Dizi Listesi - ResearchGate

TARİFNAME
BİR ANTİJEN GÖNDERİM YÖNTEMİ
5
Teknik Alan
Bu buluş, antijen ve/veya biyoaktif molekül gönderimi için yeni bir yöntem ile
ilgidir.
10
Önceki Teknik
Geleneksel olarak aşılar, öldürülmüş ya da etkisi azaltılmış canlı patojenlere karşı
vücudun antikor üretmesi prensibine dayanmaktadır. Son dönemde ise,
biyogüvenliğin arttırılması amacı ile tüm patojenin enjeksiyonu yerine patojenin
15
sadece belli parçalarının enjeksiyonuna dayanan alt birim aşıları (subunit
vaccines) geliştirilmesi çalışmaları yapılmaktadır. Alt birim aşıları, patojenin
kodladığı belirli protein ya da peptid yapıdaki antijenleri içermektedir. Bu peptid
ya da proteinlerin, antijen sunan hücreler (ASH) tarafından yutulmasını
hızlandırmak için nanometre ya da mikrometre ebatlarındaki partiküllere
20
antijenler yüklenir. Bu türdeki aşılara partikül (parçacık) aşıları denilmektedir (De
Temmerman ve ark. 2011).
Partikül aşılarda kullanılmak üzere geniş bir yelpazedeki antijen gönderim
yöntemleri
25
üzerinde
çalışmalar
yapılmaktadır.
Emulsiyon,
lipozom,
immunostimulant kompleks, virüs benzeri partiküller, altın, silika partikülleri ve
polimer bazlı partiküller bu amaçla kullanılmaktadır. Polimer tabanlı partiküller
poli(D,L-lactid)
(PLA)
ve
poli(D,L,lactic-co-glikolik
asit)
(PLGA)
gibi
biyoçözünür malzemelerden ya da polistiren gibi biyoçözünür olmayan
malzemelerden üretilebilir. Katman-katman (layer-by-layer) kapsüller, kitozan
1
partiküller, mikro- ve nanojeller de polimer bazlı diğer antijen gönderim
yöntemleridir.
Yukarıda belirtilen bütün gönderim yöntemlerinin ortak noktası, ASH’ler
5
tarafından antijenlerinin yutulmasını kolaylaştırmak için antijenlerin ebatlarının
büyütülmesidir (Xiang ve ark. 2006). Partikül aşıların bir diğer özelliği de
antijenlerin hücre dışında ve yutulduktan sonra hücre içinde enzimler tarafından
yıkılmasını yavaşlatarak antijenlerin ortamda bulunma süresini uzatması ve
böylece ASH'lerin T hücrelerine antijen sunma kapasitesinin arttırılmasıdır.
10
Antijen gönderiminde kullanılan gönderim sistemlerinin benzerleri, kontrollü ilaç
salınımı uygulamalarında da kullanılmaktadır. Mikropartikül ilaç gönderimi
sistemlerinin oral ve nazal yollardan ilaç gönderiminde kullanıldığı uygulamalar
bulunmaktadır. Büyüme faktörlerinin polimer bazlı mikropartiküllerden kontrollü
15
salınımına yönelik pek çok çalışma mevcuttur (Balmayor ve ark., 2011).
Antikor üretimi sürecinde, antijenlerin ASH’ler tarafından etkili bir şekilde
yutulması büyük önem taşımaktadır. Bunu sağlamak için, kısa peptid antijenler
(haptenler) daha büyük taşıyıcı proteinlere bağlanmaktadırlar. Bu amaçla en çok
20
kullanılan taşıyıcı proteinler keyhole limpet hemocyanin (KLH) ve dana (bovine)
serum albumin (BSA) proteinleridir. En çok tercih edilen taşıyıcı protein olan
KLH, Megathura crenulata canlısından izole edilen 350 kDa büyüklüğünde bir
proteindir. Bu protein, agregat oluşturma eğilimindedir. KLH proteininin hem
çözünür hem de agregat oluşturan formları antijenik özellik göstermektedir.
25
Büyüklüğü sebebi ile KLH proteininin bakteride üretilmesi ya da moleküler
klonlama yöntemleri ile haptenleri kodlayan DNA parçaları ile KLH'ın
birleştirilmesi pratik değildir.
2
Bahsedilen antijen ve/veya ilaç gönderim sistemlerinden lipozom ve hidrojeller,
çabuk bozulmaktadır. Ayrıca lipozomlar, birbirleriyle birleşme eğilimi gösterirler.
Hem liposomların hem de hidrojellerin raf ömürleri bu sebepler ile kısadır.
5
Polimer bazlı mikropartiküllerin ise sentezlenmesi sırasında kullanılan yöntemler
(organik çözücüler, yüksek ısı, eritme-dondurma döngüleri) yüklenen antijen ya
da biyoaktif molekülün yapısı ve etkinliğini bozabilmektedir.
Genel olarak, alt birim aşılar tüm-patojen aşılara kıyasla daha az miktarda antikor
10
üretimi sağlayabilmektedir. Bu sorunu aşmak için çeşitli stratejiler geliştirilmiştir.
Bunların ilki, ASH membranıyla birleşme eğilimi gösteren moleküllerle
(antikorlar, reseptor ligandları) mikropartiküllerin kaplanmasıdır. Bu şekilde
mikropartiküllerin ASH’ler tarafından yutulma sıklığının arttırılması sağlanır. Bir
diğer strateji ise ASH’lerin antijen sunma özelliğini arttırıcı reseptörlerini
15
hedefleyen moleküller ile mikropartikülleri kaplamaktır. Toll-like reseptör (TLR)
ailesi üyeleri ligandların bağlanması ile uyarılır ve hücrelerin antijen sunma
özelliği arttırıcı yolaklar devreye girer. TLR ailesi üyelerini uyarmak için
mikropartiküller; CpG, poly(I:C), MPL, 3M-019 ve flagellin ligandları ile
kaplanmaktadır.
20
Apoptosis associated zerre like protein (ASC, PYCARD, TMS1); NLRP3,
NLRC4 ve AIM2 inflamazom komplekslerinde görev alan 22 kDa büyüklüğünde
N terminalinde PYD domaini ve C terminalinde CARD domaini bulunan bir
adaptör proteindir. ASC proteini, enflamatuvar ve piroptotik sinyal yolaklarında
25
kaspaz-1 proteinin aktivasyonda rol almaktadır. Bu protein hücre içerisinde
sitoplazmada bulunmakta; enflamazom kompleksi uyarıldığında ise çekirdek
zarına yakın bir lokasyonda noktasal yapılar (ASC zerreleri) oluşturmaktadır.
Piroptotik hücre ölümünde, proenflamatuvar bir uyarı sonucu ASC proteinleri
30
birkaç mikrometre çapındaki küresel süper moleküler kompleksler olan
3
piroptozom yapılarını oluşturmaktadır. Piroptozomların genelde oligomerize
olmuş ASC dimerlerinden oluştuğu varsayılmaktadır.
ASC proteinini de içeren NLRP3 enflamazomu; hücre dışı ATP, membran hasarı
5
veren toksinler (nigericin), lizozom hasarı, monosodium üre (MSU), UV ışını gibi
tetikleyiciler ile aktive olabilmektedir. NLRP3 enflamazomu aktivasyonuna,
mikrometre büyüklüğünde zerre ya da piroptozom denilen yapıların oluşması
eşlik etmektedir. Bu zerre yapıları, ASC proteininin hücrede yüksek miktarda
bulunması ile başka bir uyarana ihtiyaç duyulmadan da oluşabilmektedir.
10
Saflaştırılmış rekombinant ASC proteininin hipotonik çözeltide 37 °C sıcaklıkta
inkübasyonu ile in vitro koşullarda ASC zerreleri oluşumu sağlanabilmektedir.
WO2009014863 sayılı Uluslararası patent dokümanında, ASC proteini ve
piroptozom otoimmün hastalıklarının tanı ve tedavisinde kullanılmaktadır. Bu
15
buluşta, makrofajda erken enflamatuvar safhalarında apoptoz ile ASC dimerlerini
ve prokaspaz-1’i içeren piroptozom oluşmaktadır. Kaspaz-1 aktivasyonu ASC
piroptozom
oluşumuna
bağlı
olarak
gerçekleşmektedir.
Piroptozomların
makrofajdan izolasyonu ile enflamasyon olup olmadığı tayin edilmektedir.
20
MF59-adjuvantlı influenza aşılaması sonrasında, ASC proteinin antijen spesifik
humoral bağışıklığın tetiklenmesinde rol oynadığı, ASC geni knock-out ve
yabanıl fareler üzerinden veri karşılaştırmaları yapılarak varsayılmıştır. Ancak
ASC proteini ya da ASC zerrelerine bağlanabilecek antijen peptidler vasıtası ile
antijen gönderimi gerçekleştirilmesi konusunda bir öneride bulunulmamıştır.
25
30
4
Buluşun Kısa Açıklaması
Bu buluşun amacı, ASC zerresinin antijen ve/veya biyoaktif moleküllerle
yüklenebilmesini gerçekleştirmektir.
5
Bu buluşun başka bir amacı ise, ASC zerrelerinin antijen sunan hücrelere (ASH,
antigen presenting cell,) antijen ve/veya biyoaktif molekül gönderiminde
kullanılmasını gerçekleştirmektir.
10
Bu buluşun başka bir amacı, ASH’ler tarafından endositoz veya fagositoz yolu ile
ASC zerre ile birlikte yutulan antijenlerin hücre içerisinde enzimler tarafından
yıkılmasını yavaşlatarak antijenlerin ortamda bulunma süresini uzatmasını ve
böylece ASH’lerin T hücrelerine antijen sunma kapasitesinin arttırılmasını
gerçekleştirmektir.
15
Bu buluşun bir diğer amacı ise, ASH’ler tarafından antijenlerin yutulmasını
kolaylaştırmak için ASC zerreleri vasıtası ile antijenin ebatlarının büyütülmesini
gerçekleştirmektir.
20
Bu buluşun başka bir amacı, ASC zerre ile birlikte sunulan antijen veya ilacın, raf
ömrünün uzamasını gerçekleştirmektir.
Buluşun Ayrıntılı Açıklaması
25
Bu buluşun amacına ulaşmak için gerçekleştirilen bir antijen gönderim yöntemi
şekillerden;
Şekil 1 - mCherry-ASC zerrelerinin HEK 293 FT hücrelerinde üretilmesi ve
30
saflaştırılması. HEK 293 FT hücreleri mCherry-ASC kaynaşık proteini kodlayan
plazmid ile transfekte edilmiştir. A, B, C: mCherry-ASC zerrelerini üreten HEK
5
293 FT hücreleri. A: mCherry-ASC zerreleri (konfokal mikroskopi) B: Hücrelerin
ışık mikroskobunda görüntüsü C: 1A ve 1B şekillerinin üst üste görüntüsü.
Üretilen mCherry-ASC zerreleri daha sonra 293 FT hücrelerinden saflaştırılmıştır.
D: Saflaştırılmış mCherry-ASC zerreleri (konfokal mikroskopi). E: Zerrelerin ışık
5
mikroskobundaki görüntüsü F: 1D ve 1E şekillerinin üst üste görüntüsüdür.
Şekil 2 - mCherry-FGF2 kaynaşık proteininin EGFP-ASC zerrelerine yüklenmesi.
mCherry-FGF2 ve EGFP-ASC kaynaşık proteinini kodlayan plazmidler HEK 293
FT hücrelerine transfekte edildi ve mCherry-FGF2 kaynaşık proteininin EGFP-
10
ASC zerrelerine yüklendiği gözlemlendi. A: EGFP-ASC B: mCherry-FGF2 C:
Işık mikroskobu görüntüsü D: 2A, 2B ve 2C şekillerinin üst üste görüntüsüdür.
Şekil 3- EGFP proteinine bağlı peptidlerin hidrofobik etkileşimlerle ASCmCherry zerrelerinin dış kabuğunu kaplaması. HEK 293 FT hücreleri, mCherry-
15
ASC ve EGFP-X kodlayan plazmidlerle transfekte edilmiştir. 3A, 3B, 3C: "stop"
(EGFP-stop, Dizi ID No. 2), 3D, 3E, 3F: peptid 1 (Dizi ID No. 4), 3G, 3H, 3I için
peptid 2 (Dizi ID No. 8), 3J, 3K, 3L: peptid 3 (Dizi ID No. 9) içindir. 3A, 3D, 3G,
3J: EGFP-X (X: sırasıyla “stop”, peptid1,peptid 2, peptid3). 3B, 3E, 3H, 3K:
mCherry-ASC proteinlerini göstermektedir. 3C, 3F, 3I3L: EGFP-X (X: sırasıyla
20
“stop”, peptid1,peptid 2, peptid3).ve mcherry-ASC proteinlerinin üst üste
gösterimidir.
Şekil 4-
Hidrofobik peptidler ile mcherry-ASC zerrelerinin kaplanması için
peptidlerin en az 13 amino asit uzunluğunda olması gerekmektedir. EGFP-X
25
kodlayan plazmidler HEK 293 FT hücrelerine birlikte transfekte edilmiştir. X: 4A,
4B, 4C için peptide 1_19aa (Dizi ID No. 5), 4D, 4E, 4F için peptide 1_12aa (Dizi
ID No. 6), 4G, 4H, 4I için için peptide 1_8aa (Dizi ID No. 7), 4A, 4D, 4G, :
EGFP-X. 4B, 4E, 4H, : mCherry-ASC. 4C, 4F, 4I, :
EGFP-X (X: sırasıyla
peptid1_19aa, peptid 1_12 aa, peptid 1_8 aa) ve mcherry-ASC proteinlerinin üst
30
üste gösterimidir.
6
Şekil
5
-
EGFP
ile
kaynaşık
protein
yapılan
peptidlerin
hidropati
grafikleri.Hidropati grafiklerinde yatay çizginin altına doğru uzanan kolonlar
hidrofobik, yukarı doğru uzanan kolonlar hidrofilik amino asitleri temsil
etmektedir. 5A: Peptid 1 (Dizi ID No. 4) 5B: Peptid 2 (Dizi ID No. 8) 5C: Peptide
5
3 (Dizi ID No. 9) 5D: Peptid 1_19aa (Dizi ID No. 5) 5E: Peptid 1_12aa (Dizi ID
No. 6) 5F: Peptid 1_8aa (Dizi ID No. 7).
Şekil 6 - THP-1 hücrelerinin yuttuğu mCherry-ASC zerrelerinin membranla kaplı
olması ve hücre içinde yavaş yıkımı. PMA ile farklılaştırılarak makrofaj hücresi
10
karakteristiği kazandırılan THP-1 EGFP-ASC kararlı hücre hattı, 2 saat boyunca
saflaştırılmış mCherry-ASC zerreleri ile inkübe edilmiştir. Çevre koşullarının
kontrol edilmediği ortamda uzun süreli görüntülenen hücreler membran
bütünlüklerini kaybederek apoptotik hücre ölümü karakteristiği göstermişlerdir.
Apoptoza bağlı olarak gevşeyen ve içinde mCherry-ASC zerre taşıyıcısını
15
barındıran fagolizozom organelinin membran yapısı belirgin bir şekilde
görülmektedir. Ayrıca, fagolizozom organelinin içinde fakat ASC-mCherry
zerrelerinin dışında kalan alan da mCherry sinyali ile dolmuştur (6G-L: t=600 s ile
t=1100 arası). Bu da, mCherry-ASC zerrelerinin hücre içinde yavaş bir şekilde
yıkıldığını göstermektedir. Hücreler, konfokal mikroskopta 100'er saniye aralıkla
20
görüntülenmiştir (6A-6L). Sol: EGFP-ASC. Orta: mCherry-ASC. Sağ: Işık
mikroskobu.
Şekil 7 - mCherry-ASC zerreleri içeren fagolizozomdan vesiküllerin kopuşu.
PMA ile farklılaştırılarak makrofaj hücresi karakteristiği kazandırılan THP-1
25
EGFP-ASC kararlı hücre hattı, 2 saat boyunca saflaştırılmış mCherry-ASC
zerreleri ile inkübe edilmiştir. THP-1 hücrelerinin yuttuğu mCherry-ASC
zerrelerini içeren fagolizozomdan vesiküllerin kopma anı gözlemlenmiştir.
Hücrelerin gözlemlendiği süre zarfı boyunca zerrelerin tamamen yıkımı
gözlemlenmemiştir. Hücreler, konfokal mikroskopta 10'ar saniye aralıkla
30
görüntülenmiştir (7A-7U).
7
Şekil 8 - mCherry-ASC zerrelerinin 37 °C sıcaklıkta uzun süreli inkübasyona
dayanıklılığı. mCherry-ASC zerreleri HEK 293 FT hücrelerinde üretilip
saflaştırılmıştır. ASC zerreleri saflaştırıldıktan hemen sonra (8A, 8B) ve 30 gün
37 °C'de inkübasyondan sonra (8C, 8D) konfokal mikroskopta incelenmiştir.
5
mCherry-ASC ve EGFP-C3 (Dizi ID No. 12) kodlayan plazmidler HEK 293 FT
hücrelerine birlikte transfekte edilmiştir. Birlikte transfekte edilen hücrelerden
saflaştırılan mCherry-ASC zerreleri hemen (8E-8G) ve 30 gün 37 °C'de
inkübasyondan sonra (8H-8J) konfokal mikroskopta incelenmiştir. EGFP-C3'ün
mCherry-ASC zerrelerini kapladığı ve uzun süreli inkübasyondan sonra da
10
zerrelere bağlı kaldığı gözlemlenmiştir.
Şekil 9 - mCherry-ASC zerrelerinin eritme-dondurma döngüsüne dayanıklılığı.
HEK 293 FT hücrelerinde üretilip saflaştırılan ASC-mCherry zerreleri -80 °C'de
dondurulup +37 °C'de çözülerek eritme-dondurma döngüsüne sokulmuştur.
15
Eritilip-dondurulan preparattan alınan örnekler konfokal mikroskopta sayılmıştır.
8 eritme-dondurma döngüsünden sonra bile ASC-mCherry zerre sayısında anlamlı
bir değişim gözlemlenmemiştir.
Antijen ve/veya biyoaktif molekül gönderim sisteminde görevli bir kompozisyon
20
en temel halinde;
- ASC proteinlerinin bir araya gelerek oluşturdukları en az bir ASC zerre
taşıyıcısı,
- ASC zerre taşıyıcısı tarafından taşınan antijen veya biyoaktif molekül olan en az
bir peptid veya protein içermektedir.
25
“Apoptosis-associated speck like protein containing a Caspase Activation
Recruitment Domain (CARD)” ve “ASC” olarak yer alan ifadeler, ASC geninin
farklı türlerdeki homologları veya izoformlarının ekspresyon ürünüdür. Bu tanım,
ASC proteininin insan (Dizi ID No. 1) ve zebrabalığı (Dizi ID No. 11)
30
organizmalarındaki homologları başta olmak üzere tüm canlılardaki homologları
için geçerlidir.
8
Yukarıdaki tanıma göre tarif edilen ASC proteinlerinin bir araya gelerek
oluşturduğu mikron boyutundaki perinükleer agregatlar ASC zerreleri (ASC
speck) olarak tanımlanmaktadır. Bu yapılar NLRP3, AIM2 ve NLRC4
5
proteinlerinin uyarılması ve/veya piroptosizin tetiklenmesi ile oluşabilmektedir
(Miao ve ark., 2011, Leemans ve ark., 2011, Gross ve ark., 2011). Ancak ASC
zerre yapısı, ASC proteini (Dizi ID No. 1) hücre içinde yüksek miktarda
anlatıldığında (overexpression) herhangi bir uyarıya gereksinim duymadan
oluşabilmektedir. Buluşta bahsedilen "ASC zerreleri" ya da "zerre" ifadeleri, ASC
10
proteinlerinin (Dizi ID No. 1) (endojen, kararlı ya da geçici gen anlatımı ile) hücre
kültüründe oluşturdukları ya da bakteri, maya, bakuloviral, vb. gen anlatım
sistemleri ile üretilen ve saflaştırılan ASC proteinlerinden (Dizi ID No. 1) üretilen
her türlü agregatı kapsamaktadır.
15
Buluş konusu kompozisyonda ASC zerre taşıyıcısı tarafından taşınan antijen olan
en az bir peptid veya protein, kısaca antijen; vücuda girdikleri zaman antikor
oluşumunu tetikleyen peptid, protein veya karbon hidratı taklit eden bir peptidden
oluşan gruptan en az biri veya bu grupta yer alan en az iki üyenin bir
kombinasyonudur.
20
Biyoaktif moleküller; canlı organizma, doku veya hücre üzerinde terapötik etkisi
olan moleküllerdir. Buluş konusu kompozisyonda ASC zerre taşıyıcı tarafından
taşınan biyoaktif molekül olan en az bir peptid veya protein kısaca biyoaktif
molekül; ilaç, pestisit, enzim, büyüme faktörü, hormon, vitaminden oluşan
25
gruptan en az biri veya bu grupta yer alan en az iki üyenin bir kombinasyonudur.
Buluşun tercih edilen uygulamasında kompozisyon, en az bir çeşit antijen ve/veya
en az bir çeşit biyoaktif molekül içermektedir.
ASC zerre taşıyıcısı, antijeni ve/veya biyoaktif molekülü farklı şekillerde
30
taşıyabilmektedir. Diğer bir ifade ile antijen ve/veya biyoaktif molekül ASC zerre
taşıyıcısına farklı şekillerde yüklenebilmektedir.
9
Buluşun tercih edilen uygulamasında, antijeni kodlayan DNA parçası ASC
proteinini kodlayan DNA parçası ile birleştirilerek hem antijen hem de ASC
proteinini kodlayan bir kaynaşık DNA parçası oluşturulmakta ve bu kaynaşık
5
DNA parçası, hem antijeni hem de ASC proteinini içeren bir ASC-antijen
kaynaşık proteini (fusion protein) oluşturmaktadır.
ASC proteininin 22 kDa olan görece ufak boyu sebebi ile moleküler klonlama ve
bunu takiben hücre kültüründe ya da bakteride ASC-antijen kaynaşık proteini
10
anlatımı (expression) oldukça verimli olmaktadır.
Buluşun tercih edilen uygulamasında, ASC zerre taşıyıcısını oluşturan en az bir
ASC proteini ile antijen kaynaşık protein olarak bulunmakta ve antijen bu şekilde
buluş konusu kompozisyonda, ASC zerre taşıyıcısı ile kaynaşık olarak
15
taşınmaktadır.
ASC zerrelerinin hücre kültüründen saflaştırılması ve in vitro ortamda
sentezlenmesi daha önce tarif edilmiştir (Fernandes-Alnemri ve ark. 2007). Buluş
konusu kompozisyonun hücre kültüründen saflaştırılması ve in vitro ortamda
20
sentezlenmesi işlemleri Fernandes-Alnemri ve ark. ait makalede anlatılan
yöntemler ile gerçekleştirilmiştir.
ASC zerre taşıyıcısı ve ASC zerre taşıyıcısını oluşturan her bir ASC proteinine
kaynaşık olarak bulunan antijenleri içeren ve hücre kültüründe sentezlenen buluş
25
konusu kompozisyon hücre kültüründen saflaştırılmaktadır.
Buluşun alternatif bir uygulamasında, bakteride (ya da başka bir gen anlatım
sisteminde) üretilen ASC-antijen kaynaşık proteinleri bakteriden çıkarılmakta
(ekstrakte edilmekte) ve ASC zerre taşıyıcısı ve ASC zerre taşıyıcısını oluşturan
30
her bir ASC proteinine kaynaşık olarak bulunan antijenler in vitro koşullarda
buluş konusu kompozisyonu oluşturmaktadır.
10
ASC proteini ile kaynaşık protein olarak bulunan antijen, ASC proteininin Nucuna (terminus), C-ucuna (terminus) ya da proteinin içine yerleştirilebilir.
Buluşun bu uygulamasında antijen, ASC zerre taşıyıcısının içerisinde dağınık
5
halde taşınmaktadır.
Buluşun tercih edilen bir diğer uygulamasında, antijen ve/veya biyoaktif molekül
ASC zerre taşıyıcısına, ASC zerre taşıyıcısı veya ASC zerre taşıyıcısını oluşturan
ASC proteini ile hidrofobik etkileşimler oluşturarak yüklenmektedir.
10
Buluşun tercih edilen uygulamasında, ASC zerre taşıyıcısına hidrofobik
etkileşimler vasıtası ile yüklenen antijeni veya biyoaktif molekülü oluşturan
peptid veya protein dizileri en az 13 amino asit uzunluğunda ve hidrofobik
özelliktedir. Antijeni veya biyoaktif molekülü oluşturan peptid veya protein
15
dizilerinin ortalama hidrofobisite değerleri ölçüldüğünde 0’ın üstünde değer veren
peptid dizileri hidrofobik özellikte, 0’ın altında değer veren peptid dizileri
hidrofilik özellikte olarak ifade edilmiştir.
Hidrofilik özellikteki antijen ve/veya biyoaktif molekül tek başına, ASC zerre
20
taşıyıcısı ile hidrofobik etkileşimler vasıtası ile taşınamamaktadır. Hidrofilik
özellikteki antijen ve/veya biyoaktif molekül; en az 13 amino asit uzunluğunda ve
hidrofobik peptidler ile antijen ve/veya biyoaktif molekül kaynaşık proteinlerini
oluşturmak sureti ile ASC zerre taşıyıcısına hidrofobik etkileşimler vasıtası ile
yüklenebilmektedir.
25
Buluşun tercih edilen bu uygulamasında antijen ve/veya biyoaktif molekül, ASC
zerre taşıyıcısının yüzeyinde diğer bir adı ile dış kabuğunda bulunmaktadır.
ASC zerre taşıyıcısı ve ASC zerre taşıyıcısına hidrofobik etkileşimler vasıtası ile
30
yüklenen en az bir antijen be/veya biyoaktif molekül içeren ve hücre kültüründe
sentezlenen buluş konusu kompozisyon hücre kültüründen saflaştırılmaktadır.
11
Buluşun alternatif bir uygulamasında, bakteride (ya da başka bir gen anlatım
sisteminde) üretilen ASC zerre taşıyıcısını oluşturan ASC proteinleri ve antijen
ve/veya biyokatif molekül bakteriden çıkarılmakta (ekstrakte edilmekte) ve ASC
5
zerre taşıyıcısı ve ASC zerre taşıyıcısına hidrofobik etkileşimler vasıtası ile
yüklenen en az bir antijen be/veya biyoaktif molekül in vitro koşullarda buluş
konusu kompozisyonu oluşturmaktadır.
Buluşun tercih edilen uygulamasında kompozisyon, ASC zerre taşıyıcısına
10
hidrofobik etkileşimler vasıtası ile en az bir antijen ve/veya biyoaktif molekül
yüklenerek oluşmaktadır ve hidrofobik etkileşimli kompozisyon olarak ifade
edilmektedir.
Buluşun tercih edilen bir diğer uygulamasında kompozisyon, en az bir antijen
15
ve/veya biyoaktif molekülün, ASC zerre taşıyıcısını oluşturan her bir ASC
proteini ile kaynaşık protein oluşturması ile oluşmaktadır ve kaynaşık
kompozisyon olarak ifade edilmektedir.
Buluşun tercih edilen bir başka uygulamasında ise kompozisyon, hem kaynaşık
20
kompozisyon hem de hidrofobik etkileşimli kompozsiyon üretim yöntemleri ile
oluşmaktadır. Bu kompozisyon, kaynaşık ve hidrofobik etkileşimli kompozsiyon
olarak ifade edilmektedir.
Buluş konusu kompozisyon, hücre kültüründe bir uyarı vasıtası ile veya bir uyarı
25
olmadan oluşmaktadır. Bahsedilen uyarı, proenflamatuvar uyarıcılar vasıtası ile
gerçekleşmektedir.
Buluş konusu kompozisyonda yer alan ASC zerre taşıyıcısı, ASC proteinin (Dizi
ID No. 1) kodlayan DNA parçasını içeren plazmidlerin hücre kültüründe yüksek
30
miktarda anlatılması ile uyarısız olarak oluşmaktadır. Bu şekilde ASC zerre
taşıyıcısı ve ASC zerre taşıyıcısı ile taşınana biyoaktif molekül ve/veya antijen
12
hücre kültüründe herhangi bir uyarı olmadan buluş konusu kompozisyonu
oluşturmaktadır.
Buluşun tercih edilen bir başka uygulamasında, buluş konusu kompozisyonda yer
5
alan ASC zerre taşıyıcısı, hücrenin proenflamatuvar uyarıcılar ile uyarılması
sonucu uyarı vasıtası ile oluşmaktadır. Bu şekilde ASC zerre taşıyıcısı ve ASC
zerre taşıyıcısı ile taşınana biyoaktif molekül ve/veya antijen hücre kültüründe
uyarı vasıtası ile buluş konusu kompozisyonu oluşturmaktadır.
10
Buluşun bir diğer uygulamasında, buluş konusu kompozisyon, in vitro ortamda
hipotonik bir çözelti içinde oluşmaktadır. ASC zerre taşıyıcısını oluşturan ASC
proteini (Dizi ID No. 1), antijen ve/veya biyoaktif molekül; bakteri, maya,
bakuloviral gibi bir gen anlatım sistemi ile anlatılmakta ve saflaştırılmaktadır.
Saflaştırılan ASC proteini ve antijen ve/veya biyokatif molekül hipotonik çözelti
15
(<50mM KCl konsantrasyonuna sahip bir çözelti) içerisinde, 37 °C'de
inkübasyonla buluş konusu kompozsiyonu oluşturmaktadır.
Bahsedilen antijen yükleme yöntemleri insan ASC proteini (Dizi ID No. 1) ve
insana evrimsel açıdan yakın canlılardaki homologlarında olduğu kadar,
20
zebrabalığı gibi insanın uzak bir akrabasındaki homoloğu (zASC, Dizi ID No. 11)
için de geçerlidir (Örnek 8, 9). zASC proteinlerinin oluşturduğu zerre yapıları
daha önceden tarif edilmiştir (Masumoto ve ark., 2003).
Buluşun tercih edilen uygulamasında kompozisyon, insan ya da insana evrimsel
25
açıdan yakın bir canlıya ait bir antijene karşı poliklonal antikor geliştirilmek için
kullanıldığında, tercihen ASC proteininin zebrabalığı homoloğu (Dizi ID No. 11)
gibi uzak bir akrabasındaki ASC geni tercih edilmektedir. Böylece antikor
üretiminde kullanılan konak canlı ASC proteininin zebrabalığı homoloğuna (Dizi
ID No. 11)
30
karşı antikor geliştirse bile insan ve zebrabalığı ASC genleri
arasındaki yüksek dizi farklılığı sebebi ile bu antikorlar insan ASC'ını (Dizi ID
No. 1) tanıma ihtimali azaltılmaktaktadır. Benzer şekilde, zebrabalığı ya da
13
zebrabalığının yakın bir akrabasına ait antijene karşı poliklonal antikor
geliştirileceği durumda tercihen ASC proteininin insan homoloğu (Dizi ID No. 1)
gibi görece uzak bir homoloğu kullanılır. İnsan (Dizi ID No. 1) ve zebrabalığı
(Dizi ID No. 11) ASC genleri % 34.2 benzerlik taşımaktadır ve arka arkaya
5
sadece 5 amino asit birebir aynıdır. Bu benzerlikler istenildiği takdirde bir
mutasyon taraması ile azaltılabilir.
Söz konusu buluşta bahsedilen kompozisyon, antijen ve/veya biyoaktif
molekülün, ASC zerre taşıyıcısı ile birlikte antijen sunan hücrelere (ASH)
10
iletilmesini sağlamaktadır. Antijen sunan hücreler (ASH); makrofajlar, dendritik
hücreler ve B hücreleridir.
ASH’ler buluş konusu kompozisyonu, endositoz yolu ile hücre içine almaktadır.
Hücre içerisine alınan kompozisyon, hücre zarından oluşan pH değeri 6 ila 6.5
15
olan
endosomal/fagozomal
vesikül
(erken
endozom)
ile
çevrelenerek,
endositik/fagositik yolağa girmektedir. Endositik/fagositik yolak, sırası ile erken
endozom/fagozom (pH 6-6.5), endolizozom/fagolizozom (ph 5-6) ve lizozom (pH
4.5-5) aşamalarından oluşmaktadır. Kompozisyon, endolizozom/fagolizozom ve
lizozom aşamalarında hidrolitik enzimler ve asidik pH değeri nedeni ile
20
yıkılmaktadır. Bu yıkım sonucunda kompozisyon içeriğindeki antijen 13-18
amino asitlik oligopeptidlere parçalanmakta ve bu parçalar sınıf II MHC
molekülüne
bağlanarak
bu
molekül
ile
birlikte
hücre
zarı
üzerine
gönderilmektedir. TH hücreleri, antijenin bir parçası-MHC II molekülü yapısını
tanımakta ve etkileşime geçmektedir.
25
Buluş konusu kompozisyon ile birlikte ASH’ler tarafından yutulan antijenler,
endositik yolakta kontrollü bir şekilde yıkılmaktadır. Kompozisyon bu şekilde,
görece düşük hızda antijen salınımı ve yıkımı sağlamaktadır.
30
Endositik yolak ile yutulan ASC zerreleri fagolizozom organeli içindeyken,
organelden bazı vesiküllerin koptuğu gözlemlenmiştir. Fagolizozom organelinde
14
yıkılan proteinlerin ürünü olan oligopeptidlerin MHC sınıf II moleküllerine bu tür
fagolizozomdan kopan vesiküller içinde yüklendiği bilinmektedir.
İdeal aşılar, raf ömrü uzun, taşıma sırasında ya da kaza sonucu meydana
5
gelebilecek
erime-tekrar
dondurma
olaylarından
etkilenmeyecek,
vücut
sıcaklığında uzun bir süre zarfı boyunca bozulmadan yapısını koruyacak ama aynı
zamanda da biyoçözünür olacak şekilde tasarlanmaktadır.
Buluş konusu kompozisyon vasıtası ile kompozisyon içerisinde yer alan antijen
10
ve/veya
biyoaktif
molekülün
37
°C
sıcaklıkta
kararlığı
artmakta
ve
antijen/biyoaktif molekül, bu kompozisyon içinde bozunmadan en az 30 gün
dayanmaktadır. Söz konusu kompozisyon, bu şekilde antijenin fizyololojik
koşullardaki kararlılığını arttırmaktadır ve aynı zamanda raf ömrünü uzatmaktadır.
15
Bu kompozisyon vasıtası ile antijen bozulmadan, dondur-çöz döngüsüne en az 8
kere dayanabilmektedir. Bu şekilde, kompozisyon, taşıma sırasında ya da kaza
sonucu meydana gelebilecek erime-tekrar dondurma olaylarına karşı antijenin
ve/veya biyoaktif molekülün etkilenmesini minimize etmektedir.
20
Buluş konusu kompozisyon ile yüksek sıcaklık, organik solvent kullanımı veya
dondur-çöz işlemi gibi antijene zarar verici işlemler elimine edilmiştir.
Yukarıda ASC zerre taşıyıcısı ve antijen içeren kompozisyon için yapılan bütün
açıklamalar, biyoaktif molekül ve ASC zerre taşıyıcısı içeren kompozisyon için de
25
geçerlidir.
Bu temel kavramlar etrafında, buluş konusu bir antijen gönderim yöntemi ile çok
çeşitli uygulamalarının geliştirilmesi mümkün olup, buluş burada açıklanan
30
örneklerle sınırlandırılamaz, esas olarak istemlerde belirtildiği gibidir.
15
ÖRNEKLER
Örnek 1
5
ASC zerre taşıyıcısı ve ASC zerre taşıyıcısını oluşturan ASC proteinlerine
kaynaşık olan mcherry proteinin oluşturduğu kompozisyonun HEK 293 FT hücre
kültüründe eldesi ve HEK 293 FT hücre kültüründen saflaştırılması.
Peptid ya da protein yapıdaki antijen ya da biyoaktif molekül, ASC proteini (Dizi
10
ID No. 1) kodlayan bir plazmide ASC geni ile kaynaşık bir protein oluşturacak
şekilde klonlanır. Kullanılan plazmid tercihen, SV40 replikasyon orijini
içermelidir (örneğin pcDNA3 ya da pEGFP-C3 vektör omurgası vb.). Bu şekilde
oluşturulan plasmid, ASC-antijen (ya da biyoaktif molekül) kaynaşık proteinini
yüksek miktarda anlatmak üzere seçilen hücre hattına transfekte edilir. HEK 293
15
FT hücre hattı, SV40 replikasyon orijini içeren plazmidleri yüksek kopya
sayısında hücre içinde ürettiği için bu buluşta kullanılmıştır.
mCherry-ASC kaynaşık proteini kodlayan pmCherry-C3.1-ASC plazmidi, HEK
293 FT hücrelerine kalsiyum-fosfat metodu ile transfekte edilmektedir. 1 milyon
20
hücre, 35 mm'lik hücre kültürü tabaklarına transfeksiyondan bir gece önce ekilir.
1 μg plazmid, distile su ile 219μl' ye tamamlanır ve 31 μl 2 M CaCl2 ile
karıştırılır. 250 μl 2X HBS (280 mM NaCl, 50 mM HEPES 1.5 mM Na2HPO4
pH: 7.05) ilave edilir, karıştırılır ve karışım oda sıcaklığında 15 dakika bekletilir.
Karışım bir gece önceden ekilen HEK 293 FT hücrelerinin üzerine yavaşça
25
damlatılır. Alternatif olarak, HEK 293 FT hücreleri ekilir ekilmez, hücreler henüz
hücre kültürü tabağına yapışmadan da transfeksiyon karışımı ilave edilebilir.
ASC geni HEK 293 FT hücrelerinde yüksek miktarda anlatıldığı zaman herhangi
bir uyaran olmaksızın oluşmaktadır. ASC zerre taşıyıcısını oluşturan ASC proteini
30
ile kaynaşık olarak bulunan peptid veya proteinler (örneğin mCherry-ASC), HEK
293 FT hücrelerinde yüksek miktarda anlatıldığı zaman
16
(over expression)
herhangi bir uyaran olmaksızın, ASC zerre taşıyıcısı ile kaynaşık bir şekilde buluş
konusu kompozisyonu oluşturmaktadır (Şekil 1 A-C).
ASC zerre taşıyıcısı ve ASC zerre taşıyıcısını oluşturan ASC proteinlerine
5
kaynaşık olan mcherry proteinin oluşturduğu kompozisyon, HEK 293FT
hücrelerinde, confocal mikroskobu altında (Şekil 1A), ışık mikroskobu altında
(Şekil 1B), ve confocal ve ışık mikroskobu görüntüleri üst üste geldiğindeki hali
(Şekil 1C) gösterilmiştir.
10
ASC zerrelerinin hücre kültüründen saflaştırılması ile ilgili detaylı protokol daha
önceden tarif edilmiştir (Fernandes-Alnemri ve ark. 2007). Çalışmalarımızda bu
protokol temel alınarak buluş konusu kompozisyonun saflaştırma işlemi
yapılmıştır. Kompozisyonu içeren HEK 293 FT hücreleri, proteaz inhibitor
kokteyli içeren Triton X-100 tampon çözeltisi (1% Triton X-100, 150 mM NaCl,
15
2mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH=7,5) ile toplanmış ve G22 uçlu bir şırıngadan
20 kez geçirilmiştir. Elde edilen hücre lizatı, 5000 rpm'de 1 dakika santrifüj ile
çöktürülüp süpernatant kısmındaki çözünür proteinler uzaklaştırılmıştır. Bu
aşamadan sonra pellet 1X PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4,
1.47 mM KH2PO4) çözeltisinde çözülmüştür. Opsiyonel olarak çözülen pellet, 5
20
μm'lik filtreden geçirilebilir.
Bu işlem sonrası elde edilen ASC zerre taşıyıcısı ve ASC zerre taşıyıcısını
oluşturan ASC proteinlerine kaynaşık olan mcherry proteinin oluşturduğu
kompozisyon, in vitro ortamda, confocal mikroskobu altında (Şekil 1D), ışık
25
mikroskobu altında (Şekil 1E), ve confocal ve ışık mikroskobu görüntüleri üst
üste geldiğindeki hali (Şekil 1F) gösterilmiştir.
mcherry proteini, hem hücre içerisinde hem de in vitro ortamda, ASC zerre
taşıyıcısının içerisinde ve kaynaşık olarak bulunmaktadır (Şekil 1A,1D).
30
Örnek 2
17
mcherry-ASC kaynaşık proteinini anlatan kaynaşık DNA parçasının üretilmesi.
mCherry-ASC kaynaşık proteinini kodlayan pmCherry-C3.1-ASC plazmidini
kodlamak için, insan ASC genini kodlayan pcDNA3-ASC plazmidinden HindIII5
EcoRI enzimleri ile kesilerek düşürülen parça pmCherry-C3.1 vektörü klonlama
bölgesine aynı enzimler ile kesilip yapıştırılarak mCherry-ASC kaynaşık proteini
oluşturulmuştur. pcDNA3-ASC plazmidi Gabriel Nunez'in (University of
Michigan) hediyesidir.
10
pmCherry-C3.1 plazmidini kodlamak için, pcDNA3 IFP 1.4 plazmidinden
mCherry
genini
kodlayan
(gctagcaccatggtgtctaagggcgaaga)
bölge
ve
NheI_mCherry_F
XhoI_mCherry_R
(ctcgagtttcttgtacagctcgtccat) primerleri ile polimeraz zincir reaksiyonunda (PZR)
çoğaltılmıştır. pEGFP-C3 plazmidindeki EGFP genini kodlayan bölge NheI-XhoI
15
enzimleri ile kesilip düşürülerek yerine PZR ürünü yapıştırılmıştır. pcDNA3 IFP
1.4 plazmidi Tsien Lab'dan (University of San Diego) hediye edilmiştir.
Tercih edilen antijen/biyoaktif molekül mCherry-ASC kaynaşık proteini
örneğindeki gibi ASC proteininin (Dizi ID No. 1) N-terminaline ya da alternatif
20
olarak C-terminaline yahut bu proteininin iç bölgesine klonlanarak kaynaşık
protein oluşturulabilir.
Örnek 3
Antijen ve/veya biyoaktif molekülün ASC zerre taşıyıcılarına farklı yöntemlerle
25
yüklenmesi.
ASC zerre taşıyıcılarına yüklenen FGF2 (fibroblast growth factor 2 ya da
fibroblast büyüme faktörü 2) (Dizi ID No. 10) proteini, ASC zerreleri ile
taşınabilecek biyoaktif moleküllere örnek olarak gösterilmiştir. FGF2 proteini
30
anjiyogenez, embriyo gelişimi ve yara iyileşmesi süreçlerinde rol aldığı bilinen bir
büyüme faktörüdür.
18
Antijen ya da biyoaktif molekülün ASC proteini (Dizi ID No. 1) ile kaynaşık
protein oluşturmadan zerrelere yüklenmek istendiği durumlarda, antijen ve/veya
biyoaktif molekül kodlayan DNA parçasını bulunduran plazmid, ASC geni
5
kodlayan DNA parçasını bulunduran plazmid ile birlikte istenilen hücreye birlikte
transfekte edilir.
Örnek olarak, mCherry-FGF2 kaynaşık proteini kodlayan plazmid, EGFP-ASC
kaynaşık proteini kodlayan plazmid ile birlikte transfekte edilmiştir. mCherry-
10
FGF2 ve EGFP-ASC geni kodlayan 1'er μg plazmid karışımı distile su ile 219
μl'ye tamamlanmıştır. Transfeksiyon işleminin geri kalan kısmı ve hücre
kültüründen ASC zerre ve antijen ve/veya bioaktif molekül içeren buluş konusu
kompozisyonun izolasyonu örnek 1'deki gibi gerçekleştirilmiştir.
15
ASC zerre taşıyıcısı, ASC zerre taşıyıcısını oluşturan ASC proteinlerine kaynaşık
olan mcherry proteini (antijen) ve ASC zerre taşıyıcısının dış kabuğunu kaplayan
EGFP-FGF2
proteinin
(biyoaktif
molekül)
oluşturduğu
buluş
konusu
kompozisyon, HEK 293 FT hücrelerinde, confocal mikroskobu altında (Şekil 2AB), ışık mikroskobu altında (Şekil 2C), confocal ve ışık mikroskobu görüntüleri
20
üst üste geldiğindeki hali (Şekil 2D) gösterilmiştir.
Konfokal mikroskop ile incelenen hücrelerde, mCherry-FGF2 (Dizi ID No. 31)
kaynaşık proteininden oluşan küresel bir kabuğun EGFP-ASC kaynaşık
proteinlerinden oluşan ASC zerre taşıyıcısının dış kabuğunu kapladığı
25
gözlemlenmiştir (Şekil 2).
Buluş konusu kompozisyon, birden fazla çeşitte peptid veya proteini farklı
şekillerde içerebilmektedir. Buluş konusu kompozsiyon, en az bir peptidi veya en
az bir çeşid peptidi ASC zerresinin dış kabuğunda taşır iken, en az bir peptidi
30
veya en az bir çeşit peptidi de ASC zerresinin içerisinde taşıyabilmektedir.
19
mCherry (Dizi ID No. 3), EGFP (Dizi ID No. 2), ASC (Dizi ID No. 1)
proteinlerinden oluşan ASC zerreleri ve FGF2 proteinleri (Dizi ID No. 10)
arasında bir etkileşim şimdiye kadar bildirilmemiştir.
5
Örnek 4
Mcherry-FGF2 ve EGFP-ASC kaynaşık proteinlerini anlatan kaynaşık DNA
parçalarının üretilmesi.
mCherry-FGF2 kaynaşık proteini kodlayan pmCherry-C3-FGF2 (18kDA izoform)
10
plazmidinin klonlanması için FGF2 geninin 18 kDa'luk izoformunun cDNA'sı,
HeLa hücrelerinden izole edilen RNA kullanılarak sentezlenen cDNA
kütüphanesinden
HindIII_Fgf2_F
(ctatAAGCTTatggcagccgggagcatcacc)
ve
EcoRI_Fgf2_R (ATGAATtcagctcttagcagacattggaag) primerleri ile çoğaltılmıştır.
HindIII ve EcoRI enzimleri ile kesilen PZR ürünü, pmCherry-C3.1 vektörüne aynı
15
enzimler ile kesilip yapıştırılarak klonlanmıştır.
EGFP-ASC
kaynaşık
proteinini
kodlayan
pEGFP-C3-ASC
plazmidinin
klonlanması için insan ASC genini kodlayan DNA parçası pcDNA3-ASC
plazmidinden HindIII-EcoRI enzimleri ile kesilmiş ve pEGFP-C3 vektörü
20
klonlama bölgesine aynı enzimler ile kesilip yapıştırılmak sureti ile EGFP-ASC
kaynaşık proteini oluşturulmuştur. pEGFP-C3 vektörü Clontech'ten satın
alınmıştır.
Örnek 5
25
EGFP proteinine bağlı peptidlerin hidrofobik etkileşimlerle ASC-mCherry
zerrelerini kaplaması
Eğer yüklenmek istenen antijen ve/veya biyoaktif molekül örnek 3'teki gibi ASC
zerre taşıyıcısının dış kabuğunu kaplayamıyorsa, hidrofobik özelliği olan bir yapı
30
ile birleştirilir.
20
Örneğin hidrofilik EGFP proteini (EGFP-stop, Dizi ID No. 2), mCherry-ASC ile
birlikte transfekte edildiği durumda EGFP proteini (Dizi ID No. 2) mCherry-ASC
kaynaşık proteinlerinden oluşan ASC zerre taşıyıcısı ile ko-lokalize olmamaktadır
ve ASC zerre taşıyıcısının dış kabuğunu kaplamamaktadır. (Şekil 3 A-C).
5
Buna karşın EGFP proteini (Dizi ID No. 2) hidrofobik özelliğe sahip olan peptid 1
(Dizi ID No. 4) ile kaynaşık protein oluşturup mCherry-ASC ile birlikte transfekte
edildiği durumda mCherry-ASC kaynaşık proteinlerinden oluşan ASC zerre
taşıyıcısı etrafında EGFP-peptid 1 küresel bir kabuk oluşturmaktadır (Şekil 3 D10
F).
EGFP (Dizi ID No. 2) proteini hidrofilik özelliği olan peptid 2 (Dizi ID No. 8) ve
peptid 3 (Dizi ID No. 9) ile kaynaşık protein oluşturduğu durumda ise bu kaynaşık
proteinler mCherry-ASC zerrelerinde bulunmamaktadır (Şekil 3 G-L). Peptid 1
15
(Dizi ID No. 4), peptid 2 (Dizi ID No. 8), peptid 3 (Dizi ID No. 9) peptidleri 26
amino asit uzunluğundadır.
Hidrofobik özelliğe sahip ve ASC zerresinin, hidrofobik özelliği vasıtası ile, dış
kabuğunu kaplayabilen peptid 1'in (Dizi ID No. 4) kısaltılmış versiyonlarının da
20
ASC zerresi ile birlikte buluş konusu kompozsiyonu oluşturup oluşturmadığına
bakılmıştır. Seçilen kısaltılmış peptid dizileri peptid 1’in, 19, 12 ve 8 amino asit
uzunluğundaki kısaltılmış formlarıdır. Bu kısaltılmış peptidlerden, sadece peptid
1_19aa (Dizi ID No. 5) adlı 19 amino asitlik peptid EGFP proteini (Dizi ID No. 2)
ile kaynaşık protein oluşturduğu durumda, mCherry-ASC zerrelerinin etrafında
25
EGFP-Peptid 1_19aa kaynaşık proteini küresel bir kabuk oluşturmaktadır (Şekil 4
A-C). Peptid 1'in daha kısa versiyonları olan peptid 1_12aa (Dizi ID No. 6),
peptid 1_8aa (Dizi ID No. 7) EGFP proteini (Dizi ID No. 2) ile kaynaşık protein
yapıldığı durumda, bu kaynaşık proteinler mCherry-ASC zerrelerinin etrafında
küresel bir kabuk oluşturmamaktadır (Şekil 4 D-I). Bu da, bir proteinin ASC
30
zerrelerine yüklenmesi için gerekli olan hidrofobik peptid uzunluğunun en az 13
amino asit uzunluğunda olması gerektiği anlamına gelmektedir.
21
Yukarıda bahsedilen peptidelere ait hidropati grafikleri verilmiştir (Şekil 5).
Hidropati grafiklerinden ve hesaplanan ortalama hidrofobisite değerlerinden
peptid 1'in (Dizi ID No. 4) ve peptid 1'in kısaltılmış versiyonlarının; peptid 2
5
(Dizi ID No. 8) ve peptid 3'e (Dizi ID No. 9) kıyasla daha hidrofobik yapıda
olduğu gözükmektedir. Aynı uzunluktaki peptid 1 (Dizi ID No. 4), peptid 2 (Dizi
ID No. 8), peptid 3 (Dizi ID No. 9) için hesaplanan elektrik yükleri ile mCherryASC zerrelerine yüklenebilmeleri arasında bir ilişkiye rastlanmamıştır. ASC
proteini (Dizi ID No. 1) yüzeyinin evrimsel açıdan korunmuş hidrofobik amino
10
asitlerce zengin olması ve bu amino asitlerin ASC proteininin (Dizi ID No. 1)
oligomerizasyonu için kritik öneme sahip olduğunu gösterilmiştir (Moriya ve ark.,
2005). Tüm bu bilgiler ışığında EGFP-peptid 1 (Dizi ID No. 7), EGFP-peptid
1_19aa kaynaşık proteinlerinin mCherry-ASC zerrelerine yüklenebilmesinin
sebebi olarak bu peptidlerin hidrofobik yapısı olduğu gösterilmiştir(Tablo 1).
15
Tablo 1: EGFP ile kaynaşık protein yapılan peptidlerin özellikleri
Uzunluk
Peptid 1 (Dizi ID
No. 4)
Peptid 2 (Dizi ID
No. 8)
Peptide 3 (Dizi
ID No. 9)
Peptid 1_19aa
(Dizi ID No. 5)
Peptid 1_12aa
(Dizi ID No. 6)
Peptid 1_8aa
(Dizi ID No. 7)
Ortalama
hidrofobisite
Yük (pH=7)
Zerrelere
yüklenebilme
26
1,98
0
+
26
-1,96
-1,9
-
26
-1,4
-3
-
19
3,22
-1
+
12
2,39
-1
-
8
2,89
-1
-
22
Hidropati grafikleri (Şekil 5) ve Tablo 1'de peptidlerin pH=7 için hesaplanan
elektrik yükleri,
http://www.innovagen.se/custom-peptide-synthesis/peptide-
property-calculator/peptide-property-calculator.asp
yararlanlanılarak hesaplanmıştır.
5
sitesindeki
uygulamadan
Tablo 1'de peptidler için belirtilen ortalama
hidrofobisite
değerleri
http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/HydroCalc/HydroMCalc.html
sitesindeki
uygulamaya göre hesaplanmıştır.
mCherry-ASC ve EGFP-peptid X (X yerine peptid 1 (Dizi ID No. 4), peptid
10
1_19aa (Dizi ID No. 5), peptid 1_12aa (Dizi ID No. 6), peptid 1_8aa (Dizi ID
No. 7), peptid 2 (Dizi ID No. 8), peptid 3 (Dizi ID No. 9), birlikte transfeksiyonu
ve hücre kültüründen zerrelerin izolasyonu örnek 3'teki gibi yapılmıştır.
EGFP-X plazmidlerinin klonlaması şu şekilde yapılmıştır:
15
pEGFP-peptid 1, pEGFP-peptid 2, pEGFP-peptid 3
pEGFP-C3 vektörünün klonlama bölgesinin kodladığı 26 amino asitlik bölgenin
22 amino asitlik kısmı, rastgele seçilen aynı uzunluktaki 3 peptid ile
değiştirilmiştir. Bu peptidler, pcDNA3 vektörü içindeki ampisilin direnci geni
20
içinden arka arkaya seçilen bölgelerdir. Peptid 1 (Dizi ID No. 4) BglII_Amp1_F
(ataagatcttatgagtattcaacatttccgtgtc)
ve
EcoRI_Amp1_R
(tgaattcAaaaaacaggaaggcaaaatgcc) ile, peptid 2 (Dizi ID No. 8) BglII_Amp2_F
(tctagatcttgctcacccagaaacgctggtg)
ve
EcoRI_Amp2_R
(tgaattcAGTAACCCACTCGTGCACCCAAC) ile,
25
peptid 3 (Dizi ID No. 9), BglII_Amp3_F (ataagatcttatcgaactggatctcaacagcg) ve
EcoRI_Amp3_R (tgaattcAcattggaaaacgttcttcgg) ile PZR'da çoğaltılıp pEGFP-C3
vektöründeki BglII-EcoRI enzimleri kesim bölgesi arasına klonlanmıştır.
pEGFP-peptid 1'in kısa versiyonları:
30
Ampisilin direnci geninden klonlanan peptid 1'in 15, 8 ve 4 amino asitlik kısa
versiyonları sipariş edilen oligonükleotidlerin pEGFP-C3 vektöründeki BglII-
23
EcoRI bölgesine yapıştırılması sureti ile klonlanmıştır (15, 8 ve 4 amino asitlik
peptidler, baş kısımlarındaki YSDL dizisi ile birlikte 19, 12 ve 8 amino asitlik
peptidler oluşturmaktadır). pEGFP-peptid 1-19aa (Dizi ID No. 5) klonlaması için
5
amp1_19aa_F
(gatcttgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgttttttg)
ve
amp1_19aa_R
(aattcaaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacaa),
pEGFP-peptid 1-12aa (Dizi ID No. 6) klonlaması için amp1_12aa_F
(gatcttgcggcattttgccttcctgttttttg)
ve
amp1_12aa_R
(aattcaaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaa),
klonlaması için amp1_8aa_F
pEGFP-peptid 1-8aa (Dizi ID No. 7),
10
(gatcttcttcctgttttttg) ve amp1_8aa_R (aattcaaaaaacaggaagaa), 95 °C sıcaklıkta 5
dakika denatüre edildekten sonra 1 saatlik süre zarfında yavaşça oda sıcaklığına
kadar soğutulmuştur. Bu şekilde birbirine koplement dizilerinden yapışan
oligonükleotidler, pEGFP-C3 vektöründeki BglII ve EcoRI bölgeleri arasına
klonlanmıştır.
15
Tercih edilen antijen/biyoaktif molekül EGFP-peptid 1 (Dizi ID No. 7) kaynaşık
proteini örneğindeki gibi peptid 1 (Dizi ID No. 4), peptid1_19aa (Dizi ID No. 5),
ya da ASC zerrelerine yüklenmeyi sağlayan başka bir peptide N-terminalinden ya
20
da alternatif olarak C-terminalinden klonlanarak kaynaşık protein oluşturulabilir.
Örnek 6
Kararlı bir şekilde EGFP-ASC anlatan THP-1 hücrelerinin proenflamatuvar
uyarıcılar ile inkübasyonu.
25
Antijen ve/veya biyoaktif moleküller ASC proteini (Dizi ID No. 1) ile kaynaşık
bir protein oluşturup proenflamatuvar uyarılar ile uyarılmaya müsait bir hücre
hattında kararlı bir şekilde anlatılması, sonra da proenflamatuvar uyarıcılar ile bu
hücrelerin uyarılarak antijen ve/veya biyoaktif moleküllerle ve antijen ve/veya
30
biyoaktif
moleküllerle
yüklenen
ASC
zerrelerini
kompozisyonu oluşturmaları sağlanabilmektedir.
24
içeren
buluş
konusu
Kararlı
hücre
hattının
oluşturulması
için
THP-1
hücrelerine
lentiviral
transdüksiyon metodu uygulanmıştır. Lentivirüs üretmek için EGFP-ASC
kaynaşık proteinini kodlayan lentiviral pLenti-Ef1a-EGFP-ASC plazmidi,
5
yardımcı plazmidlerle (pCMVdeltaR8.74 ve pMD2.G) birlikte HEK 293 FT hücre
hattına kalsiyum-fosfat metodu kullanılarak transfekte edilmiştir (Her 3
plazmidden 4'er μg DNA 100 mm'lik tabağa ekilen 5 milyon hücreye transfekte
edildi). Transfeksiyondan 2 gün sonra, lentivirüsleri içeren hücre kültürü
süpernatantı 0.45 μm'lik filtreden geçirildi ve polibren ile karıştırıldı (son
10
konsantrasyon: 4 μg/ml). Lentivirüs içeren süpernatant daha sonra THP-1
hücreleri üzerine ilave edildi ve 5 saat inkübe edildi. Inkübasyonun sonunda hücre
medyumu değiştirildi ve 5 günlük süre zarfında ASC-EGFP kaynaşık proteinini
anlatan hücrelerin oranında artış gözlemlendi. 5. günün sonunda hücreler her
kuyucuğa tek hücre düşecek şekilde 96-kuyucuklu tabaklara dağıtıldı ve tek bir
15
hücreden kararlı hücre hattı kolonisi oluşturuldu.
Kararlı halde EGFP-ASC kaynaşık proteinini anlatan THP-1 monosit hücre hattı,
0.5 μM PMA ile 3 saat inkübe edilerek makrofaj karakteristiği kazandırıldı. Bu
şekilde farklılaştırılan hücreler 150 μg/ml MSU ile 8 saat inkübe edilerek NLRP3
20
enflamazomu aktive edildi ve hücrerlerin EGFP-ASC zerreleri ürettikleri
görüldü.ASC zerrelerinin hücre kültüründen saflaştırılması işleminin geri kalan
kısmı örnek 1'deki gibi yapılmıştır.
EGFP-ASC kaynaşık proteini ile THP-1 monosit hücre hattına lentiviral
25
transdüksiyon yapılması için EGFP-ASC'ı kodlayan DNA parçası pEGFP-C3ASC plazmidinden NheI-NotI enzimleri ile kesilerek pLenti-Ef1a vektörüne aynı
enzimlerle kesilip yapıştırılarak klonlanmıştır. pLenti-Ef1a vektörü omurgası,
pLenti-EF1a-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE plazmidinden alınmıştır. pLentiEF1a-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE plazmidi ve lentiviral paketleme vektörleri
30
pCMVdeltaR8.74 ile pMD2.G Deisseroth Lab'ından (Stanford University) hediye
edilmiştir.
25
Kararlı bir şekilde EGFP-ASC (Dizi ID No:3) anlatan THP-1 hücrelerinde
proenflamatuvar bir uyarı (MSU gibi) olmadığı durumda kompozisyonu
5
oluşturacak olan EGFP-ASC kaynaşık proteinleri sitoplazmada dağınık bir şekilde
bulunmaktadır. Hücreler, 150ug/ml MSU ile 8 saat inkübe edildiği durumda
EGFP-ASC speckleri oluşmaktadır.
Tercih edilen antijen/biyoaktif molekül EGFP-ASC kaynaşık proteini örneğindeki
10
gibi ASC proteininin (Dizi ID No. 1) N-terminaline ya da alternatif olarak Cterminaline yahut bu proteininin iç bölgesine klonlanarak kaynaşık protein
oluşturulabilir.
Örnek 7
15
Buluş konusu kompozisyonun in vitro ortamda eldesi.
Antijen veya biyoaktif molekül olan peptidi üreten gen ile ASC geni, kaynaşık
şekilde proteini bakteriyel bir gen anlatım sisteminde üretilebilirler. Bunun yanı
sıra, antijen/biyoaktif molekül ve ASC proteinleri bakteriyel bir gen anlatım
20
sisteminde ayrı ayrı (kaynaşık şekilde olmayan) da üretilebilirler. Saflaştırılan
kaynaşık proteinler veya ayrı ayrı üretilen proteinler, sonrasında <50mM KCl
konsantrasyonuna sahip bir çözeltide 37 °C 'de inkübasyonla in vitro koşullarda
buluş konusu kompozisyonu oluşturmaktadır.
25
Örnek olarak; 6X histidine-EGFP-ASC kaynaşık proteinini pETM-20 vektör
omurgasına klonlanmış ve plazmid Rosetta2 pLysS bakteri suşuna transforme
edilmiştir. pET sistemi ile kontrol edilen gen anlatımı 0.4 mM IPTG ile gece boyu
15 °C'de indüklenmiştir. Bakteri suşu, terrific broth (12 g tripton, 24 g maya
ekstraktı, 4ml gliserol, 0.017M KH2PO4, 0.072M K2HPO4, su ile 1 litreye
30
tamamlanır) içinde büyütülmüştür. Protein saflaştırması tekniğin bilinen
durumundaki (Alba, 2007) gibi yapılmıştır. 8000 rpm'de 15 dakika boyunca
26
çöktürülen bakteri pelleti, 20 mM Tris pH 8, 500 mM NaCl, 5 mM imidazol and 5
M guanidinium hidroklorit içeren solusyonda çözülmüş ve sonike edilmiştir.
Hücre kalıntıları 13000 rpm'de 45 dakika boyunca çöktürülmüş ve süpernatant
His-saflaştırma kolonundan geçirimiştir (Pierce). Yıkama işlemi 20 mM, elusyon
5
ise 200 mM imidazol içeren solusyonla yapılmıştır. Elusyonun pH derecesi 4'e
düşürülmüş ve pH=4'teki suya karşı diyaliz edilmiştir.
In vitro zerre sentezi tekniğin bilinen durumunda (Fernandes-Alnemri ve ark.,
2007) anlatıldığı gibi yapılmıştır. Diyaliz edilen saflaştırılmış 10 ng/μl EGFP-
10
ASC proteini 30mM Tris-HCl pH=7.5 içeren solusyonda 37 °C'de 1 saat inkübe
edilmiştir.
pETM20-6X His-EGFP-ASC plazmidini klonlamak için 6X histidine-EGFP-ASC
kaynaşık proteinini kodlayan parça pEGFP-C3-ASC plazmidinden NcoI-NotI
15
enzimleri ile kesilmiş ve aynı bölgelerden 6X His içeren pETM20 vektörüne
klonlanmıştır.
Tercih edilen antijen/biyoaktif molekül 6X histidine-EGFP-ASC kaynaşık
proteini örneğindeki gibi ASC proteininin (Dizi ID No. 1) N-terminaline ya da
20
alternatif olarak C-terminaline yahut bu proteininin iç bölgesine klonlanarak
kaynaşık protein oluşturulabilir.
Örnek 8
25
Antijen/biyoaktif moleküller ile kaynaşık protein oluşturulan ASC proteini (Dizi
ID No. 1) bakteride anlatıldığı zaman kaynaşık proteinler inklüzyon cisimlerinde
kalmaktadır. Bu örnekte anlatılan yöntemle inklüzyon cisimlerinden ASC
proteinlerinin (Dizi ID No. 1) oluşturduğu mikropartiküler agragatlar ya da in
30
vitro ASC zerreleri yapılabilmektedir.
27
6X histidine-EGFP-ASC kaynaşık proteinini pETM-20 vektör omurgasına
klonlanmış ve plazmid Rosetta2 pLysS bakteri suşuna transforme edilmiştir. pET
sistemi ile kontrol edilen gen anlatımı 0.4 mM IPTG ile gece boyu 15 °C'de
indüklenmiştir. Bakteri suşu, terrific broth (12 g tripton, 24 g maya ekstraktı, 4ml
5
gliserol, 0.017M KH2PO4, 0.072M K2HPO4) içinde büyütülmüştür. 30 ml
bakteri 8000 rpm'de 15 dakikada çöktürülür. Bakteri pelleti 10 ml Triton X-100
çözeltisinde (%1 Triton X-100, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 20 mM Tris-HCl
pH=7,5) çözülür ve 30 °C'de 15 dakika inkübe edilir. Inkübasyon sırasında
Rosetta2 pLysS suşunda bulunan T7 lizozim enzimi bakteri hücre duvarını
10
sindirir. Bakteri pelleti daha sonra sonike edilir ve 14000 rpm'de 15 dakika
çöktürülür. Süpernatant kısım büyük oranda bakteriyel çözünür proteinleri
içermektedir ve bu kısım atılır. Daha sonra pellet %1 SDS içeren PBS çözeltisi
içinde çözülür ve tekrar 14000 rpm'de 15 dakika çöktürülür. Bu sefer süpernatant
büyük oranda inklüzyon cisiminden çıkan 6X histidine-EGFP-ASC kaynaşık
15
proteinini içermektedir. 1 hacim süpernatant 4 hacim aseton ile karıştırılarak
proteinler çöktürülür, SDS ise aseton tarafından süpernatantta tutulur. 14000
rpm'de 1 dakika çöktürülen karışımın süpernatant kısmı dökülür. Protein pelleti 2
kez daha 4 hacim asetonla yıkanır. Pelletin üstüne 1 hacim PBS ilave edilir ve
pellet sonike edilir. Inklüzyon cisimlerinden çıkardığımız ASC kaynaşık
20
proteinlerinden in vitro koşullarda zerre ürettiğimiz bu yönteme Triton X100/SDS/Aseton (TSA) yöntemi adını vermekteyiz.
Bu şekilde 6X histidine-EGFP-ASC kaynaşık proteinlerinden TSA yöntemi ile
oluşturulan preparat konfokal mikroskopta incelendiğinde mikro boyutlarda zerre
25
yapıları oluştuğu görülmektedir (Şekil 8A). TSA yöntemi ile elde edilen tipik bir
preparatın saflığı, SDS-PAGE jelinde yürütülen örneğin Coomassie boyaması
yapılması ile gösterilmiştir (Şekil 8B).
Tercih edilen antijen/biyoaktif molekül 6X histidine-EGFP-ASC kaynaşık
30
proteini örneğindeki gibi ASC proteininin (Dizi ID No. 1) N-terminaline ya da
28
alternatif olarak C-terminaline yahut bu proteininin iç bölgesine klonlanarak
kaynaşık protein oluşturulabilir.
Örnek 9
5
ASC zerre taşıyıcısının, diğer ASC homologları ile oluşturulması.
ASC geninin zebrabalığı homoloğu (Dizi ID No. 11), antijen/biyoaktif molekül ile
kaynaşık protein oluşturulur. Örnek olarak, EGFP-zASC kaynaşık proteinini
kodlayan plazmid HEK 293 FT hücrelerine örnek 1'deki gibi transfekte edilir.
10
Transfeksiyon ve hücre kültüründen ASC zerreleri saflaştırılması örnek 1'deki
gibi yapılır.
EGFP-zASC kaynaşık proteini kodlayan plazmidi oluşturmak için, 9 günlük
zebrabalığı embriyolarından izole edilen RNA kullanılarak sentezlenen cDNA
15
kütüphanesinden
SacI_zAsc_F
(ATAGAGCTCATGGCGGAATCTTTCAAGGAG)
ve
EcoRI_zAsc_R
(AgaattcTactgagcatcctcaaggtc) primerleri ile çoğaltılan ASC geninin zebrabalığı
homoloğu (zASC), pEGFP-C3 plazmidine SacI-EcoRI bölgelerinden kesilip
yapıştırılarak klonlanmıştır. Zebrabalığı cDNAsı Xalid Bayramlı'nın (Boğaziçi
20
Üniversitesi) hediyesidir.
Tercih
edilen
antijen/biyoaktif
molekül
örneğindeki gibi zASC proteininin
EGFP-zASC
kaynaşık
proteini
(Dizi ID No. 11) N-terminaline ya da
alternatif olarak C-terminaline yahut bu proteininin iç bölgesine klonlanarak
25
kaynaşık protein oluşturulabilir.
Örnek 10
zASC proteininden oluşan ASC zerre taşıyıcısı ve antijen/biyoaktif molekülden
oluşan buluş konusu kompozisyonun eldesi.
30
29
Zebrabalığı ASC proteininin (Dizi ID No. 11) oluşturduğu zerre taşıyıcısına
hidrofobik etkileşimler ile antijen/biyoaktif molekül yüklenmesine örnek olarak,
EGFP-zASC kaynaşık proteinini ve mCherry-C3.1 kaynaşık proteinlerini
kodlayan plazmidler, HEK 293 FT hücrelerine birlikte transfekte edilir. C3.1
5
peptidi (Dizi ID No. 13), içinde 7 amino asitlik hidrofobik bir bölge (ILQSTVP)
barındıran bir peptittir. Birlikte transfeksiyon ve hücre kültüründen ASC zerreleri
saflaştırılması örnek 3'teki gibi yapılır. Birlikte transfeksiyon sonucu EGFP-zASC
zerrelerinin etrafında mCherry-C3.1'ün bir dış kabuk oluşturduğu görülmüştür..
10
Örnek 11
THP-1 hücrelerinin yuttuğu buluş konusu kompozisyonun, hücre içinde membran
kaplı olması ve hücre içi yavaş yıkımı.
mCherry-ASC kaynaşık proteininin HEK 293 FT hücrelerinde örnek 1'deki gibi
15
yüksek miktarda anlatımı ile mCherry-ASC zerreleri oluşmaktadır. Hücre
kültüründe üretilen mCherry-ASC zerrelerinin örnek 1'deki gibi saflaştırılması
sonucu 2-8 mikrometre çapında zerreler elde edilmektedir. Phorbol 12-myristate
13-acetate (PMA) ile makrofaj hücresi karakteristiği kazandırılan ve EGFP-ASC
proteinini kalıcı bir şekilde anlatan THP-1 hücreleri, mCherry-ASC zerreleri ile
20
inkübe edilmiştir. 2 saatlik inkübasyon sonrası, kararlı bir şekilde sitoplazmasında
düşük konsantrasyonda, dağınık bir dağılımda EGFP-ASC bulunduran THP-1
hücrelerinin ASC-mCherry zerrelerini yuttuğu gözlemlenmiştir (Şekil 6, t=0 s).
Konfokal mikroskop ile incelenen hücrelerde, hücrelerin kalıcı olarak anlattığı
EGFP-ASC ile yutulan mCherry-ASC zerrelerinden gelen sinyallerinin üst üste
25
gelmediği gözlemlenmiştir. EGFP-ASC ve mCherry-ASC proteinlerini yüksek
miktarda anlatan hücrelerde ise bu iki kaynaşık proteinin aynı zerre içinde üst üste
geldiği bilinmektedir. mCherry-ASC zerrelerini yutan ve EGFP-ASC proteinini
kararlı bir şekilde anlatan hücrelerdeki ko-lokalizasyon eksikliği, yutulan
mCherry-ASC zerrelerinin membranla kaplı bir organelde bulunduğunu
30
göstermektedir. Membranla kaplı bu organel, fagolizozomdur.
30
Yutulan mCherry-ASC zerrelerinin membranla kaplı olduğunu gösteren bir diğer
kanıt da, THP-1 hücrelerinin apoptoza uğramasına sebep olan koşullarda uzun
süreli inkübasyonu sırasında elde edilmektedir. Fizyolojik koşullar altında yutulan
mCherry-ASC zerreleri sıkı bir şekilde membranla kaplıdır ve bu koşullarda
5
membranı ayırt etmek mümkün değildir. PMA ile farklılaştırılan THP-1 hücreleri
ortam koşullarının kontrol edilmediği durumda uzun süreli inkübasyonu sırasında
plazma membranı bütünlüğü kaybolmaktadır (membrane blebbing). Hücreleri
kademeli olarak apoptoza götürmek için THP-1 hücreleri lam-lamel arasına konan
PBS'te >30 dakika boyunca görüntülenmiştir.
10
Plazma membranının deformasyonuna eş zamanlı olarak, fagolizozom membranı
da deforme olmakta ve genişlemektedir. Böylece fagolizozom içinde yutulan ASC
zerrelerini saran membran görünür olmaktadır. Ayrıca, fagolizozom içinde fakat
küresel zerre yapısının dışında kalan boşluk ASC zerrelerinden kopan mCherry15
ASC ile dolduğu açık bir şekilde görülmektedir (Şekil 11, t=600 s ile t=1100 s
arası). mCherry-ASC zerre taşıyıcısı, fagolizomun içinde katı, küresel yapı olarak
ışık mikroskobu görüntüsünde net bir şekilde seçilmektedir. Fagolizozom
organelinden gelen mCherry-ASC sinyalinin ezici çoğunluğu bu yapıdan
gelmektedir. Şekil-11'da, fagolizozom içinde fakat küresel zerre yapısının dışında
20
kalan boşluktaki mCherry-ASC sinyalini gösterebilmek adına küresel zerre
yapısındaki sinyal sature olmuştur, bu yüzden iki bölge arasındaki sinyal farkı net
gözükmemektedir.
Yine
de,
fagolizozom
içindeki
mCherry-ASC
zerre
taşıyıcısından gelen sinyalinin yoğunluğunun fagolizozom içindeki dağınık
mCherry-ASC sinyaline göre kat kat fazla olması; fagolizozom içinde kontrollü,
25
yavaş bir yıkım olduğunu göstermektedir. Ayrıca hücrelerin konfokal mikroskop
altında incelendiği süre zarfında mCherry-ASC zerrelerinin tamamen yok
olmasının hiç rastlanmamış olması ve mCherry-ASC zerrelerinin 37 °C'deki en az
30 gün süren kararlılığı , fagolizozom içindeki kontrollü yıkımın saatler hatta
günler süren bir süre zarfında gerçekleşebileceğini işaret etmektedir.
30
31
THP-1 hücrelerinin apoptoza uğraması, yutulan ASC zerreleri sebebi ile değil,
hücre kültürü için uygun olmayan koşullarda uzun süreli inkübasyon sebebi ile
olmaktadır. mCherry-ASC zerreleri ile farklı süreler inkübe edilen THP-1
hücreleri görüntülenmeye başlandıktan sonraki ilk 5-10 dakika içinde membran
5
bütünlüklerini korurken 20. dakikaya doğru hücre ölümü gözlemlenmektedir.
Ayrıca, bu zaman diliminde hücre kültürü ortamını koruyan büyüme odalarında
hücreler gözlemlendiğinde membran bütünlükleri korunabilmektedir.
Örnek 12
10
Buluş konusu kompozisyonu içeren fagolizozomdan, vesiküllerin kopuşu.
mCherry-ASC zerrelerini yutan kararlı THP-1 EGFP-ASC anlatan hücreler bu
sefer hücre kültürü ortamını muhafaza eden büyüme odalarında konfokal
mikroskop ile hızlandırılmış çekimde incelendiğinde, mCherry-ASC zerrelerinin
15
hücre içinde küresel yapılarını korurken mCherry-ASC içeren vesiküllerin
fagolizozomdan kopuşu gözlemlenmiştir (Şekil 7). Yutulan zerrelerinin tamamen
yıkımı için gerekli zamam bilinmemektedir. Yine de bu bulgu, fagolizozom içinde
kontrollü bir şekilde yıkılan ve ASC zerre taşıyıcısı ile taşınan antijenlerin
fagolizozom organelinden vesiküller aracılığı ile ayrılarak antijen sunum yolağına
20
dahil olabileceğini göstermektedir. Antijen sunumu yolağına dahil olabilmek için
bu tür vesiküllerin MHC sınıf II molekülü içeren vesiküllerle birleşerek plazma
mebranına ulaşması gerekmektedir.
Ayrıca, fagolizozomdan kopan mCherry-ASC taşıyan vesiküller, sitoplazmik
25
EGFP-ASC ile üst üste gelmemektedir. Bu da, fagolizozomdan kopan parçaların
membranla kaplı vesiküller olduğuna yönünde bir kanıttır.
THP-1 makrofaj hücrelerinin hızlandırılmış görüntüleme boyunca canlılıklarını
koruması için ev yapımı bir büyüme odası kullanıldı. 60 mm'lik tabaklara agaroz
30
jel döküldü ve lam boyutunda bir parça agaroz jelden kesilerek çıkarıldı. Agaroz
jel görüntülemeden önce 37 °C'ye ısıtıldı ve kesilen boşluk 37 °C'deki hücre
32
kültürü medyumu ile dolduruldu. THP-1 hücresi ekilmiş lam, ters çevrilerek
ısıtılan büyüme odası üzerine konuldu ve konfokal mikroskopta görüntüleme
yapıldı. Bu şekilde THP-1 hücrelerinin en az 30 dakika kadar hücre
membranlarının kararlı kaldığı gözlemlenmiştir.
5
Örnek 13
Buluş konusu kompozisyonun 37°C sıcaklıkta uzun süreli inkübasyona
10
dayanıklılığı.
Antijen veya biyoaktif molekülün kaynaşık olarak veya hidrofobik etkileşimler ile
ASC zerre taşıyıcısına yüklenmesi ile oluşan kompoziyon hücre dışında,
fizyolojik sıcaklıkta (37 °C) kararlılığını ölçmek için mCherry-ASC kodlayan
plazmid, tek başına ya da EGFP-C3 kodlayan plazmid ile birlikte HEK 293 FT
15
hücrelerine transfekte edilmiştir.
Örnek olarak, ASC zerreleri hücre kültüründen örnek 1'deki gibi saflaştırılmıştır
ve PBS çözeltisi içinde 30 gün boyunca 37 °C'de bekletilmiştir. 30. günün
sonunda mCherry-ASC zerrelerinin küresel zerre yapılarını korudukları ve EGFP-
20
C3'ün mCherry-ASC zerreleri etrafında oluşturduğu küresel kabuk yapısının
koruduğu gözlemlenmiştir (Şekil 8).
Örnek 14
Buluş konusu kompozisyonun erime-dondurma döngüsüne dayanıklılığı.
25
Örnek 1'deki ve Örnek 4’deki gibi üretilen ve saflaştırılan
buluş konusu
kompozisyonlar, arka arkaya 8 eritme-dondurma döngüsüne tabi tutulmuştur (-80
°C 'den +37 °C'ye). Birim alana düşen eritilip dondurulmuş kompozisyonlar
konfokal mikroskopi ile incelenmiş ve sayılmıştır. İlk ve son eritme dondurma
döngüleri arasında anlamlı bir fark tespit edilememiştir. Örnek olarak mcherry30
ASC zerrelerinden oluşan kaynaşık kompozisyon gösterilmiştir. (Şekil 9).
33
Tarifnamede atıfta bulunulan referanslar aşağıda belirtilmiştir.
Referanslar
5
10
Balmayor ER, Azevedo HS, Reis RL. (2011) Controlled delivery systems from
pharmaceuticals to cells and genes. Pharm Res. 28(6):1241-58.
De Alba E(2007) 1H, 15N and 13C backbone and side chain chemical shifts of
human ASC (apoptosis-associated zerre-like protein containing a CARD domain).
Biomol NMR Assign. 1(1):135-7
De Temmerman ML, Rejman J, Demeester J, Irvine DJ, Gander B, De Smedt SC.
(2011) Particulate vaccines on the quest for optimal delivery and immune
response. Drug Discov Today. 16(13-14):569-82.
15
Fernandes-Alnemri T, Wu J, Yu JW, Datta P, Miller B, Jankowski W, Rosenberg
S, Zhang J, Alnemri ES. (2007) The pyroptosome: a supramolecular assembly of
ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation.
Cell Death Differ. 14(9):1590-604.
20
Gross O, Thomas CJ, Guarda G, Tschopp J. (2011) The inﬂammasome: an
integrated view Immunol Rev. 243(1):136-51.
25
Leemans JC, Cassel SL, Sutterwala FS. (2011) Sensing damage by the NLRP3
inflammasome Immunol Rev. 243(1):152-62.
30
Masumoto J, Zhou W, Chen FF, Su F, Kuwada JY, Hidaka E, Katsuyama
T, Sagara J, Taniguchi S, Ngo-Hazelett P, Postlethwait JH, Núñez G, Inohara N.
(2003) Caspy, a Zebrafish Caspase, Activated by ASC Oligomerization Is
Required for Pharyngeal Arch Development J Biol Chem. 7;278(6):4268-76.
Miao EA, Rajan JV, Aderem A. (2011) Caspase-1-induced pyroptotic cell death.
Immunol Rev. 243(1):206-14.
35
40
Moriya M, Taniguchi S, Wu P, Liepinsh E, Otting G, Sagara J. (2005) Role of
Charged and Hydrophobic Residues in the Oligomerization of the PYRIN Domain
of ASC Biochemistry. 18;44(2):575-83.
Xiang SD, Scholzen A, Minigo G, David C, Apostolopoulos V, Mottram PL,
Plebanski M. (2006) Pathogen recognition and development of particulate
vaccines: Does size matter? Methods. 40(1):1-9.
45
34
Dizi Listesi
<160> Dizi ID No toplam sayısı: 13
<210> Dizi ID No. 1
5
<211> Uzunluk: 196
<212> Tür: PRT
<213> Organizma: Homo Sapiens
<400> Dizi : 1
10
Met Gly Arg Ala Arg Asp Ala Ile Leu Asp Ala Leu Glu Asn Leu Thr
1
5
10
15
Ala Glu Glu Leu Lys Lys Phe Lys Leu Lys Leu Leu Ser Val Pro Leu
20
15
25
30
Arg Glu Gly Tyr Gly Arg Ile Pro Arg Gly Ala Leu Leu Ser Met Asp
35
40
45
Ala Leu Asp Leu Thr Asp Lys Leu Val Ser Phe Tyr Leu Glu Thr Tyr
50
55
60
Gly Ala Glu Leu Thr Ala Asn Val Leu Arg Asp Met Gly Leu Gln Glu
20
65
70
75
80
Met Ala Gly Gln Leu Gln Ala Ala Thr His Gln Gly Ser Gly Ala Ala
85
90
95
Pro Ala Gly Ile Gln Ala Pro Pro Gln Ser Ala Ala Lys Pro Gly Leu His
100
25
105
110
Phe Ile Asp Gln His Arg Ala Ala Leu Ile Ala Arg Val Thr Asn Val Glu
115
120
125
Trp Leu Leu Asp Ala Leu Tyr Gly Lys Val Leu Thr Asp Glu Gln Tyr
130
135
140
Gln Ala Val Arg Ala Glu Pro Thr Asn Pro Ser Lys Met Arg Lys Leu
30
145
150
155
160
Phe Ser Phe Thr Pro Ala Trp Asn Trp Thr Cys Lys Asp Leu Leu Leu
165
170
175
Gln AlaLeu Arg Glu Ser Gln Ser Tyr Leu Val Glu Asp Leu Glu Arg Ser
180
185
190
35
35
<210> Dizi ID No.2
<211> Uzunluk: 240
<212> Tür: PRT
<213> Organizma: Aequorea victoria
5
<400> Dizi : 2
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1
10
5
10
15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20
25
30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35
40
45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
15
50
55
60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65
70
75
80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85
20
90
95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100
105
110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115
120
125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
25
130
135
140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145
150
155
160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn I le Glu Asp Gly Ser
165
30
170
175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180
185
190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195
200
205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
35
210
215
220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225
230
235
36
<210> Dizi ID No.3
<211> Uzunluk: 236
5
<212> Tür: PRT
<400> Dizi : 3
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe
1
10
5
10
15
Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe
20
25
30
Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr
35
40
45
Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp
15
50
55
60
Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His
65
70
75
80
Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe
85
20
90
95
Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val
100
105
110
Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys
115
120
125
Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys
25
130
135
140
Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly
145
150
155
160
Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly
165
30
170
175
His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val
180
185
190
Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser
195
200
205
His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly
35
210
215
220
Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225
230
235
37
<210> Dizi ID No.4
<211> Uzunluk: 26
<212> Tür: PRT
5
<213> Organizma: Artifical Sequence
<400> Dizi : 4
Tyr Ser Asp Leu Met Ser Ile Gln His Phe Arg Val Ala Leu Ile Pro
10
1
5
10
15
Phe Phe Ala Ala Phe Cys Leu Pro Val Phe
20
25
<210> Dizi ID No.5
15
<211> Uzunluk: 19
<212> Tür: PRT
<213> Organizma: Artifical Sequence
<400> Dizi : 5
20
Tyr Ser Asp Leu Val Ala Leu Ile Pro Phe Phe Ala Ala Phe Cys Leu
1
5
10
15
Pro Val Phe
<210> Dizi ID No.6
25
<211> Uzunluk: 12
<212> Tür: PRT
<213> Organizma: Artifical Sequence
<400> Dizi : 6
30
Tyr Ser Asp Leu Ala Ala Phe Cys Leu Pro Val Phe
1
5
10
<210> Dizi ID No.7
35
<211> Uzunluk: 8
<212> Tür: PRT
<213> Organizma: Artifical Sequence
38
<400> Dizi : 7
Tyr Ser Asp Leu Leu Pro Val Phe
5
1
5
<210> Dizi ID No.8
<211> Uzunluk: 26
<212> Tür: PRT
10
<213> Organizma: Artifical Sequence
<400> Dizi : 8
Tyr Ser Asp Leu Ala His Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys Asp Ala
15
1
5
10
15
Glu Asp Gln Leu Gly Ala Arg Val Gly Tyr
20
25
<210> Dizi ID No.9
20
<211> Uzunluk: 26
<212> Tür: PRT
<213> Organizma: Artifical Sequence
<400> Dizi : 9
25
Tyr Ser Asp Leu Ile Glu Leu Asp Leu Asn Ser Gly Lys Ile Leu Glu
1
5
10
15
Ser Phe Arg Pro Glu Glu Arg Phe Pro Met
20
25
30
<210> Dizi ID No.10
<211> Uzunluk: 155
<212> Tür: PRT
35
<400> Dizi : 10
39
Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly
1
5
10
15
5
Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu
20
25
30
Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg
35
40
45
Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu
50
55
60
10
Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn
65
70
75
80
Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys
85
90
95
Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr
100
105
110
15
Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys
115
120
125
Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys
130
135
140
20
Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser
145
150
155
<210> Dizi ID No.11
<211> Uzunluk: 203
25
<212> Tür: PRT
<213> Organizma: Danio Rerio
<400> Dizi : 11
30
Met Ala Glu Ser Phe Lys Glu His Leu Gln Glu Ala Phe Glu Asp Leu
1
5
10
15
Gly Ala Asp Asn Leu Arg Lys Phe Lys Ser Lys Leu Gly Asp Arg Arg
20
25
30
Gln Glu Pro Arg Val Thr Lys Ser Ala Ile Glu Lys Leu Lys Asp Glu
35
35
40
45
Ile Asp Leu Ala Asp Leu Met Val Gly Val Phe Thr Ser Lys Asp Ala
50
55
60
Val Ser Val Thr Val Glu Ile Leu Arg Ala Ile Lys Cys Ile Ala Val
65
40
70
75
80
Ala Asp Asp Leu Leu Arg Asn Thr Gly Gln Ser Glu Ser Lys Gly Ala
85
90
95
40
Pro Ser Asp Glu Ser Lys Cys Ala Ser Ser Lys Ala Val Ser Lys Val
100
105
110
Ala Phe Ser Lys Val Asn Phe Ile Asp Glu His Trp Lys Glu Leu Ile
115
5
120
125
Asp Arg Val Asn Asn Val Asp Pro Ile Leu Asp Ile Leu Arg Gln Lys
130
135
140
Lys Val Ile Thr Asn Glu Asp Tyr Cys Thr Ile Arg Asn Lys Glu Thr
145
150
155
160
Pro Gln Lys Lys Met Arg Glu Leu Leu Thr Gly Pro Ile Thr Cys Ala
10
165
170
175
Gly Asn Lys Gly Lys Glu Val Leu Tyr Asp Ala Leu Arg Glu Ser Asn
180
185
190
Lys Phe Leu Met Asp Asp Leu Glu Asp Ala Gln
195
200
15
<210> Dizi ID No.12
<211> Uzunluk: 26
<212> Tür: PRT
<213> Organizma: Artifical Sequence
20
<400> Dizi :12
Tyr Ser Asp Leu Glu Leu Lys Leu Arg Ile Leu Gln Ser Thr Val Pro
1
5
10
15
Arg Ala Arg Asp Pro Pro Asp Leu Asp Asn
25
20
25
<210> Dizi ID No.13
<211> Uzunluk: 24
<212> Tür: PRT
30
<213> Organizma: Artifical Sequence
<400> Dizi : 13
Lys Leu Glu Leu Lys Leu Arg Ile Leu Gln Ser Thr Val Pro Arg Ala
35
1
5
10
15
Arg Asp Pro Pro Asp Leu Asp Asn
20
41
İSTEMLER
1. Antijen ve/veya biyoaktif molekülün antijen sunan hücrelere gönderim
sisteminde görevli,
5
 ASC proteinlerinin bir araya gelerek oluşturdukları en az bir ASC zerre
taşıyıcısı içeren,
 ASC zerre taşıyıcısı tarafından taşınan antijen veya biyoaktif molekül olan
en az bir peptid ile karakterize edilen bir kompozisyon.
10
2. Vücuda girdikleri zaman antikor oluşumunu tetikleyen peptid, protein ve
karbonhidratı taklit eden peptidden oluşan gruptan en az biri veya bu grupta yer
alan en az iki üyenin bir karışımı olan antijen ile karakterize edilen İstem 1’deki
gibi bir kompozisyon.
15
3. İlaç, pestisit, enzim, büyüme faktörü, hormon ve vitaminden oluşan gruptan en
az biri veya bu grupta yer alan en az iki üyenin bir karışımı olan biyoaktif molekül
ile karakterize edilen İstem 1’deki gibi bir kompozisyon.
4. En az bir çeşit antijen ve/veya en az bir çeşit biyoaktif molekül taşıyan ASC
20
zerre taşıyıcısı ile karakterize edilen yukarıdaki istemlerden herhangi birindeki
gibi bir kompozisyon.
5. Antijen veya biyoaktif molekül olan peptidi, asidik ortamda salan ASC zerre
taşıyıcısı ile karakterize edilen yukarıdaki istemlerden herhangi birindeki gibi bir
25
kompozisyon.
6. Hidroliz veya enzimler tarafından biyoçözünebilen ASC zerre taşıyıcısı ile
karakterize edilen
yukarıdaki istemlerden herhangi birindeki gibi bir
kompozisyon.
30
42
7. ASC zerre taşıyıcısını oluşturan en az bir ASC proteini ile kaynaşık protein
olarak bulunmakta olan ve ASC zerre taşıyıcısı ile kaynaşık olarak taşınan antijen
ile karakterize edilen yukarıdaki istemlerden herhangi birindeki gibi bir
kompozisyon.
5
8. ASC proteini ile kaynaşık protein olarak bulunan ve ASC proteininin N-ucuna
(terminus), C-ucuna (terminus) ya da ASC proteinin içine kaynaştırılan antijen ile
karakterize edilen İstem 7’deki gibi bir kompozisyon.
10
9. ASC zerre taşıyıcısının içerisinde taşınan antijen ile karakterize edilen İstem
8’deki gibi bir kompozisyon.
10. ASC zerre taşıyıcısını oluşturan ASC proteinleri ile hidrofobik etkileşimler
oluşturmak sureti ile ASC zerre taşıyıcısı tarafından taşınan antijen ile
15
karakterize edilen İstem 1 ila İstem 6’dan herhangi birindeki gibi bir
kompozisyon.
11. En az 13 amino asit uzunluğunda peptid dizisine sahip olan antijen ile
karakterize edilen İstem 10’daki gibi bir kompozisyon.
20
12. Hidrofobik özellikte olan peptid dizisine sahip olan antijen ile karakterize
edilen İstem 11’deki gibi bir kompozisyon.
13. ASC zerre taşıyıcısının dış kabuğunda taşınan antijen ile karakterize edilen
25
İstem 12’deki gibi bir kompozisyon.
14. En az bir çeşit peptide sahip olan antijen ile karakterize edilen yukarıdaki
istemlerden herhangi birindeki gibi bir kompozisyon.
30
15. Yukarıdaki istemlerden herhangi birindeki gibi bir kompozisyonun üretiminde
uygulanan,
43
 ASC proteinlerinin bir araya gelerek en az bir ASC zerre taşıyıcısı
oluşturması,
 antijen veya biyoaktif molekül olan en az bir peptidin ASC zerre
taşıyıcısına yüklenmesi,
5
 ASC zerre taşıyıcısı ve ASC zerre taşıyıcısına yüklenen antijen veya
biyoaktif molekül olan en az bir peptidi içeren kompozisyonun eldesi
adımları ile karakterize edilen bir kompozisyon üretim yöntemi.
16. Antijen veya biyoaktif molekül olan en az bir peptidin ASC zerre taşıyıcısına
10
yüklenmesi adımında, antijen veya biyoaktif molekül olan peptidin, ASC zerre
taşıyıcısını oluşturan her bir ASC proteinine kaynaşık olarak yüklenmesi ile
karakterize edilen İstem 15’teki bir kompozisyon üretim yöntemi.
17. Kompozisyonun eldesi adımında, ASC zerre taşıyıcısı ve ASC zerre
15
taşıyıcısına yüklenen antijen veya biyoaktif molekül olan en az bir peptidi içeren
kompozisyonun
hücre
kültüründe
sentezlenmesi
ve
hücre
kültüründen
saflaştırılması sureti ile elde edilmesi ile karakterize edilen İstem 15 ila İstem
16’dan herhangi birindeki gibi bir kompozisyon üretim yöntemi.
20
18. Proenflamatuvar bir uyarı vasıtası ile kompozisyonun hücre kültüründe
sentezlenmesi ile karakterize edilen İstem 17’deki bir kompozisyon üretim
yöntemi.
19. Bir uyarı olmadan, ASC proteini kodlayan DNA parçasını içeren plazmidlerin
25
hücre kültüründe yüksek miktarda anlatılması ile kompozisyonun hücre
kültüründe sentezlenmesi ile karakterize edilen İstem 17’deki bir kompozisyon
üretim yöntemi.
20. Kompozisyonun eldesi adımında, hücre içinde ASC zerre taşıyıcısını
30
oluşturan ASC proteininin ve kendisine kaynaşık olarak bulunan antijen veya
biyoaktif molekül olan peptidin, kaynaşık protein olarak üretildiği bakteri, maya,
44
bakuloviral gibi gen anlatım sistemlerinden çıkarılması ile karakterize edilen
İstem 15 ila İstem 16’dan herhangi birindeki gibi bir kompozisyon üretim
yöntemi.
5
21. Kompozisyonun eldesi adımında, ASC zerre taşıyıcısı ve ASC zerre
taşıyıcısını oluşturan her bir ASC proteinine kaynaşık olarak bulunan antijen veya
biyoaktif molekül olan peptidi içeren kompozisyonun in vitro ortamda hipotonik
çözelti içerisinde 37 °C sıcaklıkta inkübasyonla elde edilmesi ile karakterize
edilen İstem 20’deki bir kompozisyon üretim yöntemi.
10
22. Antijen veya biyoaktif molekül olan en az bir peptidin ASC zerre taşıyıcısına
yüklenmesi adımında, antijen veya biyoaktif molekül olan peptidin ASC zerre
taşıyıcısına, ASC zerre taşıyıcısı ile hidrofobik etkileşimler oluşturarak
yüklenmesi ile karakterize edilen İstem 15’deki bir kompozisyon üretim
15
yöntemi.
23. Antijen veya biyoaktif molekül olan en az bir peptidin ASC zerre taşıyıcısına
yüklenmesi adımında, ASC zerre taşıyıcısına hidrofobik etkileşimler vasıtası ile
yüklenen antijen veya biyoaktif molekülü oluşturan peptid dizisinin, en az 13
20
amino asit uzunluğunda ve hidrofobik özellikte en az bir çeşit peptide sahip
olması ile karakterize edilen İstem 22’deki bir kompozisyon üretim yöntemi.
24. Kompozisyonun eldesi adımında, ASC zerre taşıyıcısı ve ASC zerre
taşıyıcısına hidrofobik etkileşimler vasıtası ile yüklenen en az bir antijen veya
25
biyoaktif molekül olan peptidi içeren kompozisyonun hücre kültüründe
sentezlenmesi ve hücre kültüründen saflaştırılması sureti ile elde edilmesi ile
karakterize edilen İstem 23’deki bir kompozisyon üretim yöntemi.
25. Proenflamatuvar bir uyarı vasıtası ile kompozisyonun hücre kültüründe
30
sentezlenmesi ile karakterize edilen İstem 24’deki bir kompozisyon üretim
yöntemi.
45
26. Bir uyarı olmadan, ASC proteinin kodlayan DNA parçasını içeren
plazmidlerin hücre kültüründe yüksek miktarda anlatılması ile kompozisyonun
hücre kültüründe sentezlenmesi ile karakterize edilen İstem 24’deki bir
5
kompozisyon üretim yöntemi.
27. Kompozisyonun eldesi adımında, hücre içinde üretilen ASC zerre taşıyıcısını
oluşturan ASC proteinlerinin ve hücre içinde üretilen, ASC zerre taşıyıcısına
yüklenecek olan antijen veya biyoaktif molekül olan peptidin üretildiği bakteri,
10
maya, bakuloviral gibi gen anlatım sistemlerinden çıkarılması ile karakterize
edilen İstem 23’deki bir kompozisyon üretim yöntemi.
28. Kompozisyonun eldesi adımında, ASC zerre taşıyıcısına yüklenen antijen
veya biyoaktif molekül olan peptid ile ASC zerre taşıyıcısını oluşturan ASC
15
proteinlerinin in vitro ortamda hipotonik çözelti içerisinde 37 °C sıcaklıkta
inkübasyonda karıştırılması sureti ile kompozisyonun elde edilmesi ile
karakterize edilen İstem 27’deki bir kompozisyon üretim yöntemi.
20
25
30
46
ÖZET
BİR ANTİJEN GÖNDERİM YÖNTEMİ
Bu buluş, antijen ve/veya biyoaktif molekül gönderimi için yeni bir yöntem ve
5
antijen ve/veya biyoaktif molekül gönderim sisteminde görevli, ASC zerre
taşıyıcısı ve ASC zerre taşıyıcısı tarafından taşınan antijen veya biyoaktif molekül
içeren bir kompozisyon ile ilgilidir.
47

Download Report