Μετάφραση του mRNA mRNA Translation Βιοσύνθεση πρωτεϊνών Πολυμερισμός αμινοξέων 1 Γενικά χαρακτηριστικά A. Μετάφραση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων του mRNA σε αλληλουχία αμινοξέων- Γενικές έννοιες 1. Γενετικός κώδικας: Οι κανόνες μετάφρασης/αποκωδικοποίησης 2. Ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF): Η αλληλουχία διαδοχικών κωδικονίων (τριάδες νουκλεοτιδίων) από το εναρκτήριο έως το τερματικό. 3. Τα μεταφορικά RNAs (tRNAs) είναι τα κλειδιά της αποκωδικοποίησης, που λειτουργούν ως «προσαρμοστές/adaptors» προσαρμοστές/adaptors μεταξύ κωδικονίων και αμινοξέων Κάθε αμινοξύ συνδέεται με το δικό του μόριο tRNA, και το αμινοακυλ- tRNA που σχηματίζεται συνδέεται εξειδικευμένα ξ μ μόνο μ με μ το αντίστοιχο χ κωδικόνιο. 2 Αντίδραση πολυμερισμού 4. Η αμινο-ομάδα του νέο-εισερχόμενου αμινο-ακυλ-tRNA προσβάλλει τον αμινο-ακυλ εστερικό δεσμό του προ-υπάρχοντος αμινοακυλ- ή πεπτιδυλtRNA (κατεύθυνση ( ύθ Ν’ -> C’) 5. Το mRNA μεταφράζεται με κατεύθυνση 5’ -> 3’ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑC Lys Lys Lys Lys Asn 3 Δομικά στοιχεία των tRNAs Δομικά χαρακτηριστικά των tRNAs 1. Το ~ ½ των νουκλεοτιδίων συνδέονται σε ζεύγη βάσεων 2. Το 3’ άκρο CCA, βραχίονας υποδοχής 3. Η θηλιά ΤψC (ριβο Τ - ψευδο U - C) 4. Ο «μεταβλητός» επιπλέον βραχίονας 5. Η θηλιά διυδροουρακίλης (DHU) 6. Η θηλιά αντικωδικονίου 7. Πολλές 7 Π λλέ μονο- και δι-μεθυλιωμένες δ θ λ έ βάσεις A,U,C,G. Ουρακίλη Διυδροουρακίλη DHU Ψευδο ουρακίλη Ψ 4 Adaptor Structure Η δομή των tRNAs ανταποκρίνεται στο ρόλο του απόλυτα ειδικού «προσαρμοστή» (Adaptor) 1. Διαθέτει ελεύθερα άκρα αφενός για τη σύνδεση του αμινοξέος μ ξ ς (CCA) ( ) και αφετέρου φ ρ για γ συμπληρωματικό μ ηρ μ ζευγάρωμα με το αντίστοιχο κωδικόνιο μέσω του αντικωδικονίου. 2. Αναγνωρίζεται εξειδικευμένα από ΜΙΑ αμινοακυλtRNA συνθετάση θ ά 5 αα – tRNA συνθετάσες B. Οι Αμινοακυλ-tRNA συνθετάσες είναι τα ένζυμα που διαβάζουν/ερμηνεύουν τον γενετικό κώδικα α)) Προσαρτούν ρ ρ κάθε αμινοξύ μ ξ αυστηρά στο αντίστοιχο tRNA (με το ΣΩΣΤΟ αντικωδικόνιο) β) Ενεργοποιούν το σωστό αμινοξύ ((αμινοακυλ-tRNA μ = εστέρας ρ ς αμινοξέοςμ ξ ς tRNA)) ωστε να είναι ενεργειακά επιτρεπτή στη συνέχεια η δημιουργία πεπτιδικών δεσμών Συνθετάσες τάξης Ι και ΙΙ: Εστεροποίηση στο 2-ΟΗ ή 3-ΟΗ, 3 ΟΗ, αντίστοιχα, μονομερείς και διμερείς 6 Αδενυλίωση Οι αμινοακυλ-tRNA συνθετάσες καταλύουν δύο επιμέρους διαδοχικές αντιδράσεις Α. Τα αμινοξέα ενεργοποιούνται αρχικά με αδενυλίωση 1. αμινοξύ μ ξ + ΑΤΡ -> αμινοακυλο-ΑΜΡ μ + ΡΡj 2. ΡΡj -> 2Ρj Το αμινο-ακυλο αδενυλικό (μικτός ανυδρίτης) είναι ί ένα έ ενεργοποιημένο έ ενδιάμεσο, δά μεταβατικό, β ό προιόν ό Β Και στη συνέχεια εστεροποιούνται με το tRNA Β. 3 αμινοακυλο-ΑΜΡ + tRNA -> αμινοάκυλο-tRNA + ΑΜΡ 3. 7 Λιπο ακυλ αδενυλικό Ενεργοποιημένα ακυλοαδενυλικά ενδιάμεσα δημιουργούνται και σε άλλες βιοχημικές β χημ ς πορείες ρ ς πχ ενεργοποίηση λιπαρών οξέων για σύνθεση τριακυλογλυκερολών R-COOH +ATP Æ ΡΡjj 2Ρj 8 Εξειδίκευση tRNA αμινοακυλίωσης Οι αμινοακυλ-tRNA συνθετάσες αναγνωρίζουν τα αμινοξέα τους με εξαιρετική ακρίβεια: Το παράδειγμα της θρεονυλ-tRNA συνθετάσης Zn ZN H θρεονυλ θρεονυλ- tRNA συνθετάση διακρίνει τη θρεονίνη απ’ τη βαλίνη με βάση το σύμπλοκο συναρμογής Zn – OH - NH3 Δεν μπορεί όμως να διακρίνει, με αυτόν το μηχανισμό, τη θρεονίνη απ΄τη σερίνη 9 Διορθωτική ικανότητα Η διορθωτική ικανότητα των αμινοακυλ-tRNA συνθετασών εξασφαλίζει μεγαλύτερη εξειδίκευση Πείραμα: Ser έχει συνδεθεί λανθασμένα/τεχνητά με tRNA Thr και το λάθος αμινοαλυλ-tRNA επωάζεται με θρεονυλ-tRNA συνθετάση Th ---> Ser Th Ser-tRNA S tRNA Thr S + tRNAThr θρεονυλ-tRNA συνθετάση Συμπέρασμα: Το Τ αμινοακυλ-tRNA λ tRNA παλινδρομεί λ δ ί μεταξύ ξύ κέντρου ενεργοποίησης και κέντρου διόρθωσης και , αν είναι λανθασμένο, μπορεί να υδρολύεται στα συστατικά του ((αα = tRNA)) 10 Αναγνώριση αντικωδικίου Στην εξειδίκευση συμβάλλει η αναγνώριση της θηλιάς του αντικωδικίου ή/και τoυ βραχίονα υποδοχής των μορίων tRNAs Θ Θρεονυλο-tRNA λ tRNA συνθετάση θ ά Γλουταμινυλο-tRNA συνθετάση 11 Ριβόσωμα Γ. Ριβόσωμα : Η μοριακή μηχανή που πολυμερίζει αμινοξέα ρ ζ ς mRNA και αμινοακυλ-tRNAs μ συνταιριάζοντας Προκαρυωτικό ~20 aa/sec Ευκαρυωτικό 2 aa/sec ~2/3 ~1/3 Αυτο-συγκρότηση !! 12 Ρόλος της κάθε υπομονάδας Η μικρή υπομονάδα συνταιριάζει το mRNA με το tRNA ενώ η μεγάλη υπομονάδα καταλύει τη δημιουργία πεπτιδικών δεσμών Mεγάλη υπομονάδα Μικρή υπομονάδα A: aminoacyl- Αcceptor P: Peptide E: Exit 13 Καταλυτικός ρόλος του rRNA Tα rRNAs σχηματίζουν το μεγαλύτερο μέρος έ των θέσεων θέ Α, Α Ρ και Ε και παίζουν κύριο καταλυτικό ρόλο στη πρωτεϊνισύνθεση, To 16S rRNA της 30S L19 σε αντίθεση με τις απλούστερης –γενικά- δομής ριβοσωμικές πρωτείνες. ρ ς 14 Mεταφραστική έναρξη Shine-Dalgarno και εναρκτήριο AUG προσδιορίζουν το σημείο έναρξης της βακτηριακής μετάφρασης Α) η αλληλουχία Shine-Dalgarno AGGAGG (U) ζευγαρώνει με την συμπληρωματική CCUCC στο 3 3’ άκρο του 16S rRNA Β) το αντικωδικόνιο CAT του Met- tRNAf ζευγαρώνει με το κωδικόνιο έναρξης AUG Πείραμα προστασίας από RNase 15 πολυκιστρονικά mRNAs Θυμηθείτε !!, Τα βακτηριακά mRNAs είναι πολυκιστρονικά και μεταφραστική έναρξη συντελείται και εσωτερικά !! Shine-Dalgarno Τι θα συμβεί εάν οι θέσεις ριβοσωμικής πρόσδεσης μετατραπούν είτε σε ασθενέστερες, είτε σε ισχυρότερες ?? 16 Met-tRNAf fMet-tRNAf H βακτηριακή μετάφραση αρχίζει με φόρμυλο-μεθειονυλ-tRNA (fMet-tRNAf) To tRNAf διαφέρει από το tRNAm που μεταφέρει Met σε εσωτερικά κωδικόνια,, παρ’ ρ όλο που και τα δυο αναγνωρίζονται από την ίδια συνθετάση μπορεί ρ να φ φορμυλιωθεί ρμ μόνον όταν μ H Met μ είναι προσαρτημένη στο tRNAf σε αντίθεση με την Met που προσαρτάται στο tRNAm Αυτό είναι αποτέλεσμα της εξειδίκευσης της τρανσφορμυλάσης, που αναγνωρίζει ί tRNAf αλλά άό όχι tRNAm Τι εξυπηρετεί Τ ξ ί η φορμυλίωση λί ?? Θα το δούμε σε λίγο !! 17 IF2 IF2 O παράγοντας έναρξης IF2 είναι ένας μοριακός διακόπτης (G protein) που τοποθετεί το fMet fMet-tRNA tRNA στη θέση Ρ κατά το IF2 σχηματισμό του συμπλόκου έναρξης 70S Εναλλάσσεται μεταξύ δυο μορφών: Συνδεδεμένος είτε GTP, είτε με GDP Ο IF2-GTP σε συνδυασμό με το fMet-tRNA oρίζει το πλαίσιο ανάγνωσης στο mRNA οδηγώντας το fMet-tRNA στη θέση Ρ Μεταπίπτει στην μορφή IF2-GDP, αποσυνδέεται, και προκαλεί τη σύνδεση της 50S υπομονάδας και σχηματισμό συμπλόκου έναρξης 70S 70S. παραγ. παραγ IF2 Αποσύνδεση IF2 και άλλων IFs Σύνδεση 50S υπομονάδας 18 EF-Tu EF-Tu O παράγοντας επιμήκυνσης EF-Tu (G protein), ένας δεύτερος μοριακός διακόπτης παραδίδει τα αμινοακυλο διακόπτης, αμινοακυλο-tRNAs tRNAs στη θέση Α Ο EF-Tu δεν αναγνωρίζει fMet-tRNAf . Γι΄αυτό , fMet-tRNAf δεν μεταφέρεται στη θέση Α (αλλά στη Ρ) και fMet δεν ενσωματώνεται σε εσωτερικές θέσεις θ 19 Proofreading -EF-Tu ανακύκλωση Ο EF-Tu - GTP μ μεταπίπτει στη ημ μορφή ρφή EF-Tu - GDP και αποσυνδέεται μόνο αν το tRNA ζευγαρώσει σωστά με το αντίστοιχο κωδικόνιο EF-Tu GTP GTP EF-Tu GDP EF-Ts EF-Tu + GDP Ο παράγοντας EF EF-Ts Ts επάγει την απελευθέρωση του GDP επιτρέποντας στον EF-Tu να επανασυνδεθεί με GTP 20 N1 Ranεy Το αντικωδικόνιο του αμινοακυλ-tRNA και όχι το αμινοξύ καθορίζει την αναγνώριση του αντίστοιχου κωδικονίου στο mRNA, mRNA και επομένως το αμινοξύ που τελικά ενσωματώνεται στην πρωτείνη που συντίθεται Πείραμα: Εάν η κυστείνη του Cys-tRNAcys μετατραπεί χημικά/τεχνητά σε αλανίνη τότε το Ala-tRNAcys θα συνεχίζει να αναγνωρίζει κωδικόνιο κυστείνης και κατά την πρωτεινοσύνθεση θα ενσωματώσει αλανίνη στη θέση της κυστείνης Εφαρμογή: σύνθεση «αφύσικων» πρωτεϊνών in vitro !!! Σχηματισμός πεπτιδικού δεσμού 21 Η αντίδραση σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού Η αμινική ομάδα του νέο-εισερχόμενου αμινοακυλο-tRNA στη θέση Α προσβάλλει την καρβονυλική ομάδα του εστερικού δεσμού του προηγούμενου άκυλο-tRNA στη θέση Ρ 22 Ρόλος φορμυλίωσης Ο πιθανός ρόλος της φορμυλίωσης στην εναρκτήρια μεθειονίνη είναι η προστασία του πρώτου πεπτιδυλ-tRNA πεπτιδυλ tRNA δεσμού στη πρωκαρυωτική μετάφραση Η προσβολή του πεπτιδικού δεσμού από την -ΝΗ2 της μεθειονίνης θα οδηγούσε στο σχηματισμό σταθερού εξαμερούς δακτυλίου, δακτυλίου υδρόλυση του πεπτίδυλ-tRNA πεπτίδυλ tRNA εστερικού δεσμού και τερματισμό της μετάφρασης Γιατί αυτό δεν είναι πρόβλημα στην ευκαρυωτική μετάφραση ??? 23 EF-G EF-G O παράγοντας επιμήκυνσης EF-G είναι επίσης μια πρωτείνη ί G, G που υδρολύοντας GTP μετατοπίζει το ριβόσωμα κατά τρία νουκλεοτίδια. Μετακινεί το απο-ακυλιωμένο tRNA στη θέση Ε και το πεπτιδυλ-tRNA στη θέση Ρ, Ρ ενώ η μετακίνηση του mRNA ανοίγει τη θέση Α στο επόμενο κωδικόνιο 24 τερματισμός της μετάφρασης RFs:Οι πρωτεϊνικοί παράγοντες τερματισμού RF1, RF2, Rf3 (Release factors) αναγνωρίζουν τα κωδικόνια τερματισμού UAA, UGA, UAG Επιτρέπουν τη διέλευση ενός μορίου Η2Ο ((προσαρτημένο ρ ρ ημ σε Gly-Gly-Gln) y y ) στην η Α θέση η RF με αποτέλεσμα την αυτόματη υδρόλυση δ όλ του πεπτιδυλ-tRNA εστερικού δεσμού Ο αποκλεισμός του Η2Ο από το κέντρο της πεπτιδυλμεταφοράσης προστατεύει τον πεπτιδυλ-tRNA εστερικό δεσμό από αυθόρμητη υδρόλυση 25 Ταλάντευση Ταλάντευση-wobble: Στερεοχημική χαλαρότητα στο ζευγάρωμα της πρώτης βάσης του αντικωδικονίου με την τρίτη βάση του κωδικονίου Εάν η αναγνώριση κωδικονίου-αντικωδικονίου προϋπέθετε ζευγάρωμα και των τριών βάσεων βάσεων, τότε κάθε tRNA θα αναγνώριζε μόνο ένα κωδικόνιο. Όμως π.χ ένα αλανυλ-tRNA μεταφέρει αλανίνη σε τρία διαφορετικά κωδικόνια - Μηχανισμός αποκωδίκευσης: Δύο αδενίνες (Α 1492 και Α 1493) στο 3’ 3 άκρο του 16S rRNA της υπομονάδας 30S ελέγχουν μέσω δεσμών υδρογόνου εάν έχουν ζευγαρώσει οι δυο πρώτες θέσεις του δίκλωνου τμήματος κωδικίου-αντικωδικίου. Μ Μηχανισμός ό ελέγχου λέ δ υπάρχει δεν ά για την τρίτη ί θέση θέ !!! 26 Ευκαρυωτική Μετάφραση 5. Η ευκαρυωτική μετάφραση είναι πιο σύνθετη και διαφέρει απο την προκαρυωτική ρ ρ ή κυρίως ρ ς στο μηχ μηχανισμό μ έναρξης ρξης Προκαρυωτικό ~20 aa/sec Ευκαρυωτικό 2 aa/sec ~2/3 ~1/3 Πού συγκροτούνται οι ευκαρυωτικές ριβοσωμικές υπομονάδες ? 27 eIF4E – Cap eIF2-GTP - Met-tRNAi - 40S eIF4E – Cap eIF2-GTP - Met-tRNAi - 40S Ο ευκαρυωτικός παράγοντας έναρξης eIF4E αναγνωρίζει το 5 5’ κάλυμμα και ο eIF2-GTP σε σύμπλοκο με το Met-tRNAi και την 40S ριβοσωμική υπομονάδα σχηματίζει το σύμπλοκο προέναρξης 43S, ρ το mRNA που σαρώνει ψάχνοντας για AUG eIF2 eIF4E Αναφορά στην Kozak consensus -3A, +4G eIF2-GDP - 80S 28 Η συγκρότηση του 80S συμπλόκου έναρξης ρξης πραγματοποιείται ρ γμ μ με τη η σύνδεση της 60S ριβοσωμικής υπομονάδας, αφού προηγηθεί υδρόλυση του eIF2-GTP σε eiF2-GDP Η διεργασία επιμήκυνσης και τερματισμού είναι μηχανιστικά ανάλογες με αυτές των προκαρυωτικών συστημάτων 29 Tι είναι τα πολυσώματα ? Πολλά ριβοσώματα μεταφράζουν συγχρόνως το ίδιο μόριο 30 folding Πώς αποκτούν οι πρωτεΐνες την τρισδιάστατη δομή τους ? 1. Αυθόρμητα 31 Hsps 2. Με κατανάλωση ενέργειας (ΑΤΡ) Οι πρωτείνες θερμοπληξίας συντελούν στην αναδίπλωση νεοσυντιθέμενων πρωτεινών 32 Αντιβιοτικά Αντιβιοτικά στοχεύουν την προκαρυωτική μετάφραση Η στρεπτομυκίνη παρεμβαίνει στη δέσμευση φόρμυλο φ ρμ μ μεθειονυλο-tRNA,, ενώ άλλες ς αμινογλυκοσίδες (νεομυκίνη, γενταμυκίνη, καναμυκίνη) παρεμβαίνουν στη θέση αποκωδίκευσης (θέση 1492 του 16S rRNA) Η πουρομυκίνη, που μοιάζει με το αμινο-ακυλικό άκρο ενός αμινοακυλ-tRNA αποσυνδέει την η πολυπεπτιδική ή αλυσίδα από το ριβόσωμα 33 διφθερίτιδα Τοξίνες στοχεύουν μεταφραστικούς παράγοντες Η τοξίνη της διφθερίτιδας (Corynebacterium diphtheriae) προσθέτει θέ ADP-ριβόζη ADP βόζ στο διφθαμίδιο (τροποποιημένη His) του EF2 με αποτέλεσμα την απόλυτη αδρανοποίησή του Η τοξίνη της χολέρας ADP- ριβοσυλιώνει πρωτείνες ί G προκαλώντας λώ μαζική έκκριση υγρών από το λεπτό έντερο, αφυδάτωση φ η και θάνατο 34 Ασκήσεις Stryer Σελ. 946-947 2, 4, 10, 14, 17, 18. Lehninger Kεφ. Kεφ 27 5, 6, 7, 12. Επίσης σκεφθείτε και το παρακάτω πρόβλημα: O Mπάμπης και ο Ερμάνος, Ερμάνος δίδυμοι που ζουν στο ίδιο άγονο νησί, νησί προσβάλλονται από το ίδιο –πιθανότατα- παθογόνο βακτήριο. Στον Ερμάνο ο αγροτικός γιατρός χορηγεί χλωραμφενικόλη και σε λίγες μέρες αναρρώνει. Ο Μπάμπης, με υπόδειξη και βοήθεια της «φίλης» του, παίρνει μερικα mgs κυκλοεξιμίδιο και το ίδιο βράδυ πεθαίνει. Ο Βιολόγος του σχολείου ισχυρίζεται ότι και οι δύο χημικές ουσίες αναστέλλουν ισχυρά την σύνθεση πρωτεϊνών, ενώ ο φαρμακοποιός του νησιού βεβαιώνει ότι το κυκλοεξιμίδιο δεν διατίθεται ποτέ σε ασθενείς. Γιατί πέθανε ο Μπάμπης ?? 35 Ταλάντευση-wobble Η ινοσίνη, ινοσίνη που προκύπτει από μετα-μεταγραφική απαμίνωση αδενοσίνης, αδενοσίνης έχει τη μεγαλύτερη ευελιξία γιατί μπορεί να ζευγαρώσει με C,U,A στη τρίτη θέση του κωδικονίου 36
© Copyright 2024 Paperzz
