
volume di acetato d'ammonio 5 M e 3 volumi di etanolo freddo puro. Dopo centrifugazione, separazione
ed idratazione con etanolo al 70%, il pellet era solubilizzato in H2O bidistillata sterile. La quantità e la
purezza del DNA stampo ottenuto erano controllate
spettrofotometricamente.
Procedura RAPD-PCR
Le reazioni di amplificazione PCR erano effettuate
in un volume finale di 50 L, così composto (De
Masi et al., 2002): 1X Reaction Buffer Taq-specifico,
3 mM MgCl2, 100 M di ciascun dNTP, 20 pmoli del
primer decamerico unico ed arbitrario U4 (5'-GACAGACAGG-3'), 2,5 Unità di Taq DNA polimerasi ed il
DNA stampo di peperoncino (1, 10, 100 e 200 ng). La
miscela di reazione era assemblata a freddo e poi trasferita ad un PTC-100 Programmable Thermal
Controller (M.J. Research, U.S.A.) pre-raffreddato a
4°C. Dopo l'incubazione a 94°C per 3 minuti, la reazione di amplificazione è proseguita per 45 cicli (ciascuno costituito da 3 fasi, la prima di 1 minuto a
94°C, seguita da 1 minuto a 40°C ed infine la terza
fase di 1 minuto a 72°C), con una estensione finale a
72°C per 7 minuti; successivamente i prodotti PCR
sono stati conservati a 4°C.
Tre diverse Taq DNA polimerasi erano indipendentemente saggiate con il primer unico ed arbitrario U4
su quattro differenti concentrazioni di DNA stampo
di una popolazione (Ni 5) proveniente da Bisignano
(CS), per verificare le loro prestazioni nelle amplificazioni RAPD-PCR. In particolare, sono stati utilizzati il Frammento di Stoffel della AmpliTaq DNA
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polimerasi dalla Applied Biosystems (Foster City,
CA, U.S.A.), l'enzima HotMasterTM Taq DNA polimerasi dalla Eppendorf AG (Amburgo, Germania) e
l'enzima Taq DNA polimerasi in Storage Buffer B
dalla Promega (Madison, WI, U.S.A.).
Elettroforesi su gel
Il DNA genomico ed i prodotti di amplificazione
RAPD-PCR erano separati mediante elettroforesi su
gel d'agarosio (allo 0,7% p/v per il DNA genomico, al
2% p/v per i prodotti PCR) in tampone TBE 1X (89
mM Tris-Borato, 2 mM EDTA, pH 8,4) e visualizzati attraverso trans-illuminazione UV dopo colorazione con bromuro di etidio. I prodotti RAPD sono stati
digitalizzati mediante l'apparecchiatura Electrophoresis Documentation and Analysis System 120
(Kodak ds, Rochester, NY, U.S.A.). Nell'elettroforesi
è stato utilizzato come standard di peso molecolare il
100 bp DNA ladder (Amersham Pharmacia Biotech
Inc, Piscataway, NJ, U.S.A.).
RISULTATI E DISCUSSIONE
Per ottenere indicatori molecolari certi delle popolazioni di peperoncino in esame, in questa fase di
ricerca preliminare, ciascun protocollo sperimentale
della procedura RAPD-PCR, dall'estrazione del DNA
all'analisi elettroforetica su gel, è stato accuratamente valutato. Inizialmente, lo studio ha previsto l'ottimizzazione della procedura estrattiva del DNA genomico da giovani foglie delle 8 popolazioni di peperoncino (Tab. 1). Particolare attenzione è stata rivolta
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al procedimento di isolamento del DNA dalla specie
in esame, in quanto la presenza di polisaccaridi e
metaboliti secondari (alcaloidi, tannini, flavonoidi,
polifenoli ecc.), potrebbe rendere il DNA non amplificabile nella PCR, poiché tali molecole inibiscono
l'attività enzimatica della Taq DNA polimerasi. A tal
fine, esaminati precedenti protocolli sperimentali
(Doyle e Doyle, 1990; De Masi et al., 2002), si è proceduto all'estrazione del DNA totale dalle foglie di
peperoncino. Il detergente cationico CTAB (Bromuro
di CetilTrimetilAmmonio) si è rivelato particolarmente efficiente nella purificazione del DNA. Infatti,
un doppio trattamento con il tampone di lisi CTAB ha
permesso l'ottenimento di DNA altamente purificato,
privo di polisaccaridi ed altre molecole inibenti e
quindi idoneo all'utilizzo nell'analisi RAPD-PCR. La
resa media in DNA estratto è stata di 140 g per
grammo di foglie di peperoncino.
Il passo successivo è stato quello di determinare le
condizioni ottimali per l'amplificazione del DNA tramite RAPD-PCR. In particolare, sono state saggiate
quattro concentrazioni di DNA stampo con tre diverse Taq DNA polimerasi (Applied Biosystems,
Eppendorf e Promega) ed il primer arbitrario U4.
L'influenza di differenti quantità di DNA stampo (1,
10, 100, 200 ng) sui profili elettroforetici RAPD è
stata accuratamente valutata. La riproducibilità dei
profili di amplificazione è stata testata utilizzando il
primer U4, selezionato fra 12 oligonucleotidi progettati con un contenuto del 60% o 70% in G+C (dati
non mostrati), su di un unico campione identificato
con Ni 5 proveniente da Bisignano (Tab. 1). In Figura
Figura 1 - Comparazione dei profili di amplificazione RAPD-PCR ottenuti con il primer U4 sul DNA della popolazione n. 3 (Ni 5) di provenienza Bisignano (CS), utilizzando la Taq DNA Polimerasi della Applied Biosystems
(A), della Eppendorf (B) e della Promega (C). Linee del pannello A: 1, 10, 100 e 200 ng di DNA stampo amplificato dal Frammento di Stoffel della AmpliTaq DNA polimerasi della Applied Biosystems. Linee del pannello
B: 1, 10, 100 e 200 ng di DNA stampo amplificato dall'enzima HotMasterTM Taq DNA polimerasi della
Eppendorf AG. Linee del pannello C: 1, 10, 100 e 200 ng di DNA stampo amplificato con l'enzima Taq DNA polimerasi della Promega. Linea M: 100 bp DNA ladder (Amersham Pharmacia Biotech Inc, Piscataway, NJ,
U.S.A.), come marcatore standard di peso molecolare.
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1 sono mostrati i profili elettroforetici ottenuti in presenza del Frammento di Stoffel (Lawyer et al.,1993)
dalla Applied Biosystems (Fig. 1A), dell'enzima
HotMasterTM Taq DNA polimerasi dalla Eppendorf
AG (Fig. 1B) e dell'enzima Taq DNA polimerasi in
Storage Buffer B dalla Promega (Fig. 1C).
Per quanto riguarda l'amplificazione ottenuta
impiegando il Frammento di Stoffel della AmpliTaq
DNA polimerasi, le regioni amplificate (ampliconi)
sono risultate riproducibili per quantità di DNA stampo comprese fra 1 e 200 ng, con dimensioni tra 120 e
680 base pairs (bp). Tutte le bande sono evidenti a
partire da una quantità di DNA stampo pari a 1 ng,
soltanto quella a 120 bp risulta essere di intensità
minore, e sono chiaramente visibili fino ad un valore
di 200 ng (Fig. 1A). L'amplificazione ottenuta valendosi dell'enzima HotMasterTM Taq DNA polimerasi
della Eppendorf AG, ha evidenziato identità dei profili di amplificazione con gli ampliconi compresi fra
400 e 1600 bp, per quantità di DNA stampo compre-
se fra 10 e 200 ng.
Mentre ad una quantità di DNA corrispondente ad 1
ng, il profilo di amplificazione è differente, presentando 2 bande aggiuntive a 350 ed a 700 bp (Fig. 1B).
Simile conclusione si può trarre per gli ampliconi
ottenuti con l'enzima Taq DNA polimerasi in Storage
Buffer B della Promega (Fig. 1C); anche in questo
caso, infatti, gli ampliconi sono riproducibili per
quantità di DNA stampo comprese fra 10 e 200 ng,
con dimensioni tra 420 e 1600 bp, mentre ad 1 ng di
DNA stampo il profilo elettroforetico risulta essere
differente. Considerato quindi che gli enzimi della
Eppendorf e della Promega hanno dimostrato differenze nei profili di amplificazione e che le bande
sopra i 1000 bp sono generalmente considerate poco
riproducibili, il Frammento di Stoffel è risultato essere l'enzima più adatto per rendere massima l'efficienza, la sensibilità e la riproducibilità dell'analisi
RAPD, prerequisito essenziale per lo studio delle
popolazioni di peperoncino in esame.
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