EVDE BİYOTEKNOLOJİ Yrd. Doç. Dr. Hüseyin UYSAL ADNAN MENDERES ÜNİVERSİTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ BÖLÜMÜ 5. DERS STERİLİZASYON; BİTKİ DOKU KÜLTÜRLERİNDE KULLANILAN STERİLİZASYON YÖNTEMLERİ VE BU STERİLİZASYON YÖNTEMLERİNİ EVDE UYGULAMA OLANAKLARI 2 STERİLİZASYON: Biyoteknolojik çalışmalarda kullanılan her türlü alet edevatın, kültür ortamının ve çalışma alanının her türlü patojen ve mikroorganizmadan arındırılması işlemine sterilizasyon denir. 3 Sterilizasyon Neden Önemlidir? • Her türlü alet ekipmanda bulunan patojenler/mikroorganizmalar • Havada bulunan patojenler/mikroorganizmalar • Suda bulunan patojenler/mikroorganizmalar • Mikroorganizmaların üreme hızı • Her türlü biyoteknolojik çalışmada (tıbbi, mikroorganiza, hücre kültürleri, doku kültürleri, vb.) sterilizasyonun şart olması 4 Sterilizasyon İşlemi; • Sıcaklık uygulayarak • Kimyasal madde yardımıyla • Ürünü süzerek • Işın (UV yada radyasyon) vererek yapılabilir. 5 Burada bahsi geçen yöntemlerden süzme işlemi dışında kalan yöntemlerde mikroorganizmanın öldürülmesi veya biyolojik yapısına zarar vererek yaşam çemberinin sekteye uğratılması ve bu sayede yok edilmesi esastır. Süzme işleminde ise esas olan kullanılacak olan sıvıdan mikroorganizmaların süzülerek alınması ve steril bir çözelti veya sıvının elde edilmesi esastır. 6 • - Sıcaklık Uygulayarak Yapılan Sterilizasyon Kuru ısı sterilizasyonu Sıcak su buharı sterilizasyonu Alev sterilizasyonu 7 - Kuru ısı (hava) sterilizasyonu Her türlü cam malzemenin sterilizasonunda - Fırın 8 • Sıcak su buharı sterilizasyonu (Otoklav) Her türlü sıvı veya katı kimyasal, sıcaklığa dayanıklı plastik malzeme, cam malzeme vb. • Düdüklü tencere 9 Alev sterilizasyonu (Metal melzemeler) 10 • Kimyasal Madde Yardımıyla Sterilizasyon (Alkol, Sodyum Hipoklorit, Civa klorür, Tveen 20, Hidrojen peroksit, Klor dioksit, Etilen oksit vb.) Çalışma alanı, bitki materyalleri, kullanılcak malzemelerde ön sterilizasyon vb. 11 -Süzerek Sterilizasyon (Filtre sterilizasyonu) Sıcaklıkla bozulan sıvılar 12 • Işın (UV yada radyasyon) vererek yapılabilir. Çalışma alanının sterilizasyonu 13 Biyoteknolojik Çalışmalarda Kullanılacak Malzemelerin ve Kimyasalların Sterilizasyonu - Cam ve metalik malzemelerin sterilizasyonu - Besi ortamının sterilizasyonu - Sıcaklığa hassas kimyasalların sterilizasyonu - Çeşitli bitki materyallerinin sterilizasyonu - Çalışma esnasında kullanılacak malzemelerin sterilizasyonu 14 Cam ve metalik malzemelerin sterilizasyonu • Etüvde (fırında) kuru hava ile sterilizasyon (160-180 °C’de 2.5 – 3 saat) • Otoklavda (veya düdüklü tencerede) (121 °C’de 15-20 dakika) - Malzeme iyi yıkanmış olmalı - Yıkama sonrası saf su (veya kaynatılmış su) ile durulanmalı 15 Besi ortamının sterilizasyonu • Otoklavda (veya düdüklü tencerede) yüksek sıcaklık ve su buharı basıncı altında (121 °C) Besi ortamının sterilizasyon süresi hacmi ile doğru orantılıdır. 20 - 50 ml 15 dak. 250 500 ml 25 dak. 1000 ml 30 dak. 2000 ml 40 dak. 16 Sıcaklığa hassas kimyasalların sterilizasyonu • Yüksek sıcaklıkla bozulan kimyasallar (vitaminler, karbonhidratlar, büyüme düzenleicileri, vb.) 0,2 µ’lük gözenek çapına sahip filtreden geçirilir. 17 Çeşitli bitki materyallerinin sterilizasyonu • Çeşitli bitki materyalleri çeşitli kimyasallar kullanılarak yüzey sterilizasyonuna tabi tutulurlar. Organ Ön sterilizasyon Sterilizasyon Sterilizasyon Sonrası Tohum 10 sn saf alkol 10-20 dk. %10-20 sodyum hipoklorit 3-5 ket steril saf su ile durulama Meyve Kısa süreli alkol ile muamele 10 dk. % 2 sodyum hipoklorit 3-5 ket steril saf su ile durulama Depo organı Musluk suyu altında yıkama + saf alkol ile kısa süreli muamele 15 - 30 dk. % 2 sodyum hipoklorit 3-5 ket steril saf su ile durulama ve steril ağı ile kurulama Yaprak Kısa süreli alkol ile muamele 1 dak. %0.1’lik çinko klorit veya 5 dak %3-10’luk sodyum hipoklorit 3-5 ket steril saf su ile durulama ve steril ağı ile kurulama 18 Kullanılan bitki eksplantının iç kısmı patojen ile enfekte olmuşsa besi yerine bazı antibiyotiklerin ilavesi ile patojen gelişimi engellenebilir. 19 Çalışma esnasında kullanılacak malzemelerin sterilizasyonu • Çalışmada kullanılacak bütün malzemeler steril olmalıdır. • Çalışma esnasında kullanılan metal malzemeler alev ile veya hot plateler aracılığıyla steril edilebilir. • Bu malzemeler çalışma öncesi bir alüminyum folyaya sarılarak 20 • Bu malzemeler çalışma öncesi bir alüminyum folyaya sarılarak otoklavda (veya düdüklü tencerede) yada sodyum 15-20 dakika sodyum hipoklorit çözeltisine yatırmak sureti ile steril edilebilir. 21 Biyoteknolojik Çalışmalarda Evde Uygulanabilecek Sterilizasyon Yöntemleri Biyoteknolojik çalışmalar yapmak için steril kabin yerine ev şartlarında bir balık akvaryumu veya 50x40x40 cm ebatlarında silikonla izole edilmiş veya kenarlarından iyice yapıştırılmış, sadece bir cephesi açık cam bir kabin işi görebilir 22 Otoklav yerine basınçlı pişiriciler (30-40 cm çapında düdüklü tencere) kullanılabilir 23 Alev sterilizasyonunda kullanılmak üzere alkol veya ispirto ocağı kullanılabilir. 24 Bistüri ve bıçaklar alüminyum folyo içine sarılarak basınçlı tencerede 15 dakika kaynatılarak steril hale getirilebilir. Bu aletler aynı zamanda ticari olarak satılan klor içeren bir çamaşır suyu içine batırılarak (15-20 dakika) veya alkol içine batırıldıktan sonra aleve tutularak (dikkatli olunuz!) da sterilize edilebilir. 25 Bütün bitki materyalleri sodyum hipoklorit veya kalsiyum hipoklorit solüsyon içinde sterilize edilebilir. Bir damla sıvı deterjan da ilave edilebilir. Bitki parçaları karışımda 10-20 dakika karıştırılarak tutulur, daha sonra kap boşaltılır ve steril su ile en az 3 defa durulanır. Bütün bu işlemler sırasında materyalin mikroorganizmalarca kirlenmemesi için çaba sarf edilmelidir. 26 • Su, cam şişe veya kavanozlar içinde, kağıt veya bezler ise bir kese kağıdı veya otoklav naylonu içinde yukarıdaki metodla steril hale getirilebilir. Kese kağıdı kullanılırsa, tencereden çıkardıktan sonra ıslak durumda olduğundan 80 0C ye ayarlanmış bir mini fırın içinde kurutulmalı ve kullanılıncaya kadar açılmamalıdır. 27 • Doku kültüründe kullanılacak malzemelerin ve besin ortamlarının sterilizasyonunda kullanılan basınçlı pişirici veya filtre sterilizasyonuna alternatif bir diğer yöntem de mikrodalga sterilizasyonudur. Çünkü özellikle filtre sterilizasyonu pahalı ve az miktarda ortam için uygun olmakta, basınçlı pişirici veya otoklavda sterilizasyon ise uzun zaman almakta ve sterilize edilecek malzemelere zarar verebilmektedir. 700 W gücünde bir ev mikrodalga fırınını kullanarak 3 g şeker içeren 100 ml (%3) besin ortamının 5 dakikada, 250 ml ortamın 10 dakikada ve 1 litre ortamın da 15 dakikada başarıyla sterilize edilebilir 28