Barbara Chiara Cabras

Convalida dei
sanitizzanti
Barbara Chiara Cabras
Convalida dei
sanitizzanti
· Normative
· Panoramica sui sanitizzanti
· Convalida in vitro
· Convalida sulle superfici
Convalida dei sanitizzanti
NORMATIVE & LINEE GUIDA Annex # 1 to EU-‐GMP – 2009 USP 36-‐2013– <1116> Microbiological EvaluaBon of Clean Rooms and other Controlled Environments USP 36-‐2013– <1072> Disinfectants and AnBsepBcs – Guidance for Industry – Sterile Drug Products Produced by AsepBc Processing – cGMP – 2004 PDA – Technical Report No. 13 – Fundamentals of an Environmental Monitoring Program – 2001 ISO 14644-‐1÷3– Cleanrooms and associated controlled environments – ClassificaBon of air cleanliness – 1999-‐2006 ISO 14698-‐1÷2 – Cleanrooms and associated controlled environments – BiocontaminaBon control – General principles and methods – 2003 CLEANING AND SANITIZATION PROGRAM
“The cleaning and saniBzaBon program must achieve specified cleanliness standards, control microbial contaminaBon of products, and be designed to prevent the chemical contaminaBon of pharmaceuBcal ingredients, product-‐contact equipment, packaging materials, and ulBmately the drug products.” “The suitability, efficacy, and limitaBons of saniBzing agents and procedures should be assessed. The effecBveness of these saniBzing agents and procedures should be measured by their ability to ensure that potenBal contaminants are adequately removed from surfaces (i.e. via obtaining samples before and aeer saniBzaBon). RouBnely used disinfectants should be effecBve against the normal microbial vegetaBve flora recovered from the facility.” “Disinfectants and an:sep:cs” <1072> –USP 36-‐ Introduzione
Ø La contaminazione microbica delle “aree a contaminazione
controllata” è un aspetto fondamentale da tenere sotto controllo per
garantire la purezza, la qualità e la sicurezza di una produzione
farmaceutica.
Ø Primo passo per impostare un corretto programma di convalida delle
pulizie per aree a contaminazione controllata è la qualifica delle
soluzioni sanitizzanti che verranno utilizzate per le varie operazioni di
pulizia.
Ø Da tali studi verrà estrapolato inoltre il tempo di contatto necessario
da applicare sulle superfici durante le procedure di Cleaning.
Ø La qualifica normalmente si basa sulla verifica dell’attività di base,
dell’attività con sostanze interferenti e su test di superficie in cui viene
valutata operativamente l’efficacia del sanitizzante nelle condizioni di
utilizzo.
Ø Ad oggi sono disponibili norme ISO/EN e USP a cui fare riferimento per
una corretta impostazione del lavoro di qualifica, naturalmente alcune
norme sono indirizzate a produttori di soluzioni sanitizzanti per cui per uno
scopo prettamente farmaceutico queste devono essere interpretate al fine
di ottenere il risultato atteso. E’ infatti un punto fondamentale la valutazione
dell’efficacia dei prodotti sanitizzanti sia sulla flora microbica isolata
all’interno delle aree a contaminazione controllata sia verso le superfici
presenti nel reparto produttivo.
Ø Obiettivo è quindi fornire agli utenti le corrette indicazioni per la scelta
dei prodotti sanitizzanti, per programmare e gestire la loro qualifica e
consentirne un utilizzo che sia in conformità ai requisiti GMP.
<1072> Disinfectants and Antiseptics, USP 36"
"
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Introduction
"
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Definitions
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Classification of disinfectants
• 
Selection of disinfectant for use in a Pharmaceutical
Manufacturing Environment • 
Mechanism of disinfectant activity
• 
Microbial resistance to disinfectants
• 
Disinfectant challenge testing
• 
Disinfectants in a cleaning and sanitization program
Definizioni
Disinfettante/Sanitizzante: Un agente chimico che distrugge i microrganismi nella
forma vegetativa e microrganismi patogeni, ma non necessariamente le loro spore,
quando applicato ad una superficie. Riduzione della vitalità maggiore di 5 e 4
logaritmi nei test in vitro Norme «EN» .
Sporicida e gli antivirali possono essere considerati una speciale classe di
disinfettanti.
Sporicida: Prodotto che distrugge le spore di batteri e funghi quando ad una
sufficiente concentrazione e con un determinato tempo contatto viene applicato su
una superficie Riduzione della vitalità maggiore di 3 logaritmi nei test in vitro Norme
«EN» .
Agente Sterilizzante: Un agente che distrugge tutte le forme di microrganismi e le
loro spore. Riduzione della vitalità maggiore di 6 logaritmi.
Criteri di scelta per uso per ambito pharma
Quando selezioniamo un disinfettante per aree di produzione
farmaceutiche, dobbiamo tenere in considerazione i diversi aspetti:
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Meccanismo di azione
pH
Temperatura
Concentrazione
Tempo di contatto
Qualità acqua
Presenza di materiale organico
Natura della superficie da trattare
Criteri di scelta per uso per ambito pharma
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Resistenza microbica (rotazione)
Tossicità
Possibilità di corrodere i materiali
Facilità di applicazione
Compatibilità con agenti di pulizia o con altri disinfettanti
Sterilità
Shelf-life
Documentazione di supporto
Validazione
Convalida efficacia "
<1072> Disinfectants and Antiseptics, USP 36
Disinfectant Challenge testing
• 
use-dilution tests (screening disinfectants for their efficacy at various
concentrations and contact times against a wide range of standard test
organisms and environmental isolates)
• 
surface challenge tests (using standard test microorganisms and microorganisms
that are typical environmental isolates, applying disinfectants to surfaces at the
selected use concentration with a specified contact time, and determining the log
reduction of the challenge microorganisms)
• 
and a statistical comparison of the frequency of isolation prior to and after the
implementation of new disinfectant.
Test in vitro: Use- diluition test "
A questa categoria appartengono tutti quei test che servono
ad effettuare uno screening sui prodotti per verificarne
l’efficacia a varie concentrazioni e a diversi tempi di
contatto.
Questi test vogliono dimostrare la capacità di una soluzione
disinfettante di svolgere attività battericida, fungicida,
sporicida nelle condizioni di uso anche in presenza di
sostanze interferenti.
Per le verifiche delle attività di base è necessaria e
sufficiente la documentazione del produttore.
"
Efficacia in vitro
•  Verificare l’attività battericida in accordo con EN 1276
Criterio di accettazione: Riduzione di almeno 10^5 nella
conta vitale
•  Verificare l’attività fungicida in accordo con EN 1650
Criterio di accettazione: Riduzione di almeno 10^4 nella
conta vitale
•  Verificare l’attività sporicida in accordo con EN 13704
Criterio di accettazione: Riduzione di almeno 10^3 nella
conta vitale
AOAC Official Method"
Test qualitativi (test in vitro)"
•  Battericida: “Use diluition method” # 955.14
•  Fungicida: ”Fungicidal activity of disinfectants”
# 955.17
•  Sporicida: “ Sporicidal Activity of
disinfectants” # 966.04
Surface challenge test (1)"
Verificare l’attività battericida, fungicida, sporicida dei
disinfettanti nelle condizioni di uso
•  Criterio di accettazione
Una soluzione disinfettante può definirsi battericida e
fungicida qualora si sia ottenuto, dopo il tempo di
contatto tra disinfettante e batteri, una riduzione di
almeno 10^3 nella conta vitale. Si può definire
sporicida se la riduzione è di almeno 10^2 nella conta
vitale.
<1072> Disinfectants and Antiseptics, USP 36 Surface Challenge test (2)"
Superfici presenti nelle aree di
lavorazione
Microrganismi
Per gli studi si utilizzano i seguenti microrganismi:
•  Microrganismi richiesti dalle normative (EN o AOAC)
•  Isolati ambientali
•  Tutti i generi microbici riscontrati nell’ambiente
produttivo
•  Gli isolati più frequenti
•  I più resistenti da distruggere
Microrganismi
Microrganismi ATCC
Isolati ambientali
Battericida:
Escherichia coli 10536
Micrococcus luteus/lylae
Sthapylococcus aureus 6538
S. epidermidis/hominis Pseudomonas aeruginosa 15442 Flavobacterium resinovorum
Cellulomonas flavigena
Fungicida
Candida albicans 10231 Rhodotorula mucillaginosa chrysogenum
Aspergillus niger 16404 A. niger
Sporicida
Bacillus subtilis 6633
B. sphaericus/thurengensis
cereus/pumilus
P.
Test di efficacia sulle superfici
DESCRIZIONE DEL METODO
La condizione d’uso è una variabile che influenza l’efficacia del disinfettante. Le altre due variabili, già validate nel test in vitro sono la concentrazione ed il tempo di
contatto. La modalità di applicazione può essere “solo nebulizzazione” oppure “nebulizzazione più
azione meccanica”. I test verranno eseguiti effettuando “solo nebulizzazione”, in quanto questa è la
modalità “worst-case”.
La prova simulerà le condizioni di utilizzo facendo uso di:
• Superfici dello stesso tipo di quelle presenti nei reparti di produzione: Acciaio 316L, PVC, vetro,
alluminio, plexiglass, nobilitato.
• I batteri/miceti utilizzati per le prove descritte nel presente protocollo saranno Ceppi Standard
ATCC e ceppo isolato
• Disinfettante alla concentrazione d’uso ed al tempo di contatto di 15 minuti. Test di efficacia sulle superfici
CRITERIO DI ACCETTAZIONE
• L’attività battericida/fungicida di un disinfettante su una superficie è caratterizzata
dalla concentrazione del disinfettante e dal tempo di contatto che permette una
riduzione di vitalità R ≥ 103, secondo quanto riportato nel capitolo <1072> di
USP.
• Pertanto l’obiettivo del protocollo verrà raggiunto se, ai parametri di
concentrazione e tempo di contatto riportati al punto 6, il disinfettante riuscirà ad
ottenere una riduzione di vitalità dei microrganismi test ≥ 103 su tutte le superfici
per i batteri e miceti.
CONDUZIONE DEI TEST"
Ø PROVA ATTIVITÀ BATTERICIDA/FUNGICIDA: TEST
NELLE CONDIZIONI D’USO Ø TEST DI CONTROLLO (SUPERFICI NON TRATTATE)
Ø VALIDAZIONE DEL METODO DI FILTRAZIONE SU
MEMBRANA
Prova attività battericida/fungicida
–  Lavare ciascuna membrana con 50 ml di acqua sterile.
–  Dopo la filtrazione rimuovere ciascuna unità filtrante e trasferirla su
piastre Petri contenenti terreno TSA + neutralizzante per i batteri e SDA +
neutralizzante per i miceti, in modo che non si formino bolle tra il filtro e
il terreno di coltura. Chiudere le piastre con il coperchio.
–  Incubare le piastre a 30-35°C per 48 ore per i batteri e a 20-25°C per 72
ore per i miceti.
–  Calcolare il numero di UFC/0,1ml della sospensione test (Nc) ottenuto nel
punto 2 e il numero di UFC/0,1ml ottenuto dopo il processo di filtrazione
(C).
–  Calcolare il recovery come segue:
C (average)
R = ⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Nc (average)
X 100
Prova attività battericida/fungicida
Prelevare 100µl della sospensione preparata al punto 1.
• 
•  Depositare all’interno del quadrato 6 x 6 cm 100 µl della soluzione contenente il
microrganismo da recuperare, facendo attenzione a ricoprire in modo uniforme tutta la
superficie interna al quadrato.
•  Lasciare asciugare la superficie così sporcata per 5 minuti sotto cappa a flusso laminare.
•  Spruzzare la superficie, inquinata con il microrganismo, con il disinfettante (400µl) in modo
da coprire tutta la superficie selezionata ed attendere il tempo minimo di contatto di 15
minuti.
•  Trascorso il tempo di contatto recuperare i microrganismi inoculati usando la tecnica del
tampone inumidito in soluzione fisiologica con Tween 80 al 2%. Il tampone, verrà immerso
nel solvente da utilizzare e premuto contro la parete del contenitore per eliminare l’eccesso
di liquido. Successivamente il tampone verrà fatto muovere, facendo attenzione a fare
aderire completamente una faccia sulla superficie da campionare, orizzontalmente da
sinistra verso destra lungo l’area di campionamento per un numero di volte sufficienti a
coprire l’intera area da campionare; l’ultimo movimento deve essere fatto sulla destra
dell’area e perpendicolarmente ai precedenti per raccogliere l’eventuale accumulo di
prodotto. Le stesse operazioni dovranno essere ripetute utilizzando l’altra faccia del
tampone ed eseguendo i movimenti in senso verticale lungo l’area di campionamento.
Prova attività battericida/fungicida"
•  Recuperato il campione immergere il tampone in una provetta contenente 10 ml di
soluzione fisiologica con Tween 80 al 2%.
•  Vortexare la provetta per 2 minuti.
•  Filtrare immediatamente il contenuto della provetta su membrana filtrante (0,45
µm); il tempo di filtrazione non deve superare 1 minuto.
•  Lavare la membrana con 100 ml di diluente di lavaggio e con 50 ml di acqua
sterile.
•  Dopo la filtrazione rimuovere l’unità filtrante e trasferirla su piastre Petri
contenenti terreno TSA + neutralizzante per i batteri e su piastre Petri contenenti
terreni SDA + neutralizzante per i miceti in modo che non si formino bolle tra il
filtro e il terreno di coltura. Chiudere le piastre con il coperchio.
•  Incubare le piastre a 30!35°C per 48 ore per i batteri, a 20!25°C per 72h per le
muffe e il lievito.
•  Per ciascuna piastra determinare il numero di colonie (Na) di UFC/36 cm2 della
miscela sottoposta a prova.
Valutazione dei risultati
Registrare per ciascun microrganismo testato il numero di UFC presenti sulla lastra
di partenza: Test di controllo (Nv), ed il numero di UFC riscontrato dopo la verifica
dell’attività battericida/fungicida (Na).
Calcolare la riduzione della vitalità del microrganismo utilizzato per il test su
ciascuna superficie, applicando la seguente formula:
Nv
R (riduzione di vitalità) =
⎯⎯⎯⎯
Na
In ogni prova il risultato deve essere conforme, non è accettato l’approccio della
media
Criterio d’ accettazione
1) L’attività battericida/fungicida espressa come riduzione logaritmica
della vitalità (R) deve essere ≥ 103.
2) I controlli in piastra devono confermare la carica degli inoculi.
3) I controlli negativi devono essere negativi.
4) La validazione del metodo deve essere compresa tra 50-200%
oppure > 70%.
Contatti
Eurofins CTP Laboratories – Siena, Italy
Via Reno 2, 53036, Poggibonsi
Tel: +39-055-933873
Fax: +39-05771659097
E-mail: [email protected]
Web: www.eurofins.it - www.biolab.it

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