close

Enter

Log in using OpenID

PDF Fulltext - Gaziantep Medical Journal

embedDownload
KLÝNÝK ÇALIÞMA
01
Beta-Talasemi Hastalarýnda MLPA Yöntemi Ýle HBA
Mutasyonlarýnýn Saptanmasý
HBA Mutations Detected By MLPA In Beta-Thalassemia Patients
1
1
2
2
Yrd.Doç.Dr. Hüseyin ONAY
Uzm.Dr. Aslýhan EKMEKÇÝ
1
Dr. Esra ATAMAN
1
Dr. Mehmet AKGÜL
1
Dr. Ali VAHABÝ
2
Prof.Dr. Yeþim AYDINOK
3
Doç.Dr. Canan VERGÝN
1,2
Prof.Dr. Ferda ÖZKINAY
Ege Üniversitesi Týp Fakültesi Týbbi Genetik AD
Ege Üniversitesi Týp Fakültesi Çocuk Saðlýðý ve Hastalýklarý AD
3
Dr.Behçet UZ Çocuk Hastanesi Hematoloji Onkoloji Birimi
Gaziantep Týp Dergisi 2009;15(1):01-04.
GÝRÝÞ
Özet
Talasemi sendromlarý insanlarda en sýk gözlenen monogenik
hastalýklardýr b-talasemi major ülkemizde gözlenen en önemli halk
saðlýðý problemlerinden birisidir. HBA (alfa globin), UGT1 (bilirübin
metabolizmasý), HFE (demir metabolizmasý) genlerindeki mutasyonlar
gibi genetik düzenleyici faktörler hastalýðýn aðýrlýðýnýn belirlenmesinde
önemli role sahiptir. HBA genindeki delesyon ya da duplikasyonlar btalasemi major hastalarýndaki a-zincir birikiminin miktarýný belirlemektedir.
HBA geni 16. Kromozom üzerinde lokalizedir ve gende gözlenen
mutasyonlarý büyük oranda delesyon ve duplikasyonlar oluþturmaktadýr.
Multiple ligation dependent probe amplification (MLPA) tekniði, delesyon
ve duplikasyonlarýn sýk olarak gözlendiði genetik hastalýklarýn tanýsýnda
kullanýlabilen yeni, basit ve hýzlý bir yöntemdir. Bu çalýþmada 24 adet
prob ile HBA genindeki delesyon ya da duplikasyonlarý saptayabilen
ticari bir kit kullanýlmýþtýr. Bu çalýþmada bölümümüzde b-talasemi major
hastalýðý tanýsý almýþ 19 hastada HBA genindeki mutasyonlar MLPA
yöntemi ile araþtýrýlmýþtýr. On dokuz hastanýn 2’ sinde (%10.5) HBA
geninde delesyon saptanmýþtýr. Hastalarýn bir tanesinde delesyon HBA2
geni HBA1P arasýnda, diðerinde HBA1 ile HBA2 genleri arasýnda
saptanmýþtýr. Bu sonuç b-talasemi major hastalarý arasýnda HBA gen
mutasyonlarýn nadir olmadýðýný göstermektedir. Ayrýca MLPA tekniðinin
bu kompleks gen dizisindeki mutasyonlarýn araþtýrýlmasýnda uygun bir
teknik olduðu da görülmüþtür.
Anahtar Kelimeler: b-talasemi, MLPA, HBA
Abstract
Thalassemia syndromes are the most common monogenic disorders
in humans and b-thalassemia major is one of the most important public
health problems in Turkey. Many genetic factors play roles in modifying
the disease severity such as mutations in the alpha globin gene (HBA),
UGT1 gene (bilirubin metabolism) or HFE gene (iron metabolism).
Deletions or duplications in HBA gene determine the accumulation of
a chain in b-thalassemia major patients. The human alpha globin gene
cluster is located on chromosome 16 and deletions or duplications are
the most important mutations. Multiple ligation dependent probe
amplification (MLPA) technique is a simple and rapid technique and
used in many genetic disorders in which deletions and duplications
are common. In this study we used a commercial MLPA kit for detecting
alpha globin gene mutations. The kit contains 24 different probes in
the HBA region. In this study we aimed to investigate the incidence
of alpha globin gene mutations using MLPA technique in 19 b-thalassemia
major patients which were diagnosed in our department.Alpha globin
gene deletions were detected in 2 out of 19 (10.5%) b-thalassemia
major patients. In one of the patients the deletion was located between
the HBA2 gene and HBA1P gene. The deletion detected in the other
patient was located between the HBA1 gene and HBA2 gene. This
result suggests that alpha globin gene mutations in b-thalassemia
major patients are not rare. MLPA technique is suitable to investigate
the mutations in this complex gene cluster.
Key words: b-talasemi, MLPA, HBA
Talasemiler, hemoglobinde bulunan globin
zincirlerindeki hatalý üretime baðlý olarak ortaya çýkan
kalýtsal anemi sendromlarýdýr. Talasemi sendromlarý,
etkilenen globin zincirinin tipine göre isimlendirilmektedir.
Eriþkinlerde en önemli hemoglobin tipi Hemoglobin A’
dýr ve dolaþýmdaki hemoglobinin %95’ ini oluþturur (1).
Hemoglobin A’ nýn 2a ve 2b zincirinin bir araya gelmesiyle
oluþan tetramerik bir organizasyonu vardýr. En sýk
gözlenen talasemi tipleri alfa talasemi ve beta talasemidir.
Alfa talasemi a-globin zinciri üretiminde azalma ya da
tamamen kaybolma ile karakterizedir (2). a-globin
zincirini kodlayan HBA geni 16. kromozom üzerinde, b
globin zincirini kodlayan HBB geni ise 11. kromozom
üzerinde lokalizedir (3).
Normal eriþkinlerde a-globin genleri 4 kopya olarak
bulunur. Her DNA zinciri üzerinde birer kopya a1 ve a2
genleri cis durumda bulunur. a-globin gen dizisinde
gözlenen mutasyonlarýn %80-90 kadarýný delesyonlar
oluþturmaktadýr (Þekil 1). Daha nadir olarak da nokta
mutasyonlarý gözlenmektedir.
Alfa talasemi hastalýðýnýn klinik aðýrlýðýný kaç gen
kopyasýnýn mutasyona uðradýðý belirlemektedir. Ayný
kromozom üzerindeki bir (a+ talasemi) ya da iki (cis
durumda a0 talasemi) gen kopyasýnýn kaybý ya da her
iki kromozom üzerindeki birer gen kopyasýnýn kaybý
(trans durumda homozigot a+ talasemi) genellikle klinik
bulgu vermez; çünkü saðlam gen kopyalarýndan yeterli
a-globin zinciri üretimi saðlanabilir (1). Üç gen
kopyasýnýn kaybolduðu durum Hemoglobin H hastalýðý
olarak isimlendirilir ve talasemi intermedia tablosu
gösterir. Bu kiþilerde orta düzeyde anemi, splenomegali
ve alyuvarlarda belirgin hipokromi ve mikrositoz bulunur
(1).
Yrd.Doç.Dr. Hüseyin ONAY,
Ege Üniversitesi Týp Fakültesi Týbbi Genetik AD
Adres: Ege Üniversitesi Týp Fakültesi
Týbbý Genetik AD 35100 Bornova ÝZMÝR
Tel: 0232 390 39 62 / 76577 Fax: 0232 390 39 71
E-mail:[email protected]
Gaziantep Týp Dergisi /Yýl 2009 / Cilt 15 / Sayý 1
Onay ve ark.
02
Þekil 1. 16p13.3 bölgesine lokalize a-globin gen dizisi ve sýk gözlenen mutasyonlarýn þematik gösterimi (4).
Dört gen kopyasýnýn mutasyona uðradýðý durumda
ise Hemoglobin Barts’ a baðlý hidrops fetalis tablosu
gözlenir. Bu, in utero dönemde ciddi anemi ile seyreden
ve gestasyonun son dönemlerinde ya da doðumdan
hemen sonra ölümle sonuçlanan aðýr bir tablodur (1).
Beta talasemi hastalýðý ise HBB genindeki mutasyonlar
sonucu ortaya çýkan ve en sýk gözlenen tek gen
hastalýklarýndan bir tanesidir. Genetik olarak alfa talasemi
kadar karýþýk olmamasýna raðmen b-globin gen dizisinin
karmaþýklýðý nedeniyle bazý tablolarý aydýnlatmak ileri
testler ve tecrübe gerektirmektedir. Ayrýca beta talasemi
hastalýðýndaki önemli problemlerden bir tanesi de hastalýðýn
aðýrlýðýný belirleyen genetik düzenleyici faktörlerdir (5).
Bu faktörler arasýnda elbette en önemlisi HBB geninde
hastalýða yol açan mutasyonun lokalizasyonu ve
mutasyonun tipidir. HBB genindeki mutasyonlarýn birçoðu
için oldukça saðlam genotip-fenotip iliþkisi kurulmuþ
durumdadýr. Ýkinci önemli düzenleyici faktör ise a-globin
gen kopya sayýsýdýr. Çünkü beta talasemi hastalarýnda
kliniðin ortaya çýkmasýndaki önemli nedenlerden bir tanesi
de fazla a-globin’ in dokularda birikimidir. Bu nedenle
a-globin kopya sayýsýnýn azlýðý (delesyonlar ve
mutasyonlar) ya da fazlalýðý (gen triplikasyonu ya da
kuadriplikasyonu) beta talasemi hastalýðýnýn klinik seyrini
etkilemektedir.
Biz bu çalýþmada beta talasemi major tanýsý almýþ
hastalarda a-globin gen mutasyonlarýný araþtýrmayý ve
bu mutasyonlarýn hastalýðýn kliniði üzerine etkilerini
araþtýrmayý amaçladýk. Bu çalýþmaya 2007 ve 2008
yýllarýnda Ege Üniversitesi Týp Fakültesi Týbbi Genetik AD’
nda beta talasemi major tanýsý almýþ 19 olgu dahil
edilmiþtir. Prenatal tanýda beta talasemi major saptanan
olgular çalýmaya dahil edilmemiþtir. Eðer ailede birden
fazla beta talasemi majorlü birey varsa, sadece bir tanesi
çalýþmaya dahil edilmiþtir. HBA genindeki mutasyon ve
delesyonlarý araþtýrmak için Multiple Ligation Dependent
Probe Amplification (MLPA) yöntemi kullanýlmýþtýr. Bu
amaçla MRC Holland firmasýnýn HBA kiti kullanýlmýþtýr. Bu
kit HBA geni üzerindeki 24 bölgeye spesifik prob
içermektedir ve bu bölgelerdeki delesyonlarý
saptayabilmektedir. MLPA yöntemi hastalýðýn meydana
gelmesinde gendeki delesyo nlarýn önemli olduðu birçok
hastalýkta son yýllarda yoðun olarak kullanýlan ucuz ve
etkili bir yöntemdir. Yöntem kýsaca flöresan iþaretli
üniversal problar eklenmiþ dizilerin, eðer eþleniði olduðu
DNA’ da delesyon yoksa amplifiye olmasýna ve bunun
genetik analizörle tepitine dayanýr. Üniversal primerler
kullanýldýðý için bir PCR ile 45 kadar bölgenin ayný anda
çoðaltýlýp, bu bölgelerde delesyon olup olmadýðýnýn
araþtýrýlmasý mümkündür.
Þekil 2. MLPA-HBA kitinde görülmesi beklenen normal pikler.
Gaziantep Týp Dergisi / Yýl 2009 / Cilt 15 / Sayý 1
Onay ve ark.
03
Normal kiþilerde HBA MLPA kiti Þekil 2’ deki paterni
vermektedir. Buradaki her pik HBA geni üzerinde çoðaltýlan
bir bölgeye karþýlýk gelmektedir (Þekil 2). Genetik
analizörde yürütülen örneklerden elde edilen datalar
ücretsiz Coffalyser (http://www.mlpa.com/coffalyser/)
yazýlýmý ile analiz edilmektedir.
BULGULAR
Bu çalýþmada bölümümüzde b-talasemi major hastalýðý
tanýsý almýþ 19 hastada HBA genindeki mutasyonlar MLPA
yöntemi ile araþtýrýlmýþtýr. On dokuz hastanýn 2’ sinde
(%10.5) HBA geninde delesyon saptanmýþtýr. Hastalarýn
bir tanesinde (22 nolu hasta) delesyon HBA2 geni HBA1P
arasýnda (2 bölgede), diðerinde (15 nolu hasta) HBA1
ile HBA2 (3 bölgede) genleri arasýnda saptanmýþtýr (Þekil
3).
TARTIÞMA
Talasemi sendromlarý insanlarda en sýk gözlenen
monogenik hastalýklardýr b-talasemi major ülkemizde
gözlenen en önemli halk saðlýðý problemlerinden birisidir.
b-talasemi major genetiði en iyi aydýnlatýlmýþ
hastalýklardan bir tanesidir. Neredeyse bilinen bütün
mutasyonlarýn genotip-fenotip korelasyonu saðlanmýþ
durumdadýr. Bu bilgiler sayesinde hem oluþacak klinik
tablonun aðýrlýðý saptanabilmekte hem de prenatal tanýda
gebelik terminasyonu konusunda saðlýklý kararlar
verilebilmektedir. Hastalýðýn klinik ve genetiði bu kadar
iyi bilinmesine raðmen son yýllarda hastalýðýn kliniðini
deðiþtirebilen bazý genetik düzenleyiciler önem kazanmýþtýr.
Hastalýðýn kliniðini belirleyen faktörlerden elbette en
önemlisi HBB geninde saptanan mutasyonun yeri ve
tipidir. Ýkinci önemli faktör de HBA geninde meydana
gelen mutasyonlar sonucu a-globin gen kopya sayýsýnda
artma ya da azalmadýr. Ekstra a-globin gen kopya sayýlarý
(aaa/, aaaa ile sonuçlanan gen triplikasyon ya da
kuadriplikasyonlarý nadir deðildir ve hastalýk tablosunu
olumsuz yönde etkiler.
Tam tersi þekilde a-globin sentezini azaltan durumlarda
hastalýk kliniði daha hafif seyretmektedir (5). Bunun
yanýnda b-globin zinciri ile birleþemeyen a-globin’ lerin
g-globin ile birleþip fetal hemoglobin (HbF) oluþturmasý
da hastalýðýn kliniðini hafifletebilmektedir. Bu nedenle gglobin sentezini arttýran 3 QTL (Quantitave Trait Loci)
(Xmn1-Gg, HMIP ve BCL11A) HbF sentezini arttýrarak
klinik üzerine olumlu etki yapmaktadýr (6). Bunlarýn
dýþýnda globin zincir üretimini etkilemeden hastalýkta
gözlenen komplikasyonlarýn aðýrlýðýný belirleyen ikincil
genetik düzenleyiciler de bulunmaktadýr. UGT1 (bilirübin
metabolizmasý), HFE (demir metabolizmasý); VDR,
COL1A1, COL1A2, TGFB1 (kemik metabolizmasý); HLA
grubu (enfeksiyonlara yatkýnlýk) genlerindeki mutasyonlar
ya da polimorfizmler de hastalýðýn aðýrlýðý üzerinde önemli
etkiye sahiptir.HBA gen mutasyonlarýnýn, beta talasemi
hastalarýndaki modifiye edici etkisine dair literatürde çok
fazla çalýþma bulunmamaktadýr. Han ve ark. ile Cai ve
ark.’ larýnýn yaptýklarý iki çalýþmada da beta talasemi
heterozigotlarýnda HBA mutasyonlarý araþtýrýlmýþtýr (7,8).
Kanavakis ve ark. yayýnladýklarý bir olguda aðýr HBB
mutasyonlarý taþýyan bir olguda yný zamanda bulunan
HbH hastalýðý nedeniyle kliniðin daha hafif seyrettiði
belirtilmektedir (9). Bunun dýþýnda da tek tek olgular ile
HBA mutasyonlarýnýn beta talasemi majorlü olgulardaki
etkisi gösterilmiþtir. Biz çalýþmamýzda hem alfa talasemi
gibi genetik olarak çalýþýlmasý zor bir hasta grubunda
MLPA yöntemini kullandýk hem de önemli bir hasta
grubunda alfa talasemi mutasyon sýklýðýný saptamaya
çalýþtýk. Ýki prob bölgesinde delesyon saptanan 22 nolu
hasta IVS 2.745 (CG) /Codon 8/9 (+G) mutasyonlarýný
taþýmaktadýr. Üç prob bölgesinde delesyon saptanan 15
nolu hasta ise homozigot IVS 1.110(GA) mutasyonu
taþýmaktadýr ve erken hastalýk baþlangýcý olan bu olgunun
senelik 10-12 transfüzyon ihtiyacý bulunmaktadýr.
Sonuç olarak saptanan küçük delesyonlarýn hastalarýn
kliniði üzerinde bir etkisi olmadýðý görülmüþtür. Bu durumun
büyük ihtimalle delesyonlarýn, genler arasýndaki bölgelere
denk gelmesi nedeniyle, a-globin gen kopya sayýsýný
deðiþtirememesine baðlý olduðu düþünülmektedir.
Þekil 3. Saptanan delesyonlarýn þematik gösterimi.
Gaziantep Týp Dergisi / Yýl 2009 / Cilt 15 / Sayý 1
Onay ve ark.
04
KAYNAKLAR
1. Leung WC, Leung KY, Lau ET, Tang MH, Chan V, Alphathalassaemia. Semin Fetal Neonatal Med. 2008;13:215222.
2. Puehringer H, Najmabadi H, Law HY, Krugluger W,
Viprakasit V, Pissard S, et al. Validation of a reversehybridization StripAssay for the simultaneous analysis of
common alpha-thalassemia point mutations and deletions.
Clin Chem Lab Med. 2007;45(5):605-10.
3. Apak H. Hemoglobinopatiler ve Talasemiler. Anemiler
Sempozyumu, 19-20 Nisan 2001, Ýstanbul, s. 149-162
4. Harteveld CL, Voskamp A, Phylipsen M, Akkermans
N, den Dunnen JT, White SJ, et al. Nine unknown
rearrangements in 16p13.3 and 11p15.4 causing alphaand beta-thalassaemia characterised by high resolution
multiplex ligation-dependent probe amplification. J Med
Genet. 2005;42:922-931.
5.Thein SL. Genetic modifiers of the bhaemoglobinopathies. Br J Haematol. 2008;141:357–366.
6. Menzel S, Garner C, Gut I, Matsuda F, Yamaguchi M,
Heath S, et al. A QTL influencing F cell production maps
to a gene encoding a zinc-finger protein on chromosome
2p15. Nat Genet. 2007;39:1197–1199.
7. Han J, Zeng R, Hu B, The prevalence of betathalassemia heterozygotes compound alpha-thalassemia
in Guangdong district. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi.
2001;22:514-516.
8. Cai YL, Zheng YM, Tang MZ, Li J, Li SW, Molecular
detection and haematological analysis of heterozygotes
in beta-thalassemia combining deletional alphathalassemia. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi.
2007;15(1):195-197.
9. Kanavakis E, Traeger-Synodinos J, Lafioniatis S,
Lazaropoulou C, Liakopoulou T, Paleologos G, et al. A
rare example that coinheritance of a severe form of betathalassemia and alpha-thalassemia interact in a
"synergistic" manner to balance the phenotype of classic
thalassemic syndromes. Blood Cells Mol Dis. 2004;32:319324.
Gaziantep Týp Dergisi / Yýl 2009 / Cilt 15 / Sayý 1
Author
Document
Category
Uncategorized
Views
2
File Size
145 KB
Tags
1/--pages
Report inappropriate content