Spiroski M, Trajkov D, Petli~kovski A, Arsov T, Strezova A, Efinska-Mladenovska O, Hristomanova S, Spiroska E, Sibinovska O, Petrov J IMUNOLO[KI PRAKTIKUM - laboratoriska imunodijagnostika - Institut za imunobiologija i humana genetika, Medicinski fakultet, Univerzitet "Sv. Kiril i Metodij" Skopje, 2006 Institut za imunobiologija i humana genetika 1 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM AVTORI Prof. d-r Mirko Spiroski, asist. d-r Dejan Trajkov, asist. d-r Aleksandar Petli~kovski, asist. d-r Todor Arsov, asist. d-r Ana Strezova, biotehnolog Olivija Efinska-Mladenovska, d-r Slavica Hristomanova, d-r Eli Spiroska, molekularen biolog Olgica Sibinovska, d-r Jordan Petrov, Institut za imunobiologija i humana genetika, Medicinski fakultet, Univerzitet "Sv. Kiril i Metodij", Skopje. CIP - Katalogizacija vo publikacija Narodna i univerzitetska biblioteka "Sv. Kliment Ohridski", Skopje 612.017(076.5)(075.8) IMUNOLO[KI praktikum : laboratoriska imunodijagnostika / Spiroski M, Trajkov D, Petli~kovski A, Arsov T, Strezova A, Efinska-Mladenovska O, Hristomanova S, Spiroska E, Sibinovska O, Petrov J. - Skopje :Medicinski fakultet, Institut za imunobiologija i humana genetika, 2006. - 240 str. : ilustr. ; 28 sm Bibliografija: str. 240 ISBN 978-9989-9674-9-8 1. Spiroski, Mirko a) Imunologija - Visoko{kolski u~ebnici - Ve`bi, laboratoriski COBISS.MK-ID 68067338 © 2006 Institut za imunobiologija i humana genetika, Medicinski fakultet, Univerzitet "Sv. Kiril i Metodij", Skopje Site prava se za{titeni. Ovoj trud ne smee da bide preveden ili kopiran vo celina ili negov del bez potpi{ana dozvola od izdava~ot (Institut za imunobiologija i humana genetika, Medicinski fakultet, Univerzitet "Sv. Kiril i Metodij", Skopje). Zabraneto e bilo kakvo skladirawe i arhivirawe, elektronsko prilagoduvawe, kompjutersko programirawe ili koristewe so nekoja sli~na ili razli~na tehnologija poznata do denes ili koja }e se razvie podocna. Pe~ati: pe~atnica PROpoint grafi~ki centar, Skopje Tira`: 600 primeroci Spored misleweto na Ministerstvoto za kultura na Republika Makedonija za knigata Imunolo{ki praktikum se pla}a povlastena dano~na stapka. 2 Institut za imunobiologija i humana genetika PREDGOVOR PREDGOVOR Predmetot imunologija za prv pat e voveden vo {estogodi{niot sistem na studii na Medicinskiot fakulet vo Skopje vo u~ebnata 1993/94 godina. Predmetot se slu{a{e vo zimskiot semestar od treta godina (5. semestar) so vkupen fond od 30 ~asovi (15 ~asa teoretska nastava + 15 ~asa prakti~na nastava). Vo po~etokot celokupnata teoretska i prakti~na nastavata ja izveduvaa nastavnici i asistenti po fiziologija od Institutot za fiziologija i nastavnici i asistenti po transfuziologija od Republi~kiot zavod za transfuziologija. Institut za imunobiologija i humana genetika 3 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Vo tekot na 1994 godina bea raspi{ani izbori i bea izbrani prviot nastavnik i prvite asistenti po predmetot imunologija. Na 02.03. 1995 godina e konstituirana prvata Katedra za imunologija na Medicinskiot fakultet vo Skopje. Od 2001? predmetot Imunologija se slu{a{e vo ~etvrtiot semestar (vtora godina) so fond na ~asovi 15+15 i so dopolnitelni 15 ~asovi seminari. Od u~ebnata 2005/06 zapo~na Evropskiot kreditniot transfer sistem (EKTS) na Medicinskiot fakultet vo Skopje, spored koj predmetot Imunologija se slu{a so fond na ~asovi 24+21 (45) vo tretiot semestar (vtora godina). Vo juni mesec 1995 godina izleze od pe~at prviot u~ebnik po imunologija, odnosno knigata Osnovni imunolo{ki metodi nameneta za prakti~nata nastava od ovoj predmet. Vo 2005 izleze od pe~at knigata Imunolo{ki praktikum za prakti~nata nastava od predmetot imunologija vo izdanie na Institutot za imunobiologija i humana genetika. Vrabotenite od Institutot se zafatija so zada~a da napi{at Imunolo{ki praktikum - imuno-dijagnostika spored programata za EKTS i da im go stavat na raspolagawe na studentite. Vo ovoj praktikum se vneseni sedum blokovi od ve`bi od imunodijagnostikata vo imunologijata. Sekoj blok e sotaven od tri ve`bi, od koi prvite dve se laboratoriski metodi za imunodijagnostika, a tretata ve`ba e tolkuvawe na rezultatite od soodvetanata oblast na imunologijata. Kon ovie sedum blokovi, odnosno 21 ve`ba se ponudeni dopolnitelni materijali vo oblik na video ise~oci (na kompakt disk) za polesno sovladuvawe na materijalot. Kon sekoja ve`ba za tolkuvawe na imunolo{kite rezultati dodadeni se analizi na slu~ai so cel studentite da gi povrzat imunolo{kite rezultati so idnite klini~ki disciplini vo koi }e go primenat steknatoto znaewe od imunologijata. Studentite treba da gi sovladaat predvidenite materijali pred da prisustvuvaat na ve`bi za da osvojat najgolem broj poeni i so toa povisoka ocenka. Se nadevam deka praktikumot }e im bide od korist na studentite i deka }e pretstavuva dobra osnova za donesuvawe na novata nastavna programa od ovoj predmet. Prof. d-r Mirko Spiroski Skopje, noemvri 2006 godina 4 Institut za imunobiologija i humana genetika SODR@INA SODR@INA PREDGOVOR .....................................................................................................................................................................................3 SODR@INA .................................................................................................................................................................................... 5 BLOK 1- VRODEN IMUN SISTEM ...........................................................................................................................................9 VE@BA 1: ISPITUVAWE KLETO^EN VRODEN IMUN SISTEM ............................................................................. 11 1.1. Ispituvawe imunolo{kata funkcija na fagocitite ...........................................................................................................11 1.2. Kvalitativen NBT test ...................................................................................................................................................... 12 1.3. Kvantitativen NBT test ..................................................................................................................................................... 12 1.4. Zada~a ...................................................................................................................................................................................... 15 VE@BA 2: ISPITUVAWE HUMORALEN VRODEN IMUN SISTEM ..................................................................... 17 2.1. Proteini na akutna faza (PAF) ...................................................................................................................................... 17 2.1.1. Akutno fazen odgovor ................................................................................................................................................. 17 2.1.2. Regulacija na akutno faznite promeni .................................................................................................................... 18 2.1.2.1. Indukcija na proteinite od akutna faza so citokini i drugi signalni molekuli ............................ 20 2.1.2.2. Regulacija na drugite akutno fazni promeni so vospalitelno asociranite citokini ......................... 21 2.1.3. Funkcii na akutno fazniot odgovor ........................................................................................................................ 22 2.2. Opredeluvawe koncentracija na akutno fazni proteini so imunoturbidimetrija............................................... 23 2.2.1. Principi na imunoturbidimetrija........................................................................................................................... 23 2.2.2. Kalibracija ................................................................................................................................................................... 24 2.2.3. Sistem za temperaturna kompenzacija ..................................................................................................................... 25 2.2.4. Procedura ...................................................................................................................................................................... 25 2.3. Zada~a .................................................................................................................................................................................... 26 VE@BA 3: ANALIZA NA VRODEN IMUN SISTEM .................................................................................................... 27 3.1. Tolkuvawe rezultati od vroden imun sistem ................................................................................................................ 27 3.1.1. Normalni vrednosti od ispituvawe kleto~en vroden imun sistem ................................................................... 27 3.1.2. Klini~ka primena na akutno faznite proteini ................................................................................................... 29 BLOK 2 - IMUNI KLETKI .................................................................................................................................................... 31 VE@BA 4: KLETKI VO IMUNIOT SISTEM .................................................................................................................. 33 4.1. Dvoewe limfociti i monociti od periferna krv ..................................................................................................... 33 4.1.1. Op{ti napomeni ........................................................................................................................................................... 33 4.1.2. Postapka za dvoewe limfociti od periferna krv ............................................................................................... 34 4.1.3. Broewe kletki so hemocitometar ............................................................................................................................. 35 4.1.4. Ispituvawe `ivi i mrtvi kletki ............................................................................................................................. 37 4.2. Imunofluorescencija ....................................................................................................................................................... 38 4.2. 1. Fluorescentna mikroskopija ................................................................................................................................... 39 4.2.1.1. Fluorescentna mikroskopija so propusno svetlo ........................................................................................ 39 4.2.1.2. Fluorescentna mikroskopija so pa|a~ko svetlo .......................................................................................... 40 4.2.2. Dobivawe kowugirani protivtela ........................................................................................................................... 41 4.2.3. Podgotovka na tkiva i kletki ................................................................................................................................... 42 4.2.3.1. Tkivni preparati .................................................................................................................................................. 42 4.2.3.2. Parafinski preparati ......................................................................................................................................... 43 4.2.3.3. Kleto~ni preparati ............................................................................................................................................ 43 4.2.4. Boewe, ot~ituvawe i dokumentirawe ...................................................................................................................... 44 4.2.4.1. Direktna imunofluorescencija (DIF) ............................................................................................................ 44 4.2.4.2. Indirektna imunofluorescencija (IIF) ...................................................................................................... 45 4.2.4.3. Sistemot biotin-avidin ................................................................................................................................... 45 4.2.4.4. Kvantitativna imunofluorescencija ............................................................................................................ 46 4.2.4.5. Gre{ki i la`no pozitivni rezultati............................................................................................................. 47 4.2.4.6. Dokumentirawe na rezultatite (fotografirawe) .................................................................................... 47 4.3. Zada~a .................................................................................................................................................................................... 48 VE@BA 5: PROTO^NA CITOMETRIJA ........................................................................................................................... 49 5.1. Sistem za proto~na citometrija........................................................................................................................................ 49 5.1.1. Proto~na citometrija ................................................................................................................................................. 50 5.1.2. Te~ni sistemi ................................................................................................................................................................ 50 5.1.3. Opti~ki sistem ............................................................................................................................................................... 51 5.1.4. Analiza na podatocite .................................................................................................................................................. 53 5.1.4.1. Analiza ........................................................................................................................................................................ 53 5.1.4.2. Nadomest (kompenzacija) ....................................................................................................................................... 56 5.1.4.3. Skladirawe podatoci ............................................................................................................................................. 56 5.1.5. Proto~no sortirawe kletki ........................................................................................................................................ 57 5.2. Funkcionalen test za kletki prirodni ubijci (KPU) ................................................................................................ 57 5.2.1. Osnovi na testot ............................................................................................................................................................. 57 5.2.2. Protokol za rabota ...................................................................................................................................................... 58 Institut za imunobiologija i humana genetika 5 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 5.2.2.1. Op{ti podgotovki ................................................................................................................................................ 58 5.2.2.2. Izolacija na efektornite kletki .................................................................................................................... 58 5.2.2.3. Odmrznuvawe na K562 kleto~nata linija ......................................................................................................... 59 5.2.2.4. Priprema na primerokot za merewe ................................................................................................................... 59 5.2.2.5. Merewe i analiza na podatocite dobieni so proto~niot citometar .................................................... 60 5.3. Zada~a .................................................................................................................................................................................... 60 VE@BA 6: TOLKUVAWE REZULTATI OD KLETO^EN IMUNITET ..................................................................... 61 6.1. Normalni vrednosti na beli kletki ............................................................................................................................... 61 6.2. Imunofenotipizirawe ...................................................................................................................................................... 62 6.2.1. Voved ................................................................................................................................................................................. 62 6.2.2. Dijagnoza na hematolo{ki maligniteti ..................................................................................................................... 63 6.2.3. Ostanati klonalni/genetski hematolo{ki i imunolo{ki zaboluvawa.............................................................. 65 6.2.4. Transplantacija ............................................................................................................................................................. 65 6.2.5. Dijagnoza i sledewe na infektivnite zaboluvawa i imuni nedostatoci .......................................................... 66 6.3. Tolkuvawe rezultati od funkcionalni testovi vo kleto~en imunitet .................................................................. 67 6.3.1. Funkcionalen test za kletki prirodni ubijci ....................................................................................................... 67 6.3.1.1. O~ekuvani rezultati ............................................................................................................................................. 68 BLOK 3 - IMUNOGLOBULINI ....................................................................................................................................... 69 VE@BA 7: TALO@NI PROTIVTELA - IMUNOPRECIPITACIJA ..................................................................... 71 7.1. Precipitacija vo te~na sredina ................................................................................................................................. 71 7.2. Dvojna imunodifuzija na agar...................................................................................................................................... 72 7.3. Edine~na (radijalna) imunodifuzija na agar .......................................................................................................... 74 7.4. Imunoelektroforeza.................................................................................................................................................... 77 7.5. Zada~i .................................................................................................................................................................................... 77 VE@BA 8: PROTIVTELEN ODGOVOR ............................................................................................................................... 79 8.1.Broewe protivtela sekretira~ki B limfociti ..................................................................................................... 79 8.2.Imunonefelometrisko opredeluvawe imunoglobulinski klasi i potklasi ......................................................... 81 8.2.1. Princip na imunonefelometrija............................................................................................................................... 81 8.2.2. Opti~ki pateki na svetlinata .................................................................................................................................... 81 8.2.3. Principi na imunoturbidimetrisko merewe .......................................................................................................... 82 8.2.4. Predreakcii ................................................................................................................................................................... 84 8.2.5. Proveruvawe turbiditet .............................................................................................................................................. 85 8.3. Zada~i .................................................................................................................................................................................... 85 8.3.1. Izbroj IgM sekretira~i splenociti od gotova plo~a ........................................................................................... 85 8.3.2. Izmeri koncentracija na Ig klasi so imunonefelometar .................................................................................... 86 VE@BA 9: ANALIZA NA HUMORALEN IMUNITET ................................................................................................. 91 9.1. Normalni vrednosti od ispituvaweto humoralen imunitet ...................................................................................... 91 9.2. Klini~ko zna~ewe na imunoglobulinskite klasi i potklasi .................................................................................. 92 9.2.1. Hipogamaglobulinemii ................................................................................................................................................ 92 9.2.1.1. Prvi~ni imunonedostatoci ................................................................................................................................ 93 9.2.1.2. Vtori~ni imunonedostatoci ............................................................................................................................. 99 9.2.2. Poliklonski i oligoklonski gamopatii ................................................................................................................. 99 9.2.3. Monoklonski gamopatii .............................................................................................................................................. 100 BLOK 4 - KOMPLEMENTEN SITEM I CITOKINI .................................................................................................. 101 VE@BA 10: KOMPLEMENTEN SISTEM .......................................................................................................................... 103 10.1. Opredeluvawe CH50 na komplementot ........................................................................................................................ 104 10.2. Ispituvawe koncentracija na K3, K4 i K1inh .......................................................................................................... 107 10.2.1. Radijalna imunodifuzija (RID) ............................................................................................................................. 107 10.2.2. Odreduvawe na K3 komponentata od komplementot so radijalna imunodifuzija ........................................ 109 10.2.3. Odreduvawe na K4 komponentata od komplementot so radijalna imunodifuzija ......................................... 110 10.2.4. Odreduvawe na K1 inhibitor komponentata od komplementot so radijalna imunodifuzija ..................... 110 10.3. Zada~a ................................................................................................................................................................................. 111 VE@BA 11: CITOKINI ......................................................................................................................................................... 113 11.1. Zasituva~ki metodi ........................................................................................................................................................ 113 11.1.1. Op{ti principi na zasituva~kite metodi ............................................................................................................. 113 11.2. Imunoenzimski odreduvawa (ELISA) ........................................................................................................................ 114 11.2.1. Podgotovka na imunoatsorbentot .......................................................................................................................... 114 11.2.2. Kowugirawe ................................................................................................................................................................. 115 11.2.3. Spojuvawe enzim so protivtelo ili protivgen .................................................................................................... 115 11.2.4. Odvivawe na reakcijata ............................................................................................................................................. 115 11.2.5. ^itawe na rezultatot ................................................................................................................................................. 116 11.3. Odreduvawe koncentracija na citokini ..................................................................................................................... 116 11.3.1. Op{to za odreduvaweto citokini ......................................................................................................................... 116 11.3.2. Izveduvawe na ve`bata (Odreduvawe koncentracija na interleukin 1b) ......................................................... 118 11.3.2.1. Potreben materijal za izveduvawe na ve`bata ............................................................................................ 118 11.3.2.2. Priprema na pufer za plaknewe na bunar~iwata ........................................................................................ 118 11.3.2.3. Priprema na rabotniot rastvor na citokinskiot standard ............................................................... 119 11.3.2.4. Priprema na zasiluva~kiot rastvor Amdex ................................................................................................. 119 11.3.2.5. Standarden rastvor za razreduvawe ............................................................................................................... 119 11.3.2.6. Primerok ................................................................................................................................................................. 119 11.3.2.7. Protokol za rabota ............................................................................................................................................ 120 11.3.2.7.1. Prigotvuvawe na standardite ............................................................................................................ 120 11.3.2.7.2. Izveduvawe na testot ............................................................................................................................ 120 11.3. Zada~a ................................................................................................................................................................................... 123 VE@BA 12: ANALIZA NA KOMPLEMENTEN SISTEM I CITOKINI ............................................................ 125 12.1. Normalni vrednosti od ispituvawe komplementen sistem ..................................................................................... 125 12.2. Tolkuvawe rezultati od komplementen sistem ......................................................................................................... 126 12.2.1. CH50 .............................................................................................................................................................................. 126 12.2.2. K3 i K4 .......................................................................................................................................................................... 127 12.2.3. K1-inhibitor ............................................................................................................................................................... 127 12.2.4. Hiperkomplementemija ............................................................................................................................................. 127 12.2.5. Hipokomplementemija ............................................................................................................................................... 128 12.3. Normalni vrednosti od citokini .................................................................................................................................. 130 12.4. Dijagnosti~ko zna~ewe na citokinite ........................................................................................................................ 131 6 Institut za imunobiologija i humana genetika SODR@INA BLOK 5 - TRANSPLANTACIJA..................................................................................................................................... 133 VE@BA 13: PRIKA@UVAWE GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS ................................................. 135 13.1. Op{to za HLA ........................................................................................................................................................... 135 13.1.1. [to e HLA ............................................................................................................................................................ 135 13.1.2. Genomska struktura i polimorfizam ............................................................................................................... 137 13.1.3. Metodi za tipizirawe na HLA .......................................................................................................................... 137 13.1.4. Serolo{ki metodi ...................................................................................................................................................... 138 13.1.5. Nomenklatura ....................................................................................................................................................... 139 13.2. Serolo{ki metodi za tipizirawe na HLA .......................................................................................................... 139 13.2.1. Neophodni uslovi .................................................................................................................................................. 140 13.2.2. Prigotvuvawe limfocitna suspenzija ............................................................................................................ 140 13.2.3. Mikrolimfocitotoksi~en test ....................................................................................................................... 141 13.2.4. Rezultati ............................................................................................................................................................... 142 13.3. Zada~a ................................................................................................................................................................................. 143 VE@BA 14: GENSKA STRUKTURA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS ............................... 145 14.1. Genska struktura na GTSK i negovi polimorfizmi ................................................................................................ 145 14.2. Molekulski metodi za HLA tipizacija ....................................................................................................................... 146 14.3. Principi na molekularnite metodi za HLA tipizacija ........................................................................................ 146 14.3.1. SSOP (Sequence Specific Oligonucleotide Probing) ................................................................................................... 146 14.3.2. RLS (Reverse Line Strip) – reverzna hibridizacija ................................................................................................. 147 14.3.3. SSP (Sequence Specific Priming) ................................................................................................................................. 148 14.3.4. SBT (Sequence Based Typing) ....................................................................................................................................... 148 14.4. Nivoa na HLA tipizacija ............................................................................................................................................... 149 14.5. Dvojbenost (ambigvitet) ................................................................................................................................................. 149 14.6. Nomenklatura ..................................................................................................................................................................... 150 14.7. Izveduvawe na ve`bata .................................................................................................................................................. 152 14.7.1. RLS (Reverse Line Strip) .............................................................................................................................................. 152 14.7.2. SSP (SSP-Sequence Specific Priming) ......................................................................................................................... 153 14.8. Zada~i ................................................................................................................................................................................ 155 14.8.1. Interpretiraj gi alelite za HLA lokusot od nitroceluloznite lenti dobieni so metodot na reverzna hibridizacija (RLS) ............................................................................. 155 14.8.2. Interpretiraj gi alelite za HLA lokusot so metodot na SSP na visoko razdelno nivo ............................ 157 VE@BA 15: ANALIZA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS ........................................................ 159 15.1. Normalni vrednosti za glavniot tkivno sovpadliv kompleks .............................................................................. 159 15.2. Bolesti povrzani so GTSK ............................................................................................................................................. 160 15.2. Analiza na GTSK asocijacija i bolesti ..................................................................................................................... 160 15.3. Asocijacija so haplotipovi ........................................................................................................................................... 162 15.4. Zna~ewe na HLA sistemot vo transplantacija .......................................................................................................... 162 15.4.1. Barawe daritel ........................................................................................................................................................... 163 15.4.2. Tolkuvawe rezultati ................................................................................................................................................. 163 BLOK 6 - PREOSETLIVOST ................................................................................................................................................. 165 VE@BA 16: TIP 1 PREOSETLIVOST ............................................................................................................................. 167 16.1. Reakcii na preosetlivost ............................................................................................................................................... 167 16.2. Odreduvawe vkupen IgE i specifi~ni IgE protivtela ........................................................................................ 167 16.2.1. Alergeni ...................................................................................................................................................................... 167 16.2.1.1. Vdi{eni (inhalatorni) alergeni .................................................................................................................... 168 16.2.1.2. Hrani ...................................................................................................................................................................... 168 16.2.1.3. Antibiotici, drugi lekovi i hemikalii .................................................................................................... 169 16.2.1.4. Profesionalni alergeni ................................................................................................................................... 170 16.2.1.5. Razli~ni rastitelni produkti ..................................................................................................................... 170 16.2.1.6. Kontaktni alergeni .......................................................................................................................................... 170 16.2.1.7. Osnovni principi za vkrstena reaktivnost me|u rastitelni alergeni ................................................ 170 16.2.2. IgE posreduvana alergija ......................................................................................................................................... 171 16.2.3. Dijagnosticirawe na IgE posreduvana alergija.................................................................................................. 172 16.2.4. Princip za opredeluvawe specifi~en IgE ........................................................................................................... 172 16.3. Razlikuvawe atopiski od ne-atopiski bolesti .......................................................................................................... 173 16.3.1. UniCap Phadiatop ........................................................................................................................................................... 173 16.3.2. UniCap fx5 ....................................................................................................................................................................... 174 16.3.3. UniCap vkupen IgE ...................................................................................................................................................... 175 16.4. Dijagnosti~ki pomagala za specifi~ni alergii ........................................................................................................ 175 16.4.1. UniCap specifi~en IgE ............................................................................................................................................ 175 16.4.2. UniCap specifi~en IgA ............................................................................................................................................ 177 16.4.3. UniCap glijadin IgA .................................................................................................................................................. 178 16.4.4. UniCap specifi~en IgG ............................................................................................................................................. 179 16.4.5. UniCap glijadin IgG ................................................................................................................................................... 180 16.4.6. UniCap eozinofilen katjonski protein (EKP) ..................................................................................................... 180 16.4.7. UniCap triptaza ........................................................................................................................................................... 181 16.5. Zada~i ................................................................................................................................................................................. 182 16.5.1. Odredi vkupen i specifi~en IgE vo serum .......................................................................................................... 182 VE@BA 17: TIP 2 I TIP 3 PREOSETLIVOST ............................................................................................................. 187 17.1. Aglutinacija .................................................................................................................................................................... 187 17.1.1. Objasnuvawe mehanizmot na aglutinacija ........................................................................................................ 189 17.2. Direkten protivglobulinski test (DPT) ............................................................................................................ 189 17.2.1. Zemawe primerok ................................................................................................................................................ 190 17.2.2. Materijal ............................................................................................................................................................... 190 17.2.3. Metod ...................................................................................................................................................................... 190 17.2.4. Zabele{ki ............................................................................................................................................................. 192 17.2.5. Titar kaj antiglobulinskite testovi ............................................................................................................... 193 17.3. Indirekten protivglobulinski test ..................................................................................................................... 195 17.3.1. Potrebni materijali .......................................................................................................................................... 195 17.3.2. Metod ...................................................................................................................................................................... 195 17.3.3. Zabele{ki ............................................................................................................................................................. 196 17.4. Opredeluvawe cirkulira~ki imuni kompleksi so precipitacija so polietilen glikol .................................. 196 17.5. Zada~a ........................................................................................................................................................................... 198 Institut za imunobiologija i humana genetika 7 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM VE@BA 18: ANALIZA NA PREOSETLIVOST ............................................................................................................. 199 18.1. Normalni vrednosti za vkupen i za specifi~en IgE ................................................................................................ 199 18.2. Klini~ki simptomi za alergija i nivno dijagnosticirawe ................................................................................... 199 18.2.1. Oddelno ispituvawe alergeni ................................................................................................................................. 201 18.2.2. Ispituvawe komplet alergeni ....................................................................................................................................201 18.2.3. Ispituvawe alergeni spored dijagnoza................................................................................................................... 203 18.3. Tolkuvawe rezultati od protivglobulinski test ...................................................................................................... 204 18.3.1. Direkten protivglobulinski test ......................................................................................................................... 204 18.3.2. Indirekten protivglobulinski test ...................................................................................................................... 206 BLOK 7 - AVTOIMUNITET .................................................................................................................................................. 207 VE@BA 19: SISTEMSKI AVTOIMUNITET ................................................................................................................. 209 19.1. Voved za avtoimunost ...................................................................................................................................................... 209 19.2. Otkrivawe na avtoprotivtela ....................................................................................................................................... 210 19.2.1. Indirektna imunofluorescencija .......................................................................................................................... 211 19.2.2. Aglutinacija ....................................................................................................................................................................211 19.2.3. Imunodifuzija ............................................................................................................................................................. 211 19.2.4. Imunoprecipitacija ................................................................................................................................................... 211 19.2.5. Imunoblotirawe ........................................................................................................................................................... 212 19.2.6. ELISA ......................................................................................................................................................................... 212 19.2.7. ELIA ............................................................................................................................................................................ 213 19.2.8. Primerok za ispituvawe ........................................................................................................................................... 213 19.2.9. Stabilnost na protivtelata ..................................................................................................................................... 213 19.3. Sistemski avtoimuni zaboluvawa ................................................................................................................................. 213 19.3.1. Protivtela povrzani so revmatska bolest ............................................................................................................ 213 19.3.1.1. Fosfolipidni protivtela ................................................................................................................................ 213 19.3.1.2. Nuklearni protivtela (ANA) ......................................................................................................................... 214 19.3.2. Protivtela kon neutrofilnata citoplazma ........................................................................................................ 214 19.3.3. Sistemski lupus eritematozus (SLE) ................................................................................................................... 215 19.3.3.1. O{tetuvawe na tkivoto .................................................................................................................................. 215 19.4. Zada~a ................................................................................................................................................................................... 216 19.4.1. Opredeluvawe IgM protivkardiolipinski protivtela ................................................................................... 216 19.4.1.1. Potreben materjal za izveduvawe na ve`bata ............................................................................................... 216 19.4.1.2. Priprema na pufer za plaknewe ........................................................................................................................ 217 19.4.1.3. Priprema na rastvor za razreduvawe ............................................................................................................... 217 19.4.1.4. Primerok ................................................................................................................................................................. 217 19.4.1.5. Protokol za rabota............................................................................................................................................ 218 19.4.1.6. Presmetuvawe na rezultatite ....................................................................................................................... 219 19.4.1.7. Presmetuvawe koncentracija na IgM protivkardiolipinskite protivtela .................................... 219 VE@BA 20: ORGAN SPECIFI^EN AVTOIMUNITET ............................................................................................ 221 20.1. Organ specifi~ni avtoimuni zaboluvawa ................................................................................................................ 221 20.1.1. Endokrini avtoimuni bolesti ................................................................................................................................. 221 20.1.1.1. Protivtela kon parietalni gastri~ni kletki ......................................................................................... 221 20.1.1.2. Protivtela kon intrinzik faktorot ........................................................................................................ 221 20.1.1.3. Avtoprotivtela povrzani so dijabetes ....................................................................................................... 222 20.1.1.4.Tiroidni avtoprotivtela ............................................................................................................................... 222 20.1.2. Gastrointestinalni avtoimuni bolesti ............................................................................................................... 223 20.1.2.1. Protivtela povrzani so celijakija ................................................................................................................ 223 20.1.3. Avtoimuna bolest na crniot drob .......................................................................................................................... 223 20.1.4. Protivtela povrzani so nevromuskularni bolesti ............................................................................................. 224 20.1.4.1. Protivtela kon acetilholinski receptori ............................................................................................... 224 20.1.5. Avtoprotivtela povrzani so bubre`na bolest ...................................................................................................... 224 20.1.5.1. Protivtela kon glomerulskata bazalna membrana ..................................................................................... 224 20.2. Zada~i ................................................................................................................................................................................ 225 20.2.1. Opredeli koncentracija na tiroidni avtoprotivtela (TG i TPO) .................................................................. 225 VE@BA 21: ANALIZA NA AVTOIMUNI ZABOLUVAWA ...................................................................................... 229 21.1. Normalni vrednosti za sistemski avtoprotivtela................................................................................................... 229 21.2. Normalni vrednosti za organ specifi~ni protivtela ............................................................................................ 230 21.3. Tolkuvawe sistemski avtoprotivtela .......................................................................................................................... 231 21.3.1. Avtoprotivtela kon dvoveri`na DNK (dvDNK) ................................................................................................. 232 21.3.2. U1RNP ........................................................................................................................................................................... 232 21.3.3. RNP70 ............................................................................................................................................................................. 232 21.3.4. Sm ................................................................................................................................................................................. 232 21.3.5. Ro ................................................................................................................................................................................... 233 21.3.6. La ................................................................................................................................................................................... 233 21.3.7. CENP .......................................................................................................................................................................... 233 21.3.8. Scl-70 ............................................................................................................................................................................ 233 21.3.9. Jo-1 ................................................................................................................................................................................ 233 21.3.10. Avtoprotiv tela kon proteinaza 3 (PR3) .............................................................................................................. 233 21.3.11. Avtoprotiv tela kon mieloperoksidaza (MPO) ............................................................................................... 233 21.3.12. Avtoprotiv tela kon alfa3 lanecot na kolagen 4 (GBM) ................................................................................ 234 21.3.13. Kardiolipinski protivtela .................................................................................................................................. 234 21.4. Tolkuvawe organ specifi~ni avtoprotivtela ......................................................................................................... 235 21.4.1. Antitiroglobulinski protivtela (TG) ................................................................................................................ 235 21.4.2. TPO ............................................................................................................................................................................... 235 21.4.3. Protivtela kon parietalni kletki ........................................................................................................................ 236 21.4.4. Test za GBM protivtela ........................................................................................................................................... 236 21.4.5. Test za protivspermalni protivtela .................................................................................................................... 237 21.4.6. Protivmitohondrijalni protivtela ....................................................................................................................... 237 21.4.7. LKM1 protivtela........................................................................................................................................................ 238 22. OSNOVNI LABORATORISKI PRAVILA ................................................................................................................ 239 23. LITERATURA ....................................................................................................................................................................... 240 8 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 1: ISPITUVAWE KLETO^EN VRODEN IMUN SISTEM BLOK 1 BLOK 1 - VRODEN IMUN SISTEM U^EBNI CELI: VE@BA 1. ISPITUVAWE KLETO^EN VRODEN IMUN SISTEM (1 ~as) Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat da: go definiraat mestoto na fagocitozata vo vrodeniot imunitet; ja opredelat fagocitnata sposobnost vo eden fagocit. VE@BA 2. ISPITUVAWE HUMORALEN IMUN SISTEM (1 ~as) Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat: da gi protolkuvaat proteini na akutna faza; da ja opredelat koli~inata na nekoi proteini na akutna faza vo plazma. VE@BA 3. ANALIZA NA SLU^AI OD VRODEN IMUN SISTEM (1 ~as) Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat da: tolkuvaat rezultati od vrodeniot imun sistem; analiziraat slu~ai od vroden imun sistem. POENI: PRISUSTVO 1.5 poeni ZNAEWE 3.0 poeni VKUPNO: 4.5 poeni Institut za imunobiologija i humana genetika 9 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 10 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 1: ISPITUVAWE KLETO^EN VRODEN IMUN SISTEM VE@BA 1: ISPITUVAWE KLETO^EN VRODEN IMUN SISTEM 1.1.Ispituvawe imunolo{kata funkcija na fagocitite Fagocitnite kletki, polimorfonuklearnite neutrofili i mononuklearnite fagociti (makrofagi, monociti), imaat mnogu va`na imunolo{ka funkcija vo efektorniot del na imunolo{kiot odgovor i vo vospalitelnata reakcija. Pri bakteriska ili fungi~na agresija vrz organizmot prvi reagiraat polimorfonuklearite, a potoa se vklu~uvaat i mononuklearnite fagociti. Nivnata imunolo{ka funkcija se izrazuva pred s# preku procesot na fagocitoza, koj najkuso prika`ano, mo`e da se podeli vo nekolku fazi (Slika 1.1): Institut za imunobiologija i humana genetika Slika 1.1: Sedumte fazi od fagocitoza na bakterii. 11 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM - naso~uvawe na fagocitite kon kletkata cel, tu|iot agens (fenomen na lokomocija) i prilepuvawe do mikrobite; - goltnuvawe na mikrobite so fagocitoza; - sozdavawe fagozom; - soedinuvawe na fagozomot so lizozomot i sozdavawe fagolizozom; - digestija na kletkata cel (kleto~no i biohemisko ubivawe) niz procesot na oksidativen metabolizam; - 1.5 mL krv - 15 mkl endotoksin - 0.3 mL NBT - 10 min na 37oC - 2h2 mL SFP - 2 kapki HCL - 2 mL voda - sozdavawe ostato~no telce koe sodr`i nerazgraden materijal; - isfrlawe na ostato~niot materijal. Pri ispituvawe na imunolo{kata funkcija na fagocitite neophodno e da se postigne procenka vo site fazi od procesot na fagocitoza, za {to denes postojat brojni laboratoriski metodi, a del od niv ovde }e bide prika`an. 1.2. Kvalitativen NBT test Vo osnova se opredeluva redukcijata na NBT preku superoksid anjon, koj se javuva kako proizvod od aktiviranata oksidacija. Reduciraniot NBT ima karakteristika da se talo`i vo forma na crni zrnca od formazan. Postojat pove}e modifikacii na metodot, no najkoristeni se citohemiskite koi go opredeluvaat procentot na polimorfonukleari ili monociti {to sodr`at precipitirani zrnca od formazan. Ovaa redukcija ne e specifi~na bidej}i NBT mo`e da go reduciraat i drugi reduktazi nezavisno od oksidativniot metabolizam. Sepak, ovoj test e mnogu pogoden za dijagnoza na steknati ili vrodeni granulopatii. A - B 5 mL dioksan 20 min na 70 oC 10 min na 1000g se meri na 520 nm Slika 1.2: [ematski prikaz na kvantitativen nitroblu tetrazolium test (NBT) za ispituvawe fagocitnata sposobnost na imunite kletki. 12 Mo`e da se koristi polna krv ili ve}e izdvoeni kletki. Na 100 mikrolitri periferna krv se dodava 100 mikrolitri rastvor od NBT (2 mg/mL), se inkubira 15 min/37oC i potoa se vr{i stimulirawe na fagocitite so rastvor od endotoksin (15 mkg/mL), ili suspenzija od ubieni bakterii ili phorbol myristate acetate (50 - 100 ng/mL). Povtorno se inkubira 15 min na 37oC i se fiksira so formaldehid.Taka se liziraat eritrocitite, a drugite kletki so pomo{ na citocentrifuga se postavuvaat na predmetno staklence. Se vr{i sprotivno obojuvawe so fuchsine i mikroskopski se opredeluva procentot na kletkite koi sodr`at precipitiran reduciran NBT. 1.3. Kvantitativen NBT test Dodavaweto `olta NBT boja vo plazmata doveduva do formirawe NBT-heparin ili NBT-fibrinogen kompleks {to mo`e da bide fagocitiran od neutrofilot. Kaj normalnite neutrofili mo`e da se zgolemi fagocitnata aktivnost so dodavawe (stimulirawe) endotoksin. Ovoj Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 1: ISPITUVAWE KLETO^EN VRODEN IMUN SISTEM metod mo`e da se upotrebi za da se izmeri stepenot na stimulacijata na nestimuliranite kletki ili nivniot kapacitet za fagocitoza po stimulacijata. Stimuliranite neutrofili go vgraduvaat kompleksot na boja vo fagozomite i po lizozomalnata fuzija, intracelularnata redukcija doveduva do formirawe sini nerastvorlivi kristali na formazan. Procentot na fagocitnite kletki mo`e da bide opredelen so svetlosen mikroskop, a vkupnata redukcija na bojata mo`e da bide kvantificirana spektrofotometriski po dioksanskata ekstrakcija. A Potrebno za izveduvawe na ve`bata: Se zema venska krv so heparin (20 IE/mL); destilirana voda; solen fosfaten pufer; endotoksin od escherihia coli 1 mg/mL vo SFP; 4 mmol NBT vo SFP koj sodr`i 340 mmol saharoza; dioksan; 0.1 mol HCl; najlonska volna 100 mg vo silikonizirani pasterovi pipeti; vodena bawa na 37 i na 70o C; spektrofotometar; pasterovi pipeti ili mikrokoloni (NEN); askorbinska kiselina. Se prigotvuvaat slednive materijali: B - 340 mmol saharoza. Se merat 11.62 g saharoza, se stavaat vo kolba od 100 mL, se dodava destilirana voda do 100 mL. - Solen fosfaten pufer- KH2 PO4 0.20 g, Na2 HPO4 1.44 g, KCl 0.20 g, NaCl 8.00 g, H2O destilirana do 1000 mL. - 4 mmol NBT vo solen fosfaten pufer vo 340 mmol saharoza. Se merat 11.628 g saharoza, 0.29 g NBT, volumenot do 100 mL se dopolnuva so SFP. - 0.1 mol HCl. Se zemaat 0.83 mL od 37% HCl i se dopolnuva do 100 mL so destilirana voda. V - 150 mikromoli askorbinska kiselina = 26.4 mg. - 0.1 mol NaOH so 24 mmol Na2HCO3. Se merat 400 mg NaOH, se stavaat vo kolba od 100 mL, se dodavaat 50 mL destilirana voda za da se rastvori natrium hidroksidot i vo nego se dodavaat 0.201 g Na2HCO3 i se dopolnuva so destilirana voda do 100 mL. - 4 mmol NBT vo 340 mmol saharoza. Se merat 3 mg NBT i se stavaat 1 mL 340 mmol saharoza. G - Najlonska volna. Najlonskata volna se vari vo destilirana voda i vodata se menuva najmalku tri pati, potoa se ras~e{luva i se su{i na sobna temperatura. Se merat 100 mg i se vnesuvaat vo pasterovi pipeti ili vo mikrokoloni (NEN) na ~ie dno se nao|a filter disk ili malo koli~estvo staklena volna. Funkcijata na najlonskata volna e da gi zadr`i fagocitnite kletki, koi imaat sposobnost za prilepuvawe (atherencija) za vlaknata od najlonska volna. Po`elno e da se koristat plasti~ni epruvetki, no do kolku se raboti so stakleni sadovi, tie treba da se silikoniziraat za da se spre~i atherencijata na kletkite za nivniot yid. Treba da se zeme predvid deka i neutrofilite i monocitite imaat sposobnost za goltnuvawe (ingestija) na NBT so fagocitoza. Faktorot za konverzija za presmetuvawe moli od formazan spored koeficientot na Institut za imunobiologija i humana genetika Slika 1.3: Stapkite za izveduvawe na kvantitativniot nitroblu tetrazolium test (NBT) za ispituvawe fagocitnata sposobnost na imunite kletki. A, stavawe krv vo dve epruvetki (levo nestimulirana, desno stimulirana). B, Nanesuvawe krv vrz najlonska volna. V, Prefrlawe na najlonskata volna vo epruvetki so dioksan za nivna ektrakcija. G, kolorimetrisko opredeluvawe intenzitetot na sozdadeniot formazan. 13 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM ekstincija mora da bide presmetuvan za sekoe {i{ence boja, po hemiskata redukcija, opi{ana podolu. Testot se izvr{uva na sledniov na~in (slika 2): 1. Se zema venska krv so heparin (20 IE/mL) i od nea treba da se napravi diferencijalna krvna slika. 2. Se dodavaat 15 mkL endotoksinski rastvor (1 mg/mL vo SFP) na 1.5 mL krv za stimulacija (A) ili 15 mkL fiziolo{ki rastvor kako kontrola (B) i se inkubira na 37oC, 10 min. 3. Se dodava 0.3 mL sve`o podgotven rastvor na NBT i vnimatelno se me{a. 4. Se dodava celata krv kapka po kapka vo najlonskite koloni. 5. Otkako krvta }e navleze vo volnata, se mie dva pati so 2 mL SFP, a potoa so 2 mL destilirana voda. Destiliranata voda }e gi lizira crvenite krvni zrnca. 6. Se dodavaat po dve kapki 0.1 N HCl za da se prekine natamo{nata redukcija na vnatrekleto~nata (intracelularnata) boja i potoa se mie so 2 mL destilirana voda. 7. Se otstranuva volnata so eza (ili igla za pletewe) i se stava vo 5 mL dioksan (vo staklen sad). 8. Se inkubira na 70oC so povremeno pojako tresewe dodeka najlonskata volna ne si ja vrati belata boja (stoi okolu 20 min). 9. Se centrifugira dioksanskiot ekstrakt za da se otstrani precipitatot ili najlonskite ni{ki (1000 g, 10 min na sobna temperatura). 10. Se meri ekstincijata na 520 nm so spektrofotometar (kako slepa proba se koristi dioksan). Ekstincioniot koeficient za sekoe {i{ence NBT se opredeluva na sledniov na~in: 1. Se dodavaat 150 mkmol askorbinska kiselina (26.4 mg supstancija) na 0.2 mL NBT rastvor (4 mmol vo saharoza) i se me{a. 2. Se dodava 2.0 mL 0.1 M natrium hidroksid so natrium bikarbonat. 3. Se inkubira 10 min na sobna temperatura i se dodavaat 5 mL destilirana voda. 4. Se centrifugira na 1000 g, 15 min na sobna temperatura. 5. Se plakne edna{ so voda i so centrifugirawe kako vo to~ka 4. Se otstranuva supernatantot i se resuspendira siniot nerastvoren formazanski precipitat vo 10 mL dioksan. 6. Se rastvora 1 mL od suspenzijata vo 9.0 mL dioksan i se inkubira na 70oC, 20 minuti. 7. Se ladi do sobna temperatura i se meri ekstincijata na 520 nm so spektrofotometar koristej}i dioksan kako slepa proba. 8. Se presmetuva faktorot na konverzija od vrednosta na ekstincijata. Grubo ovoj faktor treba da bide okolu: 14 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 1: ISPITUVAWE KLETO^EN VRODEN IMUN SISTEM 1 ekstinciona edinica = 40 nmol formazan Prika`uvawe i tolkuvawe na rezultatite (Tabela 1): 1. Koristej}i go faktorot na konverzija, se odreduva brojot na moli na formazan ekstrahirani od nestimuliranata i stimuliranata krv so endotoksin. 2. Se presmetuva brojot na potencijalni fagociti (% na apsolutniot broj se dol`i na neutrofili i monociti). 3. Rezultatite se izrazuvaat kako femtomoli (10-15M) na formazan po eden fagocit. Normalno rastojanie za netretirana krv e do 129 femtomoli formazan za sekoj fagocit. Normalni granici za stimulirana krv se do 290 femtomoli formazan po fagocit. Za da se presmetaat ovie vrednosti neophodni se diferencijalna formula i broj na beli krvni kletki vo 1 mL krv. 1.4. Zada~a Izvadi krv od vena od kole{ka ili kolega i izvedi kvantitativen NBT test so nestimulirana i stimulirana krv i presmetaj gi vrednostite vo Tabela 1.1. 1. So pomo{ na kolorimetar se meri intenzitetot na Primer Otklon na skalata na kolorimetarot Izmereni EE Faktor na konverzija (1EE) Vkupno sozdaden formazan vo 1.5 mL krv Vkupno sozdaden formazan vo 1 mL krv Slu~aj nestimulirana stimulirana 0.18 (0.01=1EE) 0.4 (0.01=1EE) 18 40 40 nmol formazan 40 nmol formazan 720 nmol (18h40) 1600 nM formazan (40h40) 480 nmol formazan 1066.7 nmoli formazan Broj na beli kletki vo 1 mm3 6000 Broj na beli kletki vo 1 mL 6000000 (6000h1000) Broj na fagocite vo 1 mL krv (Ne+Mo) Sozdaden formazan na eden fagocit Tabela 1.1: Formular za presmetuvawe NBT. nestimulirana stimulirana 60% (55%+5%) od 6000000 = 3600000 0.0001333 nM formazan/ fagocit (133.3 femtomoli/fagocit) 0.0002963 nM formazan/fagocit (296.3 femtomoli/fagocit) Institut za imunobiologija i humana genetika 15 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM obojuvawe na stimuliranata i nestimuliranata epruveta. 2. Izmereniot otklon se pretvora vo ekstincioni edinici. Na primer, dokolku za stimuliranata epruveta otklonot na kolorimetarot e 0.4, toa zna~i deka ima 40 ekstincioni edinici (1EE ima otklon na kolorimetarot od 0.01). 3. Ekstincionite edinici se pretvoraat vo nanomoli na formazan. Imeno 1 EE odgovara na 40 nanomoli na formazan. Vo na{iot primer 40 EE }e odgovarat na 1600 nanomoli na formazan (40 EE h 40 nanomoli formazan = 1600 nanomoli formazan). 4. Se presmetuva sozdadeniot formazan vo eden mililitar krv. Presmetanite 1600 nanomoli formazan odgovaraat na 1.5 mL krv. So pomo{ na prosto trojno pravilo }e najdeme kolku nanomoli na formazan ima vo 1 mL krv. Vo na{iot primer, vo 1 mL stimulirana krv }e ima 1066.7 nanomoli formazan. 5. Se brojat belite kletki i se doteruva nivniot broj vo 1 mL krv. Na primer, neka so pomo{ na [ilingovata ili Nojbauerovata komora vo 1 mm3 se izbrojani 6000 beli kletki. Toa zna~i deka vo na{iot 1 mililitar krv }e ima 6000000 beli kletki. 6. Se brojat fagocitite vo eden mililitar krv. Ne se fagociti site 6000000 beli kletki. Fagociti vo krvta se samo neutrofilite i monocitite. Taka, ako so leukocitarnata formula utvrdime deka vo na{iot 1 mililitar krv ima 55% neutrofili i 5% monociti, toa zna~i deka od na{ite 6000000 beli kletki samo 3600000 se fagociti. 7. Se presmetuva sozdadeniot formazan na eden fagocit. Vo na{iot primer imame 1 mililitar krv vo koj ima 3600000 fagociti koi sozdale 1600 nanomoli na formazan. Za da utvrdime kolku formazan sozdal 1 fagocit treba vkupnata koli~ina na sozdaden formazan da ja podelime so brojot na fagociti (1600 nmoli formazan / 3600000 fagociti). Na toj na~in dobivame deka eden fagocit sozdal 0.0002963 nanomoli formazan. Dokolku nanomolite gi pretvorime vo femtomoli, }e dobieme deka eden fagocit sozdal 296.3 femtomoli na formazan. Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod) Data Student (ime i prezime) Asistent (potpis i pe~at) ______________ ____________________________ __________________________ 16 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 2: ISPITUVAWE HUMORALEN VRODEN IMUN SISTEM VE@BA 2: ISPITUVAWE HUMORALEN VRODEN IMUN SISTEM 2.1. Proteini na akutna faza (PAF) Prvata reakcija vo organizmot kon imunolo{kiot stres (ili prvata imunolo{ka reakcija) e vrodeniot, nespecifi~en odgovor koj mu prethodi na steknatiot imun odgovor. Akutno fazniot odgovor e zna~ajna sistemska reakcija na organizmot kon lokalnite ili sistemskite naru{uvawa na homeostazata predizvikani od infekcija, tkivno o{tetuvawe, neoplasti~en (malignen) rast ili imunolo{ki naru{uvawa. Na mestoto na navleguvawe na mikroorganizmite i na mestoto na tkivnoto o{tetuvawe zapo~nuvaat serija od odgovori na samoto tkivo. Se osloboduvaat vospalitelni citokini i se aktiviraat vaskularniot sistem i imunite kletki. Vakvite reakcii predizvikuvaat la~ewe na u{te pove}e citokini i drugi vospaliteli medijatori koi minuvaat niz me|ukletkinite prostori, navleguvaat vo krvta i cirkuliraat niz nea. 2.1.1. Akutno fazen odgovor Akutno faznite promeni mo`at da se podelat kako promeni vo koncentracijata na mnogu plazmini proteini, poznati kako proteini na akutna faza (PAF) (Tabela 2.1) i vo golem broj promeni vo odnesuvaweto, fiziolo{kite procesi, biohemiskite reakcii i ishranata (Tabela 2.2). Kako protein na akutna faza se definira onoj protein ~ija koncentracija se menuva (pozitivno ili negativno) za vreme na vospalitelnoto zaboluvawe. Promenite vo koncentracijata na proteinite se najmnogu zavisni od sintetiziraweto vo crniot drob. Goleminata na promenite varira od okolu 50% kaj ceruloplazminot i komplementnite proteini do nad 1000 pati vo slu~aite na C-reaktivniot protein i serumskiot amiloid A (plazmin prethodnik na amiloid A koj sozdava vtori~ni skladi{ta vo tkivata) (Slika 2.1). Institut za imunobiologija i humana genetika Tabela 2.1: ^ovekovi proteini na akutna faza (PAF). Proteini ~ija {to plazmatski koncentracija se zgolemuva (pozitivni PAF) Glavni PAF: C-reaktiven protein Alfa1 kisel glikoprotein Serumski amiloid A Komplementen sistem: K3 K4 K9 Faktor B C1 inhibitor C4b vrzuva~ki protein Manoza vrzuva~ki protein Sosiruva~ki i fibrinoliti~en sistem: Fibrinogen Plazminogen Tkiven plazminogenski aktivator Urokinaza Protein S Vitronektin Plazminogen-aktivatorski inhibitor 1 Antiproteazi: Alfa1 proteazen inhibitor Alfa1 antihimotripsin Pankreati~en sekretoren tripsinski inhibitor Transportni proteini: Ceruloplazmin Haptoglobin Hemopeksin U~esnici vo vospalitelen odgovor: Izla~ena fosfolipaza A2 Lipopolisaharid vrzuva~ki protein Interleukin 1 receptorski antagonist Granulociten kolonii stimulira~ki faktor Proteini ~ija {to plazmatskia koncentracija se namaluva (negativni PAF): Albumin Transferin Transtiretin alfa2-human serum glikoprotein Alfa fetoprotein Tiroksin vrzuva~ki globulin Insulinoviden faktor za rast 1 Faktor 12 17 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Slika 2.1: Karakteristi~en oblik na promeni vo plazminite koncentracii na nekoi proteini na akutna faza posle lesno vospalenie. Naj~estite sostojbi koi doveduvaat do zna~ajni promeni vo koncentracijata na proteinite na akutna faza vo plazmata se: infekcijata, traumata, operacijata, izgorenicite, tkivniot infarkt, razli~ni imunolo{ki ostvareni i vospalitelni sostojbi pottiknati so kristali i naprednatiot malignen proces (kancer). Umereni promeni nastanuvaat posle: intenzivno ve`bawe, toploten udar i poroduvawe. Mali promeni nastanuvaat posle psiholo{ki stres i nekolku psihijatriski zaboluvawa. Iako koncentracijata na skoro site proteini na akutna faza se zgolemuva istovremeno, nivniot porast ne e uniformen kaj site pacienti so ista bolest. Zatoa, febrilnite pacienti mo`at da imaat normalna koncentracija na C-reaktiven protein, no da imaat promeni vo drugi komponenti od proteinite na akutnata faza. Individualnata razlika vo reguliraweto koncentracijata na proteinite na akutna faza sugerira deka kaj sekoja edinka ima la~ewe na razli~ni citokini vo razli~ni koncentracii vo razli~ni patolo{ki sostojbi. 2.1.2. Regulacija na akutno faznite promeni Akutno fazniot odgovor e reakcija na organizmot kon naru{uvaweto na homeostazata (vnatre{nata sredina) predizvikana od infekcija, tkivno o{tetuvawe, malignen rast ili imunolo{ko naru{uvawe (Slika 2.2). Akutno fazniot odgovor se sostoi od lokalna reakcija na mestoto na o{tetuvaweto karakterizirano so brojni 18 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 2: ISPITUVAWE HUMORALEN VRODEN IMUN SISTEM reakcii, kako {to se slepuvawe (agregacija) na krvnite plo~ki (trombociti), sozdavawe sosirok (koagulum), pro{iruvawe i propuslivost na krvnite sadovi, kako i nasobirawe i aktivacija na ednojadreni kletki (granulociti, monociti) koi osloboduvaat citokini. Dopolnitelno, aktiviranite fibroblasti i endotelni kletki se osposobeni da la~at citokini. Ovie medijatori dejstvuvaat vrz specifi~nite receptori od razli~ni celni kletki doveduvaj}i do sistemska reakcija obele`ena so treska, zgolemen broj beli kletki (leukocitoza), zgolemena sedimentacija na crvenite kletki, zgolemeno la~ewe adreno kortikotropen hormon (AKTH) i glikokortikoidi, aktivacija na komplementnata i sosiruva~kata skala (kaskada), smaleno nivo na `elezo i cink vo plazma, negativna azotna ramnote`a i dramati~ni promeni vo Institut za imunobiologija i humana genetika Slika 2.2: Stapkite na akutno fazniot odgovor vo organizmot. 19 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM koncentracijata na nekoi plazmatski proteini. Ovie proteini se nar~uvaat akutno fazni proteini (Slika 2.2). Tabela 2.2: Vidlivi promeni kaj lu|eto pri akutno fazen odgovor. Nevroendokrini promeni: Treska, pospanost i gubitok na apetit. Zgolemeno la~ewe kortikotropen osloboduva~ki faktor, kotrikotoropin (AKTH) i kortizol. Zgolemeno la~ewe arginin vazopresin. Zgolemeno nadbubre`no la~ewe kateholamini. Hematopoetski promeni: Slabokrvnost (anemija) od dolgotrajna bolest. Zgolemeni beli kletki (leukocitoza). Zgolemeni krvni plo~ki (trombocitoza). Metabolni promeni: Gubitok na muskuli i negativen azoten bilans. Smalena glukoneogeneza. Osteoporoza. Zgolemeno sozdavawe masti vo crn drob. Zgolemena lipoliza vo masnoto tkivo. Smalena lipoprotein lipazna aktivnost vo muskulite vo masnoto tkivo. Kaheksija. Crnodrobni promeni: Zgolemen metalotionein, inducirana azoten oksid sintetaza, hem oksigenaza, mangan superoksid dizmutaza i tkiven inhibitor na metaloproteinaza-1. Smalena aktivnost na fosfoenolpiruvat karboksilaza. Promeni vo neproteinskite delovi od plazmata: Hipocinkemija, hipoferemija, hiperkupremija. Zgolemena plazma koncentracija na retinol i glutation. 20 Krajnata cel na proteinite od akutnata faza e da se otstranat naru{uvawata na homeostazata i da se vospostavi zdrava odbrambena funkcija vo organizmot, {to se definira kako negativna povratna sprega ili celosno vozobnovuvawe. Nemo`nosta da se otstranat naru{uvawata vo homeostazata doveduvaat do pozitivna povratna sprega, odnosno hroni~no vospalenie (desno na Slika 2.2). 2.1.2.1. Indukcija na proteinite od akutna faza so citokini i drugi signalni molekuli Citokinite se vnatrekleto~ni signalni polipeptidi koi gi sozdavaat aktiviranite kletki. Pove}eto citokini proizleguvaat od pove}e kletki, vlijaat na pove}e celni kletki i imaat pove}ekratni dejstva. Citokinite koi se sozdavaat za vreme na vospalenieto i u~estvuvaat vo vospalitelnite procesi, se glavnite stimulatori na proteinite na akutnata faza. Vo vospalitelno asociranite citokini spa|aat interleukin-6, interleukin-1beta, tumor nekrozniot faktor alfa, interferonot-gama, transformniot faktor za rast-beta, i verojatno interleukin-8. Tie se sozdavaat od razli~ni vidovi kletki, no niven najva`en izvor se makrofagite i monocitite na mestoto na vospalenieto. Interleukin 6 (IL-6) e glavniot stimulator na sozdavaweto na pove}eto akutno fazni proteini, dodeka drugite citokini imaat vlijanie na oddelni podgrupi od akutno faznite proteini. Pokraj negoviot efekt vrz crnodorobnite kletki, IL-6 dejstvuva i vrz nekolku drugi celni kletki (Slika 2.3). Citokinite dejstvuvaat i kako skala (kaskada) i kako mre`a vo pottiknuva~koto dejstvo za sozdavawe proteini na akutna faza. Mnogu citokini mo`at da go reguliraat sozdavaweto na drugi citokini i citokinski receptori. Na primer, tumor nekrozniot faktor-alfa e glavniot pottiknuva~ vo sozdavaweto interleukin-1 kaj pacienti so revmatoiden artrit (revmatsko vospalenie na zglobovite), a interleukin-1beta mo`e da go zgolemi ili da go namali sozdavaweto na sopstvenite receptori. Osven toa, citokinite se delovi od edna kompleksna signalna mre`a. Kletkite mnogu retko se izlo`eni samo kon eden citokin. Naj~esto kletkite se izlo`eni kon kombinacija od citokini so razli~ni biolo{ki dejstva. Efektite na citokinite vrz celnite kletki mo`at da bidat inhibirani ili stimulirani so drugi citokini, so hormoni, so citokinski receptorski antagonisti i so cirkulira~ki receptori. Kombinaciite od citokinite mo`at da imaat adidtivni, inhibitorni ili sinergisti~ki efekti. Ekspresijata na genite za akutno faznite proteini glavno se regulira na transkripcisko nivo, no u~estvuvaat i posttranskripciskite mehanizmi. Post-translaciskite Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 2: ISPITUVAWE HUMORALEN VRODEN IMUN SISTEM promeni vo glikozilacijata na plazmatskite proteini za vreme na vospalitelniot odgovor vklu~uva o{tetuvawe na oligosaharidnite granki, zgolemeno sijalirawe na orozomukoidot i smalena galaktozilacija na IgG. Promenite vo oligosaharidnite granki se pottiknuvat od vospalitelnite citokini, nezavisno od nivnite efekti vrz sozdavaweto akutno fazni proteini. Kone~no, efikasnosta na la~ewe C-reaktiven protein (CRP), proces razli~en od negovata sinteza, zna~itelno se zgolemuva za vreme na akutno fazniot odgovor. 2.1.2.2. Regulacija na drugite akutno fazni promeni so vospalitelno asociranite citokini Treskata e izraz na nevroendokrinite promeni koi go obele`uvaat akutno fazniot proteinski odgovor. Iako mo`at nekolku citokini da pottiknat treska, sozdadeniot interleukin-6 vo mozo~noto steblo e neophoden za krajnite stapki koi predizvikuvaat treska. Me|utoa, citokinite ne se edinstvenite pottiknuva~i na treskata. Najnovite naodi deka subdijafragmatskata vagotomija ja blokira treskata predizvikana od vnatreperitonealna (no ne i vnatremuskulna) injekcija od lipopolisaharidi uka`uva na neuralen prenos na febrilniot odgovor. Drugite nevroendokrini promeni se odnesuvaat na kompleksnite soodnosi pome|u citokinite, hipotalamo-hipofiznonadbubre`nata oska i drugi delovi od nevroendokriniot sistem. Na primer, vospalitelnite citokini go stimuliraat sozdavaweto kortikotropin osloboduva~ki faktor so posledovatelno zgolemeno la~ewe na adreno kortikotropen hormon (AKTH) i kortizol i direktna stimulacija na nadbubre`nata `lezda. Zgolemenoto la~ewe arginin Institut za imunobiologija i humana genetika Slika 2.3: Pleotropnite (pove}ekratnite) dejstva na interleukin-6 vo akutno fazniot odgovor. 21 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM vazopresin pod dejstvo na interleukin-6 ja objasnuva hiponatriemijata koja se javuva posle nekoi vospalitelni zaboluvawa (Slika 2.4). Slika 2.4: Regulacija na crnodrobnata sinteza na akutno faznite proteini so vospalitelnite medijatori. Promenite vo odnesuvaweto se ~esto pati prisutni vo vospalenieto, vklu~uvaj}i go gubeweto apetit (anoreksija), pospanost (somnolencija), i slabost (letargija) i mo`at da bidat pottiknati so citokinite. 2.1.3. Funkcii na akutno fazniot odgovor Vospalenieto e kompleksen, visoko orkestriran proces vo koj se vklu~eni mnogu vidovi kletki i molekuli, od koi edni zapo~nuvaat, zasiluvaat ili odr`uvaat procesi, drugi go spre~uvaat, a treti ovozmo`uvaat procesot da se vozobnovi. Mnogu od akutno faznite proteini imaat potencijal da vlijaat vrz eden ili vrz pove}e od stapkite na vospalenie. Glavnata funkcija na C-reaktivniot protein, del od vrodeniot humoralen imun sistem, e negovata sposobnost da go vrze fosfoholinot i na toj na~in da prepoznae nekoi tu|i predizvikuva~i kako i fosfolipidnite strukturi od o{tetenite kletki. C-reaktivniot protein mo`e da go aktivira komplementniot sistem ako se vrze za nekoj od negovite ligandi, kako i da se vrze za fagocitnite kletki {to se objasnuva so negoviot istovremen efekt vrz otstranuvaweto na celnite kletki i preku humoralnite i preku kleto~nite imuni sistemi. 22 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 2: ISPITUVAWE HUMORALEN VRODEN IMUN SISTEM Serumskiot amiloid A e sostaven od familija apolipoproteini koi brzo se vrzuvaat za lipoproteinite so visoka gustina (HDL) posle nivnoto sintetizirawe i vlijaat vrz holesterolskiot metabolizam za vreme na vospalenieto. Serumskiot amiloid A predizvikuva prilepuvawe (adhezija) i hemotaksija na fagocitnite kletki i na limfocitite i mo`e da pridonese do vospalenie na ateroskleroti~nite koronarni arterii so zgolemuvawe oksidacijata na lipoproteinite so niska gustina (LDL). Nekolku akutno fazni proteini zapo~nuvaat ili odr`uvaat vospalenie. Klasi~nite komplementni komponenti, od koi pogolemiot del se akutno fazni proteini, imaat centralna proinflamatorna uloga vo imunitetot, kako {to ima manoza vrzuva~kiot protein. Komplementnata aktivacija doveduva do hemotaksija, cedewe na plazminite proteini vo vospalenoto mesto, i opsonizacija na vospalnitelnite predizvikuva~i i o{tetenite kletki. Sprotivno, drugi akutno fazni proteini mo`at da prika`at protivvospalitelno dejstvo. Na primer, antioksidansite haptoglobin i hemopeksin go {titat organizmot od reaktivniot kislorod. Alfa1-proteazniot inhibitor i alfa1-antihimotripsinot ja spre~uvaat aktivnosta na proteoliti~kite enzimi. Lekuvaweto na ranata go ovozmo`uva fibrinogenot preku prilepuvawe na endotelnite kletki, rasejka, razrasnuvawe i reparacija na tkivata, dodeka haptoglobinot pomaga vo vozobnovuvaweto na tkivata so stimulirawe na angiogenezata (sozdavawe novi krvni sadovi). Slika 2.5: Turbidimetar (Turbitajmer) od firmata Bering (gore) i maksimalna brzina na reakcija i reakciono vreme zavisno od koncentracijata na protivgenot (dolu). 2.2. Opredeluvawe koncentracija na akutno fazni proteini so imunoturbidimetrija 2.2.1. Principi na imunoturbidimetrija Proteinite na akutna faza vo telesnite te~nosti se merat so pove}e metodi, od koi kaj nas se koristi imunoturbidimetrijata so aparatot turbitajmer (Slika 2.5, gore). Merniot sistem na turbidimetrijata bazira na principite na kineti~ka turbidimetrija. Turbitajmerot meri istovremeno dva parametri: Tabela 2.3: Maksimalna brzina na reakcija i reakciono vreme za reakcijata IgG/ protivIgG. 1. brzinata na maksimalna reakcija (Vmax) na sozdadeniot talog; i 2. vremeto potrebno da se postigne Vmax (tVmax) (Tabela 2.3). Ako se postavat ovie vrednosti nasproti koncentracijata, se dobiva grafikon kako na Slika 2.5. Slika 2.5 (dolu) poka`uva deka, ako se zemat oddelno, nitu Institut za imunobiologija i humana genetika 23 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Slika 2.6: Tridimenzionalna kalibraciska kriva za imunoturbidimetrija (levo). ^itawe kalibraciska kriva za imunoturbidimetrija od liniski kod (desno). krivata za Vmax nitu za tVmax se precizni (nedvojbeni). Me|utoa, ako se zemat dvata signali zaedno, jasno e deka samo edna vrednost mo`e da se dobie vrz osnova na dvete izmereni krivi so Turbitajmerot. Sostavot na reagensite garantira deka dvete krivi se komplementarni edna na druga. Merewata se izvr{uvaat na branova dol`ina od 340 nm (nanometri). Mereweto na kratkite branovi ovozmo`uva da se otkrijat mali koncentracii od protivgen/protivtelo kompleksi, koi se formiraat samo nekolku sekundi posle me{aweto na reagensot i primerokot. Svetlosniot snop se sozdava vo ksenonski izvor i se prenesuva so dvokanalna kvarcna fibro optika. Svetlosniot snop koj navleguva vo kivetata se registrira sekoi 0.1 sekunda i se analizira so precizna kombinacija od softver i hardver. Slika 2.7: Opredeluvawe tempera-turata (levo), temperaturnata kompenzacija zapo~nuva koga }e se vnese {i{enceto so reagens (desno). 2.2.2. Kalibracija 24 Za sistemot na Turbitajmer ne e neophodno da se napravi kalibraciskata kriva od korisnikot, nitu da se napravi kalibracija so merewe na edna to~ka. Reakciskite parametri Vmax i tVmax za opredelena koncentracija se Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 2: ISPITUVAWE HUMORALEN VRODEN IMUN SISTEM merat na razli~ni temperaturi (+18oC do +32oC) za vreme na kalibraciskata postapka. Parametrite Vmax, tVmax i koncentracijata se prika`uvaat vo eden grafikon, koj sozdava tridimenzionalna kriva (Slika 2.6, levo). Ovaa kriva ne dozvoluva neprecizni (dvojbeni) rezultati koi se dobivaat od Hajdelberger-Kendalovata (Heidelberger-Kendall) kriva. Kalibraciskite krivi se utvrduvaat za sekoj reagens i broj na lotot (prozvodstven broj). Tie krivi se pretvoraat vo liniski kod (barkod) koi se pe~atat i se vnesuvaat so sekoj reagens. Tie treba da bidat pro~itani samo edna{ za sekoj reagens i broj na lotot (Slika 2.6, desno). 2.2.3. Sistem za temperaturna kompenzacija Kinetskoto merewe na imunoprecipitaciskata reakcija zavisi od temperaturata. Turbitajmerot koristi nova tehnika za da se izbegne periodot na zagrevawe. Toa se postignuva so avtomatsko merewe na temperaturata vo reakciskata smesa (Slika 2.7). Vrz osnova na ovaa postapka kalibraciskata kriva matemati~ki se koregira za realno izmerenata temperatura. Temperaturata na nosa~ot na kivetata (TBI) i na {i{eto so reagens (TB0) se merat direktno, dodeka T BI ja dava sobnata temperatura. Reagensnata temperatura (T AS) se presmetuva od T B0. Mereweto temperatura zapo~nuva koga }e se stavi {i{eto so Turbikvant reagens. Aparatot prifa}a temperaturna varijacija pome|u +18 i +320C. 2.2.4. Procedura 1. Se vnesuva {i{eto Turbikvant vo prostorot za reagensi. Procesot na temperaturna kompenzacija zapo~nuva vedna{ (Slika 2.8). 2. Se prigotuva razreduvawe na primerokot zavisno koja belkovina na akutna faza ili imunoglobulin merime (Tabela 2.4). 3. Se pipetiraat 50 mkL od prethodno razredeniot primerok vo kivetata od Turbitajmerot. 4. Se vnesuva kivetata vo instrumentot. 5. Se pipetiraat 50 mkL od reagensot. Me{aweto na reagensot i primerokot, kako i mereweto i pe~ateweto na rezultatite se ostvaruva avtomatski bez intervencija na korisnikot. Dodeka e mereweto vo tek (okolu 30 sek), se prigotvuva sledniot primerok. 6. Izmerenite rezultati se vnesuvaat vo Tabela 2.5. Institut za imunobiologija i humana genetika Slika 2.8: [ematski prikaz za imunoturbidimetrisko opredeluvawe na akutno fazni proteini. 25 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Tabela 2.4: Protokoli za turbidimetrisko merewe belkovini na akutna faza. 2.3. Zada~a Izmeri koncentracija na nekoj od proteinite na akutna faza so imunoturbidimetar i vnesi ja dobienata vrednost vo Tabela 2.5. Tabela 2.5: Vnesuvawe rezultati od turbidimetrisko merewe belkovini na akutna faza. Razreduvawe na primerokot Protein na akutna faza Volumen na primerokot Plazmatska koncentracija vo mg/L Transferin Albumin Haptoglobin Alfa-1 kisel glikoprotein C-reaktiven protein Apo A1 Apo B Antitrombin-3 K4 Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod) Data Student (ime i prezime) Asistent (potpis i pe~at) ______________ ____________________________ __________________________ 26 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 3: ANALIZA NA VRODEN IMUN SISTEM VE@BA 3: ANALIZA NA VRODEN IMUN SISTEM 3.1. Tolkuvawe rezultati od vroden imun sistem 3.1.1. Normalni vrednosti od ispituvawe kleto~en vroden imun sistem Sekoja laboratorija ima svoi normalni vrednosti i gi iska`uva na razli~en na~in. Naj~esto rezultatite se iska`uvaat kvalitativno vo procenti. Toa zna~i 50% NBT bi zna~elo deka 50% od fagocitnite kletki na oboen preparat od periferna krvna slika od ispitanikot ima sini obojuvawa vo citoplazmata od fagocitite, odnosno ima pozitivni fagocitni kletki. Poretko, rezultatite se iska`uvaat kako kvantitativni vrednosti ili kako nano moli sozdaden formazan vo mL krv, ili kako femtomoli sozdaden formazan vo eden fagocit. Nie presmetuvame vo femtomoli sozdaden formazan vo eden fagocit. Normalnite vrednosti za NBT testot vo na{ata laboratorija iznesuvaat za: Nestimuliran primerok = 124 femtomoli/fagocit; ANALIZA NA SLU^AJ Stimuliran primerok = 293 femtomoli/fagocit. Iako NBT testot se koristi za pove}e nameni, sepak najzna~ajnata primena ima vo otkrivaweto na bolesta hroni~na granulomatozna bolest (HGB). Dijagnozata na HGB mo`e da se postavi kako najverojatna dijagnoza za HGB ili kako kone~na dijagnoza za HGB. Najverojatna dijagnoza za HGB: Pacient ili pacientka so nepravilen (abnormalen) NBT test ili respiratoren kolaps vo aktiviranite neutrofili (pomalku od 5 % od kontrolata) koj ima edno od slednive: 1) Hroni~na infekcija (vo hepar; perirektalen ili belodroben absces; adenitis ili osteomielitis) predizvikana od stafilokoki; Institut za imunobiologija i humana genetika Hroni~na granulomatozna bolest: Slu~ajot na Dame Vidoevski, blisku do smrtta od retki bakterii i gabi~ki. 27 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 2) Difuzen granulom vo respiratoren, gastrointestinalen ili urogenitalen trakt; 3) Neuspeh (zastoj) vo razvojot i hepatosplenomegalija ili limfadenopatija. Kone~na (zavr{na) dijagnoza za HGB: Pacient ili pacientka so nepravilen (abnormalen) NBT test ili respiratoren kolaps vo aktiviranite neutrofili (pomalku od 5 % od kontrolata) koj ima edno od slednive: 1) Mutacija vo gp91, p22, ili p67 phox; 2) Otsustvo na mRNK za eden od gorenavedenite geni so Northern blot analiza; 3) Rodnini od majkata, vujkovci ili vnuci so abnormalen NBT test ili respiratoren kolaps. Dijagnosti~ka vrednost na NBT testot:Bidej}i dolna granica na HGB iznesuva 5% od vrednosta kaj zdravite i za najverojatnata dijagnoza i za kone~nata dijagnoza za HGB, toa zna~i deka od 0 do 5% relativen odnos kaj kvalitativniot test, kako i 0 do 6.2 femtomoli/fagociti kaj nestimuliran NBT ili 0 do 15 femtomoli/fagociti kaj stimuliraniot NBT bi bile elementi za hrni~na granulomatozna bolest. Spektar na bolesta: Kaj pacientite so Iks-vrzana forma na HGB (60-70% od pacientite), bolesta se javuva mnogu porano i vo pojaka forma (po`estok oblik) za razlika od pacientite so avtozomno recesivno nasledeni formi. Tabela 3.1: Normalni vrednosti za nekoi proteini na akutna faza. m, ma{ki; `, `enski. 28 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 3: ANALIZA NA VRODEN IMUN SISTEM Najgolem del od pacientite so Iks-HGB imaat zastoj vo razvojot, te{ki bakteriski adenitisi, abscesi ili osteomielit u{te vo prvata godina od `ivotot. Naj~estite infekcii se pneumonija ili limfadenitis predizvikani od katalaza-pozitivni organizmi (osobeno Staphylococcus) ili fungi. Simptomite od strana na intestinalniot trakt ili obstrukcii na urinarniot trakt se predizvikani od granulomski formacii. Retko, vo dvete formi (i Iks vrzanata i avtozomno recesivnata), prvite simptomi ne se prepoznaeni se do polnoletstvoto. 3.1.2. Klini~ka primena na akutno faznite proteini Normalnite vrednosti na nekoi od proteinite od akutnata faza koi se koristat na Institutot za imunobiologija i humana genetika se dadeni na Tabela 3.1. Glavnite primeni na mereweto akutno fazni proteini se: vo sledeweto kako napreduva aktivnosta na ve}e dijagnosticirana bolest, za ocenuvaweto odgovor kon dadenata terapija vo vospalitelnite zaboluvawa, kako i za otkrivawe komplikacii kaj ve}e poznata bolest (Tabela 3.2). Tabela 3.2. Najzna~ajnite primeni vo mereweto akutno fazni proteini. 1. Sledeweto kako napreduva aktivnosta na ve}e dijagnosticirana bolest. 2. Ocenuvaweto odgovor kon dadenata terapija kaj vospalitelnite zaboluvawa (na primer, revmatoiden artrit, juvenilen hroni~en artrit, ankilozira~ki spondilit, Rajterov sindrom, psorijati~na artropatija, vaskuliti i revmatska treska. 3. Otkrivawe komplikacii kaj ve}e poznata bolest (na primer, skladirawe imuni kompleksi, postoperativna infekcija). Vo imunolo{kata dijagnostika na zaboluvawata se koristat pove}e od 20 proteini na akutna faza. Najgolemiot del od niv se glikoproteini (Tabela 3.3). Mereweto koncentracijata na C-reaktiven protein (CRP) vo plazma ili vo serum mo`e da razlikuva vospalitelna od nevospalitelna sostojba i e presudno za lekuvawe na pacientovata bolest. Vo nekoi bolesti (kako {to e revmatoidniot artrit), seriskoto merewe CRP ima prognosti~ka vrednost. Doktorite treba da vnimavaat koga gi ~itaat rezultatite od CRP bidej}i ponekoga{ tie se iska`uvaat kako mg na litar (mg/L), a drugi laboratorii gi iska`uvaat kako mg na decilitar (mg/dL). Obi~o koncentracijata na serumskiot amiloid A gi sledi Protein Normalna koncentracija (g/L) Koncentracija vo akutno vospalenie (g/L) Vreme za odgovor (~asovi) C-reaktiven protein 0.0008-0.004 0.4 6-10 Alfa1antihimotripsin 0.3-0.6 3.0 10 Alfa1- antitripsin 2.0-4.0 7.0 24 Orozomukoid 0.5-1.4 3.0 24 Haptoglobin 1.0-3.0 6.0 24 Fibrinogen 2.0-4.5 10.0 24 K3 0.55-1.2 3.0 48-72 K4 0.2-0.5 1.0 48-72 Ceruloplazmin 0.15-0.6 2.0 48-72 Institut za imunobiologija i humana genetika Tabela 3.3. Primeri za klini~ka upotreba na akutno faznite proteini. 29 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM ANALIZA NA SLU^AJ Postoperativna infekcija: Slu~ajot na Qubica Gora~inova posle holecistektomija. Tabela 3.4. Prisustvo na Creaktivniot protein vo bolestite. Redovno prisuten Povremeno prisuten Otsuten Aktivna revmatska groznica Akuten miokarden infarkt Karcinom Streptokokna infekcija Pnevmonija Preikardit Revmatoiden artrit Pielit Nefrit Tuberkuloza Ko`ni zaboluvawa Gorni respiratorni infekcii Bubre`ni zaboluvawa Lokalni infekcii koncentraciite na CRP, iako vo nekoi studii e poka`ano deka serumskiot amiloid A e poosetliv obele`uva~ za vospalitelno zaboluvawe. Denes, mereweto na serumskiot amiloid A ne e {iroko prifateno. Vo momentov, naj~esto upotrebuvani pokazateli za akutno fazniot odgovor se sedimentacijata na eritrociti i plazmatskata koncentracija na CRP. Sedimentacijata na eritrociti glavno zavisi od koncentracijata na fibrinogen vo plazma. Kako ispituvawe, sedimentacijata na eritrociti ima prednosti zatoa {to e poznato, ednostavno i postoi literatura vo minatite sedumdeset godini. I pokraj toa, mereweto na CRP ima nekolku prednosti nad sedimentacijata na eritrociti. Sedimentacijata na eritrociti e indirektno merka za koncentracijata na proteinite od akutnata faza i mo`e da bide pod golemo vlijanie na goleminata, oblikot, brojot na crvenite kletki (eritrocitite) kako koncentracijata na imunoglobulinite.Poradi toa, rezultatite od sedimentacijata na eritrociti se neprecizni i ponekoga{ bez zna~ewe. Sedimentacijata na eritrociti se smeta kako zastaren metod za indirektno ispituvawe fibrinogenot vo plazmata bidej}i denes postojat direktni i precizni metodi za negovo merewe. So menuvaweto sostojbata na pacientot (podobruvawe ili vlo{uvawe), sedimentacijata na eritrocitite malku se menuva, dodeka koncentracijata na CRP vo plazma naglo se menuva. [iro~inata na patolo{kite vrednosti za CRP se mnogu po{iroki otkolku tie za sedimentacija na eritrociti so posledici vo dijagnosticiraweto: kaj pacientite so koncentracija na CRP vo plazma pogolema od 100 mg/L, 80 do 85% imaat bakteriska infekcija. Sedimentacijata na eritrociti postojano se zgolemuva so vozrasta, dodeka koncentracijata na CRP vo plazma ne se menuva. Me|utoa, mnogu pacienti so aktiven sistemski lupus eritematozus nemaat visoki koncentracii na CRP vo plazma, no imaat za vreme na bakteriska infekcija. Primenata na ova soznanie za diferencijalna dijagnoza na treska kaj pacienti so sistemski lupus eritematozus e limitirano so naodite deka koncentrcaijata na CRP vo plazma e zgolemena i kaj bolnite so aktiven lupuzen serozit ili kaj hroni~en sinoviit. Zdravite lica imaat koncentracija na plazma CRP od 2 mg/ L ili pomalku, no nekoi imaat koncentracii do 10 mg/L (Tabela 3.1). Podocne`nite ispituvawa poka`aa deka vrednostite pod 10 mg/L nemaat klini~ko zna~ewe. Sepak, koncentracijata na CRP pod 10 mg/L, no zna~ajno nad vrednostite vo zdravata populacija poka`uva zna~ajna povrzanost so osteoartriot, a mo`e da predvidi i podocne`en koronaren sindrom. Poradi toa se smeta deka lesno zgolemenite koncentracii (od 2 do 10 mg/L) bi mo`ele da uka`uvaat na lesna hroni~na vospalitelna reakcija vo organizmot. Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod) Data Student (ime i prezime) Asistent (potpis i pe~at) ______________ ____________________________ __________________________ 30 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 4: KLETKI VO IMUNIOT SISTEM BLOK 2 BLOK 2 - IMUNI KLETKI U^EBNI CELI: VE@BA 4. KLETKI VO IMUNIOT SISTEM (1 ~as) Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat: da dvojat limfociti i monociti od periferna krv; kako da koristat imunofluorescencija. VE@BA 5. PROTO^NA CITOMETRIJA (1 ~as) Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat: osnovni elementi na proto~nata citometrija; da opredelat B-Li i T-Li od periferna krv. VE@BA 6. ANALIZA NA SLU^AI OD KLETO^EN IMUNITET (1 ~as) Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat da: tolkuvaat rezultati od proto~na citometrija; analiziraat slu~ai od kleto~en imunitet. POENI: PRISUSTVO 1.5 poeni ZNAEWE 3.0 poeni VKUPNO: 4.5 poeni Institut za imunobiologija i humana genetika 31 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 32 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 4: KLETKI VO IMUNIOT SISTEM VE@BA 4: KLETKI VO IMUNIOT SISTEM 4.1. Dvoewe limfociti i monociti od periferna krv 4.1.1. Op{ti napomeni So pomo{ na centrifugirawe ili gradienti so razli~na gustina, kako i koristeweto na svojstvoto na razli~na atherencija, kleto~nite elementi od krvta(limfociti, monociti, granulociti, trombociti) mo`e da se izdvojat edni od drugi. Denes postojat poslo`eni i posovremeni metodi, kakvi {to se proto~nata citometrija i separacijata so monoklonski protivtela. Od prakti~ni pri~ini (polesna aplikacija, ekonomi~nost) ovde }e bidat prika`ani najupotrebuvanite metodiki. Pred s#, primerokot krv treba da se zeme so soodveten protivkoagulans, zavisno od potrebata - koi kletki treba da se separiraat. Isto taka, neophodno e da se koristi plasti~na ambala`a za zemawe i dvoewe na kletkite, koja za nekoi potrebi e zadol`itelno da bide sterilna. Dokolku se koristi staklena ambala`a, taa treba da bide silikonizirana. Postapka za silikonizirawe: epruvetkite i drugata staklarija koja treba da se silikonizira, prethodno dobro se ~isti i se mie so 2 -3 % rastvor na NaOH, a potoa dobro se isplaknuva so destilirana voda i se su{i. Taka podgotvenata staklarija se potopuva vo rastvorot od silikon i vedna{ se isceduva. Potoa se plakne so obi~na voda (ovoj del treba da se raboti so za{titni rakavici i na otvoren prostor bidej}i silikonot i negovite isparuvawa se toksi~ni). Vaka silikoniziranata staklarija se su{i 24 ~asa na sobna temperatura, a podobro vo su{ara na 100oC za 10 min. Se obele`uva, posebno se ~uva i e spremna za upotreba. Institut za imunobiologija i humana genetika 33 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 4.1.2. Postapka za dvoewe limfociti od periferna krv Limfocitite se imunokompetentni kletki-nositeli na humoralniot i kleto~niot imunitet. Se delat na T, B i KPU limfociti, a ovie ponatamu se delat na suppopulacii. Tie naj~esto se oddeluvaat od drugite kletki od periferna krv so metodot na centrifugirawe so pomo{ na gradient fikol-triozil. Bidej}i fikolot e polisaharid so ograni~ena mo`nost za gustina, vo nego se dodava natrium metrizoat (triozil, hipak, joduron i sl.) za da se zgolemi negovata gustina. Ovoj gradient e so gustina od 1.077, a limfocitite imaat pomala gustina i }e ostanat nad nego, dodeka drugite kletki }e patuvaat kon dnoto. Potreben e sledniov materijal i oprema: puferiran fiziolo{ki rastvor(PFR), fikol (limfoprep, fikol-pak), hranliv medium (Henks, RPMI-1640 ili Parker 199), silikonizirani plasti~ni epruvetki ili plasti~ni epruvetki 12 * 75 mm, centrifuga so horizontalen rotor, pasterovi pipeti i heparin. Izveduvawe na testot: 1. Se zema venskata krv so venepunkcija vo heparinizirana epruvetka ili vo plasti~en {pric so dodatok od 100 IE heparin na 10 mL krv. Krvta mo`e da se me{a vo epruvetka so ednakov volumen na puferiran fiziolo{ki rastvor, ili da se koristi bez razreduvawe. 2. Se prigotvuva rastvor za dvoewe limfociti (Se podgotvuva 9.2% fikol vo destilirana voda i se autoklavira. Se me{aat 43.4 mL Fikolov rastvor so 6.6 mL Triozil 75). Postojat i gotovi sterilizirani rastvori za dvoewe limfociti od razli~ni kompanii (limfoprep, limfopak i drugi). 3. Se stavaat 2 mL od rastvorot za dvoewe limfociti vo graduirana epruvetka i vrz nego se nalevaat 2 mL od nerazredenata ili 4 mL od razredenata krv. Krvta se nanesuva vnimatelno so pipeta po yidot od epruvetkata, vnimavaj}i da ne se izme{a so rastvorot za dvoewe limfociti. Toa najdobro se postignuva so iskosuvawe na epruvetkata pod agol od 45 stepeni (Slika 4.1:A). Vtorata varijanta e da se vnese najprvin krvta vo epruvetkata, a podocna da se vnese rastvorot za dvoewe limfociti so igla i {pric na dnoto od epruvetkata (pod krvta) ili da se napravi so pipeta na ist na~in (Slika 4.1:B). Slika 4.1:Postapka za dvoewe limfociti od periferna krv. A, nanesuvawe krv vrz slojot od rastvor za dvoewe limfociti (limfopak) so pipeta. B, nanesuvawe rastvor za dvoewe limfociti pod prethodno naneseniot sloj krv so {pric i so igla. 34 4. Epruvetkite se centrifugiraat vo horizontalen rotor na 300 g za 15 minuti na 4oC. Po zavr{enoto centrifugirawe se dobivaat pet sloja vo peruvetkata. Najgore se nao|a slojot od plazma i trombociti, pod nego se nao|a sloj od limfociti i monociti, pod niv se nao|a slojot od rastvorot za dvoewe limfociti (limfopak), potoa tenok sloj od granulociti, i najdolu se nao|aat crvenite kletki (eritrociti). Crvenite kletki se najte{ki i poradi toa se smestuvaat na dnoto Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 4: KLETKI VO IMUNIOT SISTEM od epruvetkata po centrifugiraweto na krvta (Slika 4.2:gore). 5. So pasterova pipeta vnimatelno se sobiraat limfocitite od tenkiot me|usloj i se prenesuvaat vo drugi dve graduirani epruvetki (nekoi ja vikaat ovaa postapka `neewe na limfociti). Treba da se vnimava da ne se zema od dolniot sloj (rastvorot za dvoewe limfociti) bidej}i ima pogolema gustina i }e go spre~i uspe{noto plaknewe na limfocitite. Nekoi prepora~uvaat najprvin da se otstrani najgorniot sloj (plazmata ili razredenata plazma), a potoa da se sobiraat limfocitite (Slika 4.2:dolu). 6. Vo epruvetkite se dodava hranliv medium i se plaknat tri pati po centrifugirawe na 150 g za 10 min na 4oC. Ovaa postapka se izveduva za da se otstranat, kolku e mo`no pove}e, krvnite plo~ki (trombocitite) od limfocitite. 5. Supernatantot se otfrla i talogot od limfocitna suspenzija se doteruva so hranliv medium spored baranata koncentracija (potreben broj kletki vo 1 mL suspenzija). Ovaa postapka se izveduva so browe na limfocitite vo komora za broewe kletki. Prika`uvawe i tolkuvawe na rezultatite: Na gradientot od fikol zaostanuvaat ne samo limfocitite tuku i monocitite, pa zatoa e pravilno da se ka`e deka ovoj metod gi dvoi ednojadrenite (mononuklearnite) kletki. Prisustvoto na drugi kletki mo`e da se kontrolira so mikroskopski pregled na oboena razmaska od dobienata suspenzija. Dokolku vo natamo{noto koristewe na kletkite, monocitite zna~ajno interferiraat, tie mo`at dopolnitelno da se izdvojat so inkubirawe na kletkite vo plasti~ni epruvetki 2 ~asa na 37 o C. So ogled deka monocitite se atherentni kletki, tie }e ostanat na dnoto. Trombocitite se dvojat so pove}ekratno miewe na kletkite na pomal broj vvm (vrtewa vo minuta, okolu 200 g, 10 min). Mo`e da bidat prisutni i eritrociti, {to osobeno se slu~uva pri izdvojuvawe limfociti od krv od bolni so maligni bolesti, avtoimuni, sistemski bolesti, bolni na dijaliza ili, pak, politransfundirani, odnosno transplantirani bolni vo faza na otfrlawe. Toga{ eritrocitite se otstranuvaat so hemolizirawe. Se koristat destilirana voda i hipertoni~en Henksov pufer (na 100 mL ve}e podgotven Henksov pufer se dodava 2.5 g NaCl). Kleto~nata suspenzija se stava 30 sekundi vo kontakt so destilirana voda i potoa vedna{ se dodava hipertoni~en Henksov pufer (odnosot e voda : Henksov hipertoni~en pufer = 3:1). 4.1.3. Broewe kletki so hemocitometar Za broeweto kletki vo hemocitometar potrebno e slednovo: suspenzija od kletki, 0.5% eozin vo 0.9% natrium hlorid, komora za broewe kletki (modificirana Nojbauerova komora (Neubauer)) so pokrivno staklo, svetlosen mikroInstitut za imunobiologija i humana genetika Slika 4.2:Raspored na sloevite po centrifugirawe na krvta vrz rastvor za dvoewe limfociti (gore). Postapka za sobirawe limfociti od me|uslojot na ednojadreni kletki so pasterova pipeta ili so avtomatska pipeta (dolu). 35 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Slika 4.3: Mre`a na modificirana Nojbauerova komora za broewe kletki. Vo ~etirite agolni kvadrati broime ako ima pove}e kletki, dodeka vo pette kvadrat~iwa od centralniot kvadrat broime koga ima pomalku kletki. skop (po mo`nost so fazen kontrast), etanol 75%, detergenet za ~istewe. 1. Komorata za broewe i pokrivnoto staklo se mijat vnimatelno so detergent, voda i alkohol i vnimatelno se su{at. Nad komorata se dodava pokrivno staklo. 2. Se dodavaat 10 mkL kleto~na suspenzija i 10 mkL eozinski rastvor vo mali epruvetki (10 h 50 mm) i vnimatelno se me{a. 3. Me|u pokrivnoto staklo i komorata za broewe se dodavaat okolu 10 mkL oboena suspenzija. 4. Se ~eka 1 min kletkite da se istalo`at i se gledaat kletkite pod objektiv 20. Eritrocitite se mali ~isti kletki; limfocitite se so sli~na golemina, no temni pod fazen kontrast; polimorfonuklearnite leukociti se golemi i temni, trombocitite se kako mali temni to~ki, mrtvite se oboeni crveno bidej}i eozinot gi boi mrtvite jadra. Slika 4.4:Broewe limfociti vo edno kvadrat~e od hemocitometar. Se brojat kletkite vnatre, na leviot i gorniot rab. Na ovaa slika ima vkupno 25 kletki. 36 5. Modificiranata Nojbauerova komora ima 4 kvadratni milimetri vo aglite vo koi se brojat leukociti i eden centralen vo koj se brojat eritrociti, trombociti i leukociti (Slika 4.3). Centralniot kvadraten milimetar e podelen na 25 kvadrat~iwa oddeleni so trojni linii, a sekoj od niv e podelen na 16 mali kvadrat~enca. Volumenot {to go zafa}a edno malo kvadrat~e pod pokrivnoto staklo iznesuva 0.004 mm3. 6. Se brojat limfocitite i mrtvite kletki vo pet golemi kvadrati (vo 80 mali kvadrat~iwa). Ako e vkupniot broj pomal od 100, toga{ se brojat vo site 25 kvadrati (400 mali kvadrat~iwa). Broeweto vo edno kvadrat~e Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 4: KLETKI VO IMUNIOT SISTEM go vr{ime po~nuvaj}i od gornoto levo kvadrat~e i zavr{uvaj}i vo dolnoto levo kvadrat~e. Gi broime site limfociti vnatre vo kvadrat~eto, kako i tie na levata i gornata linija od kvadrat~eto, dodeka tie na desnata i dolnata linija ne se brojat (Slika 4.4). 7. Vkupniot broj kletki vo originalnata suspenzija e ednakov na brojot na kletkite vo pet golemi kvadrati h 105 vo 1 mL suspenzija. 4.1.4. Ispituvawe `ivi i mrtvi kletki Mora da se podvle~e deka site ispituvawa vo ovaa kniga se izvedeni na `ivi kletki. Kletkite ostanuvaat `ivi dokolku se ~uvaat na 00C (vo mraz i voda), osven limfocitite od morsko svin~e koi mora da se ~uvaat na sobna temperatura. 1. Kletkite treba brzo da se prigotvat, da se vnesat vo medium i da se upotrebat. Op{to zemeno, limfocitite ne izdr`uvaat `ivi vo ladilnik ostaveni preku no}. Membranata na `ivata kletka ne dozvoluva navleguvawe boja vo vnatre{nosta i spored ovaa osobina mo`at da se razlikuvaat mrtvite od `ivi kletki. Za ovaa namena postojat pove}e boi: tripansko sinilo, eozin, nigrozin i drugi. Za ovaa postapka potrebni se slednive materii: 0.2% tripansko sinilo vo fiziolo{ki rastvor, hemocitometar (modificirana Nojbauerova komora za broewe kletki), suspenzija od kletki, svetlosen mikroskop, vodeno bawa (37oC), epruvetka (najdobro polistirenska, 12 h 75 mm). 2. 1. Vo plasti~na epruvetka se vnesuvaat 0.1 mL od kleto~nata suspenzija i 0.1 mL od boja tripansko sinilo. Epruvetkata se inkubira 3 min na 37oC, se vadi i se ostava 5 min na sobna temperatura. 2. Modificiranata Nojbauerova komora se postavuva na svetlosen mikroskop, se nao|a mre`ata i se nanesuva pokrivno staklo. 3. Vo prostorot me|u pokrivnoto staklo i komorata se vnesuva suspenzija od oboenite kletki, se ~eka 1 min kletkite da se istalo`at i se brojat kletkite. 4. Kletkite se brojat vo pette mali kvadrati od centralniot kvadrat i toa se brojat site kletki (neoboeni i oboeni) i oddelno se brojat samo mrtvite kletki, onie koi se so oboeni jadra. 5. Pod mikroskop so fazen kontrast `ivite limfociti prosvetluvaat, dodeka mrtvite kletki se gledaat kako temni krugovi (Slika 4.5). 5. Procentot na `ivi limfocoti se presmetuva spored slednava formula: @ivi % = (Broj na `ivi kletki *100)/Vkupen broj kletki Institut za imunobiologija i humana genetika 3. Slika 4.5: Limfociti poglednati so fazen kontrast: 1. Inverten mikroskop so fazen kontrast; 2. Sve`i limfociti vo odli~na sostojba; 3. Toplotno o{teteni limfociti (zagreani na 45oC). Mrtvite kletki se gledaat kako temni krugovi, a vo nekoi kletki ima piknoti~ki jadra. 37 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 4.2. Imunofluorescencija Slika 4.6: Spektrite na apsorpcija (polna linija) i na emisija (isprekinata linija)na fluoresceinot (A) i na rodaminot (B). intenzitet na luminiscencija A intenzitet na luminiscencija Imunofluorescentnite tehniki imaat visoka osetlivost i specifi~nost na reakcijata protivgen-protivtelo, kako i mo`nost za direktno mikroskopsko prika`uvawe na imunite kompleksi vo tkiva i kletki. Za da se ovozmo`i imunofluorescencijata, neophodno e eden od reaktivite vo reakcijata prethodno da e obele`en so nekoj fluorohrom. Fluorohromite se boi koi imaat svojstvo da apsorbiraat svetlina so pomala branova dol`ina, pri {to del od apsorbiranata svetlina se pretvora vo svetlosno zra~ewe od vidniot spektar so zna~aen intenzitet. Ovoj proces se ozna~uva kako FLUORESCENCIJA (slika 4.6). Vo imunohistohemijata kako otkriva~ki reagensi se koristat protivtela obele`eni so soodvetni fluorohromi. Obi~no se upotrebuvaat fluorohromi koi raspolagaat so hemiski aktivni grupi pogodni za kowugirawe na protivteloto so B frluorohromot. Pri kowugiraweto, zna~ajno e da se so~uva imunolo{kata aktivnost na obele`enoto protivtelo. Koi fluorohromi }e se upotrebat zavisi od supstancijta koja }e se fiksira(proteini, DNK, RNK, mitohondrii ili dr.), no naj~esto upotrebuvani fluorohromi se: - fluorescein izotiocijanat (FITC); - tetrametil rodamin izotiocijanat (TMRITC); - rodamin B izotiocijanat (RBITC); - lizamin rodamin B (RB200); - 1-Dimetil-amino-naftalen-5 - sulfonova kiselina (DANCIL); - etidium bromid; - akridin oran`. 38 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 4: KLETKI VO IMUNIOT SISTEM Spomnatite fluorohromi zra~at svetlina so karakteristi~na boja: fluoresceinot i DANCIL-ot zra~at `oltozelena svetlina, dodeka drugite rodaminski soedinenija zra~at portokalovo-crvena svetlina. Site imaat svoj spektar na apsorpcija i spektar na emisija. Na pr. FITC ima tri dela vo spektarot na apsorpcija: eden na 490 nm, drug na 320nm i tret na 280nm, a spektarot na emisija e kon 520nm (Slika 4.7). Pogodnata fluorescencija,osven od kvalitetite na bojata i nejzinata koncentracija, zavisna e i od izvorot na ekscitacija (dene{nite halogeni i `ivini lampi se mnogu pogodni) i od rN na rastvora~ot (najdobar e fiziolo{ki rastvor so rN 7.2-7.4). Imunofluorescentnata tehnika naj~esto se upotrebuva za identificirawe i utvrduvawe lokalizacija na opredelen antigen vo tkivata i kletkite so pomo{ na fluorohromno kowugirano protivtelo so poznata specifi~nost. No mo`e da se koristi i za identificirawe i opredeluvawe na protivtela za {to se potrebni purificirani antigeni markirani so opredeleni fluorohromi. Osnovni fazi vo imunofluorescencijata se: apsorpcioni spektri emisioni spektri Slika 4.7: [ema za spektri na apsorpcija i spektri na emisija na pove}eto fluorohromi. 1. fluorescentna mikroskopija, 2. dobivawe kowugirani protivtela, 3. podgotovki na kletki i tkiva, 4. boewe, ~itawe i dokumentirawe. 4.2. 1. Fluorescentna mikroskopija Za ~itawe na vaka specifi~no podgotvenite preparati (vitalni kletki ili tkiva) neophoden e poseben fluorescenten mikroskop i zatemneta prostorija. Site ovie specifi~nosti dovele do razvitok na t.n. fluorescentna mikroskopija. Fluorescentnata mikroskopija se odlikuva so visok stepen na osetlivost i kontrast vo prikazot. Ako vo obi~nata svetlosna mikroskopija razlikata me|u gustinite od dve zoni iznesuva 1%, taa vo fluorescentnoto prika`uvawe se razlikuva 100%. Postojat dva osnovni vida fluorescentna mikroskopija: fluorescentna mikroskopija so propusno svetlo i fluorescentna mikroskopija so opa|a~ko svetlo (epiosvetluvawe). Ovie dve mo`at da bidat kombinirani so fazen kontrast, kako i so ispituvawe na dve branovi dol`ini (crvena i zelena) so {to se obezebduvaat dopolnitelni mo`nosti (utvrduvawe `ivi i mrtvi kletki). 4.2.1.1. Fluorescentna mikroskopija so propusno svetlo Svetlosta se sozdava vo `ivina lamba so visok pritisok, se odbiva od svetlosnoto ogledalo i se upatuva niz sobirnite le}i do ekscitira~kiot filter, koj oddava fluorescenten snop svetlina. Fluorescentniot snop svetlina minuva niz toplinsko apsorbira~ki filter i se odbiva niz Institut za imunobiologija i humana genetika 39 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM okular reflektor svetlosen izvor sobirni le}i ekscitaciski filter filter objektiv primerok podvi`no masi~e kondenzor filter za toplina ogledalo Slika 4.8: Fluorescenten mikroskop so propusno svetlo. refleksnoto ogledalo, preku kondenzorot vo primerokot. Sekundarniot filter (apsorbira~ki) gi otstranuva drugite svetlosni zraci, osven primarnata fluorescencija, i po zgolemuvaweto se prenesuva do okularot (Slika 4.8). Slika 4.9: Transmisija niz filtrite i pominatite branovi dol`ini so UG1, BG3 i FIF (gore) i Wratten 2 + CG385 (dolu). Kako izvor na svetlina se koristi svetlost so mala branova dol`ina (ultravioletna, violetna ili sina), naj~esto od `ivina lamba pod visok pritisok, smestena vo zatvoren nosa~ i refleksno ogledalo za da gi naso~i zracite kon le}ata. @ivinata lamba ima maksimum na 365 i na 437 nm. Mo`at da se koristat i jodno kvarcna lamba ili ksenonska lamba (Slika 4.8). Zada~ata na prvi~niot (ekscitaciski) filter e da ja propu{ti samo svetlinata so branova dol`ina koja sozdava fluorescencija vo primerokot, dodeka na vtori~niot (apsorbira~ki) filter e da gi zadr`i svetlinite so branovi dol`ini razli~ni od fluorescentnata branova dol`ina vo primerokot, a da ja propu{ti samo fluorescentnata svetlina od fluorohromot. Izborot na primarniot i sekundarniot filter se mnogu zna~ajni za kvalitetite na fluorescentniot mikroskop i zavisat od izvorot na svetlinata i od apsorpcioniot i emisioniot maksimum na fluorohromot. Taka na primer, za FITC }e se zemat filtri koi imaaat apsorpciski maksimum na 492495 nm, a emisionen maksimum na 520-525 nm. Za rodaminskite metodi potrebni se filtri so apsorpciski maksimum na 550 nm i emisionen maksimum na 580 nm (Slika 4.9). 4.2.1.2. Fluorescentna mikroskopija so pa|a~ko svetlo Ovaa mikroskopija ima nekolku prednosti vo sporedba so propusnata: 1) Objektivite se so {irok otvor i mal fokus pa ja koncentriraat ekscitaciskata svetlina vo pomala zona; 2) centriraweto na svetlosta i fokusiraweto kon objektot se vr{at istovremeno; 3) mo`no e istovremeno gledawe pod fazen kontrast so {to se zgolemuva kvalitetot na mikroskopiraweto (Slika 4.10). Tehni~ki e ovozmo`eno gledawe so opa|a~ka svetlost koga se vneseni dihotomnite 40 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 4: KLETKI VO IMUNIOT SISTEM (razdeluva~ki) ogledala niz koi e ovozmo`eno minuvawe na odbienata svetlost od primerokot. Fluorescentniot snop minuva niz ekscitira~kiot filter i pa|a vrz primerokot. Dihroi~noto ogledalo dozvoluva svetlosta da se upati na ednata, no ne i na drugata strana. Po osvetluvaweto na tkivoto, svetlosniot snop se odbiva, minuva niz dihroi~noto ogledalo i se gleda zgolemen vo okularot. okular reflektor svetlosen izvor sobirni le}i sobirni le}i ekscitaciski filter odbiena fluorescentna svetlina filter za toplina napre~en filter dihroi~no ogledalo objektiv primerok podvi`na masi~ka Slika 4.10: Fluorescenten mikroskop so gorno osvetluvawe. 4.2.2. Dobivawe kowugirani protivtela Denes n$ stojat na raspolagawe golem broj visoko kvalitetni kowugati so razli~na specifi~nost, prigotveni od mnogu firmi za skoro sekakva potreba. Nivniot broj postojano raste i se pro{iruva zavisno od potrebata na istra`uva~ite i dijagnosti~arite. Zatoa naj~esto e nepotrebno da se prigotvuvaat sopstveni kowugirani protivtela. Samo vo retki slu~ai, koga nema gotovi kowugati (osobeno pri nekoi originalni istra`uvawa), potrebno e da se prigotvat sopstveni kowugati. Vo takov slu~aj naj~esto se koristi kowugiraweto so fluorescein- izotiocijanat (FITC), so tetrametil-rodamid-izotiocijanat (TMRITC) i so rodamin-B-izotiocijanat (RBITC). Institut za imunobiologija i humana genetika 41 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 4.2.3. Podgotovka na tkiva i kletki Postojat razli~ni podgotovki na supstratot vo tkivata zavisno od celta na ispituvaweto. Vo imunohistohemijata naj~esto se koristat tkivni preparati prigotveni so kriostat. Kriostatnite preparati mo`at da bidat fiksirani ili sve`i. Poretko se koristat preparati kalapeni so parafin. Kletkite mo`at da se ispituvaat ili fiksirani ili pri zapazena vitalnost na kletkite - membranska imunofluorescencija (vidi 2.1 i 2.2). Pri prigotvuvaweto tkivni i kleto~ni preparati za imunofluorescentno ispituvawe, neophodno e: - da se zapazat protivgenite determinanti vo supstratot; - maksimalno da se so~uvaat morfolo{kite strukturi. 4.2.3.1. Tkivni preparati Tkivnite preparati se prigotvuvaat so naglo smrznuvawe na tkivoto, negovo se~ewe u{te dodeka e smrznato ili ~uvawe vo smrznata sostojba do momentot koga }e se se~e. Tkivoto ne smee da se odmrznuva. 1. SMRZNUVAWE SO SO2 I ALKOHOL. Se me{aat par~iwa komprimiran suv jagleroden dveoksid so alkohol (metanol ili aceton) vo termos so {iroko grlo na -70oC. Sme{ata mo`e da se koristi vedna{ ili po nejzino ~uvawe vo zamrznuva~. Tkivoto (mali par~enca do 5 mm debelina) se vnesuvaat na dnoto od {iroka epruvetka, se zatvora so gumen zatvora~ i se vnesuva na dnoto na termosot. Zamrznuvaweto nastanuva momentalno. Smrznatoto par~ence se vadi so ladna pinceta i se stava vrz mikrotomnata masi~ka, na koja prethodno bila stavena kapka puferiran fiziolo{ki rastvor. Par~enceto tkivo se pritiska so par~ence suv mraz (zadol`itelno da se nosat azbestni rakavici) za da se zalepi na masi~kata. Blokot se prefrla vo kriostat i po dvaesetina minuti (za da se izedna~at temperaturite) se se~e so debelini zavisni od celta na ispituvaweto. 2. SMRZNUVAWE VO TE^EN AZOT. Tkivoto se postavuva vrz kapka puferiran fiziolo{ki rastvor na mikrotomnata masi~ka i se potopuvaat zaedno vo te~en azot. Smrznuvaweto nastapuva vedna{. Ponekoga{ se zabele`uvaat puknatinki vo primerokot. 3. SMRZNUVAWE VO IZOPENTAN. Se vnesuva izopentan vo metalen ili plasti~en sad koj celosno se potopuva vo te~en azot za da se izladi. Koga na dnoto od izopentanot }e se zabele`at matni kapki, zna~i deka temperaturata e blizu negovoto mrznewe. Vo toj moment se vnesuva tkivoto vo izopentanot isto kako i vo to~ka 1. (Smrznuvawe so CO2 i alkohol). Vo ovaa modifikacija ne nastanuva napuknuvawe na tkivoto, no e mo`no delumno rastvorawe na tkivnite strukturi (i da se dobie poslaba fluorescencija od normalno) ili da se otkrijat nekoi protivgeni determinanti (i da se dobijat popozitivni fluorescentni naodi od normalno). 42 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 4: KLETKI VO IMUNIOT SISTEM 4. FIKSIRAWE NA KRIOSTATSKITE ISE^OCI. Kriostatskite ise~oci mo`e da se koristat nefiksirani ili fiksirani zavisno od rastvorlivosta i otpornosta na protivgenot kon fiksatorot. Imunoglobulinite i kompleksite protivgen-protivtelo se fiksiraat vo etanol, metanol ili aceton (kratkotrajno i na ladno). Pri doka`uvawe pnevmokokni polisaharidi, hormon za rast i drugi mo`e da se fiksira so 4% puferiran formalin (rN 7.2-7.4). 4.2.3.2. Parafinski preparati Se koristat pri nedostatok na kriostat i mo`nosti za smrznuvawe na tkivata. Pogodni se za ispituvawe imunoglobulini i komplement vo bubre`ni biopsii, imunoglobulini vo plazmatskite kletki i na revmatoiden faktor vo tkivata, no ne i za ispituvawe protivjadreni protivtela. 1. Fiksacijata na tkivata so debelina od 5 mm se vr{i vo 95% alkohol na 4oC za eden ~as. Potoa tkivoto se se~e na 2-4 mm i se ostava vo 95% alkohol na 4oC vo tek na 15-20 ~asa. 2. Dehidriraweto na tkivoto se vr{i niz ~etirikratno minuvawe niz apsoluten alkohol, na 4oC (sekoe po 1-2 ~asa). 3. Osvetluvaweto se vr{i niz trikratno minuvawe na tkivoto niz laden ksilen na 4oC (sekoe po 1-2 ~asa). 4. Kalapeweto vo parafin se vr{i so ~etirikratno minuvawe na tkivoto vo te~en parafin (sekoe po 1-2 ~asa) na 56oC vo termostat. 5. Se~eweto na preparatite se izveduva kako za rutinsko parafinsko se~ewe. Treba da se izbegnuva zagrevawe na ise~ocite pri nivno stavawe vrz predmetno staklo. 6. Deparafiniraweto se vr{i dvokratno vo laden ksilen (sekoe po 10-15 sekundi). 7. Plakneweto se vr{i trikratno so puferiran fiziolo{ki rastvor (po 1 min vo sekoe minuvawe). 4.2.3.3. Kleto~ni preparati Pred boeweto intrakleto~ni antigeni se prepora~uva fiksacija na kletkite vo 1% puferiran paraformaldehid za 15 min na pH 7.2. Potoa kletkite se plaknat i se vnesuvaat vo `elatinski kapsuli (5% `elatin i 5% govedski serumski albumin). Vaka prigotvenata suspenzija se zamrznuva i se se~e kako za tkivnite preparati (vidi pogore). Postojat specifi~ni postapki za oddelni vidovi kletki (timociti, mielomski kletki i drugi), kako i za izveduvawe imunofluorescentni istra`uvawa vo metodiki koi baraat kletkite da bidat `ivi (citotoksi~ni testovi, klasi na diferencijacija i sl.). Ovie postapki korisnicite treba da gi konsultiraat pred da po~nat so rabota. Institut za imunobiologija i humana genetika 43 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 4.2.4. Boewe, ot~ituvawe i dokumentirawe Postojat dva vida metodiki, koi spored mehanizmot na reakciite se delat na direktna i indirektna imunofluorescencija (mnogu sli~no kako protivglobulinskata reakcija na Coombs). 4.2.4.1. Direktna imunofluorescencija (DIF) Vo ovaa tehnika, protivserumot {to sodr`i protivtela e ve}e markiran so fluorohrom i direktno stapuva vo reakcija so soodvetniot antigen od ise~okot na tkivoto ili od `ivite kletki, pa reakcijata se odviva vo "edno vreme". (slika 67). Reakcijata e pogodna za otkrivawe antigeni na bakterii, limfociti, detekcija na antitela i sekako za koristewe dvojno boewe (imunofluorescencija so upotreba na dva fluorohromi- tipi~en primer e dvojnoto boewe so etidium bromid i akridin oran` pri razlikuvaweto mrtvi od `ivi kletki kaj limfocitotoksi~niot test). Me|utoa, testot mo`e da bide la`no pozitiven; bara rabotewe so ~ist materijal, isklu~uvawe na strani~nata ekstrafluorescencijata i osobeno izrazit afinitet, aviditet i specifi~nost me|u antigenot i protivtelata. So direktnata direktna imunofluorescencija indirektna imunofluorescencija indirektna komplementno zasilena imunofluorescencija protivtelo protivtelo plaknewe plaknewe flouresceinirano protivtelo tkiven ise~ok plaknewe dodadi flouresceinirano protiv Ig protivtelo dodadi komplement plaknewe Slika 4.11: Mehanizmi na direktna imunofluorescencijaobele`uvawe na protivgenot so primarno protivtelo (levo); direktna imunofluorescencija so fluorosceiniran protiv Ig (sredina); indirektna komplement zasilena imunofluorescencija (desno). 44 plaknewe dodadi flouresceinirano protiv C3 protivtelo plaknewe Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 4: KLETKI VO IMUNIOT SISTEM imunofluorescencija mo`e da se determiniraat i protivtela koga antigenot e poznat i markiran so opredelena fluorescentna boja. Ovoj na~in poretko se koristi. 4.2.4.2. Indirektna imunofluorescencija (IIF) Indirektnata imunofluorescencija se koristi pri otkrivaweto protivtela i avtoprotivtela, koi se naso~eni kon opredeleni antigeni vo kletkite i tkivata. Svrzuvaweto na tie protivtela so soodvetniot antigen vo supstratot se utvrduva so pomo{ na kowugati so gama globulin (nespecifi~en protivglobulinski kowugat) ili so kowugati kon oddelni klasi imunoglobulini. Metodot mo`e da se upotrebi za doka`uvawe protivtela sozdava~ki kletki kon opredelen antigen, dokolku raspolagame so soodvetniot antigen i kowugirano protivtelo naso~eno kon ispituvaniot antigen. IIF mo`e da se upotrebi i koga ne e mo`no direktno obojuvawe poradi nedostatok na sootveten kowugat. Vo takov slu~aj, supstratot go tretirame so neobele`eno protivtelo (mo`e i so serum), a nastanatata imunolo{ka reakcija ja doka`uvame so dopolnitelno boewe so specifi~en protivglobulinski kowugat (na primer, protiv IgG1). Vo osnova na ovaa tehnika, koja se odviva vo "dve vremiwa", e modifikacijata na indirektnata protivglobulinskata reakcija (Kumbsov test) ili tehnikata koja sodr`i dvojni protivtela. Imunokompleksot se formira so inkubacija na antigenot vo supstratot so neobele`eno protivtelo. Potoa se dodava obele`eniot so fluorohrom protivglobulinski serum (Slika 4.11). Indirektnata imunofluorescencija ima prednosti pred direktnata. Taa e mnogu poosetliva (ponekoga{ i do deset pati), a mo`at da se koristat pove}e vidovi specifi~ni ispituvawa so ist kowugat kon op{tite imunoglobulini ili nekoi od nivnite supklasi (protiv nuklearnite, protiv bazalnomembranskite i drugi protivtela mo`at da se otkrijat so isti kowugirani imunoglobulini). Polispecifi~niot protivglobulinski serum ovozmo`uva da se otkrijat imunokompleksite od site vidovi reakcii so protivtela od ista vrsta, kako i protivtelata koi koristat komplement bidej}i protivglobulinskiot serum mo`e da sodr`i i protivtela specifi~ni za komponentite na komplementot. 4.2.4.3. Sistemot biotin-avidin Poznato e deka biotinot (vitamin so slaba molekularna masa, rastvorliv vo voda) ima svojstvo lesno da se povrzuva so ogromen broj najrazli~ni biolo{ki molekuli. Taka toj mo`e mnogu cvrsto da se vrze i so avidinot (4 molekuli biotin se vrzuvaat so edna od avidinot). Avidin e glikoprotein koj se dobiva od albuminot od jajceto; ima molekulska masa od 68.000 i mo`e lesno da se obele`i so fluorohrom na pr. FITC ili rodamin, pri {to pove}e molekuli fluoroboja se vrzuvaat za edna molekula avidin.Taka, vo ovaa reakcija se koristat svojstvata na biotinot {to mo`e lesno da se vrze za protivtelata so kovalentna vrska (Slika Institut za imunobiologija i humana genetika 45 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 4.12), a potoa i so avidinot koj ve}e sme go obele`ale so nekoja fluoroboja. Pri ispituvaweto na protivtelata so ovoj sistem, reakcijata zapo~nuva so postavuvawe na serumot vo kontakt kade se ispituvaat protivtelata i soodvetniot antigen. Potoa se dodava protivprotivteloto (sli~no kako pri protivglobulinskiot test na Coombs ) obele`eno so biotin. Za da bide reakcijata vidliva, na kraj se dodava avidin obele`an so fluorohrom. Se dobiva mnogu jasna fluorescencija, a reakcijata e mnogu osetliva bidej}i otkriva i najmali koncentracii antitela zatoa {to tie se biotinilizirani - zna~i pove}e molekuli biotin se vrzuvaat za edna molekula od protivteloto i ovoj nov kompleks pak preku biotinot formira mnogu cvrsta vrska so dodadeniot avidin obele`en so fluorohrom. Ovie cvrsti vrski ovozmo`uvaat mo}na i jasna fluorescencija. Na takov na~in, reakcijata izrazito e amplificirana bez da se vlijae vrz to~nosta na rezultatot. Vo ovoj sistem, isto taka mo`e da se koristi obele`uvawe so dva fluorohromi. avidin imunoglobulin peroksidaza Slika 4.12: Mehanizam na avidin biotin-peroksidazen test za opredeluvawe imunoglobulini. biotin 4.2.4.4. Kvantitativna imunofluorescencija Glavniot nedostatok na imunofluorescencijata e subjektivnosta pri ot~ituvawe intenzitetot na imunofluorescencijata. Denes ima razvieno nekolku tehnolo{ki postapki za kvantifikacija na imunofluorescencijata. So pomo{ na mikrofluorometar mo`e precizno da se izmeri koli~inata na svetlo so opredelena branova dol`ina koja ja pra}a fluorescentniot primerok. Razvieni se imunofluorescentni testovi za kvantificirawe na IgG, IgA, IgM, Ce3, Ce4 i drugi materii vo histolo{kite preparati, kako i protivjadreni i protiv DNK protivtela. Koli~inata na fluorescentnite protivtela vrzani za nerastvorliviot protivgen se merat so posebno vgradeni mikrofluorimetri i se pretvoraat vo mg% so pomo{ na standardna prava dadena od proizvoditelot na opremata i/ili na hemikaliite. 46 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 4: KLETKI VO IMUNIOT SISTEM 4.2.4.5. Gre{ki i la`no pozitivni rezultati Ponekoga{ vo imunofluorescentnite ispituvawa se javuvaat gre{ki i la`no pozitivni rezultati koi se dol`at na nespecifi~ni imunolo{ki reakcii. Nespecifi~ni boewa mo`at da se dobijat poradi lo{o pre~istuvawe na kowugatite i prisustvo na fluorohromirani neimunoglobulinski materii vo niv. Nespecifi~ni boewa mo`at da se dobijat pri nesoodvetno mrznewe na primerocite, grebnatinki na predmetnoto staklo, lo{o prilepuvawe na primerokot vrz stakloto, prisustvo na bakterii (koi apsorbiraat kowugat) vo kowugatot ili pak, nekroti~ni promeni vo tkivata. ^esto nespecifi~no boewe prika`uvaat granulite na eozinofilnite leukociti {to mo`e zna~itelno da se namali so apsorpcija so crnodroben prav. Golema grupa `ivotinski tkiva (koi se koristat kako supstrat za doka`uvawe tkivno specifi~ni protivtela vo serumot od bolni lu|e) mo`e da dade la`no pozitivni rezultati zaradi heterospecifi~nite protivtela vo ispituvaniot serum, osobeno ako toj e so visok titar. Pri ispituvawe membranski imunoglobulini kaj B-limfocitite, potrebno e da se utvrdi brojot na monociti vo suspenzijata. Potpolnoto otstranuvawe na monocitite e te{ko i so golemi gubitoci na B-limfocitite, zatoa e najdobro da se utvrdi nivniot broj so fazen kontrast ili so dopolnitelno boewe na preparatite za peroksidaza. Treba da znaeme deka nekoi tkivni i kleto~ni materii imaat karakteristi~na avtofluorescencija (kalciumovite talozi, lipofuscinot i vitaminot A (`olta boja), riboflavinot (`oltozelena boja), porfirinite (temno crvena boja) i sli~no. 4.2.4.6. Dokumentirawe na rezultatite (fotografirawe) Fotografiraweto na fluorescencijata zna~ajno ne se razlikuva od obi~noto mikroskopsko fotografirawe. Obi~no me|u aparatot i objektivot se postavuva filter (naj~esto OGI). Vremeto na ekspozicija zavisi od ja~inata na filmot Slika 4.13: Inverten fluorescenten mikroskop so mo`nost za fotografirawe (Nikon, Diaphot 300). Institut za imunobiologija i humana genetika 47 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM i se opredeluva od iskustvo (od 10 sekundi do 20 min). Ekspozicija podolga od 20 min ne dava dobri rezultati zatoa {to doa|a do "gasnewe" na fluorescencijata po prodol`enoto osvetluvawe. Dobri rezultati davaat crno belite ili kolor filmovi so golema osetlivost (na pr. od 400 do 1.600 ASA). 4.3. Zada~a Odvoi limfociti od ~ovekova periferna krv i opredeli go brojot na `ivite i na mrtvite kletki vo 1 mL. Izbroj kolku limfociti ima vo dadeniot mililitar Henksov medium i nivniot broj doteraj go do 2*106 vo 1 mililitar. Rezultatite vnesi gi vo Tabela 4.1. Tabela 4.1: Tabela za vnesuvawe rezultati od izdvoenite limfociti. Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod) Data Student (ime i prezime) Asistent (potpis i pe~at) ______________ ____________________________ __________________________ 48 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 5: PROTO^NA CITOMETRIJA VE@BA 5: PROTO^NA CITOMETRIJA 5.1. Sistem za proto~na citometrija Prvite citometri bazirani na svetlina, bea malku pove}e od te~na pateka, izvor na ekscitacija i fotodetektor. Kako i pove}eto instrumenti, i proto~nite citometri stanuvaat sofisticirani aparati koi kombiniraat, te~nosti, optika, elektronika i softver so {to se ovozmo`uva mereweto da bide na mikroskopski ~esti~ki so brzina od pove}e desetici ilijadi vo sekunda. Ovie instrumenti go iskoristija razvojot na pove}e tehnolo{ki dostignuvawa (kako poluprovodnici i telekomunikacii),so {to ja zgolemija to~nosta i doverbata so zna~itelno namaluvawe na goleminata. Institutot za imunobiologija i humana genetika raspolaga so proto~en citometar CyAnADP od firmata DAKO. Aparatot ima tri laseri so mo`nost za analizirawe kletki so pet boi i soodveten softver za analiza (Slika 5.1). Slika 5.1: Sistem za proto~na citometrija CyAnADP od firmata DAKO na Institutot za imunobiologija i humana genetika. Institut za imunobiologija i humana genetika 49 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Slika 5.2: [ematski prikaz na proto~en citometar. 5.1.1. Proto~na citometrija Pripremenite primeroci ~esti~ki koi treba da se ispituvaat, go po~nuvaat svoeto patuvawe niz proto~niot citometar u{te vo epruvetakata za primerokot (plo~ka so pove}e bunar~iwa ili nekoj sli~en nosa~). Koga }e pristapime kon analiza, primerokot se vsmukuva (aspirira) od epruvetkata i se prenesuva (transportira) niz cev~iwa do proto~nata kiveta ili prskalkata. Vo proto~nata kiveta, primerokot se vnesuva vo centarot na najbrziot proto~en nosa~ i patuva do svetlosniot izvor koj se ekscitira (Slika 5.2). Svetlosnoto rasejuvawe i/ili fluorescencijata se registrira, spektralno se filtrira i se naso~uva kon soodvetnite fotodetektori za konverzija vo elektri~ni signali. Elektronskoto kru`ewe se koristi za obrabotka na ovie signali za analiza, klasifikacija, kategorizacija i ~uvawe na podatocite. Za sortirawe, sekoja ~esti~ka se sledi vo instrumentot kako {to minuva niz centralniot mlaz, se oddeluva od nego i kako polarizirana ~esti~ka se sortira. Kapkata pominuva niz elektri~no pole i na krajot se sobira vo soodveten kontejner za ponatamo{no analizirawe ili izu~uvawe, ili se frla kako otpad. 5.1.2. Te~ni sistemi Slika 5.3: Hidrodinami~nite osobini na te~nostite vo vrvot na proto~nata igla od citometarot. 50 Te~nite sistemi na proto~niot citometar se koristat za transportirawe na ~esti~ki od slu~ajna tridimenzionalna suspenzija na primerocite do ureden protok na ~esti~ki koi patuvaat niz eden ili pove}e osvetluva~ki branovi.Vo Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 5: PROTO^NA CITOMETRIJA sorterite ovie ~esti~ki se transportirani vo elektri~no provodliv te~en nosa~. Te~niot sistem ~esto koristi regulacija so vozdu{en pritisok za stabilno rabotewe i se sostoi od najmalku edna mlazna linija i linija na primeroci za snabduvawe na proto~nata kiveta. So vleguvawe na primerokot vo komorata od proto~nata kiveta, nadvore{nata, brza mlazna te~nost, hidrodinami~no ja fokusira te~nosta vo tesen centralen mlaz od edine~ni ~esti~ki do izvorot na ekscitacija (Slika 5.3). Ovaa geometrija ovozmo`uva zgolemena to~nost za pozicionirawe na to~kata od laserskoto ispituvawe, za postojanosta na ekscitira~koto zra~ewe i vo golema mera go namaluva blokiraweto na ~esti~kite vo proto~nata kiveta. Za instrumentite samo za analiza, proto~nata kiveta ima tipi~na kvadratna ili pravoagolna forma so dimenzii od redot na nekolku stotici mikroni. Za sorterite te~nosta izleguva od prskalkata niz kru`en otvor (obi~no so dijametar 50 -200 mikrometri) i se sozdava kontinuiran mlaz pred da se rasprsne vo kapki. Vo zavisnost od dizajnot na instrumentot, ~esti~kite se ili ispituvaat dodeka se vo proto~nata kiveta, ili koga izleguvaat i se zadr`uvaat vo mlazot vo vozduhot. Po ispituvaweto primerokot se isfrla vo otpadot, osven ako ne se pobara sortirawe na ~esti~kite. Za da se odre‘i vklu~uvaweto i ~isteweto na instrumentot, obi~no e obezbedena vakum linija. 5.1.3. Opti~ki sistem Opti~kiot sistem e klu~en za proto~nata citometrija - za osvetluvawe na obele`enite i neobele`enite ~esti~ki kako i za otkrivawe (detekcija) na rasprskanite i fluroscentnite svetlosni signali. Ekscitacija i emisija. Pove}eto proto~ni citometri koristat eden ili pove}e laseri za kleto~na ekscitacija. Emisijata, vo forma na svetlosno rasprsnuvawe, se javuva koga svetlinata od ekscitacijata e absorbirana i potoa povtorno rasprostraneta od ~esti~kite koi gi ispituvame, bez promena vo branovata dol`ina. Rasprskuva~ot e, tipi~no, najsilen vo direktnoto naso~uvawe, vo odnos na incidentnata drazba od izvorot.Fluorescencija se javuva koga molekulata e nadrazneta od svetlinata so edna branova dol`ina, a se vra}a na ponisko nivo so emitirawe na svetlina so podolga branova dol`ina. Svetlinata od emisijata i ekscitacijata, koja vo toj moment e od vi{okot branovi dol`ini, mo`e da bide blokirana ili diferencirana so opti~ki filter. Nekoi kleto~ni komponenti mo`at da se izmerat so primena na nekolku izvori na ekscitacija i nekolku kleto~ni obele`uva~i koi emitiraat na razli~ni branovi dol‘ini. Ovaa klu~na sposobnost za otkrivawe (detektirawe) na fluroscencija, istovremeno od pove}e razli~ni komponenti vrzana za edna ili pove}e kletki, doveduva proto~nata citometrija da bide tehnika na izbor za pove}eparametarski fluroscentni analizi na kleto~nite populacii. Institut za imunobiologija i humana genetika Slika 5.4: Dihroi~ni filtri (gore) i apsorpciski filtri (dolu) ovozmo`uvaat prostorno odvojuvawe na svetlinata. 51 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Sobirawe na svetlinata. Vo voobi~aenite proto~ni citometri,svetlinata se sobira preku dve le}i, nare~eni predna i strani~na le}a za sobirawe, zavisno od nivnata postavenost kon vleguva~kiot laserski snop svetlina. Prednata sobira~ka le}a ja sobira rasprsnatata svetlina okolu centarot na vlezniot snop. Podatocite od ovaa le}a se koristat za opredeluvawe goleminata na ~esti~kite. Strani~nata sobirna le}a ima golem otvor za efikasno sobirawe na fluorescencijata i sobira svetlina postavena 90 stepeni (perpendikularno) na svetlosniot lasrski snop. Strani~noto sobirawe se koristi za razlikuvawe na kletkite vrz osnova na nivniot izgled (morfologija). Opti~ki filtri. Koga fluorescentnata svetlina od kletkata e ulovena od sobira~kite le}i, spektralniot del koj ne interesira za sekoj obele`uva~ mora prostorno da se odvoi zaradi detekcija. Ova odvojuvawe na branovite dol`ini se postignuva so dihroni~ni (45 stepeni) i emisioni filtri. Dolgobranovite filtri dozvoluvaat transmisija na dolgi branovi dol`ini, a kratkobranovite na kratki branovi dol`ini. Selektivnite filtri dozvoluvaat pominuvawe na odredeni branovi dol`ini koi ni se od interes, dodeka ostanatite nesakanite branovi dol`ini ne gi propu{ta (Slika 5.4). Detektori. Dvata glavni tipovi na fotodetektori koi se koristat vo proto~nata citometrija se silikonskite fotodiodi i fotomultiplikaciski cevki. Silikonskite fotodiodi obi~no se koristat za naso~eno rasprskuva~ka detekcija, kade {to nivoto na signalot e visok. Dodeka fotomultiplikaciskite cevki imaat visoka senzitivnost, i zatoa se zadol`eni za strani~niot rasprskuva~ i fluroscentnata detekcija. Elektronika. Ulogata na elektronikata e za nadgleduvawe i kontrola na raboteweto na proto~niot citometar, od momentot na otkrivawe na ~esti~kata koja pominuva niz fokusot na laserot, do fizi~koto skr{nuvawe na taa ~esti~ka vo sadot za sobirawe. Koga ~esti~kata od interes pominuva niz fokusot, fluorescira, i e zabele`ana od fotodetektorot, se sozdava elektri~en signal, a elektronikata go obrabotuva toj signal. Ovoj instrument se vklu~uva koga ovoj signal go nadminuva odnapred odredenoto nivo na {umot. Ovoj {um se koristi prvenstveno za da gi otfrli slu~uvawata koi ne se predizvikani od ~esti~kite, kako {umovi od opti~kite i elektronski izvori. Pulsnite karakteristiki se determinirani od goleminata i brzinata na ~esti~kite, {irinata na osvetluva~kiot bran, a vo slu~aj na fluroscencija, od distrubucija na flurohromi vo ~esti~kata. Slika 5.5: Osobini na pulsnite merewa. 52 Razli~nite formi na obrabotka na pulsnite karakteristiki ovozmo`uva razli~nite merewa da se napravat od ist signal kako visina na vrv, integral (povr{ina), {irina, kosina, itn (Slika 5.5). Vo nekoi slu~ai, linearnata amplifikacija i analizata na fluroscencijata ili rasprsnuvaweto e soodvetna so osobinite na ~esti~kite, kako {to e slu~aj kaj DNK ispituvawata. Vo mnogu slu~ai, kako kaj studiite na imnunofenotipizacija, mereweto i Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 5: PROTO^NA CITOMETRIJA na obele`enite i neobele`enite ~esti~ki, bara merewe na pove}e golemini. Za da se postigne ovoj {iroko dinami~en rang, se koristat razli~ni analogni, digitalni ili hibridni elektronski sistemi za obrabotka na signalot. Analognite aparati, kako logaritmi~kite amplifikatori, obezbeduvaat visoka amplifikacija na mali signali, i edine~na amplifikacija na golemi signali, dodeka aparatite za obrabotka na digitalnite signali se koristat za digitalizacija na pulsnite parametri. Nekoi instrumenti koristat kombinacija od analogni i digitalni elektronski elementi za da se iskoristat prednostite na dvete napravi. Vremenata kaklkulacijata i sposobnosta za donesuvawe odluka ovozmo`uva i dvete funkcii da se odvivaat so golema brzina. Softver. Prvite proto~ni citometri koristea osciloskop za ednostavni poka`uvawe na visinata na pulsnite karakteristiki i nivna analiza. Denes, pove}eto instrumenti koristat softver za kontrola na instrumentot, skladirawe, analizirawe i prika`uvawe na podatocite. Slika 5.6: Fluorescentna {ema (histogram) so 8 vrva za PE parametarot. Vnatre vo histogramot ima ~esti~ki koi se distribuirani na baza na detektitraniot intenzitet na boja. Onie koi {to emitiraat pojak signal se postaveni na povisokite kanali po dol`ina na H oskata, dodeka poslabite se locirani vo poniskite kanali. 5.1.4. Analiza na podatocite Proto~niot citometar vo kombinacija so mo}en softverski program im ovozmo`uva na istra`uva~ite sofisticirana metoda za brzo sobirawe i analizirawe na podatoci za golema populacija kletki. Komercijalnite instrumenti se dostapni i mo`at da obrabotat preku 70.000 ~esti~ki (partikli) vo sekunda i da gi otkrijat so pomo{ na devet fluorescentni boi i dva rasprsnuva~i na svetlina. Sposobnosta da se analiziraat pove}ekratni (multipli) parametri, simultano za edna dadena kletka, im ovozmo`i na istra`uva~ite podobro da gi razberat kompleksnite kleto~ni procesi kako {to se: onkogenezata, apoptozata ili kleto~nata regulacija so pomo{ na fenotipski definirani populacii. 5.1.4.1. Analiza Dene{nite softverski programi davaat mo`nost za prika`uvawe i analizirawe na podatocite od proto~nata citometrija. Edna od opciite vklu~uva histogram kade istra`uva~ot mo`e da gleda vo proto~nata {ema samo eden parametar od edna populacija. Histogramot prika`an na Slika 5.6 ni prika`uva fikoeritrin (phycoerythrin – PE) fluorescentna {ema za primerok od 8-vrva ({ilci). Koga se anlaizira so proto~en citometar, ovie vrvovi se dizajnirani taka da ni prika`at osum razli~ni populacii so razli~ni fluorescentni intenziteti. Vrvovite se inducirani od 488 nm laser, a podatocite se skladiraat i se za~uvuvaat so koristewe na logaritamska skala. Za upotreba na podatocite, vklu~uvaj}i gi i fluorescentnite 8-vrva, podatocite od logaritamskite skali podobro e da bidat prika`ani na linearna skala. Ova e voobi~aeno koga se raboti so fluorohromi za da se prika`e prostornoto sobirawe na izlo`enata fluorescencija. Institut za imunobiologija i humana genetika Slika 5.7: Prepokrivawe. Limfocitite se odbele`eni i analizirani so FITC kowugirani protiv-CD3 protivtela. 53 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Prepokrivaweto formira specijaliziran tip na histogram koj dozvoluva (dava mo`nost) za simultano prika`uvawe podatoci od brojni primeroci (Slika 5.7). So ovoj priod, oddelni primeroci mo`at da se sporeduvaat vrz osnova na odreden fluorescentni parametri ili da se izvr{i pregled na podatocite. Nekolku primeni koi se prednost na ovoj tip analizirawe vklu~uvaat prika`uvawe na specifi~ni proteini od genite, identifikacija na kleto~ni linii so nepravilno (so anomalno) gensko prika`uvawe, ili sledewe na genskoto prika`uvawe vo odredena populacija kako odgovor za nadvore{nite faktori, kako {to se biolo{kite zna~ajni sostavni delovi. Slika 5.8: Grafikon od to~ki od Jurkatovi T-limfociti. To~kite i gustinata na crte`ite davaat mo`nost za vzaemna vrska i da se utvrdi fluorescentnata informacija simultano za dva parametra. Na primer, ovaa {ema od to~ki na Jurkat (JKT) T-limfociti koristi preden i strani~en parametar od rasprskuva~ot na svetlo. Signalot od predniot rasprskuva~ (FSC) nastanuva od prekr{enite zraci vo prednata nasoka kako {to kletkite pominuvaat niz to~kata na laserskoto ispituvawe i voobi~aeno se zarobuva (fa}a) so pomo{ na fotodioda povrzana so (ili vo par so) `leb ili grupa na filtri so konfiguracija(struktura) za emisija na spektrum od izvorot na svetlina. Ovoj parametar e vo korelacija so goleminata na ~esti~kata, dodeka stra-ni~niot rasprskuva~ na svetlina (SSC) slu`i za kleto~nata granuliranost ili vnatre{nata morfologija na kletkata ili ~esti~kata (Slika 5.8). Naizmeni~nite metodi za prika`uvawe podatoci se dostapni za dve-parametarski {emi. Edna od opciite e oblikot(reqefot), koj ni prika`uva podatoci za niza (serija) od kleto~ni linii, ne{to sli~no na toa {to se nabquduva so topografski mapi. Reqefnata {ema e vo korelacija so distribucijata i nivoto na gustina na kletkite ili ~esti~kite vnatre vo {emata i mo`at da se koristat za olesnuvawe (pomagawe) na analizata na podatoci ili da se skicira (zacrta) populacijata koja ni e od interes (Slika 5.9:desno). Razli~ni statistiki se dostapni za analiza na podatocite vnatre vo histogramite i {emite od to~ki. Statistikata vklu~uva vkupni presmetki, populaciski procenti, prosekot, sredinata, koeficientot na varijacija (KV) i standardnata devijacija. Na primer, vkupnata presmetka i Slika 5.9: [ema od to~ki i oblik za E.coli odbele`eni so boja nukleinska kiselina, SYTO-9. 54 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 5: PROTO^NA CITOMETRIJA procentot za specifi~na kleto~na populacija mo`at da se iskoristat vo klini~kata dijagnoza na bolesta. Vo slu~aj na HIV inficirani pacienti utvrduvaweto (procenuvaweto) na T kleto~nata ekspresija na CD4i CD8 mo`e da se koristi za da se utvrdi imunolo{kata sostojba na pacientot. Statisti~kiot iskaz na koeficientot na varijacija tradicionalno se koristi zaedno so vrvovite na kalibracijata i dnevnata kontrola na kvalitetot vo instrumentot, a istotaka mo`e da se koristi i za kvantificirawe na fluorescentniot intenzitet na kletkite so koristewe na standardni kalibracioni edinici ili molekuli na ekvivalenten solubilen fluorohrom (Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome (MESF)). Za da se napravi statistika za subpopulaciite, vnatre vo histogramite mo`at da se sozdadat podra~ja. Vo slu~aj na dijagnoza na bolest, klini~arite ~esto se potpiraat na statistikite od razli~nite limfocitni podsetovi za da okarakteriziraat i tretiraat mnogu tipovi na leukemii i limfomi. Najgolem del od studiite za ovie poremetuvawa se baziraat na identifikacija na kletkite koi sodr`at odredeni {emi za prika`uvawe (ekspresija) na povr{inskite kleto~ni proteini. Faktorite kako {to se celosen broj na kletki, procenti na populacija, svetlina (bistrina) ili fluorescentni razliki me|u populaciite i statisti~kiot odnos (sooodnos) pome|u populaciite, mo`at da se iskoristat za da se analiziraat i kvantificiraat podatocite. Slika 5.10: [ema od to~ki i Porti za analiza na limfocitni subpopulacii. Podatocite se kompenzirani za da se koregira fluorescentnoto preklopuvawe pome|u fluorohromite. Regionite mo`e da se koristat i za sozdavawe i primena na porti. Portite mo‘e da vklu~uvaat eden ili pove}e regioni i se koristat primarno za minimizirawe ili eliminirawe na nadvore{ni (neva`ni) slu~uvawa vnatre vo {emata za analiza ili da se izoliraat specifi~ni kletki i partikli koi ni se od interes. Nekoi softverski programi istotaka ovozmo`uvaat da se izbiraat boi za tie nastani koi se nao|aat vnatre vo odreden region ili porta, a spored toa ni se ovozmo‘uva lesna identifikacija na onie kletki koi se vo drugi histogrami ili {emi so to~ki. [emite na Slika 5.10 ni ilustriraat pateka na polna krv koja e analizirana so proto~na citometrija. Platoto na levata strana ni prika`uva malku od celata kleto~na populacija i mo`e da se identifikuva so koristewe na prednite i strani~nite rasprskuva~ki parametri. Vo ovoj eksperiment kletkite se oboeni so fluorescentno obele`eni protivtela naso~eni kon specifi~ni povr{inInstitut za imunobiologija i humana genetika 55 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM ski kleto~ni protivgeni, specifi~no FITC – kowugirano protivtelo protiv CD3, PE-kowugirano protivtelo kon CD19, i PE-Cy5 kowugirano protivtelo protiv CD45. Slika 5.11: Grafikon na spektralno emitirawe. Poliwata b i d ni go poka`uvaat o~ekuvanoto prelevawe vo FITC i PE detektorite. Sozdadena e porta specifi~na za limfocitna populacija (R1) i istata se primenuva za drugi histogrami koi sodr`at eksperimentalno dosta zna~ajni parametri. Ova ovozmo`uva identifikacija i analiza na limfocitnite subpopulacii koi prika`uvaat na svojata povr{ina razli~ni proteini. Sredi{nata slika ni gi identifikuva onie limfociti koi prika`uvaat ili CD3 ili CD19 protivgen. Limfocitite koi prika`uvaat CD3 se zeleni (dolu desno), onie koi prika`uvaat CD19 se sini (gore levo), a onie koi ne prika`uvaat nieden od ovie proteini se so violetova boja (dolu levo) (na Slikata 5.10 desno, site se vo sivi nijansi). Ovaa mo`nost za simultano analizirawe na multipli parametri za dadena kleto~na populacija e edna od najgolemite pridobivki od koristeweto na proto~nata citometrija. 5.1.4.2. Nadomest (kompenzacija) Koga se sproveduva pove}eoboen (multikoloren) eksperiment mora da se zeme vo predvid mo`nosta za fluorescentno me{awe i popre~uvawe koe se sozdava kako rezultat od boewe ili od fluorohromite koi se sostojat od blisko ili od preklopuva~ko emituvawe na spektar. Mnogu programi vo proto~nite citometri imaat algoritmi koi mo`at matemati~ki da gi koregiraat spektralnite preklopuvawa. Vo svetot na proto~nata citometrija ovoj proces e poznat kako nadomest (kompenzacija). Ova se odnesuva na specifi~ni softverski ili hardverski postapki koi matemati~ki gi otstranuvaat fluorescentnite preklopuvawa za da se poednostavat tolkuvawata na pove}eoboenite podatoci i da se razlikuvaat populaciite vo dvojno-parametarskiot histogram (Slika 5.11). Edna od pridobivkite od ovoj proces e deka na kraj im ovozmo`uva na istra`uva~ite podobro da gi skiciraat populaciite, vrz osnova na prika`uvawe ili nerika`uvawe na specifi~ni kleto~ni komponenti, kako {to se povr-{inskite kleto~ni protivgeni. 5.1.4.3. Skladirawe podatoci Prednost na proto~nata citometrija e mo`nosta za simultana detekcija i analiza na multipli parametri. Informaciite sobrani od golem broj komercijalni proto~ni citometri se za~uvani vo standardizirani dosijea poznati kako FSC (Flow Cytometry Standard). Prifa}aweto na ova uniformirano dosie im dade na istra`uva~ite mo`nost da sobiraat podatoci od razli~ni instrumenti, a potoa da gi analiziraat podatocite koristej}i razli~ni softverski programi. 56 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 5: PROTO^NA CITOMETRIJA 5.1.5. Proto~no sortirawe kletki Upotrebata na sortira~kata proto~na citometriska tehnologija privlekuva vnimanie vo raznovidni segmenti od biologijata i industrijata. Zasega ovaa tehnologija ovozmo`uva mo}na i unikatna sposobnost za brza izolacija na ~isti populacii kletki ili ~esti~ki so posakuvaniot (pobaraniot) set na biolo{ki karakteristiki. Potoa ovie populacii se dostapni za morfolo{ko ili genetsko ispituvawe, kako i za funkcionalni i terapevtski analizi. Istoriski gledano, ovaa tehnologija bila razviena za da se olesni sortiraweto na kletki i drugi ~esti~ki, a mnogu brzo e prifatena i iskoristena vo ispituvawata koi se koristat vo imunologijata za pro~istuvawe na limfocitnite podtipovi. Ottoga{ pa navamu primenata na ovaa tehnologija postojano se pro{iruva, taka da tekovnoto podra~je za upotreba se dvi`i od ekolo{ko sledewe do industrisko sozdavawe enzimi. Postojat dva metoda za sortirawe ~esti~ki so proto~nata citometrija: elektrostatski i mehani~ki metod. Vo elektrostatskiot metod (Slika 5.12 gore), ~esti~ki se isfrlaat niz prskalka i se prisiluvaat da se razdelat vo vid na kapka so upotreba na vibracii vo samata prskalka. Kapkite sodr`at ~esti~ki koi mo`at da skr{nat od glavnata nasoka na dvi`ewe so primena na polne` vo samite kapki. So mehani~kiot metod (Slika 5.12 dolu), ~esti~kite koi ni se od interes se prenaso~uvaat ili so dvi`ewe na kapilara za fa}awe ili se otklonuvaat so pomo{ na akusti~en (zvu~en) puls vo fiksirana kapilara. Slika 5.12: Elektrostatsko sortirawe (gore) i mehani~ko sortirawe (dolu). 5.2. Funkcionalen test za kletki prirodni ubijci (KPU) 5.2.1. Osnovi na testot Vo ovoj test kako celni kletki se upotrebuva kleto~nata linija K562 dobiena od pacient so hroni~na mieloidna leukemija vo terminalna blastna kriza. Vakvite celni kletki ne poseduvaat klasa 1 i klasa 2 molekuli od GTSK i se isklu~itelno osetlivi kon dejstvoto na KPU. Osnovno kaj sekoj test so koj se ispituva citotoksi~nata aktivnost e da se pravi razlika pome|u efektornite i celnite kletki. Poradi toa kletkite od K562 kleto~nata linija se oboeni so zelena fluorescentna boja, koja se pozicionira vo nivnata membrana. Ovaa boja ne se vrzuva za efektornite kletki. Liti~kiot proces e karakteriziran od nekolku fazi: prepoznavawe na celnata kletka, vrzuvawe na efektornata kletka za celnata, aktivirawe na procesite koi }e dovedat Institut za imunobiologija i humana genetika 57 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM do liza i umirawe na celnata kletka. KPU gi ubivaat celnite kletki ili preku mehanizmite zasnovani na dejstvoto na perforinite i granzimite ili preku direktno/indirektno aktivirawe na apoptozata vo celnata kletka. Po inkubacijata na efektornite i na celnite kletki vo sme{ata se dodava crvena fluorescentna boja za boewe na DNK. Ovaa boja gi obojuva samo onie kletki koi imaat o{tetena kleto~na membrana. Na ovoj na~in mo`at da se razlikuvaat ~etiri populacii kletki: `ivi celni kletki, mrtvi celni kletki, `ivi efektorni kletki i mrtvi efektorni kletki. Ottuka mo`e da se presmeta so-odnosot pome|u efektornite i celnite kletki. Rutinski, za odreduvawe na citotoksi~nata aktivnost, se presmetuvaat samo FL1 pozitivnite signali (mrtvi i `ivi celni kletki). 5.2.2. Protokol za rabota 5.2.2.1. Op{ti podgotovki 1. Se zagreva vodenoto kupatilo na 370C. 2. Se zagreva kompletniot medium na 370C. 3. Vo kupatiloto so mraz se stavaat nosa~ite za epruveti. 4. Se vklu~uva i se kalibrira proto~niot citometar. Od osobeno zna~ewe e da postoi precizna kontrola na temperaturata. 5.2.2.2. Izolacija na efektornite kletki (Slika 5.13) So venepunkcija od sekoj pacient se zema po 5 mL heparinizirana krv. Zemaweto na krv mora da bide vo asepti~ni uslovi. Efektornite kletki se izdvojuvaat so pomo{ na Ficoll-Hypaque (so gustina 1.077). Dobieniot talog posle vtoroto centrifugirawe se resuspendira vo 1 mL kompleten medium, se brojat kletkite i nivniot broj se doteruva do 5h106 kletki/mL kompleten medium. Slika 5.13: Izolacija na limfociti od periferna krv (efektorni kletki) za koristewe vo testot za KPU. 58 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 5: PROTO^NA CITOMETRIJA 5.2.2.3. Odmrznuvawe na K562 kleto~nata linija (Slika 5.14) Za da se dobijat vijabilni celni kletki neophodno e odmrznuvaweto na K562 kleto~nata linija da bide brzo. 1. Plasti~nata epruveta od 50 mL se polni so 50 mL prethodno zagrean na 370C kompleten medium. 2. Se odmrznuva edno {i{ence celni kletki. Odmrznuvaweto treba da bide vo vodena bawa, za vreme od 2060 sekundi, so kontinuirano me{awe. 3. Otkoga }e se rastopi, {i{enceto se otstranuva od vodenata bawa. Negovata sodr`ina se prefrla vo epruveta koja sodr`i 50 mL kompleten medium. Epruvetata vnimatelno se me{a. Slika 5.14: Odmrznuvawe K562 celni kletki za koristewe vo testot za KPU. 4. Kleto~nata suspenzija se centrifugira 5 minuti na 120 g. Supernatantot se frla. Kleto~niot talogot se resuspendira vo 1 mL kompleten medium. Se brojat kletkite i se doteruvaat do koncentracija od 1h105/mL kompleten medium. 5.2.2.4. Priprema na primerokot za merewe (Slika 5.15) Efektornite kletki (E) se me{aat so K562 celnite kletki (C) vo opredeleni soodnosi po~nuvaj}i od 50:1 pa se do 12.5:1 (Tabela 5.1). Sme{ata od efektornite i celnite kletki (vo kraen volumen od 200 mkL) se inkubira. Tabela 5.1: [ema za priprema na kontrolnite i ispituvanite primeroci. 1. Se pipetira sme{ata od efektorni/celni kletki vo epruveti (12h75 mm) spored {emata dadena vo Tabela 5.1. Vo edna epruveta se dodavaat samo celni kletki (kontrolen primerok). Ovaa epruveta }e ni slu`i kako kontrola za da vidime kolku od celnite kletki }e liziraat sami od sebe za vremeto za koe se izveduva testot (na pr. poradi starosta na kletkite, nivnata vijabilnost, dejstvoto na nekoi komponenti od mediumot i dr.) 2. Vo nekoi od primerocite se dodava po 30 mkL interleukin-2 (200 E/mL). Ovie primeroci ni slu`at kako ”visoki kontroli”. Interleukinot-2 sekoga{ treba da se dodade vo suspenzijata od efektorni kletki pred da se dodadat celnite kletki. 3. Site epruveti se centrifugiraat 2-3 minuti na 120 g. 4. Potoa site epruveti se inkubiraat vo inkubator, vo atmosfera so 5% CO2 vo vremetraewe od 120 ili 240 minuti. Po inkubacijata epruvetite se prefrlaat na mraz i taka se ~uvaat se dodeka ne se po~ne so mereweto. 5. Vo sekoja od epruvetite se dodava 50 mkL boja za boewe na DNK. Epruvetite se me{aat i se inkubiraat 5 minuti na 00C (vo kupatilo so mraz, za{titeni od svetlina). Kleto~nata suspenzija se meri vo rok od 30 minuti po dodavaweto na bojata za obojuvawe na DNK molekulata. Institut za imunobiologija i humana genetika Slika 5.15: Izveduvawe na funkcionalniot test za KPU. 59 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM A B Slika 5.16: Tipi~en FL histogram na funkcionalniot test za KPU. V 5.2.2.5. Merewe i analiza na podatocite dobieni so proto~niot citometar Kletkite se analiziraat so proto~en citometar koj koristi plavo-zeleno ekscitira~ko svetlo (480 nm argon-jonski laser). Merewe. Vo tekot na pribiraweto na podatocite “Live” kapijata se pozicionira vo FL1 histogramot na zelenite fluorescentni celni kletki, za da mo`e da se napravi razlika pome|u efektornite i celnite kletki. Za ovaa cel se upotrebuva kontrolnata epruveta koja sodr`i samo celni kletki. Bidej}i FL1 intenzitetot na fluorescencijata od mrtvite kletki opa|a za odreden stepen, dolnata granica na kanalot treba da se postavi onaka kako {to e prika`ano na Slika 5.16A. Od sekoja epruveta treba da se izmerat najmalku 2500 celni kletki. Analiza na podatocite. Se analizira procentot na mrtvi celni kletki (= FL2 ili FL3 pozitivni). Crvenata fluorescencija koja poteknuva od obojuvaweto na DNK molekulite mo`e da se otkrie so pomo{ na FL2 ili FL3 kanalot. Za ovaa cel kapijata za analiza se postavuva vo FL3/FL1 delot okolu site `ivi i mrtvi celni kletki (Slika 5.16B). Tabela 5.2: [ema za vnesuvawe rezultati od izbroeni kletki so proto~en citometar. Procentot na specifi~nata citotoksi~nost se presmetuva preku odzemawe procentot na mrtvi kletki izmereni vo inkubiranata epruveta koja sodr`i samo celni kletki (kontrolniot primerok, Slika 5.16A) od procentot na ubieni celni kletki izmeren vo epruvetite so primerokot od pacientot (Slika 5.16B, V). 5.3. Zada~a Izmeri go brojot na KD3+, KD4+, KD8+ i KPU so pomo{ na proto~en citometar i vrednostite vnesi gi vo Tabelata 5.2. Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod) Data Student (ime i prezime) Asistent (potpis i pe~at) ______________ ____________________________ __________________________ 60 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 6: TOLKUVAWE REZULTATI OD KLETO^EN IMUNITET VE@BA 6: TOLKUVAWE REZULTATI OD KLETO^EN IMUNITET 6.1. Normalni vrednosti na beli kletki Normalnite vrednosti na belite kletki (neutrofilite, eozinofilite, bazofilite i monocitite), vkupnite limfociti, T-limfocitite (KD4+ i KD8+), B-limfocitite i trombocitite se dadeni na Tabela 6.1. Za pogolemiot broj beli kletki nivniot broj varira spored vozrasta, a se iska`uvaat kako apsoluten broj kletki vo eden litar krv, ili kako procent od site beli kletki. Metodite za opredeluvawe brojot na belite kletki se razli~ni, po~nuvaj}i od najednostavnite so hemocitometar i komora, preku avtomatiziranite broja~i do metodite so proto~na citometrija. Tabela 6.1. Normalen broj na beli kletki i trombociti vo periferna krv od lu|e. Institut za imunobiologija i humana genetika 61 Spiroski M, Trajkov D, Petli~kovski A, Arsov T, Strezova A, Efinska-Mladenovska O. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 6.2. Imunofenotipizirawe 6.2.1. Voved Pod imunofenotipizirawe na biolo{kite primeroci se podrazbira upotreba na imunolo{ki materii (na pr. monoklonski i/ili poliklonski protivtela) za specifi~no otkrivawe na protivgenite. Ovie protivgeni, koi naj~esto poteknuvaat od proteinite, se prika`ani vrz kletkite ili vrz drugi ~esti~ki (na pr. apoptoti~nite telca) i se lokalizirani ili na nivnata povr{ina ili vo nivnata vnatr{nost. Vo sporedba so porano upotrebuvanite metodi, proto~nata citometrija e poednostavna za izveduvawe, poosetliva e i ni ovozmo`uva istovremeno kvantitativno odreduvawe na pove}e protivgeni vo golem broj kletki. Nejziniot glaven nedostatok e {to ima potreba od ednoredna kleto~na suspenzija. Isto taka, informaciite koi gi dobivame za morfologijata i lokalizacijata na molekulite vnatre vo kletkata se ograni~eni. Poradi ova proto~nata citometrija pogolema primena nao|a vo ispituvaweto na hematopoetskite kletki odkolku na kletkite koi poteknuvaat od organite ili od tkivata. Tabela 6.2: Klini~ka primena na imunofenotipiziraweto so proto~na citometrija. Deneska imunofenotipiziraweto so proto~nata citometrija nao|a {iroka primena. So boeweto na kletkite so pomo{ na protivtela mo`at da se identificiraat, da se izbrojat i da se karakteriziraat bilo koi kletki ili subkleto~ni elementi. Vo poslednite godini proto~nata citometrija naj~esta primena na{la vo hematologijata i imunologijata (Tabela 6.2). Dijagnosti~koto zna~ewe na definiraweto na kletkite od krvta so koristewe na protivtela proizleguva od to~nosta, objektivnosta i visokata reproducibilnost na tehnikata. 62 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 6: TOLKUVAWE REZULTATI OD KLETO^EN IMUNITET Imunofenotipizacijata e od kriti~no zna~ewe za inicijalna dijagnoza i klasifikacija na akutni leukemii, hroni~ni limfoproliferativni bolesti ili maligni limfomi, imaj}i predvid deka terapevtskiot pristap kaj ovie bolesti vo mnogu zavisi od protivgenskite parametri. Ponatamu, imunofenotipizacijata ovozmo`uva prognosti~ki informacii koi ne se dostapni so drugi tehniki, sledewe progresijata na bolesta kaj bolni posle hemoterapija ili transplantacija na koskena srcevina i Tabela 6.3: Definirawe na krvnite kletki so pomo{ na monoklonski protivtela. ~esto ovozmo`uva otkrivawe minimalna rezidualna bolest. Proto~no citometriskite analizi za apoptoza, otpornost kon lekovi, citokinski receptori i drugi parametri bi mo`ele da obezbedat dopolnitelni dijagnosti~ki ili prognosti~ki informacii vo bliska idnina (Tabela 6.3). 6.2.2. Dijagnoza na hematolo{ki maligniteti ANALIZA NA SLU^AJ Leukemiite pretstavuvaat abnormalna proliferacija na hematopoetski kletki zarobeni vo odredena faza na kleto~nata diferencijacija. Klasificirani se vo akutni ili hroni~ni formi vo zavisnost od klini~kite i laboratoriskite analizi. Vrz osnova na morfolo{kite i imunofenotipskite karakteristiki na aberantnite kletki, leukemiite ponatamu se delat na pove}e podtipovi. Imunofenotipiziraweto na malignite hematolo{ki zaboluvawe e edna od naj~estite klini~ki primeni na proto~nata citometrija. Negovata primena e fokusirana na karakteriziraweto na malignite kletki i klasifikacija na zaboluvaweto, otkoga prethodno }e bide postavena dijagnozata za postoewe na leukemija/limfoma. Vo tekot na ovoj period imunofenotipiziraweto e od golema pomo{ vo: Institut za imunobiologija i humana genetika T-kleto~en limfom: Slu~ajot na Donka Momirovska, posledica od nezadr`liv rast na citokin sozdava~ki klon od Tlimfociti. 63 Spiroski M, Trajkov D, Petli~kovski A, Arsov T, Strezova A, Efinska-Mladenovska O. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 1) razlikuvaweto pome|u limfoidna i mieloidna leukemija, osobeno ako postoi somnitelen/nejasen morfolo{ki i citohemiski naod; 2)subklasifikaciite na akutnite limfoblastni leukemii; 3) dijagnoza na subtipovite na minimalno diferenciranite eritroidni i megakariocitni akutni mieloblastni leukemii; i 4) prepoznavawe na T i B kleto~nite hroni~ni limfoproliferativni rastrojstva. Imunofenotipiziraweto na malignite hematolo{ki zaboluvawa so pomo{ na pove}eparametriskata proto~na citometrija e visoko senzitiven i specifi~en metod za identifikacija na malignite kletki, duri i koga tie se prisutni vo mnogu mal broj pome|u mno{tvoto na normalni Tabela 6.4: Frekfencija na aberantnite fenotipovi kaj malignite hematolo{ki zaboluvawa otkrieni so proto~na citometrija. NA: ne se analizirani na golem primerok. hematopoetski kletki. Ova e poradi toa {to kaj malignite hematopoetski kletki ima prika`uvawe na aberantni fenotipovi. So leukemija/limfoma asociranite fenotipovi (na primer, vkrstenoto prika`uvawe na liniskite protivgeni, asinhronoto prika`uvawe na protivgenite, Tabela 6.5: Imunofenotipski karakteristiki na Bkleto~ni limfoproliferativni bolesti. Legenda: sIg – membranski imunoglobulin; CLL – hroni~na limphocitna leukemija; MCL – mantle cell limfom; FL – folikularen limfom; MZL – limfom od marginalna zona; HCL – hairy cell leukemija; PL – prolimfocitna leukemija; LPL – limfoplazmocitna leukemija. prekumernoto prika`uvawe na protivgenite, tkivnoograni~enite fenotipovi, abnormalniot na~in na sozrevawe) mnogu lesno se otkrivaat so proto~nata citometrija (Tabela 6.4). Tabela 6.6: Imunofenotipski karakteristiki na Tkleto~ni limfoproliferativni bolesti. Legenda: MF- Mycosis fungoides; SS Sezary sindrom; ATLLT kleto~na leukemija/limfom kaj ozrasni; ALCLAnaplasti~en golemokleto~en limfom; ETL- Tkleto~en limfom od tip enteropatija. 64 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 6: TOLKUVAWE REZULTATI OD KLETO^EN IMUNITET Postoi golem broj na razli~ni protivtela koi se koristat za analiza na kleto~nite protivgeni kaj hematolo{kite maligniteti. Za potvrduvawe na B ili T-klonalnosta na maligniot klon, se koristat t.n. pan-B panel koj vklu~uva protivtela kon KD19, KD20 i KD22 (Tabela 6.5) ili panT panel koj se sostoi od protiv-KD2, -KD3, KD4 i/ili KD7 protivtela (Tabela 6.6), dodeka dopolnitelni paneli ili edine~ni protivtela se koristat za definitivno tipizirawe na specifi~nata limfoproliferativna bolest. 6.2.3. Ostanati klonalni/genetski hematolo{ki i imunolo{ki zaboluvawa Denes imunofenotipiziraweto e edna od primarnite dijagnosti~ki metodi za dijagnosticirawe na paroksizmalnata no}na hemoglobinurija, sistemskata mastocitoza, primarnite trombocitopatii i imunite nedostatoci. Kaj site ovie zaboluvawa genskite abnormalnosti koi se prisutni vo klonskite hematopoetski klatki se preveduvaat kako promeni vo fenotipot i vo distribucijata na nivnite specifi~ni populacii. Vakvite fenotipski promeni, koi se visoko asocirani so soodvetnite genski abnormalnosti, mo`at mnogu lesno da se identifikuvaat so imunofenotipizirawe so proto~en citometar. ANALIZA NA SLU^AJ Iks vrzan te`ok kombiniran imunonedostatok: Slu~ajot na Martin Delivanov, bez T-Li `ivotot ne mo`e da se odr`i. I pokraj faktot deka so imunofenotipiziraweto ne mo`eme da postavime krajna dijagnoza kaj najgolem broj prvi~nite nedostatoci vo imunolo{kiot sistem, toa ima golemo zna~ewe kako metoda za skrining. Bidej}i ve}e izvesno vreme se znae deka postoi asocijacija pome|u distribucijata na razli~nite populacii limfociti od perifernata krv, nivnite imunofenotipovi i promenite vo genite, se pove}e se upotrebuva imunotipiziraweto so proto~nata citometrija za to~na genska lokalizacija na defektot kaj prvi~nite imuni nedostatoci. Na primer, za identifikacija na defektot kaj Iks-vrzaniot sindrom, koj se karakterizira so zgolemena produkcija na IgM, se pove}e se upotrebuva imunofenotipiziraweto so proto~en citometar za ispituvawe na sposobnosta na in vitro aktiviranite T limfociti da prika`uvaat KD154. 6.2.4. Transplantacija Imunofenotipiziraweto so proto~en citometar vo posledno vreme se pove}e se upotrebuva i vo transplantacijata, kako na hematopoetski kletki taka i na solidni organi. Taa se pove}e se upotrebuva za broeweto na KD34+ hematopoetskite progenitori, so cel da se kontrolira kvalitetot na biolo{kite produkti koi se dobivaat posle transplantacijata na koskenata srcevina. Taka, denes se znae deka odreduvawe vkupniot broj na KD34+/KD45dim hematopoetskite progenitori vo transplantantot e najsigurniot pokazatel za pre`ivuvawe na kalemot. Najnovite studii poka`aa deka vrz pre`ivuvaweto na kalemot mo`e da vlijae i prisustvoto na drugi tipovi kletki, razli~ni od KD34+ progenitorite. Spored toa, se Institut za imunobiologija i humana genetika 65 Spiroski M, Trajkov D, Petli~kovski A, Arsov T, Strezova A, Efinska-Mladenovska O. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM poka`alo deka frekfencijata na te{kite infekcii kaj pacientite koi bile podlo`eni na avtologne transplantacija e direktno povrzana so brojot na KD4+ T limfociti prisutni vo kalemot. U{te edna primena na imunofenotipiziraweto so proto~en citometar vo transpalantacijata e takanare~enata vkrstena reakcija. So vakvata reakcija se odreduva prisustvoto na protiv-HLA protivtela vo serumot na potencijalniot daritel, se odreduva nivniot titar i nivnata specifi~nost. 6.2.5. Dijagnoza i sledewe na infektivnite zaboluvawa i imuni nedostatoci Mo`ebi naj~estata primena na imunofenotipiziraweto so proto~en citometar vo dijagnoza i sledewe na infektivnite zaboluvawa e negovata upotreba za sledewe absolutniot i relativniot broj na KD4+ T limfocitite kaj zabolenite od SIDA. Kaj ovie pacienti identifikacijata na KD4+ T limfocitite se bazira vrz boeweto na primerocite od perifernata krv so protiv-KD45 monoklonski protivtela vo kombinacija so protiv KD45 i/ ili protiv-KD3 monoklonski protivtela. Pokraj gubeweto na KD4+ T limfocitite, kaj bolnite so SIDA, ima zgolemuvawe i na protiv-virusniot imun odgovor, pretstaveno preku zgolemenoto sozdavawe na citokini i ostanati rastvorlivi proteini. Seto toa odi zaedno so modulacija na ostanatite proteini asocirani so T kleto~nata membrana, kako na primer KD38. Imeno, se poka`alo deka srednata vrednost na KD38 molekulite, koi se prika`ani vrz membranata na KD8+ T limofocitite, se zgolemuva kaj HIV pozitivni pacienti. Deneska mnogu dobro se znae deka zgolemuvaweto na prika`uvaweto na KD38 vrz KD8+ limfocitite ne samo {to e nezavisen prognosti~ki pokazatel za predviduvawe na progresijata na bolesta vo SIDA i smrten ishod, tuku slu`i i za sledewe efektot od terapijata kaj HIV-1 pozitivnite pacienti koi primaat visoko aktivna protiv-retroviralna terapija. Za `al imunofenotipiziraweto so proto~en citometar seu{te ne nao|a pogolema primena vo dijagnosticiraweto i sledeweto na ostanatite infektivni zaboluvawa. Sepak postojat napori za negovata primena vo ispituvaweto na virusno- i peptidno-specifi~niot T kleto~en odgovor kaj imunodeficientni pacienti kaj koi postoi somnevawe deka se inficirani so citomegalovirus, Ep{tajn-Barov virus ili so Mycobacterium tuberculosis. Vo ovie slu~ai se vr{i procenka na citokinskiot odgovor i identifikacija na protivgen-specifi~nite T limfociti so upotrebata na HLA-multimeri povrzani so specifi~ni virusni peptidi. 66 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 6: TOLKUVAWE REZULTATI OD KLETO^EN IMUNITET 6.3. Tolkuvawe rezultati od funkcionalni testovi vo kleto~en imunitet 6.3.1. Funkcionalen test za kletki prirodni ubijci Ovoj test slu`i za ispituvawe citotoksi~nata aktivnost na kletkite prirodni ubici (KPU). Vo nego kako celni kletki se koristat zamrznati (krioprezervirani) kletki od kleto~nata linija K562. Za da mo`eme da gi razlikuvame ovie kletki od efetornite, nivnata membrana se obele`uva so edna zelena lipofilna fluorescentna boja. Posle inkubacioniot period, ubienite celni kletki gi prepoznavame blagodarenie na obojuvaweto na DNK mlekulata vo nivnite jadra, bidej}i bojata za boewe na DNK molekulata mo`e da prodre vo ubienata kletka. Na ovoj na~in mo`e da se odredi procentot na ubieni celnikletki od strana na KPU. Na ovoj na~in se ispituvaat promenite vo aktivnosta na KPU koi mo`at da nastanat kaj razli~ni zaboluvawa ili pod dejstvo na nekoi lekovi. Kletkite prirodni ubici na po~etokot bile definirani kako “nulta” limfociti, koi svoeto citotoksi~no dejstvo go ostvaruvale vrz nekoi tumorski ili virusno zarazeni kletki, bez da ima potreba od prisustvo na klasa 1 i klasa 2 molekulite od glavniot tkivno sovpadliv kompleks (GTSK) vrz celnite kletki. Okolu 70-95% od kletkite koi projavuvaat aktivnost karakteristi~na za KPU morfolo{ki imaat izgled na golemi granulirani limfociti. KPU na svojata povr{ina imaat IgG Fc 3 receptor (KD16 protivgen) i KD56 NCAM protivgen. Poradi ova imunofenotipski se definiraat kako KD3- i KD16+ i/ili KD56+. Mora da se spomene deka i mal del od T limfocitite (KD3+KD56+) mo`at da projavat aktivnost karakteristi~na za KPU. Namaluvawe aktivnosta na KPU e edno od mnogute imunolo{ki naru{uvawa koe mo`e da se sretne kaj zabolenite od SIDA. Naru{uvaweto aktivnosta na KPU mo`’ da se sretne i kaj bolnite od multipla skleroza, bolnite so sistemski lupus eritematozus, kako i kaj bolnite so sindromot na Sjogren. Namaluvawe aktivnosta na KPU se sretnuva i kaj bolnite od sindromot na hroni~en zamor, kako i kaj pacientite so Tip 1 {e}ernata bolest. Depresija vo aktivnosta na KPU mo`e da se sretne i kaj pacientite vo naprednat stadium na maligno zaboluvawe, pri postoewe metastazi i kaj pacienti so akutna/hroni~na leukemija. Odreduvawe aktivnosta na KPU ima prognosti~ko zna~ewe vo mo`nosta za razvoj na metastazi kaj bolni so primarni tumori. KPU igraat centralna uloga i vo odbranata od virusi. Zolemuvawe na nivnata aktivnost mo`e da se javi pri nekoi akutni virusni infekcii. Zabele`ano e deka razli~ni imunomodulatori (na pr. ILInstitut za imunobiologija i humana genetika 67 Spiroski M, Trajkov D, Petli~kovski A, Arsov T, Strezova A, Efinska-Mladenovska O. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 2, interferoni) mo`at da ja zasilat aktivnosta na KPU in vitro i in vivo. 6.3.1.1. O~ekuvani rezultati Vrednostite na normalnata citotoksi~nata aktivnost na KPU so pomo{ na analizi na ednojadrenite kletki od Tabela 6.7: Normalni vrednost za aktivnosta na KPU posle inkubacija od 2 ~asa. perifernata krv kaj zdravi lica. Rezultatite se prika`ani vo Tabela 6.7 (po inkubacija od 2 ~asa) i Tabela 6.8 (po inkubacija od 4 ~asa). Tabela 6.8: Normalni vrednosti za aktivnosta na KPU posle inkubacija od 4 ~asa. Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod) Data Student (ime i prezime) Asistent (potpis i pe~at) ______________ ____________________________ __________________________ 68 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 7: TALO@NI PROTIVTELA-IMUNOPRECIPITACIJA BLOK 3 BLOK 3 - IMUNOGLOBULINI U^EBNI CELI: VE@BA 7. TALO@NI PROTIVTELA - IMUNOPRECIPITACIJA (1 ~as) Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat: da ot~itaat rezultat od RID plo~ka; da presmetaat koncentracija na imunoglobulin. VE@BA 8. PROTIVTELEN ODGOVOR (1 ~as) Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat: da izbrojat i presmetaat imunoglobulin M sekretira~ki splenociti; opredelat imunoglobulinski klasi so imunonefelometar. VE@BA 9. ANALIZA NA KLETO^EN IMUNITET (1 ~as) Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat da: tolkuvaat rezultati od kleto~en imunitet; analiziraat slu~ai od kleto~en imunitet. POENI: PRISUSTVO 1.5 poeni ZNAEWE 3.0 poeni VKUPNO: 4.5 poeni Institut za imunobiologija i humana genetika 69 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 70 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 7: TALO@NI PROTIVTELA-IMUNOPRECIPITACIJA VE@BA 7: TALO@NI PROTIVTELA IMUNOPRECIPITACIJA Imunolo{kata precipitira~ka reakcija e otkriena od Kraus vo 1897 god., a potoa postavena kako imunohemiski metod od Heidelberger i Kendall vo 1929 god. Pomasovno se upotrebuva vo dijagnostikata po negovoto postavuvawe kako metod vo gel sredina (Oudin 1946, Mancini 1960, Laurell 1966). Denes imunoprecipitira~kite metodi mnogu se perfekcionirani i za opredeluvawe na precipitira~kite protivtela se koristat turbidometrija i nefelometrija. Za postignuvawe na imunoprecipitacijata pokraj soodvetniot kvantitativen soodnos me|u protivgenot i protivtelata, potrebno e ispolnuvawe na opredeleni fizikohemiski uslovi {to se: rN, TºC, jonski sili, solenost na sredinata i dr. Imunoprecipitacijata mo`e da se izveduva vo te~na i vo gel sredina. Sposobnosta na protivtelata da gi istalo`at (precipitiraat) protivgenite od rastvor e edna od nivnite najpoznati karakteristiki. Vo ovoj proces se sozdava kompleks od vkrstena molekula protivgen-protivtelo koja e pregolema za da ostane rastvorliva vo rastvorot. Treba da se spomene deka talo`ewe ne nastanuva sekoga{ koga protivteloto }e dojde vo dopir so protivgenot. Koncentracijata na protivgenot i na protivteloto koga nastanuva imunolo{ko talo`ewe e vo opredeleni granici i se nare~uva "zona na ekvivalencija". Nadvor od ovoj soodnos, bilo koj od protivgenot ili protivteloto da e vo vi{ok, se formira samo mal del (rastvorliv) od nivniot zaedni~ki kompleks. Vo izvesni slu~ai (kaj monovalentni protivgeni i monoklonalni protivtela) nikoga{ ne doa|a do imunoprecipitacija. protivgen protivtelo 7.1. Precipitacija vo te~na sredina Precipitacijata vo te~na sredina (precipitacija vo krugprsten, "ring test") lesno e aplikabilna kaj solubilni protivgeni i precipitira~ki protivtela (slika 7.1). Institut za imunobiologija i humana genetika Slika 7.1: Reakcija na protivgen i protivtelo vo te~na sredina (Oudin-ova reakcija) 71 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Vo mikroepruvetka (visina do 1 cm) na dnoto se postavuva serum i vnimatelno vrz nego se dodava ednakva koli~ina protivgen (na pr. 2 kapki + 2 kapki). Se postavuva i kontrolen test. Za celo vreme na ispituvaweto, epruvetkite se postaveni vertikalno. Po opredelena inkubacija, so pomo{ na strani~no svetlo na temna zadnina, se ~ita reakcijata. Reakcijata e pozitivna ako se pojavi precipitira~ki prsten vo interfazata (na dopirnoto mesto me|u serumot i protivgenot) za vreme od 5 min. Vo kontrolnata epruvetka ne se pojavuva takov prsten. 7.2. Dvojna imunodifuzija na agar Slika 7.2: Dvata naj~esto koristeni oblici za ispituvawe dvojna imunodifuzija. Ova e edna od najednostavnite i dosta informativni tehnikia vo imunologijata na protivtelata. Se prigotvuva puferiran agarozen gel, a protivgenot i protivteloto se vnesuvaat vo oddelni bunar~iwa od agarot, oddale~eni 0.5 do 2 sm edno od drugo. Po inkubacija od 12-48 ~asovi se sozdava imunoprecipitira~ka linija me|u protivgenot i soodvetnoto protivtelo. Prednosta na ovaa tehnika e {to avtomatski se sozdava koncentraciski gradient na protivgenot i protivteloto vo tekot na difuzijata. Imunoprecipitaciskata linija }e nastane nekade me|u dvete bunar~iwa zavisno od mestoto kade }e se postigne ekvivalentna koncentracija me|u protivgenot i protivteloto. Za izveduvawe na metodov potrebni se slednive materijali i oprema: kvadriperm plasti~ni plo~i, agar, sad so voda (zaradi ramnewe na povr{inata), solen fosfaten pufer koj sodr`i 0.02% natrium azid(SFP-azid), vakuum pumpa, ostra igla so ramen vrv, serumski albumin 1 mg/mL vo SFPazid, protiv-human serum ili protiv-human serum albumin, kontrolen pre-imun serum, vodena bawa, inkubator za kletki. Izveduvawe: 1. Se prigotvuva 1% agar so zagrevawe na 1 g agar vo 100 mL SFP-azid vo vodena bawa se dodeka kompletno da se ratsvori (proyiren rastvor). 2. Se ladi agarot na 45ºC vo vodena bawa, se stavaat kvadriperm plo~ite da plivaat vo vodenata bawa i vo sekoja pregrada se vnesuvaat po 5 mL od agarot (da se koristi pipeta od 10 mL so {irok vrv). Po izramnuvawe na agarskata povr{ina, plo~ite se prefrlaat vo kadi~ka so ladna voda i tamu se ~uvaat do zacvrstuvawe na agarozniot gel. Plo~ite se bri{at i se stavaat vo ladilnik polovina ~as za da se stvrdne gelot. 3. Plo~ata se stava vrz crte` (Slika 7.2) i so iglata priklu~ena na vakuum se prigotvuvaat bunar~iwa. Vo sekoja pregrada se pravat po tri grupi bunar~iwa. 4. Se prigotvuvaat razreduvawa na protivserumot, kontrolniot serum i protivgenot vo SFP-azid. Najdobri razredu- 72 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 7: TALO@NI PROTIVTELA-IMUNOPRECIPITACIJA vawa za pove}eto sistemi se 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 i 1:32. 5. Vo gorniot sistem bunar~iwa, se pipetiraat 10 mikrolitri (mkL) nerazreden protivserum vo centralnoto bunar~e, a vo okolnite bunar~iwa se vnesuvaat po 10 mkL od razreduvawata na ~ove~ki albumin. 6. Vo sredniot sistem bunar~iwa se pipetiraat 10 mkL nerazreden ~ove~ki albumin vo centralnoto bunar~e, a vo okolnite bunar~iwa po 10 mkL od razredeniot protivserum. Plo~ite se inkubiraat preku no} vo inkubator za kletki na 37oC. 7. Vo dolniot sistem bunar~iwa se pipetiraat 10 mkL od pre-imun serum (serum zemen od istoto `ivotno ili ~ovek pred imunizacija), a vo okolnite bunar~iwa se vnesuvaat po 10 mkL od razredeniot protivserum. Ovie bunar~iwa slu`at za kontrola na protivserumot. Prika`uvawe i tolkuvawe na rezultatite: Se analiziraat imunoprecipitira~kite linii vo sekoj od sistemot bunar~iwa. Ako e potrebno plo~ite se bojat i se odbojuvaat. Prisustvoto na imunoprecipitira~ka linija poka`uva deka serumot sodr`i protivtela specifi~ni za protivgenot. Dokolku se dobijat pove}e linii toa uka`uva na heterogenost na protivgenot i na protivtelata. Oddale~enosta na precipitira~kata linija od bunar~eto zavisi od koncentracijata na reagensite i nivnata molekularna masa (koi vlijaat na brzinata na difuzija). Otsustvoto na precipitira~ka linija uka`uva deka: -nema protivtela specifi~ni kon protivgenot; -ima protivtela, no ne se sposobni da go precipitiraat protivegnot; -ima prisutni protivtela, no koncentracijata na protivgenot i/ili protiv serumot ne se soodvetni, ne se postignuva ekvivalencija. Ovie varijanti mo`at da se ispitaat so probuvawe drugi koncentracii reagensi ili so upotreba na drugi tehniki koi otkrivaat neprecipitira~ki protivtela. Ovaa tehnika ovozmo`uva prika`uvawe na protivgenata identi~nost ili neidenti~nost. Ovie poimi uka`uvaat na sposobnosta na protivtelata da go prepoznae protivgenot kako identi~en ili razli~en, so zna~ewe deka protivgenite se strukturno ednakvi ili razli~ni. Stepenot na identi~nost analiziran so dvojnata difuzija gi ima slednive karakteristiki (Slika 7.3): a) ednakva kontinuirana precipitira~ka linija me|u dvete protivtela (Pt1 i Pt2) so protivgenot uka`uva na imunohemiska identi~nost me|u dvete protivtela Pg1 Pg1 Pt1 A Pg1 Pg2 Pg1 Pg2 Pt1 Pt2 Pt1 Pt2 B V Institut za imunobiologija i humana genetika Slika 7.3: Interpretacija na protivgenata identi~nost so dvojna radijalna imunodifuzija. a) identi~nost; b) neidenti~nost; v) parcijalna identi~nost; 73 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM A B V G D (Pt1 i Pt2). b) dvojno vkrstuvawe na imunoprecipitira~kite linii me|u protivtelata (Pt1 i Pt2) uka`uva na celosna neednakvost. v) delumnoto vkrstuvawe na imunoprecipitira~ki linii uka`uva na parcijalna identi~nost, vo slu~ajov protivgenot 2 (Pg2) ima nekoi determinanti koi ne gi deli so protivgenot 1 (Pg1), no site determinanti od Pg1 gi ima i vo Pg2 (Slika 7.3). Vnesuvaweto 3% polietilen glikol 6.000 vo gelot ja zgolemuva precipitacijata na golemite molekularni kompleksi i mo`e da ja zgolemi senzitivnosta. Ova osobeno se koristi pri analizirawe monoklonski protivtela. 7.3. Edine~na (radijalna) imunodifuzija na agar Vo ovaa tehnika se prigotvuva agarozen gel so fiksna koncentracija protivtela. Protivgenot difundira vo gelot i se soedinuva so protivteloto koga }e se postigne ekvivalencija. Vo taa to~ka se sozdava imunoprecipitira~ko zamatuvawe okolu bunar~eto, a Mancini poka`a deka dijametarot na ova zamatuvawe pri ekvivalencijata e vo soodnos so koncentracijata na protivgenot. Kvantitativniot aspekt na ovaa tehnika e nejzinata najgolema prednost. Materijal i oprema: kvadriperm plasti~ni plo~i, agar, sad so voda (zaradi ramnewe na povr{inata), solen fosfaten pufer koj sodr`i 0.02% natrium azid(SFP-azid), vakuum pumpa, ostra igla so ramen vrv, serumski albumin 1 mg/mL vo SFP-azid, protiv-human serum ili protiv-human serum albumin, kontrolen pre-imun serum, vodena bawa, inkubator za kletki, linear (postojat i gotovi plo~i za radijalna imunodifuzija na IgG, IgA i IgM). Izveduvawe so komercijalni plo~i: 1. Plo~ite se otvoraat i se bri{e kapakot za da se otstrani kondenziranata voda. 2. Serumot se razreduva: za IgG 1:10 (0.1 mL serum + 0.9 mL fiziolo{ki rastvor); za IgA 1:2 (0.1 mL serum + 0.1 mL fiziolo{ki rastvor); IgM se ispituva ne e razreden. Slika 7.4: Edine~na imunodifuzija na agar. A) nanesuvawe serum so mikropipeta; B) {emtaski prikaz na vnesuvawe serum; V) difuzija na serumot niz agarot; G) imunoprecipitacija vo agarot; D) serisko razbla`uvawe na serumot 2, 4 i 8 pati. 74 3. Prvoto bunar~e se polni so 5 mkL (mikrolitri) standard od IgG, IgA ili IgM, 5 mkL od serumot se vnesuva vo edno od drugite bunar~iwa (spored porano napravenite razreduvawa). Plo~ata vnimatelno se zatvora i se ostava na sobna temperatura ili vo inkubator na 37oC. Prika`uvawe i tolkuvawe na rezultatite: Se meri dijametarot na istalo`eniot prsten okolu sekoe Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 7: TALO@NI PROTIVTELA-IMUNOPRECIPITACIJA R g/L ImunoglobulinG(IgG) 4.0 0.154 4.1 0.171 4.2 0.188 4.3 0.206 4.4 0.225 4.5 0.244 4.6 0.263 4.7 0.282 4.8 0.302 4.9 0.323 5.0 0.344 5.1 0.365 5.2 0.386 5.3 0.409 5.4 0.431 5.5 0.454 5.6 0.478 5.7 0.501 5.8 0.526 5.9 0.550 R g/L R g/L 6.0 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 7.0 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 0.575 0.601 0.626 0.653 0.680 0.707 0.734 0.762 0.791 0.820 0.849 0.879 0.909 0.939 0.970 1.002 1.034 1.066 1.098 1.131 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 8.9 9.0 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8 9.9 1.165 1.199 1.233 1.268 1.303 1.339 1.375 1.411 1.448 1.485 1.523 1.561 1.600 1.639 1.678 1.718 1.758 1.779 1.840 1.881 Tabela 7.1: Ot~ituvawe koncentracijata na imunoglobulin G (IgG) od gotovi plo~i bunar~e so linear, so lupa ili so RID-metar. Se postavuva dijametarot na prstenot nasproti log10 od koncentracijata na protivgenot za da se dobie standardna prava. Nepoznatiot primerok se ot~ituva od ovaa prava. Vo komercijalno napravenite imunodifuziski plo~i se dadeni tabeli za ot~ituvawe za sekoj imunoglobulin. Ovde se dadeni tabelite za ot~ituvawe na site imunoglobulini so komercijalnite kompleti (Tabeli 7.1 do 7.3). Neophodno e da nastane kompletno izedna~uvawe. Za toa se potrebni najmalku 24 ~asovi na sobna temperatura (ili 6 ~asovi na 37oC), no se prepora~uvaat 48 ~asovi (12 ~asovi vo inkubator na 37oC), ili 3 do 5 dena. Dokolku serumot sodr`i zna~ajni koli~estva IgM neophodna e inkubacija R g/L R Imunoglobulin A (IgA) 4.0 0.134 6.0 4.1 0.157 6.1 4.2 0.181 6.2 4.3 0.205 6.3 4.4 0.230 6.4 4.5 0.255 6.5 4.6 0.281 6.6 4.7 0.307 6.7 4.8 0.334 6.8 4.9 0.361 6.9 5.0 0.389 7.0 5.1 0.418 7.1 5.2 0.447 7.2 5.3 0.477 7.3 5.4 0.507 7.4 5.5 0.538 7.5 5.6 0.569 7.6 5.7 0.601 7.7 5.8 0.634 7.8 5.9 0.667 7.9 g/L R g/L 0.701 0.735 0.770 0.805 0.841 0.878 0.915 0.952 0.991 1.029 1.069 1.109 1.149 1.190 1.232 1.274 1.317 1.360 1.404 1.448 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 8.9 9.0 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8 9.9 1.494 1.539 1.585 1.632 1.679 1.727 1.776 1.824 1.874 1.924 1.975 2.026 2.078 2.130 2.183 2.237 2.291 2.345 2.401 2.456 Institut za imunobiologija i humana genetika Tabela 7.2: Ot~ituvawe koncentracijata na imunoglobulin A (IgA) od gotovi plo~i 75 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Tabela 7.3: Ot~ituvawe koncentracijata na imunoglobulin M (IgM) od gotovi plo~i R g/ L R Imunoglobulin M (IgM) 4.0 0.605 6.0 4.1 0.638 6.1 4.2 0.668 6.2 4.3 0.701 6.3 4.4 0.735 6.4 4.5 0.770 6.5 4.6 0.805 6.6 4.7 0.841 6.7 4.8 0.878 6.8 4.9 0.916 6.9 5.0 0.954 7.0 5.1 0.993 7.1 5.2 1.033 7.2 5.3 1.074 7.3 5.4 1.116 7.4 5.5 1.158 7.5 5.6 1.201 7.6 5.7 1.245 7.7 5.8 1.290 7.8 5.9 1.335 7.9 g/L R 1.381 1.428 1.476 1.525 1.574 1.624 1.675 1.727 1.779 1.832 1.886 1.941 1.996 2.053 2.110 2.168 2.226 2.286 2.346 2.407 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 8.9 9.0 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8 9.9 g/L 2.469 2.531 2.595 2.659 2.724 2.789 2.856 2.923 2.991 3.059 3.129 3.199 3.270 3.342 3.415 3.488 3.562 3.637 3.713 3.790 od 80 ~asovi na sobna temperatura (24 ~asovi vo inkubator na 37oC). Upotrebata na pre~isteni IgG ili protivtela mo`e da dade podobri rezultati. Boeweto na talo`nite prsteni so Komasi sino mo`e da dade podobri rezultati, osobeno pri pomalite koncentracii. Potrebno e da se vnese kontrolen serum od `ivotnite pred nivnata imunizacija, zatoa {to radijalnata imunodifuzija e osobeno ~uvstvitelna na artefakti. Postojat i gotovi aparati za avtomatsko ~itawe i presmetuvawe na radijalnata imunodifuzija (Dinatech i drugi). 7.4. Imunoelektroforeza Vo ovaa tehnika belkovinite najprvin se dvojat so elektroforeza na agar ili agaroza. Potoa se dodava protivserum vo centralnata brazda (paralelna so elektroforetskoto patuvawe) ostavaj}i go spontano da difundira niz gelot. Na mestoto kade {to se sretnuvaat protivgenot i protivteloto se sozdava talo`en (precipitaciski) lak. Najgolemoto ograni~uvawe na ovoj metod e relativno maloto razdvojuvawe (rezolucija) za najgolemiot broj protivgeni, koga se upotrebuva agarna elektroforeza. Materijal i oprema: seka~i za imunoelektroforeza, ~ove~ki serum, vla`na komora, 2% agar vo barbitonski pufer, barbitonski pufer, mikroskopski stakla, 7% ocetna kiselina, aparat za elektroforeza so pridru`ni delovi (Slika 7.5), Komasi brilijantsko sinilo. Izveduvawe : Slika 7.5: [ematski prikaz na aparatot za elektroforeza. 76 1. Se zagreva agarot vo voda {to vrie. Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 7: TALO@NI PROTIVTELA-IMUNOPRECIPITACIJA 2. Se bri{at staklata so alkohol i eter, se obele`uvaat staklata so brojki i nivnata pozicija vo odnos na anoda i katoda i se stavaat vo specijalnite le`i{ta. 3. So ~etki~ka vnimatelno se prema~kuvaat kraevite na staklata i ramkata so topol agar. Se razlevaat po 10 mL te~en agar vo sekoja kolona (ima po tri stakla). Plo~ata se stava vo ladilnik 24 ~asovi. A B 4. So poseben kalap se pravat po dve bunar~iwa i edna brazda na sekoe mikroskopsko staklo. So vakuum i so pinceta se vadat agaroznite otpadoci. 5. Vo bunar~iwata se nanesuva okolu 10 mkL od ispituvaniot primerok obele`en so brom fenolno sinilo. 6. Se polnat rezervoarite so pufer, se postavuvaat plo~ite, se nanesuva filter hartija i se vklu~uva elektri~na struja (po 8 mA za sekoe staklence). 7. Otkako }e zavr{i patuvaweto na belkovinite, vnimatelno se vadi sredi{niot del od brazdata, se nanesuva po okolu 1 mL protivserum. Se ostava 24 ~asovi vo vla`na komora za spontano da se istalo`at lacite. 8. Plo~ata se potopuva vo fiziolo{ki rastvor 24 ~asovi za da se otstranat neistalo`enite belkovini. Se plakne so destilirana voda i se potopuva 5-10 min vo 7% ocetna kiselina (fiksacija na lacite). 9. Plo~ata se potopuva vo boja (Komasi brilijantsko sino) i stoi 6-10 min. Plo~ata se odbojuva vo ocetna kiselina i metanol 12-24 ~asovi. 10. Primerocite se su{at na 37oC najmalku 24 ~asovi. Staklencata vnimatelno se oddeluvaat i se lepat etiketi so objasnuvawe {to ima na niv (slika 7.6). Prika`uvawe i tolkuvawe na rezultatite: Zavisno od elektri~niot polne`, belkovinite patuvaat kon anodata ili kon katodata. Za razlika od drugite frakcii, gama globulinite patuvaat kon katodata, albuminite zaradi svojata najmala molekulska masa patuvaat najdaleku kon anodata. Najmalku patuvaat IgM i fibrinogenot zaradi najgolemata molekulska masa. V G D \ Slika 7.6: Prika`uvawe na elektroforetskite postapki: A, izgled na plo~kata; B, nanesuvawe primerok; V, elektroforetsko dvi`ewe; G, nanesuvawe protivtela; D, difuzija na protivtelata i primerokot; \, imunoprecipitaciski laci. 7.5. Zada~i Izmeri dijametar na precipitaciskite prsteni od IgG, IgA i IgM, vnesi gi vo Tabela 7.4 i presmetaj ja nivnata koncentracija. Institut za imunobiologija i humana genetika 77 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Tabela 7.4: Formular za vnesuvawe koncentracija na imunoglobulin G (IgG), A (IgA) i M (IgM) od gotovi plo~i. Primer Slu~aj Primerok Dijametar (mm) Koncentracija (g/L) Primerok Dijametar (mm) Koncentracija (g/L) Standard 1 IgG 2.5 0.1 Standard 1 IgG 0.1 Standard 2 IgG 7.75 1.0 Standard 2 IgG 1.0 Primerok 1 IgG 4.6 2.63 (0.263h10) Primerok 1 IgG Primerok 2 IgG 8.8 14.48 (1.448h10) Primerok 2 IgG Standard 1 IgA 4.8 0.5 Standard 1 IgA 0.5 Standard 2 IgA 6.75 1.0 Standard 2 IgA 1.0 Primerok 1 IgA 5.8 1.268 (0.634h2) Primerok 1 IgA Primerok 2 IgA 9.4 4.366 (2.183h2) Primerok 2 IgA Standard 1 IgM 2.75 0.5 Standard 1 IgM 0.5 Standard 2 IgM 5.0 1.0 Standard 2 IgM 1.0 Primerok 1 IgM 5.0 0.954 Primerok 1 IgM Primerok 2 IgM 9.5 3.488 Primerok 2 IgM Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod) Data Student (ime i prezime) Asistent (potpis i pe~at) ______________ ____________________________ __________________________ 78 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 8: PROTIVTELEN ODGOVOR VE@BA 8: PROTIVTELEN ODGOVOR 8.1.Broewe protivtela sekretira~ki B limfociti B limfocitite od slezinkata na staorec koi ne do{le vo dopir so tu|i protivgeni ne la~at imunoglobulini i gi narekuvame limfociti devici. Po intraperitonealnoto vnesuvawe ovne{ki crveni krvni zrnca kaj staorecot, tie stapuvaat vo kontakt so niv, se osposobuvaat da la~at imunoglobulin M i pri povtornoto me{awe vo polucvrsta sostojba, vo prisustvo na komplement, imunoglobulinot M difundira vo okolinata po {to se vr{i hemoliza na ovne{kite crveni krvni zrnca. Potreben e sledniov materijal i oprema: Isplaknati ovne{ki crveni krvni zrnca, staorci, Quadriperm plo~i, Indubioza, solen fosfaten pufer, komplement, ~eli~no sito od 100 mikroni, staklen klip, inverten mikroskop. Izveduvawe na testot: Metodot za broewe imunoglobulin M sekretira~ki splenociti e modificiran metod vrz osnova na originalnite postapki od Jerne i sor., 1963 i Dreser i Vortis, 1967 (Slika 8.1). Ovne{kite eritrociti se plaknat tri pati vo fiziolo{ki rastvor i se pravi 10% suspenzija. Na sekoj staorec mu se vnesuvaat po 0.5 mL od ovaa suspenzija i.p. za da se izvr{i primarna imunizacija (primaren imunolo{ki odgovor). Po ~etiri dena staorcite se `rtvuvaat so iskrvavuvawe od aorta, a slezinkata se se~e na mali par~enca i se pasira niz ~eli~no sito od 100 mikrometri so 10 mL Henksov rastvor. Za celo vreme na rabotata, suspenzijata od splenociti se ~uva vo mraz. Metodata se izveduva vo plasti~ni plo~i Quadriperm od firmata Hereaeus (ili sli~ni). Se prigotvuva 1% rastvor od Indubioza vo solen fosfaten pufer i se razlevaat po 2.5 mL za da se formira dolen sloj. Gorniot sloj se pravi od 0.5% Indubioza vo solen fosfaten pufer i toa vo stakleni epruvetki na 45oC vo sledniov sostav: 0.5 mL Indubioza, Institut za imunobiologija i humana genetika 79 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 0.05 mL plakneti ovne{ki eritrociti (10% suspenzija), i 0.02 mL od suspenzijata na splenociti. Sme{ata se nanesuva vo rok od 3-5 sekundi vrz dolniot sloj. Za sekoj primerok se pravat po dva testa (Slika 8.2:A). Plo~ite se zatvoraat, se inkubiraat 60 min na 37oC vo inkubator so 5% SO2, se dodava komplement od zamorec (razreden 1:10 so Henksov rastvor) i se inkubira u{te 60 min. Se istura komplementot, se su{i i se brojat hemoliti~nite prsteni pod stereo mikroskop pod malo zgolemuvawe so dolno svetlo (Slika 8.2:B). Slika 8.1: [ematksi prikaz za izveduvawe na testot za broewe imunoglobulin M sekretira~ki splenociti vo Quadriperm plo~i. 80 Prika`uvawe i tolkuvawe na rezultatite: Broeweto hemoliti~ni zoni se vr{i zavisno od vkupniot broj. Ako se malku, se brojat na celo vidno pole, ako gi ima vo sredna gustina se pravat podelbi na dnoto od plo~ata, a dokolku gi ima vo golem broj, toga{ se lepi mre`a od letraset i se broi vo malite kvadrat~iwa so korekcija na nivniot vkupen broj. Rezultatite se iska`uvaat kako broj na imunoglobulin M sekretira~ki splenociti vo cela slezinka. Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 8: PROTIVTELEN ODGOVOR B A Slika 8.2: Izveduvawe na testot za broewe imunoglobulin M sekretira~ki splenociti vo Quadriperm plo~i (A) i izgledot na hemoliti~nite zoni pod mikroskop so malo zgolemuvawe (B). 8.2.Imunonefelometrisko opredeluvawe imunoglobulinski klasi i potklasi 8.2.1. Princip na imunonefelometrija Nefelometrijata e naj~esto upotrebuvaniot princip za imunohemisko merewe na proteinite vo serumot, urinata i drugite telesni te~nosti. Na IIBHG raspolagame so avtomatiziran imunonefelometar (Slika 8.3). Ako se vnesat vo kiveta soodvetniot protivgen i soodvetnoto protivtelo, se formiraat protivgen-protivtelo kompleksi. Vo ovaa metoda se meri svetlosta koja se rasprsnuva od sozdadenite protivgen-protivtelo kompleksi. 8.2.2. Opti~ki pateki na svetlinata Laserskata dioda sozdava svetlost so branova dol`ina od 840 nm. Svetlosniot snop e zbir od prakti~no paralelni zraci i minuva niz kivetata. Svetlosta se rasprsnuva od ~esti~kite sozdadeni vo kiveta od strana na protivgenprotivtelo kompleksite i pod agol od 13-240 se upatuva kon detektorot (dioda). Institut za imunobiologija i humana genetika 81 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Slika 8.3: Avtomatiziran imunonefelometar na IIBHG PN ProSpec System. Sozdadenata rasprsnata svetlina se fokusira kon fotodetektorot so sistem od le}i. Poradi geometriskiot oblik na detektorot, se otkriva samo mal del od rasprsnatata svetlina. Detektorot ja pretvora rasprsnatata svetlina vo elektri~en impuls. Koncentracijata na proteinite vo primerokot se meri kako razlika pome|u signalot pred zapo~nuvawe na reakcijata i signalot po zavr{uvawe na reakcijata so matemati~ki postapki i so sporeba so referentnata kriva. Poradi intenzitetot na upadnata svetlina, ne e potrebno dopolnitelno zasiluvawe (postamplifikacija) vo svetlosniot zasiluva~ (fotomultiplikatorot) (Slika 8.4). 8.2.3. Principi na imunoturbidimetrisko merewe Hajdelberger-Kendalovata kriva go prika`uva soodnosot pome|u nivoto na protivgenot i mereniot svetlosen signal pri konstantno nivo na protivtela (Slika 8.4). Hajdelberger-Kendalovata kriva mo`e da se podeli vo tri podra~ja: 1. Vi{ok na protivtela. Vo ova podra~je ima vi{ok protivtela, odnosno ima mnogu slobodni vrzni mesta. Dodavaweto na sekoja molekula protivgen, vedna{ se vrzuva i doveduva do natamo{no vkrsteno vrzuvawe. 2. Ramnote`ni granici. Pri pribli`no ednakvi koncentracii na protivgenot i protivteloto povr{inata na krivata se nare~uva ramnote`ni granici. Ovde vkrstenoto vrzuvawe e najjako i rastvorlivosta na kompleksot protivgen-protivtelo e najmala. 3. Vi{ok na protivgen. Vo slu~aj na vi{ok protivgen, rastvorlivost na imunite kompleksi povtorno se zgolemuva bidej}i pove}e nema vi{ok protivtela za 82 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 8: PROTIVTELEN ODGOVOR da gi vrzat site protivgeni. Ova zna~i deka izmereniot signal e pomal otkolku toj vo ramnote`nite granici. Slika 8.4: Opti~ki sistem na imunonefelometarot. Vo avaluacijata na Hajdelberger-Kendalovata kriva, dve koncentracii na protivgenot bi mo`ele da bidat odgovorni za opredeleno merewe na signalot (Slika 8.6): - Prvata to~ka le`i vrz nagorniot del od vi{okot protivtelo (niska koncentracija na protivgen). - Vtorata to~ka le`i vrz nadolniot del od vi{okot na protivgen (visoka koncentracija na protivgen). So optimizacija na uslovite na reakcija vo BN ProSpec, maksimumot na Hajdelberger-Kendalovata kriva e Slika 8.5: Haidelberger-Kendelova (Heidelberger-Kendall) kriva za imunonefelometrisko opredeluvawe imunoglobulinski klasi i potklasi. Institut za imunobiologija i humana genetika 83 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Slika 8.6: Optimizirana Hajdelberger-Kendelova kriva. pomestena kon povisokite koncentracii na protivgen do toj stepen {to izmereniot signal seu{te pa|a vo leviot del od krivata, duri i pri pogolemi koncentracii na proteini (Slika 8.7). Za da se garantira to~nost vo uslovi na vi{ok na protivgen, duri i vo slu~ai koga se prisutnite proteini vo visoki koncentracii, ili koga poka`uvaat golemi biolo{ki varijacii (na primer, urinarnite proteini), za opredeleni metodi se koristat predreakcii. 8.2.4. Predreakcii Vo predreakciite, del od primerokot se prigotvuva so kompletno koli~estvo reagens. - Dokolku, za vreme na predreakcijata, ne se nadmine pragot na reakcijata, se pipetira voobi~aenoto koli~estvo i se izveduva mereweto. Presmetanata sirova vrednost se opredeluva od referentnata kriva. - Dokolku postoi zna~ajno zgolemuvawe na signalot koj go nadminuva definiraniot prag na reakcijata, mereweto se povtoruva avtomatski so slednoto razreduvawe, dokolku e napravena konfiguracija na aparatot za avtomatsko povtoreno merewe. Predreakcijata isto taka prvo se meri za novo razreduvawe. -Ako ima povtorno zna~ajno zgolemuvawe, primerokot se prigotvuva so slednoto razreduvawe i se proveruva so predreakcija. Ovaa postapka se povtoruva se dodeka rezultatot od predreakcijata ne le`i pod propi{aniot prag na 84 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 8: PROTIVTELEN ODGOVOR reakcijata ili dodeka sistemot ne gi dostigne granicite dozvoleni za razreduvawe na primerokot. Ako i posle toa ne mo`e da se dobie rezultat, do izmerenata vrednost se dodava znakot ">". Pragot na reakcijata se presmetuva od predreakciskiot signal na gornata to~ka od kalibracionata kriva, ovaa vrednost se mno`i so faktor specifi~en za opredeleniot esej, i na kraj se dodava specifi~na konstanta za esejot. 8.2.5. Proveruvawe turbiditet Ako mereniot signal go nadminuva definiraniot prag na reakcija, rezultatot se ozna~uva so taka nare~eniot turbiditeten znak. Proveruvaweto turbiditet se izveduva vrz osnova na dva kriteriumi: 1. Ako razlikata pome|u po~etnata vrednost (prvata merena vrednost posle 7.5 sekundi) i vrednosta na slepata proba e pogolema od 1800 bita. Vrednosta od 1800 bita se nare~uva op{t turbiditeten prag. So ovoj kriterium se merat primeroci so mnogu visok intenzitet (na primer lipemi~ni serumi) ili brzi reakcii (na primer monoklonski imunoglobulini). 2. Ako razlikata pome|u po~etnata vrednost (prvoto merena vrednost posle 7.5 sekundi) i slepata proba vo kivetata se pogolemi od 800 bita plus 15% od razlikata pome|u vtoroto merewe i po~etnata vrednost. Ovoj kriterium e razvien za da se isklu~i nespecifi~niot turbiditet, ili pojava na atipi~ni reakcii so mali razliki na izmereniot signal pome|u vtoroto merewe i po~etnata vrednost. Vrednosta od 800 bita se nare~uva turbiditeten prag, a 15% se nare~uva turbiditeten faktor. Dade Bering gi presmetuva op{tiot turbiditeten prag i op{tiot turbiditeten faktor i gi gi dava kako standardni vrednosti. Dokolku se pojavi nespecifi~na reakcija, se vadi primerokot od aparatot i se o~istuva (na primer, lipemi~niot serum se o~istuva so centrifugirawe 10 minuti na 15.000 vvm). Primerokot se vra}a vo analizatorot i se procesira bez merewe na nespecifi~nata reakcija. 8.3. Zada~i 8.3.1. Izbroj IgM sekretira~i splenociti od gotova plo~a 1. Na zadnata strana od plo~kata damkata (koja odgovara na sodr`inata na epruvetata) vo sekoja od pregradite,so pomo{ na flomaster, se deli na 4 pribli`no ednakvi delovi. 2. Se stava plo~kata pod mikroskop i se nabquduva so Institut za imunobiologija i humana genetika 85 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM najmaloto zgolemuvawe. 3. Se brojat site poliwa na liza (defekti vo homogeniot raspored na eritrocitite). Na primer, da zememe deka vo edna ~etvrtina od damkata se izbrojani 25 poliwa na liza. 4. Za da utvrdime kolku poliwa na liza ima vo celata damka, 25 treba da go pomno`ime po 4 (25x4=100). Ova zna~i deka vo celata damka ima vkupno 100 poliwa na liza, odnosno ima 100 B limfociti. Imeno sekoe pole na liza odgovara na eden B limfocit koj okolu sebe izla~il IgM. IgM za sebe vrzal eritrociti, koi vo tekot na vtorata inkubacija se uni{teni od strana na dodadeniot komplement. 5. Ovie 100 B limfociti se sodr`at vo 20 mikrolitri na splenocitnata suspenzija, kolku {to be{e staveno vo epruvetata. Bidej}i celata slezina e pasirana vo 10 mL Henksov rastvor, {to e 500 x pove}e od 20 mikrolitri, dobieniot broj na B limfociti treba da go koregirame. Taka dobieniot broj 100 }e go pomno`ime po 500 (100x500=50000). Dobieniot broj se izka`uva kako cel broj x10n. Vo na{iot primer, rezultatot bi se prika`al kako 5x104 Blimfociti vo edna slezina (Slika 8.7). Primer Slika 8.7: Formular za vnesuvawe rezultati od imunoglobulin M sekretira~ki splenociti. Izbroeni poliwa na liza Vkupen broj na plazma kletki vo slezinata 25 h 4 =100 100 * (10 mL/0.02 mkL) = 50.000 ili 5.0 h 104 Slu~aj Izbroeni poliwa na liza Vkupen broj na plazma kletki vo slezinata 8.3.2. Izmeri koncentracija na Ig klasi so imunonefelometar Vo glavnoto meni (Slika 8.8) so kliknuvawe na soodvetnata ikona, najprvin se odbira opcijata Lab journal. Vo dobieniot prozorec se kliknuva na kop~eto New. Sega mo`eme da gi Slika 8.8: Glavnoto meni na avtomatiziraniot nefelometar BN ProSpec. 86 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 8: PROTIVTELEN ODGOVOR Slika 8.9: Pristap kon prozorecot za vnesuvawe na podatoci za pacientite i za vidot na analizite koi treba da se napravat. vneseme podatocite za pacientot i analizite koi treba da se izrabotat (Slika 8.9). Najprvin se vnesuvaat podatocite za pacientite: laboratoriskiot broj na pacientot (Sample ID), negovoto ime (First name) i prezime (Last name), datumot na negovoto ra|awe (Date of birth) i koj go ispratil za analiza (Comment). Dvi`eweto pome|u poliwata e so kop~eto Tab ili so ednostavno kliknuvawe na kursorot na dadenoto pole. Otkoga }e gi vneseme podatocite za pacientot vo dolniot lev prozorec (Speciemen type) gi nazna~uvame analizite koi }e treba da se izrabotat. Po proveruvaweto na to~nosta na site vneseni podatoci kliknuvame na ikonata Apply, pa na ikonata Close (Slika 8.10). Potoa aparatot sam si presmetuva kolku od reagensite }e mu bidat potrebni za da se izvedat potrebnite analizi. Dokolku vo rotorot za reagensi nekoj od reagensite e so pomala koli~ina od potrebnata, ikonata Reagents&controls na glavnoto meni }e dobie crvena boja. So kliknuvawe na nea, aparatot vedna{ }e ni poka`e koi od reagensite imaat Slika 8.10: Prozorec za vnesuvawe podatoci za pacientite i za vidot na analizite koi treba da se napravat. Institut za imunobiologija i humana genetika 87 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Sika 8.11: Prozorec za zamena na reagensite. pomala koli~ina od potrebnata. Se osvetluva dadeniot reagens i se kliknuva na kop~eto Access (Slika 8.11). Duri otkoga aparatot }e ne izvesti deka leviot kapak na aparatot e osloboden, mo`eme da pristapime kon negovo otvorawe. Otkoga }e go otvorime leviot kapak na aparatot, go otvorame i kapakot na rotorot za reagensi i go zamenuvame dadeniot reagens. Po zamenuvaweto na reagensot, gi zatvarame kapakot na rotorot za reagensi i leviot kapak na aparatot i go stisnuvame kop~eto Close. Po izvestuvaweto deka reagensot e zamenet, kliknuvame na kop~eto OK. Sika 8.12: Zamena na kivetite i bunar~iwata za razreduvawe. Istovremeno so presmetuvaweto kolku od reagensite }e bidat potrebni da se izvedat zadadenite analizi, aparatot presmetuva i kolku od kivetite za merewe i bunar~iwata za razreduvawe }e mu bidat potrebni. Dokolku nema dovolen broj od kivetite i/ili bunar~iwata za razreduvawe, toga{ ikonata Cuvettes&Dilutions cups na glavnoto meni }e stane crvena. So kliknuvawe na nea, se otvara nov prozorec vo koj mo`eme da izbereme dali }e gi zamenuvame samo 88 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 8: PROTIVTELEN ODGOVOR Slika 8.13: Prozorec za vnesuvawe na primerocite serum vo avtomatiziraniot nefelometar BN ProSpec. kivetite, samo bunar~iwata za razreduvawe ili i kivetite i bunar~iwata za razreduvawe. So kliknuvawe na sakanata ikona, aparatot }e ni dozvoli da go otvorime leviot kapak i da gi zamenime iskoristenite kiveti vo rotorot za kiveti ili iskoristenite bunar~iwa za razreduvawe od nivniot nosa~. Otkoga }e ja izvr{ime sakanata zamena, so kursorot, na {ematskiot prikaz na rotorot za kiveti i nosa~ot na bunar~iwata, gi osvetluvame kivetite i bunar~iwata za razreduvawe koi sme gi zamenile. Potoa kliknuvame ne ikonite Save i Close. Po izvestuvaeto na aparatot deka zamenata e izvr{ena, kliknuvame na OK. Sledniot ~ekor e da gi vneseme primerocite serum vo aparatot. Gi redime ependorfite so serum na nosa~ot za primeroci. Kliknuvame na ikonata Replace samples od glavnoto meni. Po izvestuvaweto na aparatot deka desniot kapak e osloboden go otvorime i go stavame nosa~ot na primeroci. Kliknuvame na ikonata Close i otkoga aparatot }e ne izvesti deka nosa~ot e staven, kliknuvame na OK. Vo ovoj moment aparatot raspoznava deka e postaven nosa~ na Slika 8.14: Lista na napraveni analizi. Institut za imunobiologija i humana genetika 89 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM primeroci, no ne rasoznava koj ependorf na koja pozicija vo nosa~ot e postaven. Poradi toa kliknuvame na ikonata Loading od glavnoto meni. Ni se otvara nov prozorec na koj e prika`an rotorot za primeroci, a vo desniot del ima prozor~e vo koj se prika`ani laboratoriskite broevi na primerocite koi treba da se izrabotat. Pozicijata na koja e postaven nosa~ot na primeroci e prika`ana so `oltozelena boja. So kliknuvawe na nea, aparatot ni dva vizuelen prikaz na nosa~ot. Sega so kursorot go osvetluvame dadeniot laboratoriski broj i go vle~eme do pozicijata na nosa~ot kade e smesten soodvetniot ependorf so serum. Otkoga na ovoj na~in }e ja definirame pozicijata na sekoj ependorf na nosa~ot, kliknuvame na ikonata Apply. Aktivnot nosa~ od `olto zelena-boja, }e premnie vo plavo`olta boja. Za da ja nabquduvame rabotata na aparatot, povtorno kliknuvame na ikonata Lab journal. Sekoja zapo~nata anliza, aparatot }e ja ozna~i so mal ~asovnik. Po zavr{uvawe na istata, do imeto na analizata aparatot, }e ja vpi{e izmerenata vrednost. Po zavr{uvaweto na site analizi, rezultatite se pe~atat. Toa se pravi na toj na~in {to najprvin se osvetluvaat site analizi, pa se kliknuva na ikonata Print. Se otvara nov prozorec na koj ni e dadeno kako }e izgleda otpe~ateniot izve{taj. Se kliknuva na ikonata na koja ima pe~atar. Otkoga }e go otpe~atime izve{tajot, go zatvarame ovoj prozorec i se vra}ame na glavnoto meni preku kliknuvaweto na ikonata System. Dobienite vrednosti se vnesuvaat vo Tabelata 8.1. Tabela 8.1: Formular za vnesuvawe rezultati od imunoturbidimetrisko opredeluvawe imunoglobulinski klasi. Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod) Data Student (ime i prezime) Asistent (potpis i pe~at) ______________ ____________________________ __________________________ 90 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 9: ANALIZA NA HUMORALEN IMUNITET VE@BA 9: ANALIZA NA HUMORALEN IMUNITET 9.1. Normalni vrednosti od ispituvaweto humoralen imunitet Normalnite vrednosti na imunoglobulinskite klasi i potklasi variraat vo prvite meseci i godini, kako i spored polot na decata (Tabela 9.1). Najgolemi promeni vo prvite meseci od `ivotot na decata imaat IgM i IgG, pomalku IgA, a imunoglobulinskite potklasi se menuvaat pomalku i nemaat zna~ajni razliki pome|u ma{kite i `enskite deca. Tabela 9.1: Normalni vrednosti za imunoglobulinskite klasi (IgM, IgA i IgG), i za imunoglobulinskite potklasi (IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4) kaj deca. Institut za imunobiologija i humana genetika 91 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Tabela 9.2: Normalni vrednosti za imunglobulinskite klasi (IgM, IgA i IgG), za imunoglobulinskite potklasi (IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4), kako i za lesnite i za te{kite verigi (lambda i kapa) kaj vozrasni lu|e. Normalnite vrednosti se iska`uvaat vo g/L i se pribli`no ednakvi za vozrasnite ma`i i `eni, osven za IgM. Normalnite vrednosti za imunoglobulinskite klasi (IgM, IgA i IgG), za imunoglobulinskite potklasi (IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4), kako i za lesnite i za te{kite verigi (lambda i kapa) se dadeni na Tabela 9.2. 9.2. Klini~ko zna~ewe na imunoglobulinskite klasi i potklasi Promenite vo koncentracijata na imunoglobulinite obi~no se klasificiraat kako: - Hipogamaglobulinemii koi mo`at da bidat zdru`eni so razli~ni zaboluvawa. Smalenata koncentracija mo`e da bide poradi smalena sinteza, zgolemen gubitok, zgolemeno razgraduvawe ili nivna kombinacija. - Poliklonski i oligoklonski gamopatii koi mo`at da nastanat so zgolemuvawe na pove}e ili na edna imunoglobulinska klasa. Spektrumot na zaboluvawa koi doveduvaat do poliklonski gamopatii e golem i vklu~uva vospalenija, hroni~ni bolesti na crniot drob, kolageni vaskularni zaboluvawa i drugi. - Monoklonski gamopatii koi se karakteriziraat so tesna lenta vo gama-globulinskata zona od elektroforezata na serumskite proteini. Monoklonskite linii gi predizvikuvaat masovnite proliferacii (razrasnuvawa) na Blimfocitnite klonovi kletki koi sintetiziraat imunoglobulini od edna klasa ili eden tip. 9.2.1. Hipogamaglobulinemii Imunonedostatocite mo`eme da gi podelime vo ~etiri kategorii: fiziolo{ki imunonedostatok (kaj novorodeni i vo starosta), primarni specifi~ni imunonedostatoci, 92 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 9: ANALIZA NA HUMORALEN IMUNITET sekundarni specifi~ni imunonedostatoci i jatrogeni imunonedostatoci (Tabela 9.3). 9.2.1.1. Prvi~ni imunonedostatoci Prvi~nite imunonedostatoci se relativno retki poremetuvawa na imuniot sistem i se odlikuvaat so zgolemena osetlivost kon pojava na infekcii. Se klasificiraat vo zavisnost od toa koj del od imuniot sistem e zafaten. Prvi~nite imunonedostatoci mo`at da se manifestiraat: - vo neonatalnata vozrast, vo forma na zgolemena prevalenca na infekciite (vrodeni imunonedostatoci). Ovaa forma e relativno retka (so prevalenca od 1:10,000 do 1:1,000,000) i mnogu te{ko kombinirano poremetuvawe na imuniot sistem. Dijagnozata i lekuvaweto na ovaa forma na imunonedostatok se vr{i vo terciernite pedijatriski centri (Klinikata za detski bolesti pri Medicinskiot fakultet). - vo tekot na adolescencijata ili ranoto polnoletstvo. Tuka spa|aat naj~estite prvi~ni imunonedostatoci, kako na primer selektivniot IgA nedostatok (so prevalenca od 1:700), nedostatocite vo IgG subklasite i zaedni~kiot varjabilen imunonedostatok. Ovie imunonedostatoci se mnogu ~esti i se predmet na razgleduvawe kako vo razli~nite medicinski disciplini taka i vo rutinskata laboratoriska praksa. Zaedni~ka karakteristika na site klini~ki zna~ajni imunonedostatoci e zgolemenata osetlivost i/ili nevoobi~aeno te{kite infekcii nekaraktristi~ni za vozrasta na pacientot. Voobi~aeno, vakvite infekcii ne se pri~ineti samo od eden predizvikuva~, nitu se ograni~eni samo na eden organ. Vo osnova, iako mo`e da se javat vrodeni poremetuvawa (prvi~ni imunonedostatoci) vo site delovi od imuniot sistem, dominiraat poremetuvawata vo oblasta na humoralniot imunitet proprateni so poremetena sinteza na imunoglobulini. Tabela 9.3: Vidovi imunonedostatoci kaj vozrasni lu|e. Institut za imunobiologija i humana genetika 93 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Tabela 9.4: Imunonedostato~ni sindromi na B limfocitite. 94 Vo slu~aj na postoewe na nekoj kombiniran imunonedostatok, site ovie tipovi na infekcii se so zgolemena prevalenca. Ovie slu~ai vsu{nost pretstavuvaat te`ok Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 9: ANALIZA NA HUMORALEN IMUNITET vid na imunonedostato~en sindrom koj se manifestira ve}e vo neonatalnata vozrast. Vakviot sindrom, bez soodvetna terapija (na pr. presaduvawe na koskena srcevina), brzo rezultira so smrt. Za razlika od seto dosega ka`ano nekoi anomalii, koi mo`at da se otkrijat so laboratoriskite testovi, ne se Tabela 9.5. Kombinirani imunonedostato~ni sindromi. sekoga{ proprateni so zgolemena osetlivost kon infekciite. Primer za ova e selektivniot IgA imunonedostatok (bez istovremeno postoewe i na defekt vo sozdavaweto na IgG podklasite) ili poremetuvaweto na mieloperoksidaznata aktivnost. Na Tabela 9.4 e daden kratok prikaz na prvi~nite imunonedostatoci na B-limfocitite so karakteristi~ni naodi za sekoj od niv. Na Tabela 9.5 se dadeni kombiniranite imunonedostatoci. Na imunonedostatok treba da se pomisli dokolku: - postojat povtoruva~ki ili nevoobi~aeno te{ki infekcii koi zafa}aat pove}e organski sistemi, a se predizvikani od razli~ni patogeni; - postojat povtoruva~ki zaboluvawa karakteristi~ni za pedijatrijata, a za koi normalno postoi dobro razvien imun odgovor - se javat nesakani komplikacii pri vakciniraweto i/ ili dokolku vakciniraweto e bez uspeh, kako i pri infekciite so pri~initeli koi voobi~aeno ne bi mo`ele da predizvikaat zaboluvawe. Za razgrani~uvawe dali se raboti za prvi~en ili vtori~en imunonedostatok od osobena va`nost e vozrasta na pacientot, kako i podatocite za postoewe te{ki sistemski zaboluvawa i/ili podatoci za primaweto na imunosupresivna/zra~na terapija i citotoksi~ni lekovi. Dokolku postoi za~estena pojava na infekcii vo tekot na detstvoto, Institut za imunobiologija i humana genetika 95 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Slika 9.1: Dijagnosti~ki priod kon somnitelni vrodeni imunonedostatoci ako e prisutna bakteriska infekcija. MPO, mieloperoksidaza, KPU, kletki prirodni ubijci. ANALIZA NA SLU^AJ pubertetot i po~etokot na polnoletstvoto, a dokolku nema podatoci za postoewe na nekoi od ovie pri~ini za vtori~ni imunonedostatoci, mo`e da se razmisluva za postoewe na prvi~en imunonedostatok. Dijagnosticiraweto na imunolo{kite poremetuvawa kaj pomalku te{kite imunonedostatoci, koi se javuvaat vo tekot na detstvoto i na po~etokot na polnoletstvoto, obi~no po~nuva so voobi~aenite klini~ki isleduvawa: - kompletna krvna slika, vkl~uvaj}i ja tuka i krvnata razmaska (diferencijalna krvna slika); - elektroforeza na serumskite belkovini i odreduvawe na koncentracijata na imunoglobulinskite klasi i podklasi; - odreduvawe na koncentracijata na feritinot za da se isklu~i postoeweto na nedostatok na `elezo; - detekcija na protivtela kon voobi~aenite patogeni i /ili postvakcinalni protivtela; - mikrobiolo{ko doka`uvawe na patogenot vo tekot na akutnata faza na infekcijata; Iks vrzana agamaglobulinemija: Slu~ajot na Bogdan Gligorovski, student na medicina skoro bez protivtela. 96 - in-vivo ko`ni testovi so ve}e doka`anite patogeni pri~eniteli za da se ispita funkcijata na T limfocitite. Vo najgolem broj na slu~ai, ovie laboratoriski testovi ni ovozmo`uvaat da go isklu~ime ili potvrdime postoeweto Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 9: ANALIZA NA HUMORALEN IMUNITET Slika 9.2: Dijagnosti~ki priod kon somnitelni vrodeni imunonedostatoci ako se prisutni te{ki me{ani infekcii so virusi i gabi. na najgolem broj od sekundarnite imunonedostatoci, kako i da gi isklu~ime ostanatite zaboluvawa koi mo`at da go kompromitiraat imuniot sistem (na pr. sistemskite hematolo{ki zabolouvawa, sindromite proprateni so gubitok na belkovini, nedostatokot na `elezo, sindromite proprateni so nedostatok na imunoglobulini i/ili sindromite so selektiven imunoglobulinski nedostatok, monoklonalnata gamopatija i dr.) Na Slika 9.1 i Slika 9.2 se prika`ani dijagnosti~kite postapki koi treba da se prevzemat vo zavisnost od spektarot na patogeni i rezultatite od bazi~nite (preliminarni) isleduvawa. Sindrom na nedostatok na protivtela. Ovoj sindrom, kako i selektivniot nedostatok na imunoglobulinite (na primer nedostatokot na IgA), mo`e da se dijagnosticira vrz osnova na imunoelektroforezata na serumskite belkovini i kvantitativnoto odreduvawe na imunoglobulinskite klasi. Od Tabela 9.3 mo`e da se vidi deka dosega se poznati nekolku te{ki vrodeni formi na ovoj sindrom na nedostatok na protivtela, me|u koi spa|a i Brutonovata bolest. Kaj site ovie formi otsustvoto na B Institut za imunobiologija i humana genetika 97 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM limfocitite mo`e da se doka`e so odreduvaweto limfocitni subpopulacii, a kaj Brutonovata bolest mo`e da se doka`e i postoeweto na mutacija na genot za btk. Sindrom na obi~niot/op{tiot varjabilen imunonedostatok (OVIN) [Common variable immunodeficiency syndrome (CVID)]: Ovoj imunonedostatok e zna~itelno po~est odkolku sindromot na nedostatok na protivtela. Toj prestavuva heterogena grupa od zaboluvawa, ~ija {to zaedni~ka karakteristika e prisustvo na sindrom na nedostatok na protivtela. Prvite klini~ki manifestacii kaj ovoj imunonedostatok se javuvaat pome|u 15-35 vozrast. Imunfenotipiziraweto na krvnite limfociti mo`e da pomogne vo karakteriziraweto na kleto~nite anomalii i vo nivnoto odvojuvawe od vtori~nite sindromi na protivtelni nedostatoci, kako na pr. onie koi se povrzani so limfomite. Zaedni~ko obele`je na site formi na OVIN e neadekvatnoto sozrevawe na naivnite zreli limfociti vo imunoglobulin-sozdava~ki plazma kletki, po stimulacijata so protivgenot. Vakvoto ne{to mo`e da se doka`e so testovite za ispituvawe funkcionalnosta na B limfocitite. Vo somnitelnite slu~ai, za da se isklu~i postoewe na sistemsko hematolo{ko zaboluvawe, treba da se napravi i biopsija na koskenata srcevina. Vo slu~aite na OVIN karakteristi~en naod e redukcijata na brojot na plazma kletkaite. Selektiven nedostatok na poedine~nite imunoglobulinski klasi: Ovie nedostatoci, a osobeno selektivniot IgA nedostatok, se obi~no naj~esti vo prirodata i ne iziskuvaat op{irno i specijalizirano dijagnosti~ko ispituvawe. Vo slu~aite na kompleten IgA nedostatok (serumskiot IgA da e <0.05 g/L), obvrzno treba da se proveri dali nedostasuva i sekretorniot IgA. Za da se proceni kompletnoto klini~ko zna~ewe vo ovie slu~ai treba da se ispita i koncentracijata na podklasite na IgG. I vo slu~aite na parcijalen nedostatok na IgA, dopolnitelno treba da se ispita nivoto na IgG i IgA podklasite. Vo site slu~ai na kompleten IgA nedostatok ili so kompleten nedostatok na IgA podklasite, treba da se o~ekuva mo`na pojava na protivtela naso~eni kon IgA. Zatoa na vakvite pacienti ne treba da im se davaat krvni produkti koi sodr`at IgA. Hiper-igM sindrom: Ovoj sindrom se odlikuva so otsustvo na prevklu~uvawe na IgM kon IgG i IgA vo tekot na infekcijata. Kaj ovie pacienti ima defekt vo CD40 ligandot koj se nao|a na T limfocitite, a koj igra mnogu va`na uloga vo T-B limfocitnata interakcija. Ovoj defekt mo`e da se otkrie so imunofenotipizirawe i so molekularno-biolo{ki metodi. Nedostatok na imunoglobulinskite podklasi: Vo serumot kaj pacientite ima nezna~itelni koli~ini na imunoglobulinskite klasi i podklasi. Vakvite pacienti stradaat od povtoruva~ki bakteriski infekcii, osobeno na respiratorniot trakt, predizvikani naj~esto od piogeni bakterii. Vo zavisnost od lokacijata na genot odgovoren 98 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 9: ANALIZA NA HUMORALEN IMUNITET za razli~nite podklasi, so zgolemena stapka istovremeno se sretnuvaat slednite defekti: - nedostatoci na IgG1 i IgG3 - nedostatoci na IgG2 i IgG4 so mo`en nedostatok na IgA2. 9.2.1.2. Vtori~ni imunonedostatoci Smaluvawe koncentracijata na imunoglobulinite poradi zgolemeno razgraduvawe (hiperkatabolizam) se javuva vo hipermetabolni sostojbi. Na primer, vakva sostojba gledame kaj bolnite so zgolemena aktivnost na tiroidnata `lezda (hipertiroidizam) koga mo`at da bidat namaleni site imunoglobulinski klasi. Serumskite imunoglobulini mo`at da bidat namaleni i kaj pacientite so miotoni~na distrofija poradi smaleniot polu`ivot. Protiv protivtelata se retka pri~ina za zgolemena eliminacija na imunoglobulinite od cirkulacijata. 9.2.2. Poliklonski i oligoklonski gamopatii Poliklonskiot ili oligoklonskot imun odgovor, koj se javuva za vreme na infekcija so kompleksni protivgeni (mikroorganizmi), doveduva do zgolemuvawe na serumskite imunoglobulini od edna ili od pove}e klasi. Dijagnozata na poliklonalni gamopatii se postavuva so kvantitativno merewe na imunoglobulinskite klasi i potklasi, koga }e najdeme zgolemuvawe nad normalnata vrednost na pove}e klasi ili potklasi imunoglobulini. Izolirano zgolemuvawe na IgM se smeta kako znak za primarna reakcija na infekcija. Kaj novorodeni, zgolemuvaweto IgM vo papo~nata vrvca se smeta kako nespecifi~en znak na vnatreuterusna infekcija. ZgoleTabela 9.6. Pri~ini za oligoklonski gamopatii. Institut za imunobiologija i humana genetika 99 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM muvawe koncentracija samo na IgG, i lesno zgolemuvawe na IgM e znak za vtori~en imun odgovor kon ve}e poznat predizvikuva~ za organizmot. Hroni~nite aktivni infekcii ja zgolemuvaat koncentracijata na IgG, no vo isto vreme se zgolemeni i/ili IgM i IgA. Relativno golemi koncentracii na IgA mo`at da se najdat kaj crnodrobnite zaboluvawa (poradi toksi~ni o{tetuvawa, alkohol, kontarceptivni lekovi, antidepresivi i sli~no). Pri~inite za oligoklonalno zgolemuvawe na imunoglobulinite se dadeni na Tabela 9.6. 9.2.3. Monoklonski gamopatii ANALIZA NA SLU^AJ Multipen mielom: Slu~ajot na Violeta Babunska, posledici od neprekinat rast na protivtelno sozdava~ki klon od B-Li. Koncentracijata na lesnite imunoglobulinski verigi vo serumot e vo korelacija so koncentracijata na intaktnite imunoglobulinski molekuli. Otstapuvawe od ova ima koga vo serumot }e se pojavat slobodni lesni ili te{ki imunoglobulinski verigi. Pokraj ovie slu~ai, zgolemuvaweto ili namaluvaweto koncentracijata na lesnite imunoglobulinski verigi mo`e da se javi i poradi pojava na proliferacija (poliklonalna ili monoklonalna) ili gubewe na intaktnite inunoglobulinski molekuli. Dodeka kaj poliklonalnite imunoglobulini imame srazmerno zgolemuvawe i na kapa i na lambda lesnite verigi (naj~esto vo sooodnos 2:1), kaj monoklonskite imunoglobulini ima zgolemuvawe na koncentracijata na samo eden tip lesni verigi. Zgolemenoto sozdavawe kako na monoklonalnite imunoglobulini taka i na slobodnite lesni verigi }e dovede do promena i na kapa/lambda soodnosot. Poradi ova vrednostite na kapa/lambda soodnosot koi izleguvaat od normalnite granici uka`uvaat na postoewe na monoklonski gamopatii (na primer kaj multipniot mielom). I dodeka intaknite imunoglobulini ne mo`at da projdat niz intaktnata glomerulska filtraciska bariera, lesnite imunoglobulinski verigi mo`at da se filtriraat i povtorno da se reabsorbiraat vo tubulite. Taka, dokolku imame zgolemeno sozdavawe na imunoglobulinskite lesni verigi, kako na primer kaj monoklonskite gamopatii, mo`e da dojde do nadminuvawe na reabsorpciskiot kapacitet na tubulite i do pojava na lesnite imunoglobulinski verigi vo urinata. Spored toa otkrivaweto na slobodnite lesni imunoglobulinski verigi vo urinata ({to e isto so BensXonsonovite proteini) e va`en pokazatel za postoewe monoklonskaa gamopatija i mo`e da se iskoristi kako za dijagnosti~ki celi taka i za sledewe tekot na bolesta. Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod) Data Student (ime i prezime) Asistent (potpis i pe~at) ______________ ____________________________ __________________________ 100 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 10: KOMPLEMENTEN SISTEM BLOK 4 BLOK 4 - KOMPLEMENTEN SISTEM I CITOKINI U^EBNI CELI: VE@BA 10. KOMPLEMENTEN SISTEM (1 ~as) Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat: da opredelat SN50 vo serum; da opredelat K3, K4, K1inh. VE@BA 11. CITOKINI (1 ~as) Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat: da opredelat koncentracija na citokin. VE@BA 12. ANALIZA NA KOMPLEMENTEN SISTEM I CITOKINI (1 ~as) Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat da: tolkuvaat rezultati od komplementen sistem; tolkuvaat rezultati od citokini; analiziraat slu~ai od komplementen sistem i citokini. POENI: PRISUSTVO 1.5 poeni ZNAEWE 3.0 poeni VKUPNO: 4.5 poeni Institut za imunobiologija i humana genetika 101 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 102 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 10: KOMPLEMENTEN SISTEM VE@BA 10: KOMPLEMENTEN SISTEM Komplementniot sistem e grupa od dvaesetina plazmatski proteini koi se vo neaktivna forma, no pri opredeleni uslovi mo`e da se aktiviraat skalesto (aktiviraniot protein go aktivira sledniot i toj sistem prodol`uva s# dodeka ne se aktiviraat site komponenti) (Tabela 10.1). Oznaka kirilica Oznaka latinica KLASI^EN PAT Ce1Kju C1q Ce1Er C1r Ce1Es C1s Ce4 C4 Ce2 C2 Ce1inh Ce4bp I C1 - inh C4 - bp I P H I DAF MCP CR1-4 ZAEDNI^KI Ce5 Ce6 Ce7 Ce8 Ce9 PAT C5 C6 C7 C8 C9 Konc. vo serum (mkg/mL) 400 000 85 000 85 000 200 000 110 000 60 - 80 30 - 50 30 - 40 200 - 600 25 regulacija 105 000 570 000 88 000 180 - 240 250 35 ALTERNATIVEN PAT Ce3 C3 Be B De D Pe Ha I DAF MKP Cr1-4 Mol. masa (daltoni) 190 000 90 000 24 000 regulacija 170 - 280 000 150 000 88 000 70 000 45 - 70 000 145 - 400 000 190 000 106 000 120 000 151 000 71 000 regulacija Es protein S protein 80 000 HRF HRF 20 - 65 000 Institut za imunobiologija i humana genetika Tabela 10.1: Belkovini na komplementot. DAF=Decay Accelerating factor MCP=Membrane Cofactor Protein CR1-4=Complement Receptor HRF=Homologous Restriction Factor 1 300 200 1 20 - 25 360 - 550 35 76 - 80 60 - 80 55 - 60 55 - 60 60 500 - 103 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Nivnoto aktivirawe mo`e da po~ne so prisustvo na bakteriski polisaharidi (t.n. alternativen pat na aktivacija) ili pak, so prisustvo na kompleks protivgen protivtelo, {to pretstavuva klasi~en pat na aktivacija. Ispituvawata mo`e da bidat kvalitativni koga se opredeluva vkupnata aktivnost na celiot sistem preku merewe na hemoliti~kiot kapacitet na serumot izrazen vrz eritrociti od oven koi se senzibilizirani so protivtela od zajak (mo`e da se koristat i ~ove~ki eritrociti). Kako edinica obi~no se koristi CH50, definirana kako koli~ina na serum neophodna da lizira 50% od eritrocitite. No, ispituvawata mo`e da bidat i kvantitativni koga se vr{i poedine~no dozirawe na sekoja komponenta na komplementot sli~no kako i kaj protivtelata, so pomo{ na radijalnata imunodifuzija ili pak, nefelometriski. 10.1. Opredeluvawe CH50 na komplementot Koga se dodava komplement (sve` serum) na crveni krvni zrnca oblo`eni so protivtela vo raste~ki proporcii, se dobiva karakteristi~no lizirawe na kletkite (Slika 10.2). Krivata dostignuva 100% liza asimptotski, zaradi {to e mnogu te{ko da se dobie vkupnata liti~ka aktivnost na komplementot (CH100), pa voobi~aeno se meri to~kata na 50% liza (CH50). Fon Krog (von Krogh) napi{al formula koja ja pretstavuva sigmoidnata kriva od hemolizata so komplement, koja glasi: x = k(y/(100-y))1/n kade {to: 104 procent na hemoliza Slika 10.2: Soodnos me|u koncentracijata na komplementot i liziranite eritrociti. Se gleda nelinearen soodnos vo pomalite i pogolemite razreduvawa na serumot. opti~ka gustina na 541 nm x= koli~inata na komplementot (mL od razreden serum); mL serum 1:1000 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 10: KOMPLEMENTEN SISTEM y= proporcija na liziranite ovne{ki eritrociti, del od edinica (0.3/(1-0.3)) ili kako celi procenti (30/ (100-30)); k= 50% edinica na komplement, edna komplementna edinica; 1/n= konstanta koja zavisi od gustinata na eritrocitite vo testot. Pri gustina na eritrocitnata suspenzija od 0.6-1.2*10^8 konstantata ima vrednost od 0.2-0.02. Za izvr{uvawe na testot e potrebno: solen veronalen pufer (SVP), ovne{ki eritrociti, 0.04% amonium sulfat, sve` ili sve`o zamrznat zamore~ki serum, kowski hemoliti~en serum, spektrofotometar, ispituvaniot serum, 0.1 % rastvor od Na2CO3, higroskopen pamuk, kalibrirani pipeti, mraz, termostat, centrifuga. Standardizirawe (senzibilizirawe) suspenzija od ovne{ki eritrociti: 1. Se razreduva veronalniot pufer do rabotna koncentracija. Se vnimava da nema bakterisko ili gabi~no zagaduvawe bidej}i tie imat protivkomplementna aktivnost. 2. Se plaknat 4 mL eritrocitna suspenzija (od 25% suspenzija vo Alseverov rastvor) tri pati vo solen veronalen pufer (centrifugirawe 200 g za 3 min). 3. Se resuspendiraat isplaknatite eritrociti vo odnos 1:18 mL solen veronalen pufer (se dobiva pribli`no 5% suspenzija). Suspenzijata se filtrira niz tenok sloj pamuk. 4. Se me{aat 1 mL eritrocitna suspenzija so 25 mL amonium sulfaten rastvor (ili 1 mL suspenzija so 14 mL 0.1% rastvor od Na2CO3) za da se liziraat kletkite i se ~ita apsorbancijata na hemoliti~kiot rastvor na 541 nm nasproti slepata proba. Za 6% suspenzija od ovne{ki eritrociti, vo 1 sm kiveta apsorbancijata treba da bide 0.48-0.50. Dokolku e potrebno se prilagoduva suspenzija vo ovie granici. 5. Se me{aat 15 mL solen veronalen pufer, 0.1 mL kowski hemoliti~en serum (razreden liofiliziran hemolizin 1:150 do 1:1000), 15 mL 6% suspenzija od ovne{ki eritrociti. 6. Se inkubira na 37oC za 15 min. Se upotrebuvaat senzibilizirani eritrociti vo tek na 24 ~asa. Ponatamu se postavuvaat epruvetkite kako {to e dadeno na tabela 14. Se koristi sve`, smrznat ili liofiliziran serum kako izvor za komplement. Epruvetka broj 1. Pufer (SVP) (mL) 2. Rastvoren komplement, 1:30 (mL) 3. Senzibilizirana Er suspenzija (mL) 1 2 3 4 5 1.10 1.05 1.00 0.90 0.80 0.10 0.15 0.20 0.30 0.40 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 Institut za imunobiologija i humana genetika 6 7 0.04% amon. Tabela 10.2: Protokol za ispituvawe CH50 na komplementniot sistem vo serum. 1.20 1.20 - - 0.30 0.30 105 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM - Epruvetkite se me{aat i se inkubiraat na 37oC 60 min. - Se prenesuvaat epruvetkite vo mraz i im se dodavaat po 2.0 mL solen veronalen pufer. - Epruvetkite se me{aat i se centrifugiraat na 200 g 10 min na 4oC. - Se zema supernatantot od sekoja epruvetka i se meri apsorbancijata na 541 nm. Prika`uvawe i tolkuvawe na rezultatite: - Pretpostavuvaj}i deka sedmata epruvetka ja prika`uva vkupnata liza, se presmetuva lizata vo drugite 6 epruvetki kako procent od sedmata. - Se postavuva % na liza nasproti koncentracijata na komplementot (mL nerazreden serum). Ova }e dade sigmoidna kriva kako na slikata 18. Ovaa kriva ja sledi ravenkata na fon Krog. Ravenkata mo`e da bide logaritamski transformirana za da se dobie prava linija: log x = log k + (1/n)log(y/(100-y)) Se postavuva log x nasproti log (y/(100-y)) za sekoe razreduvawe na upotrebeniot komplement. Pravata linija ima koeficient na opa|awe (sloup = angliski slope) 1/n so vrednosti koi zavisat od eksperimentalnite uslovi, no se dvi`at okolu 0.2-0.04 (Slika 19). Interceptot na linijata e na apscisata, kade {to log(y/(100-y)) = 0 i pretstavuva logaritam od razreduvaweto {to doveduva do 50% liza. Presmetuvaweto mo`e da se napravi i spored formulata: log k = log x - 1/n log ((y/100-y)), mL serum 1:500 kade {to log k odgovara na edna CH50. Nivoto na komplementot vo serumot normalno se iska`uva kako broj na CH50 edinici po 1 mL serum (CH50 * mL-1). Titarot na komplementot se koregira so razreduvaweto na serumot, dokolku go ima vo pogolema koli~ina (Slika 10.2, Tabela 10.2). Slika 10.2: Logaritamska transformacija na krivata na Fon Krog od koja se ekstrapolira vrednosta na SN50 za komplementnata aktivnost vo serumot. 106 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 10: KOMPLEMENTEN SISTEM Normalni vrednosti za komplementot vo ~ove~kiot serum iznesuvat 25-50 CH50 edinici na mL. Dobienite normalni vrednosti ne isklu~uvaat vrodeni ili zdobieni varijacii na oddelnite komponenti od komplementniot sistem. Golemi varijacii vo komplementniot sistem nastanuvaat zaradi nesoodvetno zemawe i ~uvawe na serumot. Zemawe krv so oksalat, citrat, EDTA ili heparin ima protivkomplementen efekt. Krvta treba da se zeme vo suva i ~ista epruvetka, bez protivkoagulans, a serumot ili sinovijalnata te~nost treba da se ispitaat vedna{ ili da se zamrznat na -70oC. Ne smeat smrznatite primeroci da se odmrznuvaat pove}e pati. Klini~kata va`nost na serumskoto nivo na komplementot e uka`uvaweto na intenzitetot na sozdavaweto, kako i negovoto razgraduvawe. Smaleni koncentracii mo`e da ima pri pomalo sozdavawe i/ili pogolemo razgraduvawe na komplementniot sistem. Namaluvawe ima pri akutniot glomerulonefrit (do 25% od normalnoto nivo), formi od hroni~en nefrit (hipokomplementen nefrit), pri sistemskiot lupus eritematodes, revmatoidniot artrit (osobeno vo sinovijalnata te~nost) i kaj drugi bolesti. 10.2. Ispituvawe koncentracija na K3, K4 i K1inh 10.2.1. Radijalna imunodifuzija (RID) Edine~na radijalna imunodifuzija na plo~a: rastvor od primerok koj sodr`i protivgen se raspredeluva vo kru`ni bunar~iwa od agarozen gel koj sodr`i monospecifi~ni protivtela (protivserum). Po opredeleno vreme na inkubacija (24 ~asa) se formiraat jasno vidlivi imunoprecipitaciski prsteni (Slika 10.3). Slika 10.3. Edine~na radijalna imunodifuzija na plo~a za opredeluvawe K3, K4 i K1inh. Institut za imunobiologija i humana genetika 107 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Pribor i reagensi: • • • • • • • • • Vodeno kupatilo. Greja~ so me{alka. Stakleni plo~i 10 h 10 sm, 1.5 mm visoki, prethodno izmieni so detergent i isplaknati so topla voda i etanol (1 ~as - 1 nedela). Pred upotreba plo~ite se plaknat so sme{a od aceton i etanol (50%-50%) (1:1). Dup~alka za gelot i kalap. Vla`na komora (nepropustliva za vozduh koja e dovolno golema za da go dr`i gelot). Fen za su{ewe. Dr`a~ za plo~ite. Kalibriran instrument za zgolemuvawe. Veronalen solen pufer (VSP) (5 pati koncenriran rastvor). Podgotvuvawe rastvori i gelovi: Rastvor A: - 85 g NaCl. - 3.75 g natrium barbiturat. - do 1 litar so H2O. Rastvor B: - 5.75 g barbiturna kiselina vo 600 mL topla H2O. Se me{aat dvata rastvora (A+B) i se nadopolnuva do 1.8 litri so H2O. Po ladeweto se podesuva pH na 7.4±0.5 so 1M HCl. Se dopolnuva voda do 2 litra, a ostanatiot del od VSP mo`e da se ~uva na 4-10 °C do 6 meseci. Veronalen pufer (e isto so barbituraten pufer): • • • • • • 0.1 M EDTA rastvor. 33.6 g Na2 – EDTA. 800 mL H2O. Se podesuva pH na 7.6±0.05 so 2N NaOH. Se dopolnuva voda do 1 litar. Se ~uva na 4-10°C vo tek na 6 meseci. Pufer za agaroza: VSP pufer 9 dela. 0.1 M EDTA 1 del. Podgotvuvawe agaroza: 1.5 g agaroza. 0.01 g natrium azid. 100 mL pufer za agaroza. Se zagreva so me{awe, vo tek na 5 min. Po topeweto gelot se raspredeluva na podednakvi delovi (10 do 15 mL) i se ~uva na 4°C. Rastvor za boewe: 1 g amidoblek. 250 mL metanol. 200 mL destilirana voda. 50 mL ledena ocetna kiselina (mo`e da se upotrebi i 96% ocetna kiselina). 108 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 10: KOMPLEMENTEN SISTEM Rastvorot e filtrira pred upotreba. Rastvor za odbojuvawe: 500 mL metanol. 100 mL ledena ocetna kiselina (mo`e da se upotrebi i 96% ocetna kiselina). 400 mL H2O. Primerok: Kako primerok mo`e da se koristi serum ili plazma od krvzemena so EDTA kako protivsosiruva~). Rabota so primerocite: Pri koisteweto serum epruvetkata so venska krv se ostava 60-120 min na sobna temeperatura za da nastane sosiruvawe i retrakcija na sosirokot. Potoa epruvetkata se centrifugira na 2500 vvm na 4°C vo tek na 5 min. Taka dobieniot serum se prefrla vo ependorvi (epruvetki za ~uvawe so kapa~e). Zemenite primeroci mo`at da se ~uvaat i nekolku godini (bez da izgubat od svojata aktivnost) na 70°C ili pokratko, ako se ~uvaat na -20°C. Treba da se izbegnuva odmrznuvawe i povtorno zamrznuvawe na primerocite. 10.2.2. Odreduvawe na K3 komponentata od komplementot so radijalna imunodifuzija 1. Se rastopuvaat 15 mL od prethodno podgotvenata 1.5% agaroza so vnimatelno zagrevawe. Po ladewe na 56°C vo nea se dodava 55 mkL protiv-human K3 IgG (Diasorin) pri kontinuirano me{awe. 2. Se istura sme{ata od protivtela i agaroza, na 5255°C, na ~ista staklena plo~a za da se oformi 1.5 mm tenok gel (15 mL za plo~a so dimenzii 10h10). Se ~eka okolu 10 min. 3. Vo gelot se pravat bunar~iwa so dijametar od 2.5 mm. 4. Vo bunar~iwata se vnesuvaat po 5 mkL od primerocite razredeni 1:16 (10-1.2) i po 5 mkL Human Kalibrator (DAKO) (ili sme{a od zdrav human serum kako standardi 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; (10-0.3; 10-0.6; 10-0.9; 10-1.5; 10-1.8) razredeni vo pufer koj go koristime za prigotvuvawe agarozen rastvor. 5. Se inkubira vo vla`na komora na sobna temperatura, 24 ~asa. 6. Plo~ite se plaknat so potopuvawe vo solen fosfaten pufer ili 0.9% NaCl, 2-20 ~asa. 7. Po plakneweto plo~ite se vadat od rastvorot za plaknewe i gelot se pokriva so vla`na filter hartija. 8. Plo~ite se su{at so pomo{ na fen (so topol vozduh) ili se stavaat vo zagreana komora. 9. Plo~ite se mestat na dr`a~ i se potopuvaat vo rastvor Institut za imunobiologija i humana genetika 109 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM za boewe 10-15 min. 10. Po boeweto plo~ite se plaknat so voda i se potopuvaat vo rastvor za odbojuvawe 1- 2 min. 11. Plo~ite povtorno se su{at so fen ili vo zagreana komora. 12. Se pravi standardna prava od koncentraciite na poznatite standardi nasproti kvadratot od dijametarot (d2 vo odnos na mm2) na odgovara~kite precipitaciski zoni i koncentracijata na protivgenot od primerocite se odreduva so interpolacija od standardnata prava. Normalni vrednosti: 0.70 - 1.80 g/L 10.2.3. Odreduvawe na K4 komponentata od komplementot so radijalna imunodifuzija Protokolot za odreduvawe na K4 komponentata od komplementot so RID e ista kako za K3 komponentata (vidi 10.2.2.). Razliki ima samo vo to~kite 1 i 4. 1. Se rastopuvaat 15 mL od prethodno podgotvenata 1.5% agaroza so vnimatelno zagrevawe. Po ladewe na 56°C vo nea se dodava 55 mkL protiv-human K4 IgG (Diasorin) pri kontinuirano me{awe. 4. Vo bunar~iwata se vnesuvaat po 5 mkL od primerocite razredeni 1:2 (10-0.3) i po 5 mkL Human Kalibrator (DAKO) (ili sme{a od zdrav human serum kako standardi 1:1; 1:2; 1:4; 1:8 (100; 10-0.3; 10-0.6; 10-0.6; 10-0.9) razredeni vo pufer koj go koristime za prigotvuvawe agarozen rastvor. Normalni vrednosti: 0.15 - 0.55 g/L. 10.2.4. Odreduvawe na K1 inhibitor komponentata od komplementot so radijalna imunodifuzija Protokolot za odreduvawe na K1 inhibitor komponentata od komplementot so RID e ista kako za K3 komponentata (vidi 10.2.2.). Razliki ima samo vo to~kite 1 i 4. 1. Se rastopuvaat 15 mL od prethodno podgotvenata 1.5% agaroza so vnimatelno zagrevawe. Po ladewe na 56°C vo nea se dodava 120 mkL protiv-human K1inh IgG (Calbiochem) pri kontinuirano me{awe. 4. Vo bunar~iwata se vnesuvaat po 5 mkL od primerocite 110 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 10: KOMPLEMENTEN SISTEM razredeni 1:2 (10-0.3) i po 5 mkL Human Kalibrator (DAKO) (ili sme{a od zdrav human serum kako standardi 1:1; 1:2; 1:4; 1:8 (10-0.3; 10-0.3; 10-0.6; 10-0.6; 10-0.9) razredeni vo pufer koj go koristime za prigotvuvawe agarozen rastvor. Normalni vrednosti: 64 % - 166 % od onaa vrednost dobiena so normalen serum. Odreduvawe koncentracijata na K3, K4 komponentite, kako i K1 inhibitorot, mo`e da se napravi i so pomo{ na imunonefelometrija kako {to e opi{ano vo 8.2. Imunonefelometrisko opredeluvawe imunoglobulinski klasi i potklasi. Edinstvenata razlika e vo vidot na monoklonskite protivtela koi se koristat (vo slu~ajov bi koristele monoklonski protivtela kon K3, K4 i K1 inhibitor). 10.3. Zada~a Da se opredeli komplementnata aktivnost vo serum od pacient i da se presmeta standardnata prava na Slika 10.3, kako i SN50 vo Tabelata 10.3. mL 10 1 0,1 0,1 1 10 y/1-y Slika 10.3: Formular za presmetuvawe SN50 za komplementnata aktivnost vo serumot. Institut za imunobiologija i humana genetika 111 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Tabela 10.3: Primer za presmetuvawe CH50 na komplementot i formular za negovo presmetuvawe. Primer Slu~aj Epruveta Serum (mL) Ekst. (nm) y/1-y Epruveta Serum (mL) 1 0.1 0.12 0.12 (0.10/0.96-0.10) 1 0.1 2 0.15 0.17 0.19 (0.15/0.96-0.15) 2 0.15 3 0.2 0.22 0.26 (0.20/0.96-0.20) 3 0.2 4 0.3 0.29 0.39 (0.27/0.9-0.27) 4 0.3 5 0.4 0.37 0.57 (0.35/0.96-0.35) 5 0.4 6 / 0.02 / 6 / 7 / 0.96 / 7 / Hemoliti~ki edinici (HE) 46.8 HE vo 1 mL (1.56h30) (0.64 mL ima 1 HE) Ekst. (nm) y/1-y Hemoliti~ki edinici (HE) Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod) Data Student (ime i prezime) Asistent (potpis i pe~at) ______________ ____________________________ __________________________ 112 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 11: CITOKINI VE@BA 11: CITOKINI 11.1. Zasituva~ki metodi Od zasituva~kite metodi najprvin se vovedeni radioimunolo{kite metodi za opredeluvawe mali koncentracii materii vo tkivata i telesnite te~nosti (1960). Yalow i Berson dobija Nobelova nagrada za imunologija, za istra`uvaweto pri opredeluvawe na insulinot vo serumot. Podocna se vovedeni enzimoimunolo{kite metodi so ne{to pomala osetlivost, a najdocna imunofluorescentnite metodi za opredeluvawe mali koncentracii materii. Zaedni~ki beleg na site metodi e principot na zasituvawe voveden od Ekins vo 1960 godina, objavuvaj}i go metodot za opredeluvawe tiroksin vo serumot. 11.1.1. Op{ti principi na zasituva~kite metodi Slika 11.1: [emata na Ekins vo koja se postaveni osnovite na zasituva~kite metodi od koi se razvija radioimunolo{kite, enzimoimunolo{kite i fluoroimunolo{kite odreduvawa. Zasen~enoto pole go prika`uva obele`eniot del od supstancijata. Osnovniot princip na zasituva~kite metodi e prika`an od Ekins so ednostavniot primer na kofa so voda i edna Institut za imunobiologija i humana genetika 113 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM ~a{a: sekoga{ kofata voda mo`e da se izmeri so edna ~a{a (ako se znae nejziniot volumen). Osnovno vo ovoj metod e da mu se ovozmo`i na soedinenieto {to se meri (P) da reagira so specifi~en receptoren reagens (Q), koj ima ograni~en kapacitet na vrzuvawe. Soedinenieto P po zasituvaweto so Q, se deli na dva dela (slobodno P i vrzano P-Q), taka {to nivniot soodnos varira kako funkcija od vkupnata koli~ina na soedinenieto P (Slika 11.1). Za da mo`at ovie metodi da se koristat neophodno e efikasno da se odvoi vrzanata od slobodnata materija i da se izmerat nivnite koli~ini. 11.2. Imunoenzimski odreduvawa (ELISA) Imunoenzimskite metodi koristat enzim kako odbele`uva~ za opredeluvawe specifi~nata reakcija protivgen: protivtelo. So niv mo`e da se doka`uvaat protivtela i protivgeni. Ovaa metodologija se pojavi vo 1971 godina so zada~a da ja zameni radioimunolo{kata metodologija, odnosno da koristi reagensi koi ne se radioobele`eni, a pritoa da ne izgubi od osetlivosta, to~nosta i drugite visoko oceneti karakteristiki na radioimunolo{kite tehniki.Taka, imunoenzimskite metodi koristat dosta iskustva od radioimunologijata i imunofluorescencijata.Od 1972 godina ovie odreduvawa ve}e se koristat kako mnogu pogodni i vo histo- i citohemiskite metodi. Podgotovkite na reagensite, odvivaweto na reakcijata i ~itaweto na rezultatite e prili~no slo`ena procedura, me|utoa dava mnogu precizni rezultati. 11.2.1. Podgotovka na imunoatsorbentot Se koristat brojni atsorbenti sposobni da gi fiksiraat protivgenite ili protivtelata pasivno ili so kovalentna vrska. Pri pasivnata atsorpcija proteinite se diluirani od 1 do 10 mkg/mL vo alkalen rastvor so rN 9.6 i na plastika ili staklo se atsorbiraat za nekolku ~asa. Kako solidni nosa~i se upotrebuvaat na pr. polistiren, polikarbonat, propilen ili lateks vo forma na top~iwa, plo~ki, yvezdi~ki, epruvetki ili mikroplo~ki. Denes, naj~esto se koristat mikroplo~kite od polistiren koi ovozmo`uvaat istovremeno testirawe pogolem broj primeroci i koristewe avtomatika. Adsorpcijata so kovalentna vrska dobiena vo solidna faza so protivgenot ili protivteloto e cvrsta, ireverzibilna vrska i ovozmo`uva maksimalna preciznost vo ispituvaweto, dodeka kaj pasivnata vrska, plastikata nema sekoga{ ist kapacitet za vrzuvawe-atsorbirawe i vrskata ne e tolku cvrsta pa ima pu{tawe - dezatsorbirawe so kraen efekt - pogre{ni rezultati. Se koristat sefadeks, 114 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 11: CITOKINI celuloza, agaroza, akrilamid ili polistiren so glutaraldehid ili avidin. Denes ovaa faza fabri~ki e izvr{ena i komercijalno se nabavuvaat gotovi reaktivi. 11.2.2. Kowugirawe Kako kowugat se koristi enzim {to treba da zadovoli opredeleni karakteristiki za da bide pogoden obele`uva~. Toj treba da e solubilen, da obezbedi visok stepen na ~istota, da ima soodvetna kataliti~ka aktivnost, da ja zadr`uva specifi~nata aktivnost dodeka e vrzan za reagira~kiot supstrat, da e stabilen za vreme na ~uvaweto i vo tekot na reakcijata, da ovozmo`uva ednostavna, brza i osetliva enzimska reakcija, da ne stapuva vo reakcija so biolo{kata sredina i da e otsuten vo okolnata sredina {to se upotrebuva vo reakcijata. 11.2.3. Spojuvawe enzim so protivtelo ili protivgen Vo imunoenzimskite reakcii se koristat posebni hemiski agensi koi ovozmo`uvaat spojuvawe na enzimot so protivteloto ili pak, so protivgenot. Tie ne treba da vlijaat vrz aktivnosta na enzimot, nitu vrz tekot na imunolo{kata reakcija. Za vakva cel, najmnogu se koristi 1% rastvor glutaraldehid po takanare~eniot metod vo dve vremiwa, koj e vospostaven 1971 godina. Vo prvo vreme nastapuva fiksirawe na molekulata od glutaraldehidot (toj e dialdehid) za NH2 grupata od enzimot. Za da se otstrani vi{okot na reaktivite agensite se filtriraat niz gel. Potoa vo vtoro vreme nastapuva fiksirawe na vtorata aldehidna reakcija od glutaraldehidot {to ostanal sloboden za NH2 grupata od proteinskata molekula od protivteloto ili od protivgenot. Za ova spojuvawe mo`e da se koristat i p-benzoquinone, carbodiimide, dimaleimide, cyanobromide i dr. 11.2.4. Odvivawe na reakcijata Reakcijata mo`e da se odviva vo t.n. homogena ili heterogena faza. Vo homogena faza reakcijata se odviva direktno. Aktivnosta na enzimskiot obele`uva~ e modificirana vo protivgen-protivtelo reakcijata, a protivtelata igraat uloga na specifi~en reaktiv so izrazen princip na kompeticija. Reakciite so homogena faza se ednostavni, brzi, mo`e da se avtomatiziraat, no pomalku se osetlivi od onie so heterogena faza. Ovde se koristat razli~ni enzimi i supstrati kako na pr. lizozim so mre`a od micrococcus luteus ( se ~ita turbidometriski) ili pak, beta D-galactosidase so 0-nitrophenil beta D galactopyrannoside- (se ~ita spektrofotometriski). Vo heterogenata faza vo prviot del postoi reakcija me|u atsorbiraniot protivgen za supstrat (dokolku se doka`uvaat protivtela, a pri doka`uvawe protivgen Institut za imunobiologija i humana genetika 115 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM reakcijata se postavuva sprotivno) so specifi~no protivtelo i so serumot {to se ispituva, a potoa se dodava protivprotivtelo obele`eno so enzim koe stapuva vo reakcija so vrzanite protivtela za fiksiraniot protivgen, doveduva do promena na bojata i ovozmo`uva ~itawe na testot. I vo ovaa faza se koristat razli~ni enzimi i supstrati, no naj~esto peroxydase so supstrati: diaminobenzidine, tetramethylbenzidine; Phosphatase alcaline so P-nitrophenylphosphate; Beta-D-galactosidase so 0-nitrophenil-B-Dgalactopyrannoside i site se ~itaat spektrofotometriski. Denes imunoenzimolo{kite reakcii najmnogu ja koristat heterogenata faza i kako naj~esto upotrebuvaniot metoda e ELISA (Enzyme Linked Immunoadsorbent Assay) testot. Metodot e opi{an vo 1971 godina od Engvall i Permann i vo osnova sodr`i direkten natprevar me|u protivtelata (imunoatsorbirani za mikroplo~ka i onie {to se spoeni so enzimot) za vrzuvawe so specifi~niot protivgen koj treba da se opredeli. 11.2.5. ^itawe na rezultatot Enzimite zaedno so drugite supstrati treba da ovozmo`at to~no ~itawe, {to se vr{i so nivno merewe-opredeluvawe: turbidometriski, spektrofotometriski, kolorimetriski, a u{te poprecizno so pomo{ na fluorimetrija ili luminiscencija. Za opredeluvawe protivgeni, se koristat pove}e internacionalno opredeleni (etalonirani) standardi. Potrebno e da se ima i sopstveni vnatre{ni i nadvore{ni kontroli. Koli~inata na protivgenot se presmetuva od dobienite vrednosti za intenzitetot na aktivnosta interpolirana od dobienata standardna kriva. Kvalitativnoto opredeluvawe pozitiven naod za protivtela se dobiva od presmetaniot indeks spored opti~kata gustina (OG): - OG pozitivna/ OG negativna> 1.5 ; - OG silno pozitivna/ OG slabo pozitivna> 1.8. Titarot na protivtelata mo`e da se dobie od opredelena kriva koja e konstruirana spored naodite od razli~ni opti~ki gustini. 11.3. Odreduvawe koncentracija na citokini 11.3.1. Op{to za odreduvaweto citokini Dijagnosti~kata procenka na citokinite se vr{i in vivo, eks vivo i in vitro. Celokupnata postapka opfa}a 116 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 11: CITOKINI odreduvawe na nivnata genska ekspresija, odreduvawe na nivnata koncentracija i procenka na nivniot efekt. In vivo procenkata slu`i za doka`uvawe prisustvoto na citokinite vo krvta, telesnite te~nosti i tkivata. Poradi redundantniot i pleotropniot efekt na citokinite, nivnata in vivo procenka e popogodna za procenkata na aktivnosta na procesot na zaboluvaweto (na pr. nekoj vid na nesakani imunolo{ki odgovori, kakvi {to se otfrlaweto na presadeniot organ, avtoimunite zaboluvawa, infektivnite zaboluvawa i dr.), odkolku za diferencijalno dijagnosti~ki celi. Kako rutinska dijagnosti~ka postapka, odreduvaweto na citokinite na nivo na gRNK ili na nivo na belkovina, seu{te ima ograni~ena upotreba. Vakvata ograni~enost, osobeno pri odreduvaweto na citokinite vo krvta i/ili kletkite, se dol`i na faktot {to imunolo{kiot odgovor naj~esto se odviva vo razli~nite kompartmani, nedavaj}i ja pri toa vstinskata slika na sistemsko nivo. No i pokraj se, postojat izvesni indikacii kaj koi odreduvaweto na kocentracijata na citokinite mo`e da ima klini~ko zna~ewe. In vitro odreduvaweto na koncentracijata na citokinite ni ovozmo`uva da ja odredime sposobnosta na odredeni kletki da la~at citokini po nivnata stimulacija so razli~ni materii. Eks vivo odreduvaweto na nivnata koncentracija ni ovozmo`uva da ja odredime sposobnosta na oddelni kletki da la~at citokini in vitro, otkako bile izlo`eni in vivo na odreden vid na terapija. Vakvite in vitro/eks vivo odreduvawa, nare~eni i u{te “testovi so polna krv”, ve}e se izborija za svoeto mesto vo rutinskata dijagnostika. Za taa cel se zema krv so protivkoagulans, se razreduva so medium i se inkubira nekolku ~asa so razli~ni stimulansi. Potoa se meri koli~inata na citokinskite receptori koi }e se pojavat na kletkite, kako i/ili koli~estvoto na odredeni citokini vo supernatantot. Vakvata postapka e lesna za izveduvawe, mo`e da se povtori, a {to e najva`no od se, mnogu e sli~na na ona {to se slu~uva vo organizmot. Vakvite testovi se upotrebuvaat vo dijagnosticiraweto na prvi~nite i vtori~nite imuni nedostatoci, vo procenkata na imunomodulatorniot efekt vo tekot na terapijata, otkrivaweto na prisustvo na endotoksini vo tkivnite te~nosti, kako i pri reakciite kon tu|ite protivgeni. Odreduvaweto koncentracijata na citokinite ne prestavuva nekoj pogolem problem, so ogled na faktot deka postojat pove}e metodi koi slu`at za direktnoto merewe na nivnata koncentracija. Problemot se javuva koga treba da se protolkuvaat dobienite rezultati. Nekoga{ upotrebuvanite bioeseji sega kompletno se zameneti so enzimatiski imunotestovi. Bidej}i citokinite svojata aktivnost ja projavuvaat vo pikomolarni koli~ini, potrebno e upotrebuvanite metodi da poseduvaat golema senzitivnost. Edno od najgolemite ograni~uvawa vo mo`nosta za dijagnosti~ka primena na odreduvaweto na citokinite, proizleguva od nivniot Institut za imunobiologija i humana genetika 117 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM kratok biolo{ki polu`ivot vo plazmata, koj naj~esto e meren vo minuti (so isklu~ok na nekoi, kako na pr. IL-12). Vo ostanatite pri~ini spa|aat i: vrzuvaweto na citokinite za nivnite receptori na povr{inata na kletkite, kako i za rastvorenite receptori vo krvta; vrzuvaweto za belkovinite na plazmata; nivnoto proteoliti~ki razgraduvawe; kako i nivnoto eliminirawe preku bubrezite. Dopolnitelno ograni~uvawe prestavuva i faktot deka po stimulacija, citokinite se la~at samo nekolku ~asa i toa pove}e lokalno otkolku sistemski. 11.3.2. Izveduvawe na ve`bata (Odreduvawe koncentracija na interleukin 1b) 11.3.2.1. Potreben materijal za izveduvawe na ve`bata Za odreduvawe na koncentracijata na citokinite vo serum/ plazma neophodni se: - primerok na serum/plazma - plasti~en nosa~ za stripovi - stripovi (sekoj strip ima 8 bunar~iwa) - pufer za plaknewe (pH 7.8) - vtori~no protivtelo (protivtelo kon soodvetniot citokin za koe ima vrzano biotin) - standardi za IL-1beta (0.31 pg/mL; 0.63 pg/mL; 1.25 pg/ mL; 2.5 pg/mL; 5.0 pg/mL; 10.0 pg/mL) - standarden rastvor za razreduvawe - zasiluva~ki rastvor Amdex - pufer za plaknewe na bunar~iwata - 3,3’5,5'-tetra-metil benzidin (TMB) substrat - rastvor za stopirawe na reakcijata (0.18 M sulfurna kiselina) - samoleplivi lenti za pokrivawe na polo~kata - pipeti od 25 μL, 100 μL, 200 μL, 500 μL i 1000 μL - plasti~ni prodol`etoci - aparat za kontinuirano me{awe - aparat za avtomatsko plaknewe bunar~iwa - spektrofotometar (Victor2) 11.3.2.2. Priprema na pufer za plaknewe na bunar~iwata Se zemaat 50 mL od koncentratot za plaknewe i se prefrlaat vo ~ista kolba od 2000 mL. Koncentratot se razreduva 30 118 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 11: CITOKINI pati so dodavawe na 1500 mL destilirana voda. Vaka pripremeniot pufer za plaknewe e stabilen 2 nedeli na temperatura od +2 do +8oC dokolku se ~uva vo dobro zatvoren kontejner. 11.3.2.3. Priprema na rabotniot rastvor na citokinskiot standard Suvata supstanca vo {i{enceto se rastvora so destilirana ili dejonizirana voda. Koli~inata na potrebnata destiliranata/dejoniziranata voda potrebna da se rastvori suvata supstanca e dadena na samoto {i{ence. Se me{a vnimatelno (so prevrtuvawe na {i{enceto). 11.3.2.4. Priprema na zasiluva~kiot rastvor Amdex Se priprema vedna{ (ne podolgo od 15 minuti) pred negovoto stavawe vo bunar~iwata. Na suvata supstanca se dodavaat 11 mL destilirana ili dejonizirana voda. Vaka prigotveniot zasiluva~ki rastvor e stabilen 1 nedela na temperatura od -15 do -30oC dokolku se ~uva vo dobro zatvoren kontejner. 11.3.2.5. Standarden rastvor za razreduvawe Mnogu e va`no rastvorot za razreduvawe da ja otslikuva prirodnata sredina na primerokot. Vo slu~aite koga kako primerok koristime serum, plazma ili urina, za razreduvawe upotrebuvame standarden rastvoruva~. Ako rabotime so supernatant od kultura na kletki, kako razreduva~ }e go koristime mediumot vo koj e odr`uvana kulturata na kletki. 11.3.2.6. Primerok So razvojot na testovi vo ~ija osnova le`at imunolo{kite reakcii, ovozmo`eno e odreduvawe na nivoto na citokinite vo razli~ni telesni te~nosti (na primer urina, sinovijalnata te~nost, serum, plazma i dr.) Sepak kako naj~esti primeroci se koristat plazmata i serumot. Kon site ovie primeroci, koi se koristat za odreduvawe koncentracijata na citokinite, treba da se odnesuva kako kon potencijalno inefektivni materjali, pa zatoa so niv treba da se rakuva spored zakonskite upatstvata za rabota so takvi materjali. Vo zavisnost od kompletot za rabota koj se koristi, potrebni se od 50-200 μL serum ili plazma (iako najgolem del od avtorite smetaat deka e podobro da se koristi plazma). Dokolku se koristi serum krvta se zema so venepunkcija, se ostava da sosiri i se odvojuva serumot so centrifugirawe (5 minuti na 4000 vvm). Za dobivawe plazma se koristi krv zemena so natrium citrat, heparin ili EDTA. Dokolku e toa mo`no, potrebno e plazmata i kletkite da se izdvojat od 30 minuti do 2 ~asa od zemaweto na primerokot na krv, za da se spre~i enzimskoto raspa|awe Institut za imunobiologija i humana genetika 119 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM i inaktivacijata na citokinite, no i poradi faktot {to nekoi od faktorite koi predizvikuvaat sosiruvawe mo`at da predizvikaat aktivacija na citokinite/receptorite. Op{to zemeno, primerocite mo`at da se ~uvaat na +4oC kratko vreme. Ako e neophodno primerokot da se ~uva podolgo od 1 den, toa treba da se napravi na -20oC, a ako treba da se ~uva podolgo od edna nedela, toaga{ treba da se ~uva na -80oC. Isto se postapuva i so primerocite od drugite telesni te~nosti. Treba da se izbegnuva odmrznuvawe i povtorno zamrznuvawe na primerokot. Dokolku se koristi serum, ne treba da se koristat hemolizirani primeroci i primeroci koi stoele nesmrzanti pove}e od 24 ~asa. Dokolu se dobijat rezultati nad gornata granica na testot, toga{ primerokot treba da se razredi (so standardnior razreduva~ ili so medium za kultura na kletki) i povtorno da se izvede testot. 11.3.2.7. Protokol za rabota 11.3.2.7.1. Prigotvuvawe na standardite 1. Se obele`uvaat 6 polipropilenski epruveti (0.31 pg/mL, 0.63 pg/mL, 1.25 pg/mL, 2.5 pg/mL, 5 pg/mL i 10 pg/mL). 2. Vo epruvetata obele`ena so 10 pg/mL se pipetira 990 μL od standardniot razreduva~. 3. Vo site ostanati epruveti se pipetira po 500 μL od standardniot razreduva~. 4. Vo epruvetata obele`ena so 10 pg/mL se pipetira 10 mL od rabotniot rastvor na citokinskiot standard i dobro se prome{uva. 5. Od epruvetata obele`ena so 10 pg/mL se prefrlaat 500 μL vo epruvetata obele`ena so 5 pg/mL i dobro se prome{uva. 6. Vakviot na~in na dvojno razreduvawe se povtoruva posledovatelno vo site preostanati epruveti. 11.3.2.7.2. Izveduvawe na testot Koncentracijata na citokinite ili nivnite receptori vo primerokot se odreduva so pomo{ na ELISA metodot ili so pomo{ na drugi enzimski imunotestovi. Deneska postojat najrazli~ni komercijalno dostapni kompleti za odreduvawe na koncentracijata na citokinite koi ne sekoga{ davaat pribli`no ednakvi rezultati. Nekoi od rezultatite koi se dobivaat od ovie razli~ni testovi, za `al nemo`at da se sporedat. So napredokot na imunolo{kite tehniki, sozdadeni se razli~ni vidovi na imunolo{ki testovi koi ovozmo`uvaat brzo, to~no i ednostavno merewe na razli~ni parametri vo telesnite te~nost (serum, plazma, sinovijalna te~nost, urina i dr). ELISA testovite se pove}e se koristat za ovie nameni. Samite imuni testovi prestavuvaat alternativa za 120 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 11: CITOKINI biolo{kite metodi i proto~nata citometrija. Tie se ednostavni za izveduvawe, a rezultatite se dobivaat za nekolku ~asa. Naj~esto upotrebuvanata ELISA metoda koristi dva vida na protivtela. Ednite, nare~eni u{te i imobilizira~ki protivtela, se vrzani za cvrstata faza na testot, naj~esto mikrotitraciona plo~a so 96 bunar~iwa. Kako cvrsta faza mo`e da se javat i polistirenski top~iwa i magnetni partikli, koi isto taka ~esto se koristat vo avtomatiziranite ELISA tehniki. Protivtelata koi se nao|aat vo cvrstata faza, a koi se so visok afinitet, slu`at da ja vrzat za sebe materijata od interes koja se nao|a vo ispituvaniot primerok. Posle prvoto miewe na bunar-~iwata, se dodava vtoroto protivtelo. Toa e specifi~no za razli~en epitop na odreduvanata materija, poradi {to so negovoto vrzuvawe za ve}e vrzanata ispituvana materija za prvi~noto protivtelo, se sozdava sendvi~. Za vtoroto protivtelo, koe u{te se narekuva i detektira~ko protiv-telo, e vrzan enzim biotin, HRP (horseradih peroksidase) ili alkalna fosfataza (Slika11.2). Vo nekoi metodi vtoroto protivtelo se obele`uva so edna materija so mala molekulska masa, kako {to e na pr. FITC (fluorescenten tiocijanat), a potoa celiot kompleks se odreduva so protiv-FITC za koj e vrzan enzim. Ova treto protivtelo za koe e vrzan enzim, naj~esto HRP, e univerzalno protivtelo, koe mo`e da se koristi vo razli~ni testovi kaj koi {to specifi~noto protivtelo e naso~eno kon materiite koi sakame da gi odreduvame vo primerokot. So malata molekulska masa na FITC (389 Da) se otstranuvaat site problemi koi mo`at da se javat poradi slo`enite ~etiridimenzioni strukturi vo prostorot, kako koga detekti-ra~koto protivtelo bi bilo obele`ano so golemi molekuli, kakva {to e HRP (40 kDa). Posle vtoroto miewe na bunar~iwata, se dodava zasiluva~kiot rasvor Amdex. Zasiluva~kiot rastvor prestavuva specifi~en multifunkcionalen kowugat so unikatna struktura koja sodr`i Slika 11.2: Principot na odreduvawe koncentracija na citokini vo primerokot. Institut za imunobiologija i humana genetika 121 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM molekuli na HRP i streptavidin. Ovoj kowugat se vrzuva za citokinot za kogo se vrzani i prvi~noto i vtori~noto protivtelo. Vrzuvaweto na protivtelata stanuva vidlivo koga enzimot vrzan za detektira~koto protivtelo i zasiluva~kiot rastvor reagira so dodadeniot substrat 3,3’5,5'-tetra-metil benzidin (TMB). Po izvesno vreme reakcijata se stopira so dodavawe na 0.18 M sulfurna kiselina. Na kraj obojuvaweto se ~ita na soodvetna branova dol`ina so spektrofotometar ili ELISA ~ita~. Intenzitetot na obojuvaweto e pravoproporcionalen so koncentracijata na ispituvaniot citokin vo primerokot. Site standardi i primeroci se rabotat vo duplikat. Za sekoj test treba da se napravi nova standardna prava. Site hemikalii i primeroci pred da se po~ne so rabota treba da se zagreat na sobna temperatura (+20 - +250C). 1. Vo nosa~ot se stava potrebniot broj na stripovi (plasti~ni bunar~iwa). Vi{okot na stripovi se vra}aat vo plasti~noto kese. Od keseto se istisnuva vozduhot i vnimatelno se zatvora. 2. Se pipetira po 100 μL od standardniot razreduva~ (Sr), standardite (St) i nepoznatite primeroci (Pr) vo bunar~iwata, spored prika`anata {ema (Slika 11.3, dolu). 3. Nosa~ot se pokriva so samolepliva lenta i se inkubira 2 ~asa (±5 minuti) na sobna temperatura. Za vreme na celata inkubacija nosa~ot vnimatelno se me{a. Slika 11.3: Raspored na standardite i primerocite za opredeluvawe citokini. 4. Site bunar~iwa se plaknat ~etiri pati so pufer za plaknewe. 5. Vo sekoe od bunar~iwata se dodava po 100 μL od vtori~noto protivtelo (protivtelo kon soodvetniot citokin za koe ima vrzano biotin). Pri negovoto stavawe treba da se vnimava vrvot na prodol`etokot da ne go dopre nitu bunar~eto nitu negovata sodr`ina (Slika 11.3, gore). 4. Nosa~ot povtorno se pokriva so samolepliva lenta i se inkubira eden ~as (±5 minuti) na sobna temperatura. Za vreme na celata inkubacija nosa~ot vnimatelno se me{a. 6. Site bunar~iwa se plaknat ~etiri pati so pufer za plaknewe. 7. Vo sekoe od bunar~iwata se dodava po 100 μL na prethodno pripremeniot zasiluva~kiot (Amdex) rastvor. Dodavaweto na zasiluva~kiot (Amdex) rastvor se izveduva na ist na~in Slika 11.4: Mehanizam na dejstvo na zasiluva~kiot rastvor pri opredeluvaweto citokini. 122 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 11: CITOKINI kako i dodavaweto na vtori~noto protivtelo (Slika 11.4). 8. Nosa~ot se pokriva so samolepliva lenta i se inkubira 30 minuti (±5 minuti) na sobna temperatura. Za vreme na celata inkubacija nosa~ot vnimatelno se me{a. 9. Site bunar~iwa se plaknat ~etiri pati so pufer za plaknewe. 10. Direktno od {i{enceto se dodava 100 μL od 3,3’5,5'tetra-metil benzidin (TMB) substratot. 11. Nosa~ot se inkubira 1 ~as (±5 minuti) na sobna temperatura. Za vreme na celata inkubacija nosa~ot vnimatelno se me{a. Vo tekot na ovaa inkubacija nosa~ot ne se pokriva so samolepliva lenta. 12. Se proveruva dali sekoj strip e pravilno namesten vo svoeto le`i{te i se meri absorbancata na 450 nm, so pomo{ na spektrofotometar (Victor2). 12. Presmetuvawe na rezultatite. Aparatot Victor2 sodr`i program za avtomatsko generirawe na standardni pravi od izmerenite vrednosti za standardite, kako i za avtomatsko presmetuvawe na nepoznatite primeroci. Ext (nm) 10 1 0,1 0,01 0,1 1 10 pg/mL 11.3. Zada~a Da se presmeta koncentracijata na interleukinot 1β spored protokolot . Konstruiraweto na standardnata prava se izveduva na Slika 11.5. Ot~itanite i presmetanite rezultati od citokinote se vnesuvaat vo dadenata Tabela 11.1. Institut za imunobiologija i humana genetika Slika 11.5: Bilogaritamski formular za opredeluvawe koncentracija na citokini. 123 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Tabela 11.1: Primer za presmetuvawekoncentacija na IL-1beta. Primer Slu~aj Stand./ primerok Ext (nm) Sredna vred.(nM) Konc. (pg/mL) Stand./ primerok St 1 0.067/0.060 0.0635 0.31 St 1 0.31 St 2 0.212/0.221 0.2165 0.63 St 2 0.63 St 3 0.472/0.502 0.487 1.25 St 3 1.25 St 4 1.049/1.082 1.0655 2.5 St 4 2.5 St 5 1.763/2.032 1.8975 5 St 5 5 St 6 2.469/2.391 2.43 10 St 6 10 Poz 2.00/2.10 2.053 5.72 Poz. Neg 0.082/0.086 0.084 0.31 Neg. 8109 0.066/0.066 0.066 0.25 8139 0.403/0.384 0.3935 1.27 8155 0.066/0.072 0.069 0.26 8175 0.061/0.057 0.93 2.7 8243 0.061/0.054 0.0575 0.22 8249 1.95/1.95 1.95 5.46 8321 0.123/0.124 0.1235 0.44 8324 0.076/0.075 0.075 0.28 8351 0.649/0.669 0.659 2.03 8377 1.619/1.620 1.6195 4.61 8379 0.105/0.103 0.104 0.38 8418 0.079/0.064 0.0715 0.27 8477 0.071/0.060 0.0655 0.25 8501 0.830/0.834 0.832 2.51 Ext (nm) Sredna vred.(nM) Konc. (pg/mL) Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod) Data Student (ime i prezime) Asistent (potpis i pe~at) ______________ ____________________________ __________________________ 124 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 12: ANALIZA NA KOMPLEMENTEN SISTEM I CITOKINI VE@BA 12: ANALIZA NA KOMPLEMENTEN SISTEM I CITOKINI 12.1. Normalni vrednosti od ispituvawe komplementen sistem Normalnite vrednosti od komponentite na komplementniot sistem se razli~ni za deca i za vozrasni, osobeno za K3 i za K4 i se iska`uvaat vo g/L (Tabela 12.1). Tabela 12.1: Normalni vrednosti na K3 i K4 zavisno od vozrasta na ispitanikot. Rezultatite od komplementniot sistem mo`at da se analiziraat kako koncentracija na faktorite, koga zboruvame za proteinska koncentracija, ili kako aktivnost (funkcija) na komponentite. Ako proteinskata molekula koja se sintetizirala nema biolo{ki efekt, toga{ zboruvame za neefikasen proteinski faktor (nezrel faktor, nedostatok na aktivnost na faktorot). Vo takov slu~aj neophodno e istovremeno da se odreduvaat i koncentracijata i biolo{kata aktivnost na soodvetniot faktor. Na Tabela 12.2. dadeni se koncentraciite na proteinite na nekoi faktori kaj vozrasni lu|e i biolo{kata aktivnost na nekoi komplementni faktori koi naj~esto se ispituvaat Institut za imunobiologija i humana genetika 125 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM vo imunologijata. Koncentracijata na proteinite (komponenti na komplement) se iska`uva vo g/L, dodeka biolo{kata aktivnost mo`e da se iska`e vo edinici na litar (E/L), efektivni molekuli na eden mL (ef.mol.mL (ili kako relativen odnos (%) (Tabela 12.2). Tabela 12.2: Normalni vrednosti na komponentite od komplemetniot sistem i biolo{kata aktivnost na nekoi komplementni faktori. 12.2. Tolkuvawe rezultati od komplementen sistem Klini~ki, odreduvaweto na komplementot slu`i za: - da se otkrie dali komplementniot sistem se aktiviral, i dokolku ima hipokomplementemia, da se utvrdi dali se aktiviral klasi~niot ili alternativniot pat na komplementot; -da se dijagnosticiraat kongenitalnite defekti na komplementniot sistem. Ispituvawata koi se pravat rutinski za evaluacija na komplementniot sistem, vklu~uvaat odreduvawe na CH50, merewe na proteinskata koncentracija na K3 i/ili K4, faktor B, i K1-inhibitor. 12.2.1. CH50 Kaj pacienti koi prv pat odreduvaat komplement, treba da se napravi ispituvawe na CH50, K3 i/ili K3c, i K4. 126 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 12: ANALIZA NA KOMPLEMENTEN SISTEM I CITOKINI Odreduvaweto na CH50, ni dava informacija za formiraweto na K3 konvertaza i formiraweto na klasi~niot pat na aktivacija, t. e na toj na~in }e dobieme evaluacija za K1-K8. Generalno, odreduvaweto na CH50, e skrining test za dijagnoza na sostojbi asocirani so niska aktivnost na komplementot. Testot e pomalku korisen za monitoring na bolesti, bidej}i mu nedostasuva neophodniot stepen na analiti~ka senzitivnost, koja e potrebna za da se zabele`uvaat promenite vo koncentraciite na K3 i K4. 12.2.2. K3 i K4 Iako odreduvaweto na K3, ~esto se koristi kako rutinski laboratoriski test za odreduvawe aktivacija na komplementot, toj e neosetliv parametar i ne se namaluva se dodeka stapkata na potro{uva~ka ne ja premine na stapkata na sinteza. No, ovaa sostojba dosta retko se slu~uva, bidej}i vo pove}eto sostojbi za aktivacija na komplement se javuva akuten odgovor koj e zdru`en so zgolemeno sozdavawe na K3. Promeni vo koncentracijata na K3 mo`at da se vidat kaj aktivna forma na SLE i membransko proloferativen glomerulonefritis. Vo slu~aj na avtoimuna hemoliti~na anemija i hereditaren angioneurotski edem, K3 obi~no ima normalna vrednost dodeka K4 ima namalena vrednost. Genetskiot nedostatok na K4 e povrzan so visoka prevalencija na avtoimuni zaboluvawa, posebno so SLE. ANALIZA NA SLU^AJ Nedostatok na Faktor I: Slu~ajot na Momir Temelkovski, nekontrolirana komplementna aktivacija doveduva do podlo`nost za infekcii i isip (jade`). 12.2.3. K1-inhibitor Odreduvawe na K1-esteraza inhibitor e zna~ajno kaj pacienti so povtoruva~ki angioedemi na ko`a, gastrointestinalen trakt, i trahea. 12.2.4. Hiperkomplementemija Pove}eto komponenti na komplementot, osobeno, K3, K4, i K1-inhibitor, se reaktanti na akutnata faza. Za vreme na vospalenie, tie se sozdavaat ne samo vo crniot drob, tuku i vo makrofagite. Takvi sostojbi se: sistemski infektivni bolesti, ne-infektivni hroni~ni vospalitelni zaboluvawa kako revmatiden artrit i fiziolo{ki sostojbi (kako bremenost). Otkrivawe na zgolemeni vrednosti vo vakvi slu~ai ne e od osobena va`nost. Kaj aktivnite zaboluvawa so imuni kompleksi, so aktivacija na komplement, dobivame redukcija na CH50 ili na koncentraciite na komponentite od komplementot, ako tie vrednosti ne se namaleni, tuku se normalni, treba vedna{ da se posomnevame na zgolemena sinteza na komponentite na komplement. Institut za imunobiologija i humana genetika 127 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 12.2.5. Hipokomplementemija Hipokomplementemijata e va`en indikator za prisustvo na bolesti na imuni kompleksi ili za analizirawe na aktivnosta na zaboluvaweto. Koga se bara klini~ka asocijacija na hipokomplementemija, mora da se ima na um deka: Tabela 12.3: Bolesti kade {to hipokomplementemijata e predizvikana od sozdavawe imuni kompleksi. 128 -mnogu ne-imunolo{ki iducirani zaboluvawa, mo`at da predizvikaat namaluvawe na serumskite koncentracii na komponentite od komplementot. Ovie bolesti mo`at da bidat multisistemski zaboluvawa so Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 12: ANALIZA NA KOMPLEMENTEN SISTEM I CITOKINI pridru`na redukcija na komplementot, so klini~ka slika sli~na na vaskulit predizvikan od imuni kompleksi. -bolesti na imuni kompleksi mo`at da bidat prisutni iako ima normalna aktivnost na komplement, vo prisustvo na odgovor na belkovinite na akutna faza (CRP). -komplementnite nedostatoci (deficiencii), kako rezultat na nasledni sostojbi ili malnutricii, golemo o{tetuvawe na hepar ili nefrotski sindrom mo`at da nalikuvaat na sostojbite koi se javuvaat pri aktivacija Institut za imunobiologija i humana genetika Tabela 12.4: Bolesti i sostojbi kade {to hipokomplementemijata ne e predizvikana od sozdavawe imuni kompleksi. 129 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM na bolestite na imuni kompleksi. Tabela 12.5: Laboratoriski naodi kaj povtoruva~ki angioedem. ANALIZA NA SLU^AJ Hereditaren angionevrotski edem (HAE): Slu~ajot na Ratko Slaveski, nedostatok na komunikacija i na komplementna regulacija. 130 Pribli`no 50% od licata so hereditaren K3 nedostatok ili nedostatok na eden od komponentite na klasi~niot pat na aktivacija, imaat klini~ki prisuten SLE ili simptomi sli~ni na SLE. Iako hipokomplementemijata e ~est naod kaj bolesti na imuni kompleksi so vklu~eno bubre`no naru{uvawe, vo nekoi bubre`ni zaboluvawa predizvikani od imuni kompleksi, hipokomplementemijata se nao|a mnogu retko ili nikoga{. Vakvi zaboluvawa vklu~uvaat glomerulopatii kaj [enlain-Henoh (Shonlein- Henoch) purpura, IgA glomerulopatija, K1kju glomerulopatija, membranozna nefropatija (idiopatska, inducirana so lekovi, ili od malignen tumor) i Gud-Pasteroviot (Good-Pasture’s) sindrom. 12.3. Normalni vrednosti od citokini Normalnite vrednosti na nekoi citokini vo telesnite te~nosti se dadeni vo Tabela 12.6. Nivnata koncentracija Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 12: ANALIZA NA KOMPLEMENTEN SISTEM I CITOKINI mo`e da se opredeluva vo serum, vo plazma, vo urina ili vo drugi telesni te~nosti. Koncentracijata na citokinite se iska`uva vo pikogrami vo eden mL (pg/mL). Normalnite vrednosti na citokinite vo telesnite te~nosti zavisat od laboratoriskiot metod so koj se opredeluvaat. Vrednostite dadeni na Tabela 12.6 se dobieni so ELISA metodot (Tabela 12.6). Citokin Normalno Citokin Normalno IL-1alfa serum 0-5.4 pg/ml plazma 0 pg/ml urina 0-4.34 pg/ml IL-8 serum 1.2-16.7 pg/ml plazma 0-8.1 pg/ml urina 0-204.0 pg/ml IL-1beta serum 0-1.5 pg/ml plazma 0 pg/ml urina 0 pg/ml IL-10 serum 0-6.8 pg/ml plazma 1-15 pg/ml urina 0-2.7 pg/ml IL-2 serum 0-4.0 pg/ml plazma 0-6.5pg/ml urina 0 pg/ml IL-13 serum 0-6.9 pg/ml EDTA plazma 0-23.2 pg/ml urina 0 pg/ml IL-4 serum 0-4.6 pg/ml plazma 0 pg/ml urina 0 pg/ml IFN serum 0-1.1 pg/ml plazma 0-1.5 pg/ml urina 0-23.5 pg/ml IL-5 serum 0 pg/ml plazma 0 pg/ml urina 0 pg/ml IFN serum 0-1.5 pg/ml plazma 0-2.6 pg/ml urina 0.5-1.2 pg/ml IL-6 serum 0-14.9 pg/ml plazma 0-1.6 pg/ml urina 0-0.6 pg/ml TNF serum 0.9-4.9 pg/ml plazma 0-1.8 pg/ml urina 0 pg/ml Tabela 12.6: Koncentracii na IL-1 vo serum i plazma kaj zdravi lu|e. 12.4. Dijagnosti~ko zna~ewe na citokinite I pokraj toa {to do deneska se otkrieni golem broj na citokini, zasega vo rutinskata dijagnosti~ka praksa zna~ajno e odreduvaweto samo na nekoi od niv (IL-6, IL-8 i TNFalfa (Tabela 12.7). Nivnoto odreduvawe vo telesnite te~nosti se koristi za procenka na intenzitetot na te{kite vospalitelni reakcii. Poradi pleotropnoto i redundantno dejstvo na citokinite seu{te ne e doka`ano deka mo`at da bidat specifi~en marker za nekoe zaboluvawe, iako vo posledno vreme e doka`ano deka odredeni zaboluvawa se rezultat na poremetuvaweto vo citokinskata mre`a. Odreduvaweto na koncentracijata na citokinite deneska naj~esto se koristi koga sakame da ja odredime te`inata na edno zaboluvawe, so ogled na faktot deka prevklu~uvaweto vo citokinskata mre`a naj~esto korelira so stepenot na o{tetuvawata karakteristi~ni za dadenoto zaboluvawe. Ova naj~esto se odnesuva na sistemskite zaboluvawa povrzani so aktivirawe na vrodeniot ili zdobieniot imun sistem (na pr. hroni~nata srceva insuficiencija), poradi {to i doa|a do zna~itelno zgolemuvawe na nivoto na citokinite vo plazmata. Kaj nekoi zaboluvawa (revmatoidniot artrit, Kron-ovata bolest, Lajmskata bolest i dr.), doa|a do zgolemeno sozdavawe na citokinite na ““ospalenieto”, kakvi {to se IL-1 i TNF, dodeka kaj drugi Institut za imunobiologija i humana genetika 131 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Tabela 12.7: Indikacii za odreduvawe na koncentracijata na citokini i citokinski receptori. Tabela 12.8: Koncentracii na IL vo plazmata kaj zdravi lu|e i kaj nekoi zaboluvawa. Klini~ka sostojba Koncentracija (pg/mL) Otfrlawe na presaden bubreg 30-300 Revmatoiden artrit (IL-1beta) 20-230 Septi~en {ok (IL-1beta) 40-1250 Te{ka mozo~na malarija (IL-1beta) 17-131 Eksperimentalna endotoksemija (IL1beta) 60-200 Citokin IL-6 (plazma/serum) Zaboluvawe Zabele{ka Sepsa, trauma Dobar prognosti~ki parametar (podobar od CRP) Pokazatel za stepenot na sistemskoto vospalenie Pokazatel za stepenot na o{tetuvaweto na organot Za rana dijagnoza na neonatalna sepsa Pokazatel za stepenot na periferna hipooksija Srceva insuficiencija IL-6 (urina) Presaduvawe na bubreg Znak za otfrlawe i infekcija na presadeniot bubreg IL-6 (plazma) Revmatoiden artrit Nespecifi~en marker za aktivnost rIL-2R (plazama, serum) Presaduvawe Sarkoidoza Nespecifi~en marker za aktivnost (znak za alarm) Marker za aktivnost IL-8 (plazma, serum) Sepsa, trauma Srceva insuficiencija Pokazatel za stepenot na sistemskoto vospalenie Za rana dijagnoza na neonatalna sepsa Pokazatel za stepenot na periferna hipooksij IL-8 (bronhoalveolaren lavat) Pove}ekratna trauma, izgorenici Rana dijagnoza na ARDS (adult respiratory distress syndrome IL-10 (plazma, serum) Pove}ekratna trauma, operacii, sepsa Pokazatel za stepenot na imunosupresija Marker za rizik od infekcij TNF (plazma, serum) Sepsa Srceva insuficiencija Pokazatel za stepenot na sistemskoto vospalenie Prognosti~ki parametar za meningokokna sepsa Negativen prognosti~ki parametar TNF (cerbrospinalna te~nost) Multipla skleroza Meningitis Marker za aktivnost , osobeno vo slu~aj na bakteriski meningi (SIDA i sistemskiot lupus eritematozus) imame namaleno sozdavawe na IL-2 i IFN-gama, citokini koi mo`at da go zasilat imuniot odgovor. Podatocite dobieni od istra`uvawata napraveni kaj pacientite so neonatalna sepsa, poka`ale deka odreduvaweto na koncentracijata na citokinite vo plazmata/serumot mo`e da pomogne vo ranata dijagnoza. Na primer, neonatalnata sepsa mo`e so sigurnost da se predvidi ve}e prvite nekolku ~asa po ra|aweto dokolku postoi poka~uvawe na koncentracijata na IL-8 i IL-6. Za razlika od ova, so dosega upotrebuvaniot metod na merewe na koncentracijata na belkovinata na akutnata faza - CRP, toa be{e mo`no duri otkako }e izminat 24-48 ~asa. Odreduvaweto pak na koncentracijata na IL-1b koj cirkulira vo krvta, mo`e da ima prognosti~ka vrednost. Nivoto na IL-1 vo krvta se zgolemuva 1-2 dena pred da se javi otfrlawe na presadeniot bubreg. Kaj septi~niot {ok, pre`ivuvaweto e vo pozitivna korelacija so nivoto na IL-1b vo plazmata, dodeka pak te`inata na zaboluvaweto e vo korelacija so koncentracijata na TNF. Nivoto na IL1b se zgolemuva i pri vlo{uvaweto na simptomite kaj revmatoidniot artrit (Tabela 12.8). Za razlika od IL-1b, IL-1a e primarno povrzan so kletkite, pa zatoa se sre}ava kaj odredeni zaboluvawa (na pr. kaj fatalni slu~ai na cerebralna malarija. Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod) Data Student (ime i prezime) Asistent (potpis i pe~at) ______________ ____________________________ __________________________ 132 Institut za imunobiologija i humana genetika 13. PRIKA@UVAWE GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS BLOK 5 BLOK 5 - TRANSPLANTACIJA U^EBNI CELI: VE@BA 13. PRIKA@UVAWE GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS (1 ~as) Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat: serolo{ki da opredelat glaven tkivno sovpadliv kompleks. VE@BA 14. GENSKA STRUKTURA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS (1 ~as) Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat: da opredelat genska struktura na glaven tkivno sovpadliv kompleks; da opredelat haplotipovi na glavniot tkivno sovpadliv kompleks kaj edna familija. VE@BA 15. ANALIZA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS (1 ~as) Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat da: tolkuvaat rezultati od glaven tkivno sovpadliv kompleks; analiziraat slu~ai od transplantacija. POENI: PRISUSTVO 1.5 poeni ZNAEWE 3.0 poeni VKUPNO: 4.5 poeni Institut za imunobiologija i humana genetika 133 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 134 Institut za imunobiologija i humana genetika 13. PRIKA@UVAWE GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS VE@BA 13: PRIKA@UVAWE GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS 13.1. Op{to za HLA 13.1.1. [to e HLA HLA e kratenka od zborovite Humani Leukocitni Antigeni koi u~estvuvaat vo imuniot odgovor. Toa se zbir od molekuli (glikoproteini) prika`ani vrz povr{inata na skoro site kletki koi se sposobni da gi prika`at protivgenite i da bidat prepoznaeni od limfocitite. HLA molekulite go kontroliraat imuniot odgovor preku prepoznavawe svoe od tu|o. Tie pripa|aat na grupata molekuli poznati kako Imunoglobulinska supergenska familija, vo koja se vklu~eni imunoglobulinite, T-kleto~nite receptori, KD4, KD8 i drugi. Glavna funkcija na HLA molekulite e prika`uvawe na protivgenot (proteinska veriga od protivgenot) kon T- limfocitite i zapo~nuvawe specifi~en imun odgovor. HLA molekulite gi kodiraat dve grupi geni, HLA klasa 1 i HLA klasa 2, a funkciite na dvete grupi se sosema razli~ni. HLA klasa 1 proteinite gi kodiraat genite HLA-A, HLAB i HLA-Cv (za da se razlikuva od komplementot, podolu samo kako HLA-C). Klasa 1 molekulite se nao|aat na skoro sekoja kletka vo ~ovekovoto telo i tie im gi prika`uvaat protivgenite na citotoksi~nite T limfociti (Tct-Li) (KD8+ T-Li). Klasa 1 molekulite se izgradeni od dve verigi (Slika 13.1), te{ka veriga (transmembranski polipeptid) kodirana od genite za HLA-A, HLA-B i HLAC na kusiot krak od 6 hromozom, i lesna veriga, beta-2 mikroglobulin (koj ne e transmembranski polipeptid, a e kodiran od gen na 15 hromozom). HLA klasa 2 proteinite gi kodiraat genite HLA-DR, HLA-DKu i HLA-DP. Klasa 2 molekulite, sprotivno od klasa 1 molekulite, se nao|aat samo na B-Li, makrofagite Institut za imunobiologija i humana genetika 135 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Slika 13.1: Prikaz na klasa 1 nasproti klasa 2 molekulite od HLA. i drugi protivgen prika`uva~ki kletki (PPK). Klasa 2 molekulite se sostojat od dva transmembranski polipeptidi, alfa veriga i beta veriga (Slika 13.1). Beta verigata e mnogu pove}e polimorfna vo sporedba so alfa verigata. Poradi toa HLA tipiziraweto se vr{i na beta verigata (HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DKuB1 i HLA-DPB1). Razli~ieto na glavniot tkivno sovpadliv kompleks (GTSK) pome|u individuite od ist vid pretstavuva polimorfizam na GTSK. Polimorfizmot zna~i prisustvo na pove}e aleli vo odreden genski lokus kaj razli~ni edinki od ist vid so pogolema frekvencija od 1% vo populacijata. Struktura na molekulite od HLA klasa 1 i klasa 2. Molekulite na HLA klasa 1 imaat po edna kopija od dvata polipeptidni lanci: te`ok lanec-alfa (α) - polimorfen; i lesen lanec - beta 2 (β2) mikroglobulin-monomorfen. Genot koj go kodira (β2) mikroglobulinot e nadvor od HLA kompleksot i se nao|a na 15-ot hromozom kaj ~ovekot. Polimorfizmot na HLA-A, -B i -C molekulite e rezultat na razlikite vo aminokiselinskata sekvenca na te{kiot lanec na HLA klasa 1. Najve}e od ovie razliki proizleguvaat od nukleotidna supstitucija vo egzon 2 i 3. Molekulite na HLA klasa 2 se izgradeni od edna alfa i edna beta veriga. Za razlika od polimorfizmot kaj HLA klasa 1, koj se dol`i na polimorfizmot na genite za te{kiot lanec, polimorfizmot na HLA klasa 2 poteknuva od alfa i beta lancite, a najpolimorfen e egzon 2. Polimorfizam na genite od HLA. Klasi~ni HLA geni za 136 Institut za imunobiologija i humana genetika 13. PRIKA@UVAWE GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS HLA klasa 1 se HLA-A, B i C, a neklasi~ni se HLA-E, F, G, H, J, K, L. Genite za HLA prva klasa se visoko polimorfni i do denes (oktomvri, 2006) vo svetot se objaveni 489 aleli za HLA-A lokusot, 830 za HLA-B, 226 za HLA-C, 9 za HLAE, 21 za HLA-F, 23 za HLA-G, 12 za HLA-H, 9 za HLA-J, 6 za HLA-K, i 5 za HLA-L lokusot od prata klasa. Za HLA od vtorata klasa se objaveni 3 za HLA-DRA, 545 za HLA-DRB, 34 za HLA-DKA1, 78 za HLA-DKB1, 23 za HLA-DPA1, 125 za HLA-DPB1, 4 za HLA-DMA, 7 za HLA-DMB, 12 za HLADOA i 9 za HLA-DOB. Vkupniot broj HLA aleli (oktomvri 2006) iznesuva 2607 od site lokusi (Slika 13.2). Broj na protivgeni/aleli So razvojot na molekularnite tehniki, brojot na novootkrienite aleli sekojdnevno se zgolemuva, a novootkrienite aleli se objavuvaat vo posebna baza koja e dostapna vo nau~nite spisanija i na Internet. Klasa 1 protivgeni Klasa 1 aleli Klasa 2 protivgeni Klasa 2 aleli Slika 13.2: Brojot na HLA protivgenite i alelite 19682006. Godina 13.1.2. Genomska struktura i polimorfizam HLA genite se locirani na hromozomot 6p21.31 (kusiot krak od 6 hromozom) i pokriva podra~je od okolu 3.6 Mbp (megabazni parovi) zavisno od haplotipot. Klasi~nite HLA protivgeni se kodirani od HLA-A, -B i -C od klasata 1 i HLA-DR, -DKu i -DP od klasa 2 podra~jeto. Site klasa 1 geni se so golemina pome|u 3 i 6 kb, dodeka klasa 2 genite se dolgi od 4-11 kb. Edna od glavnite osobini na HLA e ekstremno golemiot polimorfizam (razli~ie). Vo prika`anite podra~ja HLA ima najgolem stepen na polimorfizam vo ~ovekoviot genom. Brojot na poznatite aleli postojano se zgolemuva (Slika 13.2). 13.1.3. Metodi za tipizirawe na HLA Protivgenite se obrabotuvaat vo dve pateki. Vo vnatre{nata pateka virusnite ~esti~ki ili maligno transformiranite kletki sozdavaat vnatrekleto~ni antigeni koi Institut za imunobiologija i humana genetika 137 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Serolo{ki metodi za klasa 1 od GTSK Serolo{ki metodi za klasa 2 od GTSK Ekstrakcija na genomska DNK Slika 13.3: Dvete pateki za obrabotka na protvgenite kako osnova za serolo{kite metodi i genomskata DNK kako osnova za molekulskite metodi. Molekulski metodi za klasa 1 i za klasa 2 od GTSK se obrabotuvaat vo proteazomite i zaedno so klasa 1 od GTSK se prika`uvaat vrz povr{inata na kletkata. Vo nadvore{nata pateka goltnatite (fagocitirani) predizvikuva~i (bakterii i drugo) se obrabotuvaat i se prika`uvaat vrz povr{inata na imunite kletki zaedno so klasa 2 od GTSK. Poradi toa, so serolo{ki metodi mo`eme da gi ispitame molekulite na GTSK prika`ani vrz povr{inata na kletkata (Slika 13.3). Vo jadroto na kletkite se nao|aat genite za glavniot tkivno sovpadliv kompleks i so izolacija na genomskata DNK i polimerazno veri`na reakcija mo`e da se analiziraat molekulite na GTSK od klasa 1 i od klasa 2 so molekulski metodi (Slika 13.3). Dokolku postoi gen vo DNK za opredelen alel, no toj ne se prika`uva vrz povr{inata na kletkite, toga{ zboruvame za nula alel (neiska`an alel). Sekako deka organizmot ne mo`e imunolo{ki da reagira na nula alelite. 13.1.4. Serolo{ki metodi Serolo{ki baziranite metodi za HLA koristat protivgen specifi~ni serumi za da se opredeli HLA tipot kaj ispitanicite. Serumite se ~ove~ki produkti koi reagiraat specifi~no so HLA protivgenite prika`ani na povr{inata od belite krvni kletki. Serolo{kata metoda opredeluva koj tkiven tip od HLA vo belite kletki od ispitanikot so koj serum reagira, a so koj serum ne reagira. Posle inkubacijata so koja se ovozmo`uva vreme protivteloto da se vrze so soodvetnite protivgeni vo kletkite, se dodava komplement za da se pottikne kleto~noto 138 Institut za imunobiologija i humana genetika 13. PRIKA@UVAWE GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS raspa|awe. Potoa reakcijata se gleda pod mikroskop i se stepenuva zavisno od brjot na umrenite kletki. Tipiziraweto se ozna~uva posle analiza na reakciskite oblici za razli~ni serumi. Serolo{kata tipizacija e pomalku specifi~na otkolku metodite za molekularno tipizirawe. 13.1.5. Nomenklatura Oficijalna nomenklatura koja se koristi za serolo{ka definicija na protivgenite od HLA e taa na Svetskata zdravstvena organizacija (SZO). Bukvite (A, B i sli~no) ozna~uvaat genetski lokus, a brojot soodvetniot protivgen {to go kodira toj lokus. Brojkite vo zagradi ozna~uvaat {iroko prisutni protivgeni od koi se razdeluvaat specifi~nosti (Slika 13.4). Lokus Protivgeni Razdeluvawe (Split) Slika 13.4: Serolo{ka nomenklatura za HLA. 13.2. Serolo{ki metodi za tipizirawe na HLA Za serolo{ka tipizacija na HLA se koristi testot na mikrolimfocitotoksi~nost koj gi koristi limfocitite od ispitanikot kako celni kletki. Postojat pove}e prizvoditeli na kompleti za serolo{ko ispituvawe na HLA. Podolu }e bide opi{an eden od niv. Vo tekot na ve`bite mo`no e da bidat upotrebeni i poinakvi kompleti, no tie zna~ajno ne se razlikuvaat pome|u sebe. @ivi kletki lesno se izdvojuvaat od periferna krv, limfni Slika 13.5: [ematski prikaz na serolo{kite metodi za opredeluvawe HLA. Institut za imunobiologija i humana genetika 139 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM jazli, slezina i drugo. Vo ovie serolo{ki metodi se brojat mrtvite kletki so aktivacija na komplementot (zaja~ki) vo kombinacija so prisutnite specifi~ni protivgen-protivtelo kompleksi. Reakcijata protivtelo-protivgen-komplement se meri so nabquduvawe na testot pod mikroskop so zgolemuvawe od 150 pati so fazen kontrast i so vitalni boi kako {to se Eozin ipislon ili Propidium jodid. Mrtvite kletki (vrz koi se nao|a protivgen otkrien od specifi~niot protivserum) }e ja adsorbiraat bojata i poka`uvaat soodvetna promena na bojata. Negativnite kletki (tie {to nemaat protivgen otkrien od specifi~niot protivserum) ostanuvaat `ivi i ja isfrlaat bojata (ostanuvaat neoboeni) (Slika 13.5). 13.2.1. Neophodni uslovi Limfocitna suspenzija se prigotvuva od 10 mL polna krva zemena so heparin, ACD ili natrium citrat. Koncentracijata se podesuva do 2-3 h 106 kletki/mL. Limfocitnata suspenzija mora da se podgotvi najdocna 48 ~asa od zemaweto krv za da se obezbedat optimalno `ivi kletki. Suspenzijata se ~uva na sobna temperatura do upotreba. Nu`no e `ivite kletki da bidat nad 80% bez zna~ajno zagaduvawe so ne-limfocitni kletki. Zagaduvawe so granulociti ili visok broj na nelimfocitni kletki mo`e da dade la`no pozitivni rezultati. Zagaduvawe so trombociti mo`e da dovede do necelosno lizirawe na limfocitite i da dade la`no negativni rezultati. 13.2.2. Prigotvuvawe limfocitna suspenzija 140 Se zemaat 10 mL polna krv vo vakutajner so heparin, ACD ili natrium citrat (najdeno e deka EDTA ne e dobar protivsosiruva~). Se ~uva primerokot do upotreba na sobna temperatura. Krvta se centrifugira 10 min na 700-900 g za da se dobie plazma. Ovaa postapka mo`e da se zabrza so agregira~ka supstanca kako {to e 5% Dekstran (se me{aat 2 mL 5% Dekstran so 10 mL polna krv i se ostavaat crvenite kletki da se istalo`at na 370C za 15 min). So Pasterova pipeta vnimatelno se vadi plazmata (okolu 2 mL) i se prenesuva vo ~ista epruvetka 17 h 100 mm koja sodr`i 5 mL HBSS rastvor. Se me{a epruvetkata. Se vnesuvaat 4 mL Fikol-Hipak rastvor (220C) vo Institut za imunobiologija i humana genetika 13. PRIKA@UVAWE GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS ~ista epruvetka 17 h 100 mm. Vrz rastvorot od Fikol-Hipak vnimatelno se nanesuva izdvoenata plazma. Epruvetkata se centrifugira 20 min na 700 h g. Posle centrifugiraweto ednojadrenite kletki se nao|aat kako tesen sloj pome|u plazmata i rastvorot na Fikol-Hipak. Se aspiriraat site ednojadreni kletki od slojot i se prenesuvaat vo epruvetki 17 h 100 mm. Se razreduva so 4 mL HBSS. Se otstranuva supernatantot i kletkite se resuspendiraat vo 1 mL RPMI-1640 so 20% FTS (fetalen tele{ki serum). Se brojat kletkite od suspenzijata vo hemocitometar. Se ocenuva ~istotata, se brojat kletkite i se podesuva nivniot broj do 2-3 h 106 kletki/mL. Se izveduva testot na vijabilnost (`ivi i mrtvi kletki). Se dodava edna kapka Tripan sino i edna kapka kleto~na suspenzija vo ~ista epruvetka i se me{a. Epruvetkata se inkubira na sobna temperatura 15 min. Se ispituvaat `ivite kletki vo hemocitometar. @ivite kletki imaat neo{teteni membrani i izgledaat mazno, dodeka mrtvite kletki imaat neramna membrana. Limfocitnata suspenzija e gotova za upoteba za serolo{kiot mikrolimfocitotoksi~en test za klasa 1 so upotreba na isfrawe na boja. Procentot na `ivi kletki treba da e najmalku 80%. 13.2.3. Mikrolimfocitotoksi~en test Se prigotvuva limfocitna suspenzija so najmalku 80% `ivi kletki bez zna~itelno zagaduvawe so nelimfocitni kletki. Se vadi plo~kata za HLA serolo{ka tipizacija od zamrznuva~ i se ostava da se zatopli na sobna temperatura. So 50 mkL mikropipeta se dodavaat 1 mkL od limfocitnata suspenzija (okolu 3.000 limfociti) na vrvot od sekoe vedrence vnimavaj}i da ne se dopre specifi~niot protivserum. Vnimavaj da se sme{aat limfocitite i protivesrumot (Slika 13.6). Inkubiraj gi plo~kite na sobna temperatura za: o klasa 1 (isfrlawe na boja) 30 min o klasa 1 (fluorescencija) 30 min o klasa 2 (fluorescencija) 45 min So koristewe na 250 mkL pipeta se dodavaat po 5 mkL od zaja~ki komplement bez da se dopre specifi~niot protivserum. Plo~ite se inkubiraat na sobna temperatura za: o klasa 1 (isfrlawe na boja) 60 min Institut za imunobiologija i humana genetika Slika 13.6: Nanesuvawe limfociti, komplement i boja vo plo~ka za serolo{ko tipizirawe na HLA. 141 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM o klasa 1 (fluorescencija) 50 min o klasa 2 (fluorescencija) 60 min So 100 mkL pipeta se dodavaat po 2 mkL filtriran 5% voden rastvor od Eozin Ipsilon kon sekoe bunar~e i se inkubira na sobna temperatura 3-5 minuti. Se vnimava da ne se dopre specifi~niot protivserum so pipetorot. Ovaa stapka se skoknuva ako se koristat fluorescentni boi. So upotreba na 250 mkL pipeta se dodavaat po 5 mkL filtriran neutraliziran formalin kon sekoe vedrence, vnimavaj}i da ne se dopre specifi~niot protivserum. Ovaa stapka se skoknuva ako se koristat fluorescentni boi. Vo fluorescentnite tehniki se dodavaat po 5 mkL od propidium jodid vo sekoe bunar~e, vnimavaj}i da ne se dopre specifi~niot protivserum. Se stava kapak vrz plo~kata i se ostavaat plo~kite na sobna temperatura 15 min za da se stalo`at limfocitite. Plo~kite oboeni so Eozin Ipsilon se ~itaat posle eden ~as ili sledniot den. Plo~kite oboeni so fluoresceinski boi mo`at da se ot~ituvaat posle 30 min ili sledniot den (ot~ituvaweto na plo~kite oboeni so fluorescentni boi posle 36 ~asa mo`at da dadat zgolemeni la`no pozitivni rezultati). Testot se ot~ituva mikroskopski na 150 h zgolemuvawe pod fazen kontrast. 13.2.4. Rezultati Mrtvite kletki (tie koi sodr`at protivgen) ja absorbiraat bojata, izgledaat pogolemi i potemni i imaat razli~en oblik na jadroto. @ivite kletki (tie koi nemaat protivgen), ja isfrlaat bojata, izgledaat posvetli i pomali vo golemina vo sporedba so mrtvite kletki. Dokolku se koristat fluorescentni boi, `ivite kletki se zeleni, a mrtvite kletki se crveni (Slika 13.7). Posle korekcija za procentot na mrtvite kletki vo negativnite kontrolni bunar~iwa, testot se stepenuva na sledniov na~in: Slika 13.7: Imunofluorescentno boewe na limfociti. Gore negativen mikrolimfocitotoksi~en test, dolu pozitiven limfocitotoksi~en test (mrtvi limfociti). 142 % Mrtvi kletki Stepen Tolkuvawe 0-10 11-20 21-50 51-80 81-100 - Negativno Somnitelno negativno Slabo pozitivno Pozitivno Silno pozitivno Ne~itlivo 1 2 4 6 8 0 Institut za imunobiologija i humana genetika 13. PRIKA@UVAWE GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS 13.3. Zada~a Opredeli ja serolo{kata tipizacija na HLA od plo~ki i rezultatite vnesi go vo Tabela 13.1 i Tabela 13.2. Tabela 13.1: Formular-1 za vnesuvawe rezultati od serolo{ka tipizacija na HLA. Ime i prezime Primerok ID _____________________________________ Pol _________ ____________ Etni~ka pripadnost _______________ HLA-ABC (Plo~ka 1) Bunar~e broj 1A 1B 1C 1D 1E 1F 2F 2E 2D 2C 2B 2A 3A 3B 3C 3D 3E 3 A1 A1 A1 (36) A1 36 (80) A2 A2 28 A2 69 A3 A3 A23 A23 A23 24 80 A24 A24 A25 A25 A25 26 34 6 Rezultat Specifi~nost Serum ID Neg. kon. PFR 1654 PFR 1800 PFR 1656 PFR 1655 PFR 1722 PFR 1725 PFR 1730 PF 1388 P PFR 1736 PF 378 RF PFR 1650 PF M013 C PFR 1649 PFR 1627 PF 145 RN PFR 1612 PFR 158 Bunar~e broj 4F 4E 4D 4C 4B 4A 5A 5B 5C 5D 5E 5F 6F 6E 6D 6C 6B 6A Specifi~nost A26 A26 25 66 (34) A30 B18 (A31) A31 (30) A31 (30) A32 A33 A74 25 31 32 33 (26) (29) (34) A74 25 32 (31) (33) A74 31 32 33 (29) (30) Serum ID PF 964 D Bunar~e broj Rezultat A34 A34 (66) A34 66 A11 A11 A29 A29 A30 31 PFR 1596 PF 1705 PF 684 AD PF 1706 PF 1732 PFR 1605 PF 1636 PF 1533 PF 1699 PF 1317 P PF 1787 PF 1534 PF 1774 A PF 1845 PF 1185 D PFR 1588 PFR 1595 7A 7B 7C 7D 7E 7F 8F 8E 8D 8C 8B 8A 9A 9B 9C 9D 9E 9 Specifi~nost A28 A28 (34) (66) A36 B51 B51 52 B51 78 B52 (49) (51) B52 (49) (50) (63) B7 B7 13 41 60 61 73 81 (48) B7 27 73 81 B7 42 81 B8 B8 B44 B44 B44 45 B44 45 76 Serum ID PF 1666 A PF 1477 A PF 1708 PF 1702 PFR 1738 PFR 1747 PF 1714 PF 1669 PF 1450 A PFR 1614 PFR 1801 PFR 1840 PF 1813 PFR 1554 PF 1322 PF 1571 PF 219 X PF 768 AA Bunar~e broj 10F 10E 10D 10C 10B 10A 11A 11B 11C 11D 11E 11F 12F 12E 12D 12C 12B 12 Specifi~nost B45 B45 76 B13 B13 B14 B14 B62 B62 B62 75 (57) (63) B62 75 77 (63) (76) (B63) 49 51 52 B63 51 52 53 77 (49) (75) B38 B38 39 B38 39 B39 B39 64 67 Serum ID PF 1483 PF 458 AC PF 1458 P PFR 1615 PFR 1659 PF 1387 B PF 1667 PF 1717 PF 1303 B PFR 1623 PFR 1664 PF 1017 PF 1677 PF 1695 PF 1330 A PF 1536 PF 1687 A Rezultat Rezultat Poz. kon. Institut za imunobiologija i humana genetika Izraboteno od: _____________ ^itano od: _____________ Kontrolirano od: _____________ Datum: __________ HLA-A ____________________ Datum: __________ HLA-B ____________________ Datum: __________ HLA-C _____________________ Institut za imunobiologija i humana genetika 143 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Tabela 13.2: Formular-2 za vnesuvawe rezultati od serolo{ka tipizacija na HLA. Ime i prezime Primerok ID _____________________________________ Pol _________ ____________ Etni~ka pripadnost _______________ HLA-ABC (Plo~ka 2) Bunar~e broj 1A 1B 1C 1D 1E 1F 2F B57 B57 58 B58 57 2E 2D 2C 2B 2A 3A 3B 3C 3D 3E 3 B58 57 (46) B18 B18 (14) B49 B49 50 B49 51 52 63 B50 (56) (62) (72) B55 56 (Cw7) B54 55 57 (56) (58) (63) B55 B55 (67) B56 B56 (55) B27 Rezultat Specifi~nost Serum ID Neg. kon. PF 716 N PF M012 PFR 1593 PFR 1753 PFR 1598 PF 1465 P PFR 1625 A0 PF 1696 PFR 1664 PF 1352 C PF 357 Y PF 1527 PF 1718 PF 1715 PF 1844 PF 1470 A PFR 1820 Bunar~e broj 4F 4E 4D 4C 4B 4A 5A 5B 5C 5D 5E 5F 6F 6E 6D 6C 6B 6A Specifi~nost B27 B27 47 B35 50 75 (71) (78) B35 50 75 (78) B35 51 52 53 78 B35 51 53 78 B35 53 (62) B35 53 (75) B37 B37 B60 B60 B61 60 13 47 B61 60 48 81 B41 B41 B42 B42 7 27 81 Serum ID PF 1709 PF 1682 PF 1011 H PF 932 E PF 1355 C PF 1320 C PFR 160 PF 1402P PF 917 C PF 1814 PF 1771 PF 004 RNC PF 1464 P PFR 1601 PF 1567 PF 1710 PF 1775 PFR 1804 Bunar~e broj 7A 7B 7C 7D 7E 7F 8F 8E 8D 8C 8B 8A 9A 9B 9C 9D 9E 9 Specifi~nost B42 7 81 (73) B46 54 56 59 (62) B47 18 37 48 52 (B47) 60 61 (13) B48 60 (61) B48 60 (81) B53 35 (78) B53 35 (51) B59 8 B59 8 14 (39) (73) B70 45 50 62 75 (35) (56) (76) (78) B71 46 59 60 (8) (55) (56) (61) (62) B73 B73 B75 77 (62) Cw1 Cw1 Cw2 Serum ID PFR 1825 PFR 1586 PF 952 D PFR 1822 PFR 1799 PF M018 B PF 1490 PF 1551 PF 436 BD PFR 1610 PF 1719 PF 1688 A PF 1678 PF 157 BB PF 1741 PF 1834 PFR 1831 PFR 1648 Bunar~e broj 10F 10E 10D 10C 10B 10A 11A 11B 11C 11D 11E 11F 12F 12E 12D 12C 12B 12 Specifi~nost Cw2 Cw3 Cw3 B46 Cw4 Cw4 (Cw17) Cw5 Cw5 Cw6 Cw6 Cw7 A2 (28) Cw7 (28) Cw8 Cw9 Bw4 Bw4 (A23) (A24) Bw6 Bw6 Serum ID PF 318 AA PFR 1590 PF 380 P PFR 1591 PF 1777 PF 1537 PF 1575 PF 1693 PF 1791 PF 1837 PF 1532 PF 1443 B PF 1812 PF 1772 B PF 1769 PF 1566 PF 1574 Rezultat Rezultat Rezultat Poz. kon. Institut za imunobiologija i humana genetika Izraboteno od: _____________ ^itano od: _____________ Kontrolirano od: _____________ Datum: __________ HLA-A ____________________ Datum: __________ HLA-B ____________________ Datum: __________ HLA-C _____________________ Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod) Data Student (ime i prezime) Asistent (potpis i pe~at) ______________ ______________________ __________________________ 144 Institut za imunobiologija i humana genetika 14. GENSKA STRUKTURA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS VE@BA 14: GENSKA STRUKTURA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS 14.1. Genska struktura na GTSK i negovi polimorfizmi Klasa 1 molekulite se nao|aat na skoro sekoja kletka vo ~ovekovoto telo i tie im gi prika`uvaat protivgenite na citotoksi~nite T limfociti (Tct-Li) (KD8+ T-Li). Klasa 1 molekulite gi prika`uvaat vnatre{nite (endogeni) protivgeni. Vnatre{en protivgen mo`e da bide del od virusen protein ili tumorski proteini. Prika`uvaweto vakvi protivgeni uka`uva na vnatre{ni kleto~ni o{tetuvawa, koi ako ne se spre~at }e se ra{irat niz ~ovekovoto telo. Poradi toa, uni{tuvaweto na vakvite kletki e prednost za teloto kako celina. Klasa 2 molekulite mu go prika`uvaat protivgenot na pomaga~kiot T-Li (Tpo-Li). Klasa 2 molekulite prika`uvaat nadvore{ni protivgeni. Nadvore{nite protivgeni mo`at da bidat delovi od bakteriski kletki ili virusi koi Slika 14.1: Karta na HLA podra~jeto. Institut za imunobiologija i humana genetika 145 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM se goltnati i obraboteni i potoa prika`ani na pomaga~kite T-Li. Za vozvrat Tpo-Li mo`at da gi aktiviraat B-Li za da sozdavaat protivtela koi }e ovozmo`at uni{tuvawe na patogenot. Da se potsetime deka HLA e lociran na hromozomot 6p21.31 i pokriva podra~je od okolu 3.6 Mbp (megabazni parovi) zavisno od haplotipot. Klasi~nite HLA protivgeni go kodiraat sekoe podra~je od HLA-A, -B i -C od klasata 1 i HLA-DR, -DKu i -DP od klasa 2 podra~jeto. Site klasa 1 geni se pome|u 3 i 6 kb, dodeka klasa 2 genite se dolgi od 411 kb (Slika 14.1). Edna od glavnite osobini na HLA e ekstremno golemiot polimorfizam (razli~ie). Vo prika`anite podra~ja HLA ima najgolem stepen polimorfizam vo ~ovekoviot genom. Brojot na poznatite aleli postojano se zgolemuva (Slika 13.2). 14.2. Molekulski metodi za HLA tipizacija So napredokot na molekulskite tehniki i otkrivaweto na polimerazno veri`nata reakcija (PVR), zapo~nato e HLA tipizirawe na nivo na DNK molekulata, so {to zna~itelno se zgolemuva brojot na novootkrienite aleli. Za molekulskite metodi ne se neophodni `ivi limfociti, bilo koj izvor na kletki mo`e da poslu`i kako izvor za izolacija na DNK. Poradi standardizacija na probite i prajmerite, molekularnoto tipizirawe e poto~no od serolo{koto tipizirawe. Toa isto taka dava pove}e informacii i detali na povisoko nivo poradi {to e mo`no da se identificiraat site aleli kako i protivgeni. Alelite opredeluvaat koi protivgeni se prisutni vrz povr{inata na kletkite. Zaradi unapreduvawe na metodite za HLA tipizacija, postojano se odr`uvaat me|unarodni HLA rabotilnici na koi se usoglsasuvaat i standardiziraat metodite za HLA tipizacija. 14.3. Principi na molekularnite metodi za HLA tipizacija 14.3.1. SSOP (Sequence Specific Oligonucleotide Probing) SSOP e hibridizaciska tehnika, kade posle amplifikacijata na regionot od interes so PVR sledi hibridizacija na celnata sekvenca so probnata sekvenca. 146 Institut za imunobiologija i humana genetika 14. GENSKA STRUKTURA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS Principot na ovoj priod zna~i deka razli~ni aleli vo lokusot mo`e da se detektiraat so probi koi gi prepoznavaat razlikite vo alelite i se koristat za da go detektiraat komplementarniot region na amplificiranata celna sekvenca. Za da se izvede toa, potrebno e edna od DNK ni{kite da bide imobilizirana vo reakcijata. Denes postojat tehniki za imobilizacija i na celnite i na sekvencite od probite. Dokolku e imobiliziran ampplificiraniot produkt, toga{ probata se obele`uva i aplicira. Toa e tradicionalna dot blot tehnika, imenuvana taka zatoa {to celnata sekvenca e nanesena kako to~ki na filter ili membrana. Materijalot mo`e da bide nanesen i kako linija, toga{ procesot e ozna~en kako slot blot. Dokolku probata e imobilizirana, a amplificiraniot produkt e obele`en, metodata se ozna~uva kako reverzna dot blot ili blot dot. Ovie metodi se pogodni, bidej}i golem broj na primeroci mo`e da se nanesat vo edine~na dot-blot reakcija, a primerokot mo`e da se testira za mnogu probi vo edine~na blot-dot reakcija. 14.3.2. RLS (Reverse Line Strip) – reverzna hibridizacija Vo metodata na reverzna hibridizacija se koristat nitrocelulozni lenti na koi komercijalno se naneseni oligonukleotidni probi od ednoveri`na DNK (Slika 14.2). Dvoveri`nata DNK od dobieniot amplificiran produkt se denaturira so NaOH i se aplicira vo kadi~ka kade se nao|aat nitro-celuloznite lenti za da se ovozmo`i hibridizacija so oligonukleotidite probi, pod posebni hibridizacioni uslovi. Prisustvoto na biotiniliziran PVR produkt vrzan za specifi~nata proba se detektira so koristewe na streptavidin-horseradish peroxidase (HRP) i hromogen substrat, so dobivawe na sini linii na mestoto na Slika 14.2: Opredeluvawe HLA na Institutot za imunobiologija i humana genetika so avtomatiziran sistem za reverzna hibridizacija so aparatot Bee Robotics. Institut za imunobiologija i humana genetika 147 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM pozitivnata proba. Pozitivni osobini na RLS: Metodot na RLS vklu~uva egzon specifi~na amplifikacija, a alelskata diskriminacija se vr{i vo tek na fazata na hibridizacija. +Odedna{ mo`e da se tipiziraat pove}e primeroci +Lesno za avtomatizacija +Potrebno e malo koli~estvo na DNK Negativni osobini na RLS: - Vremenski dolgotrajno - minimum 4 - 5 ~asa - Visoka stapka na ambigviteti vo sporedba so SSP 14.3.3. SSP (Sequence Specific Priming) SSP e tehnika bazirana na PVR, dizajnirana za visoka rezolucija na pottipovi za HLA klasa 1 i 2. Se koristat alelski ili grupno specifi~ni prajmeri za amplifikacija na genomskata DNK vo termalna plo~ka so 96 alveoli vo termosajkler. Po zavr{eniot PVR ciklus, PVR produktot se detektira na 2% agarozen gel so elektroforeza. Pozitivni osobini na SSP: +Alelska diskriminacija vo fazata na amplifikacija +Pomalku ambigviteti vo sporedba so RLS +Visoka specifi~nost +Brzina - ne se potrebni specifi~ni post amplifikaciski proceduri (vremetraewe - 2.5 ~asa od izolacija na DNK) Negativni osobenosti na SSP: - Te{ko mo`e da se avtomatizira - Neizbe`ni se mnogu PVR-ii - Sklonost kon kontaminacija - Te{ko e da se tipiziraat mnogu primeroci 14.3.4. SBT (Sequence Based Typing) Naj~esto koristen metod za DNK sekvencionirawe e dideoksi metodot (od Fred Sanger vo 1970 god.) koj vklu~uva ekstenzija na kratok prajmer so DNK polimeraza. Dvoveri`nata DNK se denaturira vo ednoveri`na so toplina. Potoa, kratok oligonukletiden prajmer se anilira za edna od edno-veri`nite DNK ni{ki. Za sekoe sekvencionirawe se koristat ~etiri oddelni reakcii. Sekoja reakcija sodr`i ednoveri`na DNK koja treba da se sekvencionira, prajmer {to treba da se anilira za taa DNK, DNK polimeraza, 4 normalni deoksinukletodni prekurzori (dATP, dCTP, dTTP, i dGTP) i mala koli~ina na modificirani prekurzori, dideoksinukleotidi (ddNTP). Kaj dideoksinukleotidite nedostasuva 3`-OH grupata koja e neophodna za elongacija na DNK. Koga 148 Institut za imunobiologija i humana genetika 14. GENSKA STRUKTURA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS prajmerot }e se ekstendira, DNK polimerazata na nekoe mesto }e vklu~i dideoksinukleotid namesto normalniot deoksinukleotid, {to }e ja prekine poli-merizacijata. DNK verigite vo sekoja reakcija se detektiraat na poliakrilamidna gel elektroforeza. 14.4. Nivoa na HLA tipizacija Nivoto na razdeluvawe na molekularnite metodi zavisi od specifi~nosta na probite koi se upotrebuvaat za tipizacija. Nekoi probi mo`at da razlikuvaat protivgen so nisko nivo na razdeluvawe, dodeka drugi probi ovozmo`uvaat razlikuvawe na alelite so visoko razdelno nivo (Slika 14.3). Postapkite so niskorazdelno oligotipizirawe SSP (Sequence Specific Primer) ili SSOP (Sequence Specific Oligonucleotide Probe) ovozmo`uvaat nisko do sredno razdelno nivo na tipizirawe.Za visoko razdelno nivo na tipizirawe denes se koristi metodata na sekvencionirawe, SBT (Sequence Based Typing) ili visokorazdelno SSP tipizirawe. Slika 14.3: [ematski prikaz na serolo{ki i molekulski metodi za HLA tipizacija. 14.5. Dvojbenost (ambigvitet) Nekoi probi koi se upotrebuvaat vo molekulskoto tipizirawe mo`at da otkrijat prisustvo na nekolku razli~ni aleli od istiot gen i ne opredeluvaat precizno koj specifi~en alel e prisuten. Vo takov slu~aj zboruvame za sredno razdelno nivo ili dvojbenost na rezultatot. Ili poinaku ka`ano, nemo`nosta da se utvrdi edine~en alel so ~etiri decimalni mesta, se nare~uva dvojbenost ili ambigvitet. Na primer, HLA-A*02011/012/014/09/30/31 ne go opredeluva edine~niot alel, tuku dava razli~en (grupen) rezultat od *02011, ili 02012, ili 02014, ili 0209, ili 0230, ili 0231. Institut za imunobiologija i humana genetika 149 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Ambigvitetite mo`at da bidat: 1. Alelski - nemo`nost za dobivawe na edine~en (nedvojben) rezultat na nivo na aleli, alelite se tipiziraat kako grupa na aleli. Primer: HLA-A* 02011/ 012/014/09/30/31 2. Genotipski - nemo`nost za razdvojuvawe na oddelnite genotipovi. Primer: HLA-A*0501/03 i A*07011/012/06 ili HLA-A*0707/09 i A*0802/07. 14.6. Nomenklatura Ozna~uvaweto HLA aleli za sekoj lokus se vr{i spored slednata nomenklatura. Se upotrebuvaat ~etiri brojki za da se identificiraat alelite: HLA lokusot (A, B, C, DR, DP i DKu) se oddeluvaat so simbolot * od dvete brojki, koi go ozna~uvaat serolo{kiot ekvivalent na protivgenot. Posle toa sledat dve brojki koi go ozna~uvaat specifi~niot alel. Povremeno se dodavaat dopolnitelni brojki za da se opredeli razli~en podtip koj se dobiva so nukleotidna substitucija koja ne vlijae vrz amino-kiselinskata sekvenca i prika`uvaweto protivgeni vo proteinskiot produkt. Ottuka, HLA-A*03012 e alel od A lokusot koj kodira HLA-A3 serolo{ki protivgen i e 01 alelski podtip na A3. Toj alel vo isto vreme ima skriena nukleotidna substitucija koja go razlikuva od A*03011 (Slika 14.4). Ne-kodira~kite i intronskite brojki se koristat mnogu retko. Nula (Null) i Nisko (Low) go definiraat nivoto na prika`uvawe na alelite vrz povr{inata na kletkite i isto taka retko se koristi (Tabela 14.1). Nivo na razdvoenost: Nisko A*02 Sredno A*0201/0205/0209/0240 Visoko A*0201 Nisko nivo Visoko nivo Gen Slika 14.4: Nomenklatura na molekulskoto tipizirawe na HLA. 150 Yvezda Alelska familija ednkva so serolo{ki protivgen Alelski podtip (amino kiselinski razliki Nekodira~ki (sinonimen) polimorfizam Intron- N=null L=low ski 3' ili 5' polimorfizam Institut za imunobiologija i humana genetika 14. GENSKA STRUKTURA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS Nomenklatura Zna~ewe HLA HLA podra~je i prefiks za HLA geni HLA-DRB1 Opredelen HLA lokus, vo slu~ajov DRB1 HLA-DRB1*13 Grupa aleli koi go kodiraat DR13 protivgenot HLA-DRB1*1301 Specifi~en HLA alel HLA-DRB1*1301N Nula alel HLA-DRB1*130102 Alel koj se razlikuva vo sinonimska mutacija HLA-DRB1*13010102 Alel koj sodr`i mutacija nadvor od kodira~koto podra~je HLA-DRB1*13010102N Nula alel koj sodr`i mutacija nadvor od kodira~koto podra~je HLA-DRB1*13X Ne e napravena visoka razdelnost HLA-DRB1*13? Napravena e visoka razdelnost, no bez diskriminacija Tabela 14.1: Terminologija za molekulskoto tipizirawe na HLA genite. Dvojbenosta nastanuva poradi vkrsteni reakcii na probite koi se koristat za tipizirawe i se ozna~uvaat so dva simboli -(crti~ka) ili / (kosa crta). -(crti~ka) zna~i site mo`nosti pome|u prviot i posledniot naveden broj; / (kosa crta) zna~i samo spomenatite mo`nosti. Kako primer e daden sledniov genotip: DRB1*0401-04 DRB1*0401 ili 0402 ili 0403 ili 0404 DRB1*0401/04 DRB1*0401 ili DRB1*0404 Genotipot HLA-B*1501/02/05/15/21/45/56/70 zna~i deka probata ne mo`e da otkrie prisustvo na alelite 03, 04, 06 i sli~no, zatoa nie ne znaeme dali pacientot nema ili ima aleli 03 ili 04 i ne znaeme koj od navedenite aleli gi ima. Koga ozna~uvame dvojben rezultat kako {to e vo primerot za HLA-B*1501/02/05/15/21/45/56/70 mnogu e va`no da ne se skratuva rezultatot zatoa {to mo`e da se izgubi zna~ajna informacija koja mo`e da dade precizen rezultat. Smaluvawe na rezultatot vo gorniot primer samo na HLAB*1501 e pogre{en, zatoa {to vsu{nost pacientot bi mo`el da ima rezultat HLA-B*1502 ili nekoj tret. Vo ozna~uvaweto na rezultatite vo laboratorijata mo`no e da se dade i druga nomenklatura. Toa e alfanumeri~ki kod vospostaven od National Marrow Donor Program (NMDP). Koga se dobiva kompleksna nomenklatura, kako vo gorniot slu~aj so HLA-B*1501/02/05/15/21/45/56/70 razli~nite mo`ni aleli mo`at da se kodiraat so nekolku bukvi spored nomenklaturata od NMDP: Institut za imunobiologija i humana genetika 151 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM B*1501/02 =B*15AB HLA-B*1501/02/05/15/21/45/56/70 =B*15FGR 14.7. Izveduvawe na ve`bata 14.7.1. RLS (Reverse Line Strip) Protokol za reverzna hibridizacija (RLS) na 13-ta Internacionalna rabotilnica za histokompatibilnost: 1. Izolacija na genomska DNK so standarden protokol na fenol-hloroformna ekstrakcija. 2. PVR amplifikacija na egzon 2 i 3 od genite na HLA - A, - B, i - C so biotinilirani prajmeri (Slika 14.5). Protokol za PVR na egzon 2 i 3 na HLA-A, B i C genite Za HLA-A, -B i C lokus: 1. Master miks za HLA-A, B i C (koj gi sodr`i prajmerite) 2. MgCl2 3. H2O 4. DNK Vkupen volumen 30 mkL 15 mkL 10 mkL 5 mkL 60 mkL Termalen ciklus na amplifikacija: 1. 95oC 5 min 2. 95 oC 1min 3. 62 oC 1min o 4. 72 C 1min 5. 4 oC do upotreba Uspe{nosta na PVR se proveruva so elektroforeza na 2% agarozen gel, oboen so etidium bromid. Slika 14.5: PVR amplifikacija na egzon 2 i 3 od HLA klasa 1. 152 Institut za imunobiologija i humana genetika 14. GENSKA STRUKTURA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS 3. Reverzna hibridizacija – Reverse Line Strip – Roche Molecular Systems,USA (Slika 14.6). Po amplificirawe na egzon 2 i 3 od HLA-A, B i C genite i proverka na uspe{nosta na amplifikacijata, sledi reverzna hibridizacija na dobieniot produkt. Vo metodata na reverzna hibridizacija se koristat nitrocelulozni lenti na koi komercijalno se naneseni oligonukletodini probi od ednoveri`na DNK. Dvoveri`nata DNK od dobieniot amplificiran produkt se denaturira so NaOH i se aplicira vo kadi~ka kade se nao|aat nitroceluloznite lenti za da se ovozmo`i hibridizacija so oligonukleotidnite probi, pod posebni hibridizacioni uslovi. Slika 14.6: Prika~uvawe ednoveri`na DNK na nitrocelulozni lenti. Uspe{nosta na hibridizacijata se potvrduva so prisustvoto na sino oboeni linii na mestoto na pozitivnata proba. 4. Softverska analiza - Reverse Line Strip Pattern Interpretation Software. Rezultatite od nitroceluloznite lenti se interpretiraat so poseben kompjuterski program, koj sino oboenite pozitivni lenti gi identifikuva kako aleli. 14.7.2. SSP (SSP-Sequence Specific Priming) Protokol za SSP od 13-ta Internacionalna rabotilnica za histokompatibilnost: 1) Izolacija na genomska DNK so standarden protokol na fenol-hloroformna ekstrakcija. 2) PVR amplifikacija na genomska DNK so setovi na alelski specifi~ni prajmeri vo termalna plo~ka so 96 alveoli – High Resolution SSP UniTray, PEL-FREEZ. Vo sekoe vedrence se nao|a specifi~en zapo~nuva~ za amplifikacija na odredena sekvenca, rasporeden po opredelen redosled, Institut za imunobiologija i humana genetika 153 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Slika 14.7: Raspored na zapo~nuva~i vo vedrencata od termalnata plo~a. spored proizvoditelot (Slika 14.7 i Tabela 14.2). Termalen ciklus na amplifikacija: 1. 96oC 5 min. 2. 96 oC 1min. 3. 70 oC 1min. 5 povtoruvawa 4. 72 oC 1min. 5. 96 oC 1min. 6. 65 oC 1min. 21 povtoruvawe 7. 72 oC 1min. 8. 96 oC 1min. 9. 55 oC 1min. 4 povtoruvawa 10. 72 oC 1min. 11. 4 oC do upotreba } } } 3) Detekcija na PVR produktot - elektroforeza na 2% agarozen gel oboen so etidium bromid. Tabela14.2: Podgotovka na primerokot. Pri analiza na rezultatite so metodata na SSP, se analiziraat fragmentite dobieni na gel elektroforeza. Vo sekoja alveola na termalnata plo~ka ima prajmeri za vnatre{na kontrola, koi amplificiraat fragment so soodvetna golemina, nazna~ena od proizvoditelot. Prisus- Broj na reakcii PVR pufer (ì l) Taq DNK polimeraza (ì l) Voda (ì l) Volumen na DNK (ì l) 2-8 alveoli 9-12 alveoli 13-16 alveoli 17-24 alveoli 25-32 alveoli 33-40 alveoli 41-44 alveoli 45-48 alveoli 96 alveoli 75.0 85.0 120.0 150.0 200.0 250.0 275.0 300.0 580.0 1.2 1.4 1.9 2.4 3.2 4.0 4.4 4.8 9.3 30.0 34.0 48.0 60.0 80.0 100.0 110.0 120.0 268.0 14.0 15.0 20.0 25.0 34.0 42.0 46.0 50.0 80.0 154 Kone~en volumen na DNK i voda (ì l) 44.0 49.0 68.0 85.0 114.0 142.0 156.0 170.0 348.0 Institut za imunobiologija i humana genetika 14. GENSKA STRUKTURA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS Slika 14.8: HLA tipizacija so metodot na SSP. tvoto na tie fragmenti na gel elektroforeza ja osiguruva uspe{nosta na PVR reakcijata. Lentite za vnatre{nata kontrola na gel elektroforeza mora da bidat prisutni vo sekoja alveola, so isklu~ok na lentite kade ima specifi~en produkt, kade mo`e no, ne mora da gi ima. Specifi~niot produkt, odnosno pozitivnite lenti se fragmenti so soodvetna golemina na bazni parovi. Specifi~niot prajmer za oddelen alel se nao|a vo sekoja alveola. Dokolku toj alel e prisuten vo primerokot za analiza, na gel elektroforeza }e se zabele`i specifi~en produkt, a dokolku vo primerokot go nema toj alel nema da ima specifi~en produkt. Goleminata na fragmentite za sekoj specifi~en produkt e nazna~ena vo upatstvoto od proizvoditelot. Pri sekoja gel elekroforeza vo lentata broj 9 se stava marker so golemina od 50-200 bazni para, za da se sporedat goleminite na dobienit fragmentite so onie od markerot (Slika 14.8). 4) Softverska analiza – UniMatch Plus, Version 3.0, PELFREEZ. So vnesuvawe na brojot na lentite od specifi~en produkt vo softverot za analiza, se dobiva soodvetniot rezultat. 14.8. Zada~i 14.8.1. Interpretiraj gi alelite za HLA lokusot od nitroceluloznite lenti dobieni so metodot na reverzna hibridizacija (RLS) Startuvaj go so dvoen klik softverskiot program Dynal Pattern Matching Program 5.30 (Slika 14.9A). 1. Na po~etok se vnesuvaat podatocite od pacientot za analiza. Odberi go kop~eto Browse. Odberi Browse patients→ new Institut za imunobiologija i humana genetika 155 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM A B V G Slika 14.9: Interpretacija na rezultat od HLA klasa 1 so specijalen softver (Dynal Pattern Matching Program 5.30). patient→ vnesi podatoci za pacientot→ next→ vnesi komentari za pacientot→ next→ finish (Slika 14.9B). 2. Ponatamu se kreira raboten list (worksheet) za sekoj pacient ili za familijata na pacientot (Slika 14.9V). Vrati se na Browse. Odberi Browse Worksheets→ Create new Worksheet. Vo prozor~eto Worksheet ID vnesi go brojot na pacientot ili familijata za analiza→ vo prozor~eto sample odberi add a new sample→ vo prozor~eto kit odberi go lokusot za tipizacija i seriskiot broj na kitot so reagensite (za sekoj HLA lokus ima soodveten broj od proizvoditelot)→ vo prozor~eto patient odberi go pacientot {to vo prethodniot ~ekor go vnese za analiza. 3. Sledi analiza na pozitivnite probi i interpretacija na rezultatot (Slika 14.9G). Odberi Save and manually input data→ vnesi gi pozitivnite probi (sino oboenite lenti)→ odberi interpret→ vo prozorecot od levata strana }e gi dobiete alelite za ispituvaniot lokus→ odberi finish. 156 Institut za imunobiologija i humana genetika 14. GENSKA STRUKTURA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS 14.8.2. Interpretiraj gi alelite za HLA lokusot so metodot na SSP na visoko razdelno nivo Startuvaj go so dvoen klik softverskiot program UniMatch Plus v3.0 (Slika 14.10levo). Od desnoto prozor~e odberi go soodvetniot kit za analiza→ odberi analyze a reaction pattern. Vo prozor~eto {to }e se pojavi vnesi go vtoriot alel (Slika 14.11), dokolku e poznat so prethodna analiza so niska rezolucija ili odberi unknown dokolku ne e poznat. Vo prozor~eto analysis form vnesi gi podatocite za pacientot, negovata etni~ka pripadnost, dali se raboti za primatel ili daritel, podatocite za ispituva~ot, serolo{kite rezultati od HLA tipizacija, kako i podatoci za kitot koj go koristime za analiza (Slika 14.12gore). Slika 14.10: Aktivirawe na softverot za analiza na HLA klasa 1 so metodot SSP (UniMatch Plus v3.0). Odberi select lines→ odberi gi pozitivnite lenti dobieni od gel elektroforezata i vnesi gi na soodvetnata predvidena linija. Liniite od skalata na elektroforezata so poznata dol`ina se ozna~eni so M (Slika 14.12sredina). Potoa odberi → perfect match. Postoi mo`nost da se odbere i parcijalna analiza na rezultatot, odnosno so mininum na gre{ki vo analizata. Takva analiza ne se prepora~uva, no ponekoga{ e neophodna, osobeno ako sme nai{le na nov Slika 14.11: Vnesuvawe podatok dali e poznat drugiot alel vo softverot za analiza na HLA klasa 1 so meotodot SSP (UniMatch Plus v3.0). Institut za imunobiologija i humana genetika 157 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Slika 14.12: Vnesuvawe podatoci za ispitanikot i za kompletot od HLA klasa 1 (gore), vnesuvawe rezultati od elektroforezata na specifi~nite amplikoni (sredina), i dobieniot rezultat od HLA klasa 1 genotipizacija (dolu) so specijalen softver za SSP (Uni-Match Plus v3.0). Tabela14.3: Formular za vnesuvawe resultati od HLA. alel. Vo prozorecot }e se pojavat alelite i mo`nite kombinacii na aleli (Slika 14.12dolu). Rezultatite se vnesuvaat na Tabela 14.3 Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod) Data Student (ime i prezime) Asistent (potpis i pe~at) ______________ __________________________ ____________________________ 158 Institut za imunobiologija i humana genetika 15. ANALIZA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS VE@BA 15: ANALIZA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS Zna~eweto na glavniot tkivno sovpadliv kompleks (GTSK) mo`e da bide za: 1. Antropolo{ki studii - odreduvawe i sporeduvawe na alelski frekvencii me|u populacii i odreduvawe na vlijanieto na migraciite i etni~koto me{awe vrz potekloto na populaciite. 2. Bolesti povrzani so GTSK- odreduvawe na povrzanosta na odredeni aleli so razli~ni bolesti. 3. Transplantacija - odreduvawe na sovpadlivosta me|u primatelot i potencijalniot daritel pri transplantacija na solidni organi i tkiva vo ramkite na familijata i kaj nesrodni daruvawa. Tabela 15.1: Frekvencii na HLA-A alelite vo makedonskata populacija (216 nesrodni ispitanici ili 432 geni). 15.1. Normalni vrednosti za glavniot tkivno sovpadliv kompleks Normalnite vrednosti za glavniot tkivno sovpadliv kompleks se iska`uvaat kako frekvencija na opredelni aleli od HLA vo zdrava populacija, ako se opredeluvani so molekulski metodi. Naj~esto frekvencijata na alelite se iska`uva kako decimalen broj so tri decimalni mesta. Frekvencijata na fenotipovite, odnosno antigenite opredeleni so serolo{ki metodi se iska`uvaat kako procenti. Poradi univerzalnoto zna~ewe, poradi mo`nostite za etni~ki, populaciski i regionalni sporedbi, kako i poradi potrebata od globalni analizi (meta analizi), frekvenciite na alelite i na antigenite se skladiraat vo me|unarodni bazi na podatoci dostapni do site istra`uva~i i gra|ani vo Svetot. Institut za imunobiologija i humana genetika 159 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Tabela 15.2: Frekvencii na HLA-B alelite vo makedonskata populacija (216 nesrodni ispitanici ili 432 geni). Postojat pove}e bazi na podatoci za HLA antigenite i za alelite, no najpoznati i najkoristeni se: Bazata za glavniot tkivnosovpadliv kompleks (http::/ www.ncbi.nlm.nih.gov/mhc) i Bazata za alelski www.allelefrequencies.net). frekvencii (http:// Podatocite od alelite za HLA-A, -B, -Cv i za -DRB1 vo makedonskata populacija se vneseni vo Bazata za alelski frekvencii. Treba da se pojasni deka podatocite za HLADRB1 se vneseni so ~etiri decimalni mesta, odnosno se prika`ani alelite, dodeka vo HLA-A, -B, i -Cv se prika`ani kombinirano: pomaliot del se prika`ani kako aleli, a pogolemiot del se prika`ani kako grupno specifi~ni aleli. Ovie razliki proizleguvaat od toa {to podatocite za HLA-DRB1 se bez dvojbenosti (ambigviteti), dodeka podatocite za HLA-A, -B i -Cv se so dvojbenosti i treba dopolnitelno da se genotipiziraat i prika`at kako aleli (so ~etiri decimalni mesta). Frekvenciite od HLA-A alelite vo makedonskata populacija poka`uvaat najgolemi frekvencii za HLA-A*02 (0.322), sleduvaat HLA-A*24 (0.132), HLA-A*01 (0.113), i HLA-A*03 (0.112). Dosega se indentificari vkupno 21 rali~ni aleli, odnosno grupno specifi~ni aleli (Tabela 15.1). Retki aleli vo makedonskata populacija se HLAA*66 (0.002). Frekvenciite od HLA-B alelite vo makedonskata populacija se prika`ani na Tabela 15.2. Podatocite poka`uvaat najgolemi frekvencii za HLA-B*51 (0.153), sleduvaat HLAB*35 (0.135), i HLA-B*18 (0.134). Dosega se indentificirani vkupno 31 razli~ni aleli, odnosno grupno specifi~ni aleli. Retki aleli vo makedonskata populacija se HLA-B*1401, HLA-B*3802, HLA-B*4102, HLA-B*45, i HLA-B*4501 (0.002). Frekvenciite od HLA-Cv alelite vo makedonskata populacija se prika`ani na Tabela 15.3. Podatocite poka`uvaat najgolemi frekvencii za HLA-Cv*07 (0.243), sleduvaat HLA-Cv*04 (0.160), i HLA-Cv*12 (0.139). Dosega se indentificari vkupno 20 rali~ni aleli, odnosno grupno specifi~ni aleli. Retki aleli vo makedonskata populacija se HLA-Cv*020201, i HLA-Cv*1403 (0.002). Frekvenciite od HLA-DRB1 alelite vo makedonskata populacija se prika`ani na Tabela 15.4. Podatocite poka`uvaat najgolemi frekvencii za HLA-DRB1*1601 (0.149), sleduvaat HLA-DRB1*1104 (0.139), HLA-DRB1*1101 (0.092), HLADRB1*0101 (0.082),HLA-DRB1*0701 (0.073), i HLADRB1*1301 (0.073). Dosega se indentificari vkupno 29 rali~ni aleli, odnosno grupno specifi~ni aleli. Retki aleli vo makedonskata populacija se HLA-DRB1*0408, HLADRB1*0804, HLA-DRB1*0806, HLA-DRB1*1307, i HLADRB1*1404 (0.003). 160 Institut za imunobiologija i humana genetika 15. ANALIZA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS 15.2. Bolesti povrzani so GTSK Odredeni bolesti poka`uvaat asocijacija so soodvetni HLA aleli, a stepenot na povrzanost se opredeluva so odreduvawe na relativniot rizik (RR). Tabela 15.3: Frekvencii na HLA-Cv alelite vo makedonskata populacija (216 nesrodni ispitanici ili 432 geni). RR mo`e da se presmeta so ravenkata RR = (N * P+) * (N * K-) / (N * P-) * (N * K+) N e brojot na pacientite (P) i na kontrolni primeroci (K) so pozitivni (+) ili negativni (-) HLA aleli. RR isto taka mo`e da se presmeta dokolku se poznati soodvetnite frekvencii na alelite: RR = hp * (1 - hc) / hc* (1 - hp) Primer: okolu 90% od pacientite koi boleduvat od specifi~no zaboluvawe imaat ekspresija na HLA antigen HLA-Bh, koj se nao|a kaj 9% od kontrolnata populacija. Relativniot rizik toga{ }e bide: RR = 0.9 (1-0.09) / 0.09 (1-0.9) = 91 Vrednostite na RR> 1 zna~i deka licata koi ja imaat soodvetnata determinanta imaat zgolemen rizik, dodeka onie so vrednost RR < 1 imaat pomal rizik za razvoj na bolesta. Vo gorniot primer, individuite koi imaat prika`ano HLABh imaat 91 pati pogolema mo`nost da razvijat bolest otkolku onie koi go nemaat alelot za HLA-Bh. No, toa ne zna~i deka site lica koi imaat HLA-Bh alel }e zabolat od taa bolest. Opi{ani se i pove}e od edna asocijacija za mnogu HLA determinanti, na primer HLA-DR3, determinanta koja pripa|a na haplotipot HLA-A1, B8, DR3. Ovoj haplotip e mnogu ~est vo severna i sredna Evropa i voop{to kaj beloto naselenie. Se smeta deka ovoj haplotip poka`uva asocijacija so razvojot na avtoimunite zaboluvawa, no pri~inata za toa seu{te ne e poznata (Tabela 15.1) . 15.2. Analiza na GTSK asocijacija i bolesti Za HLA sistemot e karakteristi~na vrzanata neramnote`a (linkage disequilibrium). Vrzanata neramnote`a pretstavuva razlika pome|u najdenata frekvencija za odredena kombinacija na aleli i o~ekuvanata frekvencija spored frekvencijata na individualnite aleli. O~ekuvanata frekvencija za kombinaciite mo`e da se presmeta so mno`ewe na frekvenciite od dvata aleli. HLA alelite na nekoj lokus, na primer HLA-A1 se ~esto povrzani so specifi~ni aleli od drugi lokusi, na primer HLA-B8. Dokolku HLA-A1 se javuva kaj 16% vo populacijata (frekvencija=0.16) i HLA-B8 vo 9% od taa grupa (frekvencija = 0.09) se o~ekuva 1.4% od taa grupa da gi imaat dvata alela (0.16h0.09=0.014). Sepak, podatocite Institut za imunobiologija i humana genetika 161 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Tabela 15.4: Frekvencii na HLA-DRB1 alelite vo makedonskata populacija (158 nesrodni ispitanici ili 316 geni). poka`uvaat deka HLA-A1 i HLA-B8 se nao|aat zaedno vo 8.8% od ispituvanite individui. Ovaa razlika e merka za vrzanata neramnote`a pome|u ovie aleli od HLA klasa 1. Pokraj toa, frekvencijata na HLA alelite se razlikuva od onaa na normalnite ili tie kaj zdravata populacija. Na toj na~in, ~estiot alel vo grupata na pacienti ne sekoga{ zna~i i asocijacija so bolest, osobeno koga toj alel e mnogu ~est vo populacijata. Od druga strana zgolemenata zastapenost na odreden alel mo`e da poso~uva na indirektna asocijacija so bolest, bidej}i toj alel mo`e da bide vo nevrzana ramnote`a so drugi, cvrsto vrzani aleli. Na primer, kaj idiopatski membranski glomerulonefritis e najdeno deka ovaa bolest e povrzana so HLA-B8 so RR od 2.3. Za HLA-DR3, antigen koj se nao|a vo vrzana neramnote`a so HLA-B8 RR e 12.0. Antigenite koi se definirani so vrzana neramnote`a vo populacijata isto taka sozdavaat haplotipovi na familii. 15.3. Asocijacija so haplotipovi Nekoi bolesti poka`uvaat pogolem stepen na povrzanost so specifi~en haplotip otkolku so edine~ni antigeni ili aleli. Takov primer e juvenilniot dijabetes melitus tip 1. Se smeta deka licata koi imaat HLA-DR3 + HLA-DR4 imaat pogolema mo`nost za razvoj na bolesta, otkolku onie koi imaat samo HLA-DR3 ili HLA-DR4. 15.4. Zna~ewe na HLA sistemot vo transplantacija Za transplantacija na bubreg dovolno e polovina od HLA genite poma|u davatelot i primatelot da bidat identi~ni (poluidenti~ni ili haploidenti~ni) za da se prifati kalemot uspe{no. Poradi toa, za transplantacija na bubreg e dovolna serolo{ka tipizacija za HLA. Bidej}i roditelite i decata se sekoga{ poluidenti~ni (osven vo retki slu~ai pri rekombinacija na HLA genite) davaweto bubreg od roditel na dete e naj~estata kombinacija (srodni transplantacii). Za transplantacija na koskena srcevina (TKS), stepenot na HLA sovpa|awe pome|u daritelot i primatelot se kriti~ni za uspe{nata transplantacija, ili verojatnosta da se razvie bolesta kalem protiv doma}in (BKpD) e golema. Taa e naj~estata forma na otfrlawe vo klini~kite transplantati pri TKS. Vo obid da se minimiziraat vakvite alogeni odgovori se pravi tipizacija na HLA klasa 1 i klasa 2 genite na daritelot i na primatelot kolku e mo`no poprecizno. Me|utoa, poradi isklu~itelniot polimorfizam, HLA identi~en daritel retko se dobiva. Najgolem del primateli 162 Institut za imunobiologija i humana genetika 15. ANALIZA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS Tabela 15.5: HLA asocijacii so bolesti so zgolemen rizik za razvoj na bolest. se podlo`eni na imunosupresivni lekovi za da se spre~i ili da se zapre alogeniot odgovor, no istovremeno ovoj nespecifi~en priod go naru{uva imuniot odgovor i toj stanuva osetliv kon infekcii. 15.4.1. Barawe daritel Koga se bara daritel za koskena srcevina, prvata stapka e da se bara pome|u bra}ata i sestrite (sroden daritel). Ako nema HLA identi~en daritel vo rodninite ili ako pacientot nema bra}a i sestri, odlukata se bazira vrz bolesta na pacientot, medicinskite uslovi i HLA tipizacija vo po{irokata familija (tetki, ~i~kovci, bratu~edi i sli~no) ili direktno se bara nesroden daritel. Nesroden daritel se bara niz nacionalnite i internacionalnite registri za transplantacija na koskena srcevina vo koi ima iljadnici HLA tipizacii, a vo nekoi slu~ai milioni potencijalni dariteli. ANALIZA NA SLU^AJ 15.4.2. Tolkuvawe rezultati Nitu edna molekulska tehnika, sama po sebe ne e dovolna za dobivawe na edine~en, nedvojben rezultat (rezultat so ~etiri decimalni mesta). Re{avaweto na ambigvitetite e skapa i iscrpuva~ka rabota, zatoa sekoja laboratorija razviva sopstvena strategija pri tipiziraweto na pacientite i kombiniraweto na metodite so cel da se dobie edine~en rezultat na visoko razdelno nivo vo zavisnost od opremata i uslovite za rabota. Tuka }e ja prika`eme strategijata i algoritamot na Institutot za imunobiologija i humana genetika, pri tipiziraweto na pacientite za transplantacija na koskena srcevina (TKS). Institut za imunobiologija i humana genetika Bubre`niot kalem kako komplikacija od avtoimuna insulin zavisna {e}erna bolest: Slu~ajot na Hristijan \oreski: saga za otfrlaweto i prifa}aweto organ. 163 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM ANALIZA NA SLU^AJ Baraweto soodveten daritel za TKS se vr{i vo ramkite na familijata (srodno daruvawe). Prviot skrining na potencijalnite dariteli se izveduva so metodot na reverzna hibridizacija, RLS. Po zavr{enata reverzna hibridizacija i skrining na pacientot i potencijalnite donori, voobi~aeno se dobivaat rezultati so visok procent na ambigviteti, odnosno tipiziraweto e od nisko do sredno razdelno nivo na tipizacija. Bolest kalem protiv doma}in: Slu~ajot na Ilija Popov, lekuvaweto predizvika problem. Pri srodnoto daruvawe, sovpadlivosta pome|u pacientot i potencijalniot donor mo`e da se identifikuva vrz osnova na haplotipovite koi gi nasleduvaat od majkata i od tatkoto. Zaradi toa, pri sekoja tipizacija potrebni se primeroci krv od site ~lenovi na potesnoto semejstvo (majka, tatko, brat, sestra), dokolku se dostapni. Za poprecizni rezultati, ili kade ne postoi mo`nost za srodno daruvawe, sleduva fazata na barawe nesroden daritel. Za nesrodnoto daruvawe neophodno e visoko razdelno tipizirawe, koe kaj nas se izveduva so metodata na SSP. Nesrodnoto daruvawe za sega se izveduva vo pogolemite internacionalni centri za transplantacija na koskena srcevina. Pacientot i potencijalniot donor, koj e otkrien so metodata na RLS, se tipiziraat na visoko razdelno nivo so metodata na SSP, so {to zna~itelno se namaluva procentot na ambigviteti do poptolno dobivawe na edine~en nedvojben rezultat. Tabela 15.6: Formular za vnesuvawe rezultati od molekulska tipizacija na HLA. Scenario: Kaj pacientot e dijagnosticirana akutna mieloidna leukemija. Lekarite prepora~uvaat transplantacija na koskena srcevina. Zada~a: Pronajdete dali pacientot ima soodveten daritel od ~lenovite na negovata familija (Tabela 15.2). Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod) Data Student (ime i prezime) Asistent (potpis i pe~at) ______________ __________________________ ____________________________ 164 Institut za imunobiologija i humana genetika 16. TIP 1 PREOSETLIVOST BLOK 6 BLOK 6 - PREOSETLIVOST U^EBNI CELI: VE@BA 16. TIP 1 PREOSETLIVOST (1 ~as) Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat: da opredelat vkupen i specifi~en IgE; koi analizi se potrebni za ispituvawe tip 1 preosetlivost. VE@BA 17. TIP2 I TIP 3 PREOSETLIVOST (1 ~as) Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat: da opredelat indirekten protivglobulinski test; i direkten kako se opredeluva koli~inata na cirkulira~kite imuni kompleksi. VE@BA 18. ANALIZA NA PREOSETLIVOST (1 ~as) Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat da: tolkuvaat rezultati od tip 1 preosetlivost; analiziraat slu~ai od tip 1 preosetlivost. POENI: PRISUSTVO 1.5 poeni ZNAEWE 3.0 poeni VKUPNO: 4.5 poeni Institut za imunobiologija i humana genetika 165 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 166 Institut za imunobiologija i humana genetika 16. TIP 1 PREOSETLIVOST VE@BA 16: TIP 1 PREOSETLIVOST 16.1. Reakcii na preosetlivost Vnesuvaweto protivgeni po primarna imunizacija doveduva do vtori~na (sekundarna) imunizacija vo najgolem broj slu~ai, no ponekoga{ mo`e da se razvie preosetlivost (hipersenzitivnost). Denes razlikuvame pet tipovi preosetlivost: Tip 1. Anafilakti~ka preosetlivost; Tip 2. Citotoksi~na preosetlivost; Tip 3. Imunokompleksna preosetlivost; Tip 4. Odlo`ena (kleto~na) preosetlivost; Tip 5. Stimulaciska preosetlivost. Vo site reakcii na preosetlivost od tipovite 1-3 vklu~eni se humoralni protivtela, dodeka od tipot 5 preosetlivost vklu~eni se protivreceptorski protivtela. Nasproti toa, vo preosetlivost od tipot 4 vklu~eni se T-limfocitite. 16.2. Odreduvawe vkupen IgE i specifi~ni IgE protivtela 16.2.1. Alergeni To~nata alergolo{ka dijagnoza zavisi od vistinskiot izbor na alergen za testirawe. Vo ovoj del se objasnuvaat razlikite pome|u alergenite i nivnata primena vo dijagnosti~kite testovi. Ponekoga{ kaj pacientite mo`e da se javat simptomi predizvikani od prethodno neidentifikuvani supstancii koi mo`e da bidat novi alergeni, pa pacientite treba da se ispituvaat za da se identifikuva noviot alergen. Sepak, za supstancii kako boja za pe~atewe tekst, formaldehid, ~ad od cigari, smog, Institut za imunobiologija i humana genetika 167 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM pamuk, {e}er i ~ove~ki prvut ne postojat dovolno podatoci za da bidat koristeni kako test alergeni. 16.2.1.1. Vdi{eni (inhalatorni) alergeni Aeroalergenite koi se dobro poznati kako predizvikuva~i na IgE posreduvana alergija gi vklu~uvaat polenite, fungi, algi, `ivotinski otpadoci, insekti, mikrokrle`i, proteini od hrana, dodatoci na hrana, antibiotici, lekovi i profesionalni alergeni. Postojat i slu~ai koga ne se identifikuvani specifi~ni alergeni adekvatni za dijagnosti~ko testirawe. Odreduvaweto brojot i vidot na alergeni pogodni za ispituvawe zavisi od nivnata povrzanost so podatoci od istorijata na pacientot, vklu~uvaj}i zna~ajna izlo`enost, objektiven dokaz za alergenosta na supstancata od interes i od postoeweto na soodveten alergen materijal za testirawe. Nekoi poleni poka`uvaat vkrstena reaktivnost i klini~arot mora da bide svesen za nivnoto klini~ko zna~ewe za da se izbegne nepotrebno udvojuvawe. Koga voobi~aeni poleni ne predizvkuvaat vkrstena reaktivnost, ispituvaweto i le~eweto so pove}e lokalno prevalentni poleni mo`e da e neophodno za da se izbegne zna~itelno proma{uvawe. Ekstrakti od doma{na pra{ina sodr`at razli~ni alergeni. Razli~nosta vo sostavot i potentnosta na alegenite vo komercijalnite ekstrakti od doma{na pra{ina i dostapnosta na pove}e selektivni alergenski ekstrakti za ispituvawe na poedine~ni komponenti (na pr. mikrokrle`i, buba{vaba, epidermi) od doma{nata pra{ina go namaluva zna~eweto na komercijalniot ekstrakt od doma{na pra{ina. Fungite (muvlite) mo`e da dovedat do simptomi na respiratorna alergija. Tehni~kite pote{kotii vo izoliraweto na specifi~ni fungalni protivgeni od sporite ili hifite go ote`nuvaat i karakteriziraweto na klini~ki zna~ajnite alergeni za nekoi od ovie vidovi. Za klini~ki celi, fungite mo`e da se klasificiraat kako nadvore{ni (na pr. Alternaria sp. i Cladosporium sp.) i/ili vnatre{ni (na pr. Aspergillus sp. Penicillium sp.) 16.2.1.2. Hrani Momentna preosetlivost posreduvana od IgE kon razli~ni vidovi na hrana e prakti~no va`na za mali deca i adolescenti, no treba da se zeme vo predvid vo bilo koja vozrast ako podatocite od anamnezata sugeriraat na toa. Skoro sekoja hrana mo`e da bide alergena. Bidej}i alergenosta e visoko specifi~na za odredena hrana, nereaktivnost kon nekoja hrana pretstavnik na grupa na 168 Institut za imunobiologija i humana genetika 16. TIP 1 PREOSETLIVOST sli~ni hrani ne mo`e da se zeme kako dokaz za otsustvo na reaktivnost kon drugi hrani od taa grupa. Iako mnogu alergeni od hrana se dobro karakterizirani, seu{te ne postojat standardizirani ekstrakti od hrana. Ponatamu, relevantnite alergeni prisutni vo nativnata hrana mo`e da ne bidat prisutni vo ekstraktot za testirawe. Mnogu hrani sodr`at protivgeni koi brzo se gubat verojatno poradi proteoliti~kata digestija za vreme na ~uvaweto, pa zatoa korisno e testirawe so sve`i prirodni sokovi, posebno ako postoi somnevawe za alergiski reakcii kon ovo{je. Istorijata (anamnezata) na pacientot e najva`na vo izborot na hrani za testirawe, a nekoga{ treba anamnezata na pacientot da se dopolni so podatoci za simptomite posle jadewe spored dieta koja precizno mu e odredena. Vakov priod e potreben prvenstveno za pacienti so potencijal za anafilaksa predizvikana od hrana. Kaj deca pomladi od 3 godini, najva`ni alergeni od hrana se mleko, belka od jajce, kikiriki, soja, p~enka i ovo{ja od grupata na citroni. 16.2.1.3. Antibiotici, drugi lekovi i hemikalii Mehanizmi posreduvani od IgE mo`e da se odgovorni za nesakani dejstva na mnogu antibiotici, drugi farmacevtski i biolo{ki proteini. Za mnogu od ovie supstancii seu{te ne se identificirani relevantnite alergeni ili ne postojat kako komercijalni ekstrakti za testirawe. Peniciloil polilizin e reagensot koj se koristi za otkrivawe na IgE protivtela kon glavnata alergenska determinanta na penicilinot (peniciloil) i e pozitiven vo 80% od pacientite osetlivi na penicilin. Iako pove}eto reakcii na penicilin se dol`at na senzibilizacija so metaboli~ki produkti {to poteknuvaat od beta-laktamskiot prsten, specifi~ni determinanti od strani~niot lanec na razli~ni penicilini mo`e da se odgovorni za nekoi reakcii na preosetlivost kon betalaktamskite antibiotici. Ko`ni i in vitro testovi mo`e da se koristat za otkrivawe na osetlivost kon biolo{ki preparati (insulin, enzimi, protamin, heparin, intravenski imunoglobulinski preparati i drugi krvni produkti) i odredeni vakcini koi sodr`at supstancii so golema molekulska masa vo tragi. Ne e e dobro poznato kakva e klini~kata vrednost na ovie testovi. Mnogu hemikalii (sulfonhloramidi, azotni boi, aromi) koi se koristat vo hranite kako aditivi, lekovi, kozmeti~ki preparati mo`e da predizvikaat ili IgE posreduvani reakcii ili kontakten dermatitis ili i dvete. Institut za imunobiologija i humana genetika 169 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 16.2.1.4. Profesionalni alergeni Poka`ano e deka pove}e od 200 supstancii so golema i mala molekulska masa koi se koristat vo industrijata predizvikuvaat alergiski simptomi so klasi~ni imunolo{ki mehanizmi. Koga vnesuvaweto na ovie supstancii e preku respiratorniot pat, naj~esti manifestacii na senzibilizacija se rinitis, astma i/ili hipersenzitiven pneumonitis. Mnogu nisko molekularni hemikalii od rabotnite mesta se poznati kako predizvikuva~i na naj~estata imunolo{ka profesionalna bolest, alergiski kontakten dermatitis. 16.2.1.5. Razli~ni rastitelni produkti Mnogu rastitelni produkti kako himopapain, piretrum, seme od pamuk, psilium i rastitelni gumi se povrzani so alergiski simptomi. Prevalencijata na osetlivost i anafilaksa kon lateks proteinot koj se sodr`i vo medicinskite rakavici, vozduh i drugi medicinski preparati mnogu e zgolemena i kaj pacienti i kaj medicinskiot personal. Osetlivite individui mo`e da reagiraat na lateks vo kateterite, endotrahealni tubi, delovi koi se instaliraat intravenski ili drugi bolni~ki materijali koi sodr`at lateks. Testirawe so lateks protein i/ili drugi rastitelni produkti mo`e da e indicirano kaj odredeni pacienti, no treba da se potencira deka standardizirani i dobro karakterizirani ekstrakti za ovie alergeni seu{te nema. 16.2.1.6. Kontaktni alergeni Hemikalii, rastitelni smoli i masti se glavna pri~ina za alergiski kontakten dermatitis. So pe~ test so 20 do 30 alergeni od skrining panel se otkrivaat do 70% od site alergiski kontaktni dermatitisi. Otkrivawe na pri~inata za alergiski kontakten dermatitis vo individualni slu~ai vklu~uva skrining pe~ testovi, po {to sledat testovi za specifi~ni komponenti ako postoi mo`nost za nivno odreduvawe. 16.2.1.7. Osnovni principi za vkrstena reaktivnost me|u rastitelni alergeni Postoi zna~itelna alergenska razli~nost pome|u polenite od drva. Isklu~oci postojat kaj nekoi iglolisni drva i ~lenovi na familiite brezi i buki (dab, negundo i leska). Postoeweto na zaedni~ki protivgeni e pravilo za golema podfamilija na trevi “severni pastirski trevi”; sepak 170 Institut za imunobiologija i humana genetika 16. TIP 1 PREOSETLIVOST kompletna vkrstena reaktivnost retko se javuva. Trevite ma~kina opa{ka i metla imaat dodatni edinstveni protivgeni koi mo`e da se od klini~ko zna~ewe. Obi~niot troskot ne reagira vkrsteno so severnite trevi, no poka`uva mala vkrstena reaktivnost so zapadnite preriski trevi. Korovite od slo`enata familija koja go vklu~uva rodot ambrozija, se potentni senzibilizatori i ekstenzivno vkrsteno reagiraat. Pelinite (rod Artemisia) silno vkrsteno reagiraat pome|u sebe. Vkrstena reaktivnost postoi i kaj korovite diva loboda, {tir i loboda. Kaj nekoi korovi postoi samo parcijalna vkrstena reaktivnost. 16.2.2. IgE posreduvana alergija IgE protivtelata sozdadeni po prviot kontakt so odreden alergen se fiksiraat na povr{inata na mastocitite vo ko`a i sluznici. Dokolku alergenot koj go predizvikal sozdavaweto na IgE protivtelata povtorno se najde vo cirkulacijata (po povtorno vnesuvawe na inkriminiranata hrana) toj e vrzan od IgE protivtelata fiksirani na membranata na mastocitite. Rezultat na reakcijata protivgen-prtoivtelo koja se odviva na povr{inata na mastocitite e nivna degranulacija pri {to se osloboduvaat biolo{ki aktivni supstancii (histamin, leukotrieni i prostaglandini). Ovie pak predizvikuvaat vazodilatacija i zgolemena propustlivost na krvnite sadovi i se odgovorni za simptomite karakteristi~ni za alergiskata reakcija (vospalenie, urtikarija, sekrecija na sluz, ~e{awe ili kivawe) (Slika 16.1). Slika 16.1: [ematski prikaz na mehanizmite vklu~eni vo sozda-vaweto alergiska reakcija kaj lu|e (tip 1 preosetlivst). Najserioznata, opasna po `ivot alergiska reakcija e Institut za imunobiologija i humana genetika 171 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM anafilakti~kiot {ok. Vo ovaa sostojba momentnoto osloboduvawe na razli~ni biolo{ki medijatori doveduva do otekuvawe na grloto, bronhokonstrikcija, namaluvawe na krvniot pritisok, gubewe na svesta, a nekoga{ duri i do smrt. Hrani koi obi~no se povrzani so ovaa inaku retka sostojba se kikiriki, morska hrana, jajca i mleko. 16.2.3. Dijagnosticirawe na IgE posreduvana alergija IgE posreduvanata alergija e nesakana reakcija kon nekoj alergen koja naj~esto e lesna za identifikuvawe, najmnogu zatoa {to postojat doverlivi dijagnosti~ki testovi. A B IgE Vo rutinska primena se dva na~ini za dijagnosticirawe na IgE posreduvana alergija. Prviot e injektirawe (potko`no) na somnitelniot alergen vo podlakticata na pacientot i sledewe na posledovatelnata reakcija. Vtoriot, ponov metod podrazbira otkrivawe na cirkulira~ki IgE protivtela kon razli~ni alergeni vo serumot na ispitanikot vo in vitro uslovi. Pome|u rezultatite dobieni so primena na dvata metodi postoi visoka korelacija i taa e nad 90%. Dobrite osobini na kvantitativnoto odreduvawe na specifi~nite IgE protivtela se: 1. Alergen V G rezultatot ne zavisi od eventualno koristenata terapija; 2. mo`e da se primeni i kaj bolni so silno izrazeni ko`ni promeni; 3. mo`e da se izveduva bez nikakov rizik po ispitanikot (od anafilakti~ki {ok na pr.); 4. serumot za ispituvawe mo`e da se zamrznuva pa da se pravat i sporedbi na koncentracijata na protivtelata kaj istiot ispitanik vo tekot na vremeto; 5. posebno e prepora~liv za ispituvawe na deca pomali od 3 godini bidej}i so edno bockawe (zemawe krv) mo`e da se ispita prisustvo na IgE protivtela kon mnogu alergeni). Relativni nedostatoci na in vitro odreduvaweto na IgE protivtela se ograni~uvaweto samo na cirkulira~ki protivtela, a ne i na tie fiksirani na mastocitite i vo tkivata, kako i negovata visoka cena. 16.2.4. Princip za opredeluvawe specifi~en IgE Slika 16.2: Princip za opredeluvawe specifi~en IgE. 172 Specifi~niot IgE se opredeluva so sendvi~ imunolo{ko opredeluvawe. Alergenite se vrzuvaat za crvsta faza i reagiraat so specifi~nite IgE protivtelata vo primeInstitut za imunobiologija i humana genetika 16. TIP 1 PREOSETLIVOST rokot. So IgE protivtelata se otkrivaat fluores-centno obele`eni protiv IgE protivela (Slika 16.2). A. Alergenot kovalentno se vrzuva za top~ence (imunokap) koe {to reagira so specifi~niot IgE vo serumot od pacientot; B. Posle isplaknuvawe (isfrlawe) na nespecifi~niot IgE, se dodavaat protivtela kon IgE koi sozdavaat kompleksi; V. Posle inkubacija, se isfrla nevrzaniot obele`en protiv IgE so plaknewe, a vrzanite kompleksi se inkubiraat so soedinenie za razvivawe; G. Posle stopirawe na reakcijata se meri fluorescencijata na eluatot (ispirokot). Kolku pove}e specifi~en IgE se vrzal za kugli~kite tolku povisoka fluorescencija se dobiva. Za da se opredeli koli~estvoto na specifi~en IgE, serumot od pacientot se sporeduva so kalibraciskite primeroci. 16.3. Razlikuvawe atopiski od neatopiski bolesti Poimot atopija ozna~uva lokalna reakcija na preosetlivost tip 1. Najnovata definicija za atopija e deka atopijata e li~na ili familna tendencija: da se sozdavaat IgE protivtela vo odgovor na niski dozi alergeni, obi~no proteini i kako rezultat na toa da se razvijat tipi~ni simptomi kako {to se astma, rinokonjunktivit ili egzem/dermatit. Za razlikuvawe atopiski od neatopiski bolesti se koristat tri alergolo{ki ispituvawa: UniCap Phaditop, UniCap fx5 i UniCap vkupen IgE. 16.3.1. UniCap Phadiatop [to meri UniCap Phadiatop? Phadiatop e test so koj se razlikuvaat atopiskite od neatopiski bolesti. Toj e prviot ~ekor {to se prezema vo ispituvaweto na atopiska alergija. Testot se sostoi od balansirana me{avina na relevantni alergeni koi reagiraat so specifi~ni IgE protivtela vo serumot na pacientot. UniCap Phadiatop uka`uva na atopiska alergija na voobi~eni di{ni alergeni. Koja e klini~kata korist od ovoj test? Phadiatop ovozmo`uva diferencijalno ispituvawe na atopijata. Kaj deca, tinejxeri i vozrasni, dava odgovor na pra{aweto: Institut za imunobiologija i humana genetika 173 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM dali simptomite na pacientot se dol`at na alergija? UniCap Phadiatop dava objektiven odgovor da ili ne: pozitiven rezultat uka`uva na atopiska alergija. Lekarot mo`e da prodol`i so pospecifi~ni testovi za da go potvrdi alergenot pri~initel; negativen rezultat uka`uva deka simptomite ne se predizvikani od voobi~aeni alergeni i lekarot mo`e da ispituva drugi mo`nosti. Kolku se doverlivi rezultatite? Kombinaciite na alergeni {to se koristat, kako i na~inot na koj se kombinirani rezultiraat so verojatnost od 90% vo to~no klasirawe na atopi~ni i ne-atopi~ni pacienti postari od 6 godini. Klini~kata osetlivost i specifi~nost e sledna: osetlivost: 93%; specifi~nost 89%. 16.3.2. UniCap fx5 [to meri UniCap fx5? UniCap fx5 e multi-alergenski test koj uka`uva na prisustvo na IgE protivtela vo serum ili plazma kon alergeni od soja, kikiriki, mleko, jajca, p~enica ili riba. Alergenskiot panel pretstavuva voobi~aeni nutritivni alergeni. Koja e klini~kata korist od ovoj test? UniCap fx5 e test za ispituvawe osetlivost kon voobi~aeni nutritivni alergeni: kaj vozrasni i kaj deca, pozitiven odgovor potvrduva alergija na hrana i treba da bide sleden od testirawa so posebni nutritivni alergeni; kaj mnogu mali deca (pod 3 godini), ovozmo`uva potvrduvawe na atopiski status. Pozitiven rezultat kaj mnogu mali deca potvrduva osetlivost kon nutritivni alergeni vklu~eni vo testot. Pojavuvaweto na IgE protivtela tolku rano vo `ivotot e ~esto povrzano so pokasno razvivawe na alergiska bolest. Zatoa, individuite treba da bidat sledeni za da se vidi dali razvile simptomi i stanale osetlivi i na drugi alergeni. Kolku doverlivi se rezultatite? Osetlivosta i specifi~nosta na fx5 e presmetana i se dobieni slednite rezultati: osetlivost: 89%; specifi~nost 96%. 174 Institut za imunobiologija i humana genetika 16. TIP 1 PREOSETLIVOST 16.3.3. UniCap vkupen IgE [to meri UniCap vkupen IgE? UniCap vkupen IgE kvantitativno meri koli~ina na vkupen IgE vo serum ili plazma. IgE se sozdavaat vo organizmot kako rezultat na povtoruvana stimulacija so alergeni. Koja e klini~kata korist od testot? Visoki nivoa na cirkulira~ki vkupni IgE protivtela se obi~no povrzani so alergii. Merewe na vkupen IgE: obezbeduva vredni informacii za vkupnata opteretenost so alergii; obezbeduva uvid vo atopiskiot status na pacientot; vo profesionalna alergija, testot uka`uva na atopiski status i mo`e da ne postoi povrzanost so voobi~aeni alergeni, pa e potrebno pospecifi~no ispituvawe. Kakvi vrednosti treba da se o~ekuvaat? Koncentracijata na IgE vo serum e povrzana so vozrasta. Na okolu 10 godini, vkupniot IgE dostignuva vrednosti koi se odr`uvaat ponatamu. Kako normalni vrednosti za vkupniot IgE se definiraat gornite granici bidej}i postoi asimetri~na distribucija na dobienite vrednosti. Preporaka e sekoja laboratorija da ima sopstveni o~ekuvani vrednosti. 16.4. Dijagnosti~ki pomagala za specifi~ni alergii Protivtelata {to se merat so metodot na UniKap (UniCap) mo`eme da gi podelime vo ~etiri grupi. Prvite tri grupi opfa}aat protivtela od trite imunoglobulinski klasi IgE, IgA i IgG, a ~etvrtata grupa se kleto~ni obele`uva~i (Tabela 16.1). Globalno, IgE protivtelata uka`uvaat na alergiski procesi, IgA protivtelata uka`uvaat na promeni vo mukozno asociranoto limfoidno tkivo (MALT), dodeka IgG protivtelata uka`uvaat na citotoksi~ni reakcii vo organizmot. Kleto~nite obele`uva~i uka`uvaat na stepenot (ili intenzitetot) na reaktivnosta na nekoi kletki vklu~eni vo tip 1 preosetlivost (eozinofili, bazofili i drugi). 16.4.1. UniCap specifi~en IgE [to meri UniCap specifi~en IgE? UniCap specifi~en IgE meri IgE protivtela kon specifi~ni alergeni vo ~ove~ki serum ili plazma. Specifi~nite IgE se pojavuvaat vo ~ove~kiot serum ili plazma kako rezultat na senzibiInstitut za imunobiologija i humana genetika 175 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Tabela 16.1: UniCap testovi po klini~ki oblasti. UNICAP TEST KLINI^KA OBLAST Inunoglobulin E alergii, atopija/ne-atopija diferencijalna dijagnoza UniCap fx5 alergii, dijagnoza na alergija na hrana UniCap vkupen IgE dijagnoza na alergii UniCap specifi~en IgE alergii, dijagnoza na specifi~ni alergeni Imunoglobulin A UniCap specifi~en IgA alergii, enteropatii osetlivi na hrana, celijakija UniCap glijadin IgA celijakija UniCap Phadiatop Imunoglobulin G UniCap specifi~en IgG alergii, celijakija, imunoterapija, UniCap glijadin IgG bolest na beli drobovi, avtoimunitet celijakija UniCap TPO tiroiden avtoimunitet UniCap TG tiroiden avtoimunitet Kleto~ni obele`uva~i UniCap EKP astma, vodewe na le~ewe so kortikosteroidi UniCap triptaza alergija, anafilaksa lizirawe so alergen i mo`e da se otkrijat posle povtorno izlo`uvawe. Koja e klini~kata korist od testot? Mereweto na cirkulira~ki IgE protivtela kon specifi~en alergen obezbeduva objektivno merewe na senzibilizacijata so alergenot. Denes za ispituvawa postojat pove}e od 450 alergeni. Merewe na specifi~ni IgE pomaga vo identifikuvaweto na predizvikuva~kite alergeni, predviduva rizik za alergisko zaboluvawe i gi naso~uva klini~kite odluki: - Identifikuvawe na predizvikuva~ki alergeni. Odreduvawe na reaktivnost kon nekoj alergen obezbeduva informacii za mo`nite pri~initeli na alergiski simptomi i vospalenie. Mereweto na IgE zaedno so informaciite za vozrasta, simptomite, klini~kite uslovi i vremeto koga simptomite se vidlivi mo`e da pridonesat za lekuvawe na pacienti so atopi~en ekzem, alergiski bronhitis, rinitis, konjuktivitis i astma. - Predviduvawe na iden razvoj na alergija. 176 Institut za imunobiologija i humana genetika 16. TIP 1 PREOSETLIVOST Posebno kaj mali deca, raniot IgE odgovor mo`e da gi napravi individuite podlo`ni na idna osetlivost kon alergeni. Mereweto IgE kaj mali deca ovozmo`uva sledewe na razvojot na atopijata. - Naso~uvawe na klini~kite odluki kaj mladi so atopi~en dermatit. Za nekoi alergii na hrana vrednosta kEA/L (kilo edinici specifi~en alergen na eden litar) na specifi~nite IgE mo`e da bide od korist. Kakvi vrednosti treba da se o~ekuvaat? Zdravite individui imaat mnogu niski nivoa na specifi~ni IgE vo krvta, normalno pod 0.35 kEA/L (kilo edinici specifi~en alergen vo eden litar). Senzibiliziranite pacienti poka`uvaat zgolemeni nivoa, nad 0.35 kEA/L. UniCap specifi~nite IgE otkrivaat IgE protivtela vo interval 0.35-100 kEA/L. Rezultatot se izrazuva kvantitativno, kako nivo ili kako klasa specifi~en IgE (Tabela 18.2) . Klini~kata osetlivost i specifi~nost e sledna: osetlivost: 89%; specifi~nost 91%. 16.4.2. UniCap specifi~en IgA [to meri UniCap specifi~en IgA?UniCap specifi~niot IgA meri IgA protivtela specifi~ni za protivgeni vo serum i plazma. Specifi~nite IgA protivtela se del od normalnata imunolo{ka odbrana na organizmot. Prisutni se vo sekreti kako plunka, vo sluznici, kako i vo krvta. Nivoto na specifi~ni IgA se zgolemuva koga imuniot sistem odgovara, na primer, na nutritiven alergen. Slednite protivgeni se otkrivaat vo IgA sistemot: glijadin (AGf98), α-laktalbumin (AGf76), β-laktalbumin (AGf77) i kazein (AGf78). Koja e klini~kata korist od testot? Vo serum, visoki nivoa na specifi~ni IgA kon alergeni od hranata mo`e da uka`uvaat na zgolemena izlo`enost na vakvi alergeni poradi o{tetuvawe na crevnata sluznica. Kaj celijakija, na primer, nivoata na specifi~ni IgA protivtela kon glijadin se zna~ajni za dijagnoza na bolesta. Kakvi vrednosti treba da se o~ekuvaat? Kaj zdravi individui, nivoata na specifi~ni IgA protivtela kon razli~ni protivgeni variraat zna~ajno vo zavisnost od izlo`uvaweto. Za da se odredi dali nivoata se zgolemeni, referentnoto nivo na specifi~no IgA protivtelo mora da se meri na pove}e primeroci od zdravi individui i, ako e mo`no, da se sporedi so nivoata na IgA kaj bolni individui. Ne postojat prepora~ani grani~ni vrednosti za specifi~ni IgA protivtela bidej}i tie se obele`uva~i za izlo`enosta na protivgeni i ne se direktno povrzani so Institut za imunobiologija i humana genetika 177 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM bolest. Rezultatite variraat vo odnos na eden protivgen, kako i pome|u razli~ni protivgeni. Geografskite varijacii se isto taka va`ni. 16.4.3. UniCap glijadin IgA [to meri UniCap glijadin IgA? UniCap glijadin IgA meri specifi~ni IgA protivtela protiv glijadin vo ~ove~ki serum i plazma. Glijadin e frakcija na glutenot rastvorliva vo alkohol, a koja se sretnuva vo p~enica, ja~men, r` i oves. Koja e klini~kata korist od ovoj test? Nepodnesuvawe na glijadin mo`e da dovede do celijakija, koja e enteropatija so osetlivost na hrana {to trae cel `ivot, a se karakterizira so o{tetuvawa na sluznicata na tenkoto crevo po zemawe na hrana. Mereweto na IgA i IgG kon glijadin e prviot ~ekor vo ispituvaweto na pacientite suspektni za celijakija i vo podobruvaweto na le~eweto na ovie pacienti. Mereweto na IgA protiv-glijadinski protivtela so UniCap glijadin IgA e va`no vo nekolku sostojbi. - Vo dijagnoza: - kako prv ~ekor vo ispituvawe na pacienti so simptomi na celijakija; - vo otkrivawe na asimptomatski bolni od celijakija i bolni so rizik za razvivawe na pridru`ni bolesti na celijakija; - kako dodatok za biopsija za dijagnoza na celijakija. - Vo sledewe na le~eweto: A. Dieta bez gluten: - da se proceni vremeto za koe }e se postigne remisija po dietata (toa e razli~no kaj razli~ni lu|e); - kako povtoren rezultat za sledewe na bolesta. Niska koncentracija na IgA protivtela po eliminirawe na glutenot uka`uva na mo`na remisija i ~esto dobro korelira so simptomite. B. Izlo`uvawe na gluten: - da se poka`e relaps na bolesta, normalno za nekolku nedeli do nekolku meseci po izlo`uvaweto (razli~no kaj razli~ni lu|e). Nivoto na protiv-glijadinski protivtela brzo se zgolemuva kako odgovor na primawe na gluten i se koristi za sledewe na pacientot za vreme na izlo`uvaweto. Kakvi vrednosti treba da se o~ekuvaat? Kaj 192 zdravi subjekti, na vozrast od 2-74 godini se poka`aa 95-ti percentil od 3.5 mg/L. 178 Institut za imunobiologija i humana genetika 16. TIP 1 PREOSETLIVOST 16.4.4. UniCap specifi~en IgG [to meri UniCap specifi~en IgG? UniCap specifi~en IgG meri protivgen-specifi~ni IgG protivtela vo ~ove~ki serum ili plazma. Ovie protivtela se del od prirodnata odbrana na organizmot i se sozdavaat vo krvta kako odgovor na dopir so tu|i supstancii. Kaj avtoimuni bolesti protivtelata se naso~eni kon sopstveni protivgeni (avtoprotivgeni). Koja e klini~kata korist od testot? Sozdavaweto na IgG protivtelata e del od kompleksni nastani so koi organizmot se obiduva da go inaktivira i uni{ti ili da go otstrani protivgenot. Taka prisustvoto na IgG protivtela specifi~ni za nekoj protivgen e siguren pokazatel za izlo`enost na toj protivgen. Nivoto na IgG protivtela obi~no uka`uva na intenzitetot na izlo`uvaweto. So merewe na specifi~nite IgG protivtela se obezbeduvaat vredni klini~ki informacii vo pove}e poliwa. Alergiski bolesti Kaj alergiski bolesti, specifi~nite IgG se koristat: - vo klini~ki studii na astma, rinitis, urtikarija, ekzem i gastrointestinalni poremetuvawa; - kako obele`uva~ za izlo`enost kaj razli~ni bolesti na belite drobovi; na pr. alergiski alveolitis, aspergilom i aspergiloza. Alergija na hrana Protivgen specifi~ni IgG protivtela se mereni kaj pacienti somnitelni za alergija na hrana: - prisustvoto na IgG protivtela e znak za izlo`enost; - nivoto na specifi~ni IgG protivtela e od dijagnosti~ka va`nost za odredeni nutritivni protivgeni, kako glijadin. Imunoterapija Vo sledewe na imunoterapija so inhalira~ki alergeni i otrov od tvrdokrilci, zgolemenite nivoa na specifi~ni IgG: - poka`uvaat generalna (no ne definitivna) povrzanost so klini~kiot ishod; - poka`uvaat deka imuniot sistem odgovara na terapijata. Avtoimunitet Zgolemeni nivoa na specifi~ni IgG protivtela kon protivgeni kako tiroidna peroksidaza i tiroglobulin mo`e: - da uka`at deka pacientot strada od avtoimuna bolest; - pomognat vo dijagnozata na bolesta. Institut za imunobiologija i humana genetika 179 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Kakvi vrednosti treba da se o~ekuvaat? Nivoto na specifi~ni IgG protivtela kaj zdravi lica kon razli~ni protivgeni mo`e da varira zna~itelno, zavisno od izlo`enosta. Za da se odredi dali nivoata se zgolemeni mora da se izmerat referentni vrednosti za IgG na pove}e primeroci na serum od zdravi lica i tie da se sporedat so nivoata na IgG na bolnite. Ne postoi grani~na vrednost za specifi~ni IgG protivtela, bidej}i tie se obele`uva~i za izlo`enost na protigen i ne se direktno povrzani so bolest. Rezultatite variraat za eden protivgen i pome|u razli~ni protivgeni. Geografskite razliki se isto taka va`ni. 16.4.5. UniCap glijadin IgG [to meri UniCap glijadin IgG? UniCap glijadin IgG meri specifi~ni IgG protivtela protiv glijadin vo ~ove~ki serum i plazma. Glijadin e frakcija na glutenot rastvorliva vo alkohol, a koja se sretnuva vo p~enica, ja~men, r` i oves. Koja e klini~kata korist od ovoj test? Nepodnesuvawe na glijadin mo`e da dovede do celijakija, koja e enteropatija so osetlivost na hrana {to trae cel `ivot, a se karakterizira so o{tetuvawa na sluznicata na tenkoto crevo po zemawe na hrana. Mereweto na IgA i IgG kon glijadin e prviot ~ekor vo ispituvaweto na pacientite suspektni za celijakija i vo podobruvaweto na le~eweto na ovie pacienti. Ovoj test ovozmo`uva selektiven skrining na somnitelnite i rizi~nite grupi za celijakija. Kakvi vrednosti treba da se o~ekuvaat? Kaj 192 zdravi subjekta, na vozrast od 2-74 godini se poka`aa 95-ti percentil od 3.5 mg/L. 16.4.6. UniCap eozinofilen katjonski protein (EKP) [to meri UniCap EKP? UniCap EKP go meri nivoto na eozinofilni katjonski proteini (EKP) vo serum. EKP e silno citotoksi~en protein koj go ima vo eozinofilnite granuli. Eozinofilite se kletki, glavno odgovorni za predizvikuvaweto vospalenie karakteristi~no za astma. Koga eozinofilite vo di{nite pati{ta se aktiviraat , tie se obezzrnuvaat (degranuliraat) i predizvikuvaat o{tetuvawe i odlupuvawe na di{niot epitel. Ova mo`e da ja zgolemi preosetlivosta i da dovede do hroni~na vospalitelna bolest na di{nite pati{ta. EKP se osloboduva od aktiviranite eozinofili za vreme na vospalitelniot proces. Koja e klini~kata korist od ovoj test? Astmati~nite pacienti so eozinofilsko vospalenie imaat zgolemeni 180 Institut za imunobiologija i humana genetika 16. TIP 1 PREOSETLIVOST nivoa na EKP vo serum i drugi telesni te~nosti kako bronhijalen i alveolaren sekret i plunka. Koli~inata na EKP vo serumot e objektivna merka za eozinofilskiot vospalitelen status kaj astmata. Visoko nivo na EKP uka`uva na vospalenie, {to e rizik faktor za astma. Mereweto na EKP vo serum mo`e da se koristi: - za sledewe na vospalenieto kaj astma; - za vodewe na le~eweto so kortikosteroidi kaj astma; Kakvi vrednosti treba da se o~ekuvaat? Kaj normalni vozrasni se izmereni vrednosti so geometriska sredina od 4.4 mkg/L i 95-ti percentil od 11.3mkg/L. Vrednosti nad 15 mkg/L treba da se smetaat za zgolemeni. Sepak, pacientite treba da bidat svoja kontrola vo sledeweto na lekuvaweto. 16.4.7. UniCap triptaza [to meri UniCap triptaza? UniCap triptaza meri nivo na triptaza oslobodena od mastocitite vo serum. Mastocitite imaat klu~na uloga vo alergiskite reakcii i nivniot broj se zgolemuva vo uslovi na vospalenie. Koga se aktivirani, tie osloboduvaat razli~ni medijatori koi vodat do simptomi na alergiski reakcii, kako anafilaksa. Ovie medijatori vklu~uvaat triptaza i histamin. Koja e klini~kata korist od testot? Triptazata se osloboduva vo cirkulacijata otkako kaj pacientot se slu~i anafilakti~ka reakcija predizvikana od lekovi, otrovi od insekti i hrana. Ova zgolemuvawe na koli~inata na triptaza mo`e da pomogne vo ispituvaweto stepenot na reakcijata. UniCap triptaza mereweto na primeroci od serum od zdravi individui i primeroci od serum od pacienti so anafilaksa, poka`a jasno razdeluvawe na dve grupi. Zgolemeni nivoa na triptaza uka`uvaat na: - anafilaksa {to se dol`i na lekovi, ubod od insekti ili hrana; - mastocitoza. Nivoto (ili koncentracijata) na triptaza se zgolemuva i vo nazalnite te~nosti kaj: - aktiven alergiski rinitis; - izlo`uvawe na alergen kaj pacienti so alergiski rinitis. Kakvi vrednosti treba da se o~ekuvaat? Kaj normalni lica na vozrast od 2-74 godini se izmereni vrednosti so geometriska sredina od 5.6 mkg/L i 95-ti percentil od 13.5 mkg/L. Zgolemeno nivo na triptaza obi~no mo`e da se izmeri vo vreme 3-6 ~asa po anafilakti~ka reakcija. Toa se vra}a na normala 12-14 ~asa po osloboduvaweto. Institut za imunobiologija i humana genetika 181 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Primerocite e najdobro da se sobiraat pome|u 15 minuti i 3 ~asa po nastanot za koj se misli deka }e predizvika aktivacija na mastocitite. 16.5. Zada~i 16.5.1. Odredi vkupen i specifi~en IgE vo serum UniKap (UniCap) e avtomatiziran laboratoriski sistem koj od primerok na krv obezbeduva kvantitativni rezultati za koncentracijata na specifi~ni i vkupni IgE Slika 16.2: UniKap-100 (UniCap-100) avtomatiziran laboratoriski sistem na Institutot za imunobiologija i humana genetika, Medicinski fakultet, Skopje. protivtela. Kvalitetnata informacija dobiena na ovoj na~in pomaga vo dijagnosticiraweto i donesuvaweto na odluki vo lekuvaweto na alergiskite bolesti (Slika 16.2). Slika 16.3: Po~etniot ekran za vklu~uvawe na aparatot UniKap-100 (UniCap-100). 182 Institut za imunobiologija i humana genetika 16. TIP 1 PREOSETLIVOST Prvo se vklu~uva kompjuterot, a vedna{ potoa aparatot. So dvojno kliknuvawe na ikonata ImmnunoCAP Information Data Manager se vleguva vo programata (softver) preku koja se povrzani aparatot i kompjuterot. Otkoga }e se vklu~i progarmata na ekranot so slika se prika`ani dvata aparata (UniCap 100 i UniCap 101), a pod niv na dolniot del se gledaat ikoni preku koi se kontrolira rabotata. Vedna{ pod slikata na aparatot mo`e da se vidi dali aparatot e vklu~en (vo toj slu~aj ima `olto svetlo i pi{uva “free”-slobodno), isklu~en (crveno svetlo i pi{uva “off-line”) ili ako raboti imame zeleno svetlo i pi{uva “assay” (Slika 16.3). Koga }e vidime deka aparatot ja postignal potrebnata temperatura i se povrzal so kompjuterot (toa se gleda so `olta boja na ekranot ili na ekranot od samiot aparat pi{uva: prepare run? (podgotvi se za rabota)), kliknuvame edna{ na ikonata na dolniot del od ekranot na koja pi{uva “reqest” (barawe) ili pritiskame Slika 16.4: Ekranot za vnesuvawe primeroci na aparatot UniKap-100 (UniCap-100). F2. Toga{, ni se prika`uvaat site pacienti koi dotoga{ se izraboteni. Od desnata strana na ekranot ima 3 ikoni preku koi se vnesuvaat novi pacienti (ikonata so oznaka “new”), se otvaraat ve}e izrabotenite (ikona – “open“) ili se bri{at nekoi podatoci (ikona – “delete” ) (Slika 16.4). Pod niv ima naredbi so ~ie selektirawe mo`e da se vidat site izraboteni pacienti, onie koi ne se po~nati da se rabotat, onie koi vo momentot se rabotat i podatocite ili rezultatite koi sme go odobrile ili odbile. So klik na prvata ikona (“new”) vleguvame vo programata kade{to se vnesuva laboratoriskiot broj na pacientot i kade{to se biraat analizite koi treba da se izrabotat. Vo kvadrat~eto so oznaka “Sample Id” se vnesuva laborato-riskiot broj na pacientot i se pritiska “enter”. Sega od stranata ni se aktiviraat dve ikoni od koi vo prvata gi ima site testovi koi se rabotat so ovoj aparat,a vo vtorata se testovi koi se rabotat spored dijagnozata na pacientot i tie se narekuvaat paneli. So klik na prvata ikona "add test" se poka`uva tabela koja e podelena na dva dela i od levata strana se Institut za imunobiologija i humana genetika 183 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Slika 16.5: Ekranot za vnesuvawe alergeni (paneli) na aparatot UniKap-100 (UniCap-100). metodite koi se rabotat na ovoj aparat. Metodot se bira so negovo ozna~uvawe i pritiskawe na “enter”. Na desnata strana se nao|aat specifi~nite alergeni koi se biraat na ist na~in. Potoa se zatvora tabelata i se kliknuva na ikonata “save” za da se zapametat baranite podatoci. Na ovoj na~in se vnesuvaat site pacienti (Slika 16.5). Po vnesuvaweto na pacientite i nivnite analizi se vra}ame so pritiskawe na ikona na koja {to pi{uva “back” na po~etnata strana (stranata na koja {to ima slika od aparatite). Potoa kliknuvame dva pati na aparatot koj {to sakame da go pu{time. Ni se otvaraat dve tabeli. Na levata strana gi gledame site metodi koi se rabotat so ovoj aparat i so kliknuvawe na praznite kvadrat~iwa se biraat metodite koi planirame da gi rabotime (Slika 16.6). So samoto birawe na metodot na desnata strana ni se prika`uvaat site laboratoriski broevi na vnesenite neizraboteni pacienti koi gi sodr`at baranite analizi. Otkoga }e go odbereme metodot i }e ni se poka`at na ekranot pacientite koi treba da se rabotat po~nuvame so Slika 16.6: Ekranot za izbor na metodite koi sakame da gi rabotime na aparatot UniKap-100 (UniCap-100). 184 Institut za imunobiologija i humana genetika 16. TIP 1 PREOSETLIVOST Slika 16.7: Ekranot za izbor na pacientite koi sakame da gi rabotime na aparatot UniKap-100 (UniCap-100). nivno selektirawe na ist na~in odnosno so kliknuvawe na kockite pred laboratoriskiot broj. Na dolniot del od stranata od levo se gledaat podatocite za kalibraciite, a od desnata strana se gleda kolku prazni mesta ima ostanato vo aparatot. Vkupniot broj na alergeni koi mo`e da se izrabotat so edno vklu~uvawe na aparatot e 44 (Slika 16.7). Otkoga }e se napolni aparatot, odnosno }e se vnesat site pacienti i brojot na analizi }e dostigne 44 se kliknuva na ikonata ozna~ena so "send" so{to zapo~nuva prefrluvaweto na podatocite od kompjuterot vo aparatot. Aparatot {tom }e gi dobie podatocite ni dava lista na raspredelba (distribution list) od koja mo`e da se vidi pozicijata na sekoj serum, reagens i alergen (Slika 16.8). Otkoga }e se prefrlat podatocite za analizite koi }e se rabotat treba da se podgotvi aparatot za rabota. Aparatot e sostaven od dva nosa~a. Prviot nadvore{niot se vika nosa~ na primeroci, a vtoriot ili vnatre{niot e nosa~ot na koj se redat alergenite. Od stranata na aparatot ima tri kanti~ki koi se ozna~eni so razli~na boja (plava, Slika 16.8: Lista na raspredelba (Distribution list) e na aparatot Uni-Kap100 (UniCap-100). Institut za imunobiologija i humana genetika 185 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM zelena i `olta). Vo plavata kanti~ka stoi "wash solution" (rastvor za perewe). Ovoj rastvor se prigotvuva od specifi~en koncentrat koj se rastvara vo 1000 mL destilirana voda. Ovaa kanti~ka mora da bide napolneta do vrvot pred da se zapo~ne so rabota. Vo zelenata kanti~ka ima "rinse solution" (rastvor za plaknewe), a toa e destilirana voda koja mora da ja napolnime pred da zapo~neme. Na `oltata kanti~ka ima oznaka "waste" (otpadok) i ovaa kanti~ka ostanuva prazna za da mo`e aparatot vo tekot na rabotata da gi isfrla te~nostite vo nea (Slika 16.9gore). Slika 16.9: Strani~en pogled (gore) i mestata za vnesuvawe primeroci od serum, hemikalii i top~enca (dolu) na aparatot Uni-Kap100 (Uni-Cap-100). Tabela 16.3: Vnesuvawe rezultati od UniCap-100. Site stapki od ponatamo{niot proces se avtomatizirani i od ekranot na samiot aparat ~itame {to treba da se napravi. Prvo ne pra{uva dali gore opi{anite kanti~ki se polni i pravilno rasporedeni. Odgovorot se vr{i so pritiskawe na kop~iwata "yes" i "no" na tastaturata od samiot aparat. Potoa se vnesuvaat serumite na pacientite (ima to~no opredelena pozicija za sekoj serum, a taa mo`e da se vidi i od listata na raspredelba). Otkoga }e se vnesat serumite se stavaat vedna{ do niv kontrolite na kalibracionite krivi (po dve kontroli za sekoja kriva) i tie se so oznaka sKK-1 i sKK-2 za specifi~nite IgE protivtela i vKK-1 i vKK-2 za vkupnite IgE protivtela. Potoa se vnesuvaat reagensi koi ni se potrebni: Kowugat za specifi~en IgE, koj stoi sekoga{ na pozicija A na nadvore{niot nosa~, a kowugatot za vkupen IgE stoi na pozicija B. Pri stavaweto na kowugatite aparatot bara da se vnese specifi~niot kod od kalibracijata za toj mesec. Se vnesuva razvoen rastvor (development solution) na pozicija E i zapira~ki rastvor (stop solution ) na pozicija H. Otkoga }e gi vneseme serumite i reagensite aparatot zapo~nuva so edna slepa proba koja{to trae 2 min, pri{to toj gi proveruva kanti~kite i dali se e staveno na pravilnoto mesto. Potoa od ekranot mo`e da vidime koj alergen treba da se vnese. Alergenite se redat na vnatre{niot nosa~ (Slika 16.9 dolu). Vo ovoj sistem alergenite se fiksirani na kuglici koi se naredeni vo penkala. Od nadvor se postavuva penkaloto, a aparatot sam gi zema i gi redi na to~no opredelenata pozicija. Dobienite rezultati se vnuvaat vo formular pogoden za taa namena (Tabela 16.3). Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod) Data Student (ime i prezime) Asistent (potpis i pe~at) ______________ ____________________________ __________________________ 186 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 17: TIP 2 TIP 3 PREOSETLIVOST VE@BA 17: TIP 2 I TIP 3 PREOSETLIVOST 17.1. Aglutinacija Aglutinacijata pretstavuva specifi~no fiksirawe na specifi~ni protivtela za opredeleni protivgenski epitopi koi se nao|aat na povr{inata na nekoi humani kletki, bakterii ili virusi, pri {to doa|a do nivno me|usebno slepuvawe i grupirawe. Ovie grupi na kletki se narekuvaat aglutinati, protivtelata (antitelata) koi u~estvuvaat vo ovoj proces se narekuvaat aglutinini; protivgenite se imenuvani kako aglutinogeni, a reakcijata kako aglutinacija. Ovaa reakcija najmnogu se koristi vo krvnogrupnata imunohematologija, kade pretstavuva osnoven test, pa kako takva, niz reagiraweto na eritrocitnite protivgeni i protivtela, }e bide pretstavena. U~esnici vo reakcijata se protivgeni i protivtela. Protivgenite se nao|aat na kleto~nata membrana i se osnoven faktor vo reakcijata, predizvikuvaat sozdavawe protivtela i pretstavuvaat specifi~ni receptori vo procesot na fiksacija na protivtelata (slika 17.1). Celosno protiv H protivtelo Test eritrociti so H protivgen reakcija protivgen-protivtelo = aglutinacija Institut za imunobiologija i humana genetika Slika 17.1: [ematski prikaz na aglutinacija na erotrocitite. 187 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Pritoa, va`na e nivnata gustina na kleto~nata membrana (kvantitativno prisustvo), kako i polo`bata vo membranata. Taka na pr., protivgenot A od krvnogrupniot sistem AVO, ima 1.000.000 mesta na eritrocitnata membrana i za dobivawe reakcija potrebna e 2% eritrocitna suspenzija, a za D protivgenot od Rh sistemot potrebna e 40%, bidej}i toj e prisuten so 10-30.000 mesta na membranata. Ili pak, protivgenot A prominira nad membranata i protivtelata lesno se fiksiraat za nego, dodeka D protivgenot e postaven podlaboko vo membranata i neophodno e nejzino enzimsko tretirawe za da se ovozmo`i kontakt so protivtelata. Protivtelata glavno se od IgM klasa, no mo`e da bidat i od IgG klasa. Spored na~inot na postanuvawe mo`e da bidat prirodni i imuni, pri {to prirodnite se od IgM, a imunite pred s#, se od IgG klasa. Prirodnite protivtela gi dobivame po ra|awe vo tek na prvite 6 meseci, a imunite kako odgovor na alo ili druga imunizacija (iako vo princip site protivtela se imuni). Za da se dobie aglutinacija, neophodno e adekvatno kvantitativno prisustvo na protivtelata. Taka na pr., dovolni se 25 molekuli protiv A aglutinini od IgM klasa, dodeka za protiv D aglutininite, koi se od IgG klasata, se potrebni 20.000 molekuli. Za da se odviva reakcijata, potrebno e da se ispolnat i drugi uslovi kakvi {to se: temperatura, pH, jonski sili, inkubacija, prome{uvawe i centrifugirawe. - postojat optimalni temperaturni granici vo koi najdobro se fiksiraat protivtelata za protivgenite i odvivaweto na aglutinacijata e pogodno. Nekoi reakcii se odvivaat najdobro na 4oC ili na sobna temperatura od 18oC do 22oC, toa se studeni protivtela (kako na pr. od AVO sistemot); odnosno na 37oC t.n. topli protivtela (kako {to se na pr. od Rh sistemot). - Za aglutinacija pogoden pH e od 6.9 do 7.2. Dokolku pH e nad 8 ili pod 6, neophodno e da se puferira za{to evidentno ja namaluva senzibilnosta na reakcijata. - Namaluvaweto na jonskite sili doveduva do zgolemuvawe na fiksacijata na protivtelata za epitopite i do la`ni reakcii, odnosno do avtoaglutinacija. Zatoa, neophodno e reakcijata da se izvr{uva vo solena sredina i so precizno opredelena koncentracija na eritrocitite kako protivgenski supstrat. - Kaj prirodnite aglutinini reakcijata e brza i ~esto nema potreba od inkubacionen period. No, kaj iregularnite inkompletni protivtela, taa e potrebna i se odviva vo vremenski interval od 15 do 60 min zavisno od uslovite {to gi baraat soodvetnite epitopi i nivnite specifi~ni protivtela. - ^estopati e potrebno prome{uvawe i centrifugirawe 1 do 2 min na 500 g za da se podobri fiksacijata na protivtelata. 188 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 17: TIP 2 TIP 3 PREOSETLIVOST 17.1.1. Objasnuvawe mehanizmot na aglutinacija Pove}e teorii go objasnuvaat ovoj mehanizam. Teorijata na Marrak objasnuva deka protivtelata povrzuvaj}i gi me|usebno eritrocitite formiraat mostovi i tridimenzionalna slika na aglutinirawe na ovie kletki. Teorijata na Bordet zboruva deka me|u kletkite postojat sili na kohezija i repulzija koi gi odr`uvaat razdvoeni, no koga pod dejstvo na protivtelata tie }e se naru{at, toga{ nastapuva aglutinacija. Me|utoa, najprifatlivo e objasnuvaweto na Pollack koj govori za postoeweto na zeta potencijal okolu eritrocitite. Vsu{nost, zeta potencijalot pretstavuva razlika me|u potencijalot na katjonskiot prsten okolu eritrocitot i jonskiot naboj na okolinata (Slika 17.2). Normalna vrednost za zeta potencijalot e -16 mV, a ako padne pod-7 mV }e se javi la`na aglutinacija. Aglutinacijata ne e mo`na nad -23 mV . Aglutininite od IgM klasa najdobro reagiraat na -18 do -23 mV, a IgG od 8 do -10 mV. eritrocit gusto smesteni katjoni okolu eritrocitot Z potencijal Slika 17.2: Eritrocit vo neutralna sredina obikolen so katjonski prsten. Aglutinacijata mo`e da bide direktna koga aglutininite od serumot deluvaat direktno vrz epitopite od eritrocitnata membrana ili arteficielna koga se potrebni dodatni reagensi za promena na zeta potencijalot (proteoliti~ki enzimi-tripsin, papin, bromelin; makromolekularni supstancii - albumin, plazmagel, dekstran, fikol; protivglobulinski serum) za da se ovozmo`i fiksirawe na protivtelata za protivgenite. Inaku, treba da se istakne deka aglutinacijata e reverzibilen proces. Pri promena na uslovite, na pr. temperaturata (so 10 min zagrevawe na 56oC se razdvojuvaat aglutinatite, se defiksiraat protivtelata od protivgenite,odnosno se eluiraat - proces na elucija) se dobiva sostojba ista kako pred po~etokot na reakcijata. 17.2. Direkten protivglobulinski test (DPT) Direktniot protivglobulinski test ni slu`i za otkrivawe protivtela koi se vrzani za kletkite, no koi ne mo`at da izvr{at nivna aglutinacija (nekompletni protivtela). Protivhumaniot globulin (protivglobulinski serum) gi aglutinira eritrocitite koi se oblo`eni so soodvetnite globulini. Vo zavisnost od specifi~nosta na protivglobulinskiot serum, mo`e ponatamu da se doka`uva i specifi~nosta na ovie globulini (na pr. dali se protiv IgG, protiv IgM, protiv IgA, protiv C3d ili protiv C3c protivtela). Aktivacijata na komplementot in vitro, od strana na prisutnite ladni avtoantitela, se spre~uva so upotrebata na EDTA ili natrium citrat. So pove}ekratno Institut za imunobiologija i humana genetika 189 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM miewe na eritrocitite se otstranuvaat rasvorlivite ili nespecifi~no vrzanite globulini za niv. Na toj na~in se ovozmo`uva otkrivawe na imunoglobulinite ili faktorite na komplementot koi se specifi~no vrzani za eritrocitite in vivo. 17.2.1. Zemawe primerok Krvta za direktniot protivglobulinski test najdobro e da se zeme so protivkoagulans EDTA (0.01M) za da mo`e da se inaktivira komplementot, so {to bi se spre~ila in vitro senzibilizacijata na eritrocitite so klini~ki nezna~ajni ladni protivtela (na pr. nekompletni ladni protivtela koi normalno gi ima vo krvta). Na toj na~in bi se spre~ilo dobivawe na la`no-pozitivni rezultati. Eritrocitite od primerokot krv zemen so EDTA ili citrat, najprvin se mijat 6 pati so fiziolo{ki rastvor ili so fosfaten pufer. Otkoga }e se isplaknat 6 pati, od niv se prigotvuva 2-3% suspenzija. Dokolku se dobie pozitiven rezultat so upotrebata na eritrociti koi se izdvoeni od koaguliran ili od primerok zemen so nekoj drug protivkoagulans, a koj {to primerok stoel na sobna temperatura ili vo fri`ider, toga{ DPT treba da se povtori so primerok zemen so EDTA. 17.2.2. Materijal Suspenzija na eritrociti od primerok na krv (2-3%), najmalku dva polispecifi~ni protivglobulinski serumi (koi sodr`at najmalku protiv-IgG i protiv-C3d), monospecifi~ni protivglobulinski serumi (najmalku dva, protiv IgG i protiv C3d), AB serum, epruvetki ili predmetni stakla, centrifuga, mikroskop i jak izvor na svetlo. 17.2.3. Metod Test za prosejuvawe (skrining test). Direktniot protivglobulinski test se izveduva so upotreba na najmalku dva polispecifi~ni protivglobulinski serumi. Vo Slika 17.3: Direkten protivglobulinski test. 190 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 17: TIP 2 TIP 3 PREOSETLIVOST obele`anite epruveti edna kapka (1 kapka odgovara na pribli`no 50 μL) od polispecifi~niot protivglobulinski serum se me{a so edna kapka od eritrocitnata suspenzija. Potoa epruvetkata se inkubira 15 minuti na sobna temperatura. Po inkubacijata, epruvetkata se centrifugira 15-30 sekundi na 1000 vvm (120g). Rezultatot se ~ita, so lesno protresuvawe na epruvetata, nasproti izvor na svetlina. Na~inot na koj talogot od eritrociti }e se resuspendira e presuden za rezultatot na testot. Epruvetata se nakosuva i vnimatelno se me{a. Potoa so lesni dvi`ewa napred-nazad se nabquduva sodr`inata na epruvetata nasproti izvor na svetlina (dali ima aglutinati) (Slika 17.3). Dokolku rezultatot e negativen se zema edna kapka od epruvetata i se nabquduva pod mikroskop. Vtoroto ~itawe se izveduva posle povtorno inkubirawe vo vremetraewe od 1 ~as na sobna temperatura i povtorno centrifugirawe na 1000 vvm (120g) 15-30 sekundi. Ova e neophodno bidej}i senzitivnosta na protivglobulinskiot test, osobeno za otkrivawe na C3, zna~itelno se zgolemuva so inkubacijata. Slika 17.4: Ja~ina na aglutinacija iska`ana vo vid na poeni. Ja~inata na aglutinacijata se iska`uva vo vid na poeni (Slika 17.4): 4+ prisustvo na eden soliden aglutinat, bez prisu-tni slobodni kletki 3+ nekolku golemi aglutinati i prisustvo na mal broj slobodni kletki 2+ prisustvo na sredno golemi agregati so slobodni kletki vo zadninata 1+ prisustvo na mali agregati na matno crvena zadnina + ne`ni agrgati na matno crvena zadina ili agre-gati vidlivi pod mikroskop 0 nema aglutinacija Diferencirawe. Najdobro e DPT prvin da se izvede so Institut za imunobiologija i humana genetika 191 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM polispecifi~en serum koj sodr`i protivtela so najmalnku dve specifi~nosti (protiv-IgG i protiv-C3). Dokolku se dobie pozitiven protivglobulinski test, ponatamu treba da se odredi tipot (specifi~nosta) na protivteloto ili protivtelata so upotrebata na monospecifi~ni protivglobulinski serumi. Kontroli. Vo princip, sekoga{ koga se raboti protivglobulinskiot test, istovremeno treba da se napravat i pozitivna, negativna i avto-kontrola. Kako pozitivna kontrola se koristat test kletki na koi ima vrzno protivtela (na pr. Coombs-ovi kontrolni kletki). Ovie kletki ili se me{aat so polispecifi~niot protivglobulinski serum i/ili protiv-IgG serumot so koj se izveduva protivglobulinskiot test ili se dodavaat vo epruvetite vo koi e dobien negativen DPT. Dokolku dojde do pojava na aglutinacija toa zna~i deka DPT e navistina negativen. Ako i po dodavaweto na senzibi-lizirani kletki ne dojde do pojava na aglutinacija, zna~i deka ili ima gr{ka vo procesot na rabota ili protiv-globulinskiot serum e so lo{ kvalitet. Najdobro e kako pozitivna kontrola da se koristat kletki oblo`eni so C3. Tie bi se dodavale vo epruvetite vo koi e dobien negativen DPT so upotreba na monospecifi~en protivglobulinski serum (koj sodr`i samo protiv-C3 protivtela). Pojavata na aglutinacija pri povtornoto centrifugirawe ni uka`uva na faktot deka ne do{lo do inhibicija na protivglobulinskiot serum so IgG i/ili C3 kako rezultat na nesoodvetnoto miewe na eritrocitite na pacientot. Kako negativna kontrola naj~esto se koristat test kletki koi ne se oblo`eni so protivtela. Vo slu~aj da ne raspolagame so vakvi test kletki, negativnata kontrola mo`e da se izvede i so dodavawe na 1% govedski serumski albumin ili rastvoruva~ za protivglobulinskiot serum na izmienite eritrociti od pacientot. Vo negativnata kontrola ne smee da dojde do pojava na aglutinacija. Avto-kontrolata se izveduva so me{awe na eritrocitite od pacientot so AB kontrolen serum. 17.2.4. Zabele{ki - So prodol`enata inkubacija mo`e zna~itelno da se zgolemi otkrivaweto na komponentite na komplementot koi se vrzani za eritrocitite. - Edno miewe na eritrocitite so normalen fiziolo{ki rastvor (vklu~uvaj}i i centrifugirawe na 2000 vvm za vreme od 2 minuti) posle vtoroto ~itawe mo`e da ja zasili reakcijata, so {to bi se spre~ila pojavata na prozon fenomenot. - Upotrebata na fosfaten pufer za plaknewe (pH 7.0), EDTA i govedski serumski albumin ja spre~uvaat 192 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 17: TIP 2 TIP 3 PREOSETLIVOST elucijata na labavo vrzanite protivtela, kako i nespecifi~noto aktivirawe na komplementot. - Podobro e testot da se izvr{uva vo epruveti otkolku na predmetni stakla, bidej}i predmetnite stakla nemo`at da se centrifugiraat. - Nesoodvetnoto plaknewe, kako i visokata koncentracija na imunoglobulini vo serumot na pacientot, mo`e nepovolno da vlijaat na testot. 17.2.5. Titar kaj antiglobulinskite testovi Za da mo`e da se sudi za ja~inata na aglutinacijata nastanata pome|u oblo`enite eritrociti i monospecifi~niot protivglobulinskiot serum, korisno e najprvin da se odredi negoviot titar. Odreduvaweto na titarot po`elno e da se napravi i na komercijalno dostapnite protiv-IgG i protiv-C3 monospecifi~ni protivglobulinski serumi. Otkoga }e se odredi titarot, sekoja od aglutinaciite koi }e se dobijat od razli~nite razreduvawa na monospecifi~niot protiv-globulinski serum }e ni poslu`i za sozdavawe skala na poeni, preku koja ponatamu }e se izrazuva ja~inata na aglutinacijata. So vakov na~in na izrazuvawe e ovozmo`ena mnogu poprecizna procenka na ja~inata na aglutinacijata, odkolku koga bi procenuvale samo vrz osnova na edno razreduvawe na protivglobulinskiot serum. No, so ogled na faktot deka izrabotkata na edna vakva skala e proizvolna i zavisi od protivglobulinskiot serum koj go upotrebuvame, nejzinata va`nost e ograni~ena samo na laboratorijata koja i ja izrabotila. Potrebni materijali: 2-5% suspenzija na eritrociti prigotveni od krv zemena od pacient, monospecifi~en Coombs-ov serum (protiv-IgG, protiv-C3c, protiv-C3d, protivtela kon lesnata veriga), epruveti, centrifuga, rastvor za miewe eritrociti (fiziolo{ki rastvor, fosfaten pufer), izvor na svetlo, mikroskop. Metod: 1. Se prigotvuva serija na dvojno razreduvawe na protivglobulinskiot serum vo fiziolo{ki rastvor. Se zemaat 12 epruveti i se obele`uvaat na sledniot na~in: NR (nerazreden), 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024, K (kontrola). Koli~inata na protivglobulinski serum koja }e ja stavime vo prvata epruveta zavisi od toa kolku ~esto se izveduva protivglobulinskiot test. Dokolku toj se izveduva mnogu ~esto, toga{ taa koli~ina mo`e da bide i 10 mL. Vo ostanatite epruveti, osven vo epruvetata obele`ana so K, se stavaat po 5 mL fiziolo{ki rastvor. Potoa polovina od sodr`inata od prvata epruveta se prefrla vo vtorata epruveta, od vtorata epruveta polovina od sodr`inata se prefrla vo tretata epruveta, od tretata Institut za imunobiologija i humana genetika 193 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Slika 17.5: Priprema na epruvetite za odreduvawe titarot na protivglobulinskiot serum . vo ~etvrtata, se do epruvetata obele`ana so 1:1024. Polovina od sodr`inata na epruvetata obele`ana so 1:1024 se frla. Vaka pripremenite epruveti se ~uvaat na +40C (Slika 17.5). 2. Se zemaat 11 novi epruveti i se obele`uvaat od NR do 1:512. Vo sekoja od niv se stava po edna kapka 2-5% eritrocitna suspenzija prigotvena od primerok zemen od pacient. Pozitiven rezultat retko se dobiva vo razreduvawata pogolemi od 1:512, no dokolku e toa potrebno mo`at da se prigotvat i razreduvawa pogolemi od 1:1024. 3. Epruvetite se mijat 4 pati so izotoni~en fiziolo{ki rastvor. Po poslednoto miewe epruvetite kompletno se dekantiraat za da na dnoto ostane samo talog od eritrociti. 4. Vo sekoja od epruvetite se dodava po 2 kapki od soodvetnite razreduvawa na protivglobulinskiot serum. 5. Epruvetite se me{aat i se centrifugiraat 1.000 do 1.500 vvv 15-20 sekundi. 6. Se nabquduva aglutinacijata na ist na~in kako i kaj direktniot protivglobulinski test. 7. Razli~nite ja~ini na aglutinacii koi se javuvaat vo epruvetite se obele`uvaat so poeni. Taka aglutinacijata 4+ odgovara na 10, 3+ odgovara na 8, 2+ odgovara na 6, 1+ na 4, + na 2, a 0 zna~i deka nema aglutinacija (Tabela 17.1). Tabela 17.1: Primer za titar na DAT. Razreduvawe nerazreden 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 Kontrola 194 Stepen na aglutinacija za protiv-IgG protiv-C3 4+ 4+ 4+ 3+ 4+ 3+ 3+ 2+ 2+ 1+ 1+ 0 0 0 0 0 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 17: TIP 2 TIP 3 PREOSETLIVOST 17.3. Indirekten protivglobulinski test Dodeka so direktniot protivglobulinski test mo`at da se otkrijat in vivo vrzanite globulini za eritrocitite so pomo{ na aglutinacijata so protivglobulinskiot serum, indirektniot protivglobulinski test ni slu`i za otkrivawe na protivtela koi slobodno cirkuliraat vo serumot i koi mo`at specifi~no da se vrzat za eritrocitite in vitro. Op{to ka`ano, polispecifi~niot protivglobulinski serum se upotrebuva za da se otkrijat in vitro vrzanite protivtela (IgG, IgM), bilo da se vrzani direktno za kletkite bilo preku nivnoto aktivirawe na komplementot. So upotrebata na regensi koi sodr`at protivtela so to~no opredelena specifi~nost, na primer test serumi, indirektniot protivglobulinski test ni ovozmo`uva i specifi~no i senzitivno testirawe na protivgenite. 17.3.1. Potrebni materijali Ispituvan serum, polispecifi~en Coombs-ov serum (protiv-IgG, protiv-C3c, protic-C3d, protivtela kon lesnata veriga), centrifuga, rastvor za miewe eritrociti (fiziolo{ki rastvor, fosfaten pufer), Coombs-ovi kontrolni kletki, O test eritrociti, epruveti. 17.3.2. Metod Vo obele`ena epruveta se kapnuvaat 2-4 kapki od serumot na pacientot (vo koj se ispituva dali postojat slobodni protivtela) i 1-2 kapki od prethodno pripremenite test O eritrociti (3-5% suspenzija napravena so me{awe 7 O Rh+ i 3 O Rh- primeroci na krv od zdravi krvodariteli, pereni 6 pati so fiziolo{ki rastvor ili fosfaten pufer). Po inkubacijata od 45 minuti na 37oC eritrocitite se perat 3 pati so fiziolo{ki rastvor ili fosfaten pufer. Se mijat na toj na~in {to najprvin se dodava 3 mL od fiziolo{kiot rastvor ili fosfatniot pufer, potoa vnimatelno se resuspendiraat i na krajot se centrifugiraat na 1500-2000 vvm vo tek na 1 minuta. Po sekoe centrifugirawe supernatanot kompletno se otstranuva so aspiracija ili so dekantirawe. Po tretoto plaknewe vo epruvetkata se dodavaat 1-2 kapki od protivglobulinskiot serum i se centrifugira 15-30 sekundi na 1000 vvm. Rezultatot vnimatelno se ~ita nasproti izvor na svetlina (Slika 13). Dokolku testot e negativen se zema edna kapka i se Institut za imunobiologija i humana genetika 195 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM nabquduva pod mikroskop. Potoa se izveduva pozitivna kontrola so upotreba na Coombs-ovi test kletki. Dokolku se dodade 1 kapka na silno oblo`eni eritrociti (na nivnata povr{ina ima vrzano ogromen broj na IgG i C3d) toga{ testot treba da stane pozitiven (da se pojavi vidliva aglutinacija) vo rok od 5 minuti bez centrifugirawe. Dokolku se upotrebat slabo oblo`eni kletki (za svojata povr{ina imaat vrzano ne tolku golem broj na IgG i C3d) toga{ e potrebno epruvetata da se centrifugira 15 sekundi na 1000 vvm. I kaj indirektniot protivglobulinski test, kako i kaj direktniot, paralelno se izveduvaat i negativna i avtokontrola. 17.3.3. Zabele{ki Faktori koi mo`at pozitivno da vlijaat na testot: optimalna temperatura na sredinata, optimalna pH (glavno pome|u 6.50-7.0), golem broj na protivgeni na edna kletka (visoka gustina na protivgenot), pomal broj na kletki, pogolema koli~ina na serum i/ili pogolema koncentracija na protivtela, vnimatelno i potpolno me{awe na epruvetkite vo koi se izveduva testot. Faktori koi mo`at negativno da vlijaat na testot: raspadnat protivgen, stari test kletki, prekratko ili predolgo vreme na inkubacija (optimalno pome|u 30-60 minuti), Testirawe na protivtela: Voobi~aeno soodnosot pome|u suspenzijata na eritrociti i serumot treba da bide 1:2-3 (vi{ok na protivtela) a vremeto na inkubacija treba da e podolgo i da se dvi`i pome|u 30 i 120 minuti. IgM i slabo vrzanite komplement aktivira~ki protivtela so indirektniot protivglobulinski test se otkrivaat glavno preku otkrivawe na komplementot (IgM i preku protiv-telata kon lesnata veriga). Poradi toa poprepora~livo e, barem koga se bara prisustvo na protivtela kaj pacienti, da se upotrebuva serum namesto plazma. 17.4. Opredeluvawe cirkulira~ki imuni kompleksi so precipitacija so polietilenglikol Ova e najednostaven i lesno primenliv metod koj vo su{tina pretstavuva dodavawe 4.166% rastvor na polietilen glikol (PEG) vo serumskata proba koja sodr`i imuni kompleksi i doveduva do zgolemuvawe na opti~kata gustina nad nekoja grani~na vrednost (Slika 17.6). Potreben e sled196 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 17: TIP 2 TIP 3 PREOSETLIVOST Test serum Dodadi PEG vo test serumot za da se sozdade talog PEG Supernatantot sodr`i slobodni IgG Talogot sodr`i IgG kompleksi, se plaknat vo PEG, se rastvoraat i se merat Slika 17.6: Vo serumot {to sodr`i kompleksi od IgG i IgG monomer se dodava PEG za da se dobie krajna koncentracija od 2% PEG. Pri ovaa koncentracija kompleksite selektivno se talo`at, a supernatantot sodr`i slobodni protivtela. Epruvetkata se centrifugira i kompleksite pa|aat na dnoto. Slobodnite protivtela se otstranuvaat so plaknewe, a talogot se rastvora i kompleksnite IgG se merat kvantitativno so nefelometrija. niov materijal i oprema: H3BO4, Na2B4O7 * 10 H2O, PEG so molekulska masa 6.000, (NH4)SO4, BaCl2, spektrofotometar, lateks za opredeluvawe revmatoiden faktor, 0.1 mol/L boraten pufer pH 8.4 (rastvor A 1.24% H3BO4 vo destilirana voda, rastvor B 1.9% Na2B4O7 * 10 H2O vo destilirana voda. Se me{aat 55 mL od rastvor A, 45 mL rastvor B i 100 mL destilirana voda, pH 8.4), rastvor na PEG (se rastvoraat 10 g PEG vo 240 mL boraten pufer), razreduvawa od lateks (od osnovnoto razreduvawe 1:40 vo boraten pufer, se pravat razreduvawa 1:640 i 1:1280), rastvori za standardno ot~ituvawe apsorbcija na 450 nm (1. se me{aat 2 mL 0.025 mol/L (NH4)SO4 i 0.01 mL 0.025 mol/L BaCl2 - ot~itanata ekstincija * 1.000 = 12.4 = 1.8; 2. se me{aat 2 mL 0.025 mol/L (NH4)2SO4 so 0.02 mL 0.025 mol/L BaCl2 - ot~itanata ekstincija * 1.000 = 23.8 = 4.7; 3. se me{aat 2 mL 0.025 mol/L (NH4)2SO4 so 0.03 mL 0.025 mol/L BaCl2 - ot~itanata ekstincija * 1.000 = 35.4 = 5.5). Izveduvawe na testot: Se zemaat 0.3 mL od ispituvaniot serum i se me{aat so 0.6 mL boraten pufer. Vo dve epruvetki se sme{uvaat po 2 mL rastvor na PEG i po 0.22 mL od razreduvaweto na ispitaniot serum. Se prigotvuva "slepa proba" so me{awe 2 mL boraten pufer i 0.22 od razredeniot serum. Epruvetkite dobro se me{aat i se ostavaat na sobna temperatura eden ~as. Se meri apsorpcijata na dvete epruvetki na 450 nm na-sproti "slepata proba". Prika`uvawe i tolkuvawe na rezultatite: Se presmetuva srednata aritmeti~ka golemina od apsorbancijata na dvete epruvetki i se mno`i so 1.000 za da se dobie rezultat izrazen vo me|unarodni edinici (ME). Normalna vrednost za lu|e iznesuva 12.1 - 7.4 ME. Spektrofotometarot se proveruva so pomo{ na prigotvenite standardni rastvori. Institut za imunobiologija i humana genetika 197 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Treba da se dobijat ve}e prika`anite vrednosti. Pogruba proverka mo`e da se napravi so lateksni probi (so razreduvaweto 1:640 treba da se dobijat pozitivni vrednosti, a so razreduvaweto 1:1280 da se dobijat negativni). Nedostatok na metodot e {to ne se talo`at imunite kompleksi so mala golemina. Pogoden e metodot koj koristi konsumacija na S1q komponentata na komplementot. So pomo{ na enzim ili izotop, se markira S1q koj potoa od imunite kompleksi e iskoristen. Koli~inata na konsumiraniot S1q (se meri vo serumot pred i po reakcijata) pretstavuva vrednost za imunite kompleksi. 17.5. Zada~a 1. Da se napravi direkten i indirekten protivglobulinski test. 2. Da se presmeta titarot na dadenite protivglobulinski serumi i da se vnese vo dadenata Tabela 17.2. Tabela 17.2: Formular za vnesuvawe rezultati od titar na protivglobulinski serum. Razreduvawe Primer Slu~aj Stepen na aglutinacija za Stepen na aglutinacija za protiv-IgG protiv-C3 Ja~ina Poeni Ja~ina Poeni nerazreden 4+ 10 4+ 10 1:2 4+ 10 3+ 8 1:4 4+ 10 3+ 8 1:8 3+ 8 2+ 6 1:16 2+ 6 1+ 4 1:32 1+ 4 0 0 1:64 0 0 0 0 Kontrola 0 0 0 0 Vkupno 68 protiv-IgG Ja~ina Poeni protiv-C3 Ja~ina Poeni 36 Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod) Data Student (ime i prezime) Asistent (potpis i pe~at) ______________ ____________________________ __________________________ 198 Institut za imunobiologija i humana genetika 18. ANALIZA NA PREOSETLIVOST VE@BA 18: ANALIZA NA PREOSETLIVOST 18.1. Normalni vrednosti za vkupen i za specifi~en IgE Koncentracijata na vkupniot IgE vo serum e povrzana so vozrasta. Na okolu 10 godini, vkupniot IgE dostignuva vrednosti koi se odr`uvaat ponatamu. Kako normalni vrednosti za vkupniot IgE se definiraat gornite granici bidej}i postoi asimetri~na distribucija na dobienite vrednosti. Gornata granica se presmetuva kako geometriska sredna golemina + 1.96 standardni devijacii (SD). Preporaka e sekoja laboratorija da ima sopstveni o~ekuvani vrednosti (Tabela 18.1). Zdravite individui imaat mnogu niski nivoa na specifi~ni IgE vo krvta, normalno pod 0.35 kEA/L (kilo edinici specifi~en alergen vo eden litar). Senzibiliziranite pacienti poka`uvaat zgolemeni nivoa, nad 0.35 kEA/L. UniCap specifi~nite IgE otkrivaat IgE protivtela vo interval 0.35-100 kEA/L. Rezultatot se izrazuva kvantitativno, kako nivo ili kako klasa specifi~en IgE (Tabela 18.2) . 18.2. Klini~ki simptomi za alergija i nivno dijagnosticirawe Alergenot kaj atopi~no lice mo`e da predizvika momentna reakcija so egzem, rinit, konjuktivit, bronhokostrikcija, povra}awe i prolivi, a vo retki slu~ai i anafilaksa. Simptomite mo`at da bidat ednostavni, kako {to se zacrveneti o~i ili komplicirani, kako {to e astma, rinit Institut za imunobiologija i humana genetika Tabela 18.1: Normalni vrednosti na vkupen IgE opredelen so UniCap. Geometriska sredna vrednost (kE IgE/L) Gorna granica + 1.96 SD (kE IgE/L) 0.6 4.5 3 1.0 8.0 6 1.8 14.3 9 2.6 19.6 12 3.2 25.5 2 5.7 45.1 3 8.0 62.7 4 10.0 78.4 5 12.0 94.1 6 14.0 109.8 7 16.0 123.5 8 18.0 139.2 9 20.0 152.9 10 i pove}e 22.0 166.7 Vozrast Nedeli 6 Meseci Godini 199 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Tabela 18.2: Tolkuvawe na rezul-tatite od specifi~en IgE spored koli~ina (vo kEA/ L), nivo i klasi na specifi~en IgE. Kvantitativni rezultati (kEA/L) Nivo na alergen specifi~ni protivtela Polukvantitativni rezultati (Klasi na specifi~en IgE) pod 0.35 Otsutno ili nemerlivo 0 0.35 do 0.7 Nisko 1 0.7 do 3.5 Sredno 2 3.5 do 17.5 Visoko 3 17.5 do 50.0 Mnogu visoko 4 50.0 do 100.0 Mnogu visoko 5 nad 100.0 Mnogu visoko 6 i urtikarija. Tie mo`at da bidat lesni ili te{ki. Hroni~nite reakcii mo`at da se vidat kako ko`ni reakcii (egzem), a vo bronhijalnata astma prisutnoto vospalenie na belodrobnoto tkivo mo`e da dovede do astmati~ni napadi posle dopir so alergenot. Manifestaciite na atopiskite zaboluvawa zna~ajno variraat so vozrasta i vklu~enite alergeni. Vo detstvoto naj~esti se alergii kon hrana, osobeno jajca i mleko. Posle tretata godina dominantni alergeni se di{nite alergeni. Razvojot na alergiite vo razli~na vozrast mo`e da se opi{e kako alergiski mar{. Toa zna~i deka, naj~esto postoi nasoka na razvoj na atopiite od novorodenoto pa se do starosta (Slika 18.1). Alergiskite reakcii na razli~ni organi se javuvaat so razli~ni simptomi (Tabela 18.3). Tie mo`at da bidat lokalni na ko`ata, o~ite, nosot, ustata, di{niot sistem ili gastrointestinalniot sistem (atopii) ili sistemski (anafilaksija) Slika 18.1: Alergiski mar{ od ra|awe do starost. 200 Institut za imunobiologija i humana genetika 18. ANALIZA NA PREOSETLIVOST Ko`a Atopiski dermatit, urtikaria O~i/nos Rinokonjuktivit Usta Oralen alergiski sindrom (OAS) Di{en sistem Svire`i vo detstvoto, astma Gastrointestinalno Prolivi, povra}awe,koliki Sistemski Anafilaksija Tabela 18.3: Klini~ki simptomi za alergiski reakcii spored razli~ni lokalizacii. Ispituvawata na specifi~niot IgE mo`at da se izveduvaat ♦ oddelno za sekoj somnitelen alergen; ♦ so komplet alergeni za opredeleno zaboluvawe; ili ♦ spored dijagnoza. 18.2.1. Oddelno ispituvawe alergeni Vo prirodata postoi ogromen broj alergeni. Za pogolemiot broj od niv lu|eto razvivaat alergii, no za samo mal del od alergenite postojat laboratoriski metodi za nivno ispituvawe. Denes postoi tehnologija za ispituvawe okolu 1000 alergeni, no vo medicinskite institucii (pa i na IIBHG) se ispituvaat samo naj~estite alergeni (Tabeli 18.4 i 18.5). Za sekoja grupa alergeni postoi me|unarodno definirana mala latini~na bukva koja se koristi za nivno ozna~uvawe, a posle nea sledi broj. Na primer, mlekoto se ozna~uva so f2, polen od ambrozija w1 i sli~no. Pokraj alergenite koi se nao|aat vo prirodata, izgotveni se i specijalni i rekombinantni alergeni za oddelni epitopi so koi se vr{at prodlabo~eni i istra`uva~ki analizi na bolnite so alergii. Tie se ozna~uvaa so golemata bukv R (Research) i do nea se stavaat drugite oznaki (primer Rf261 e oznaka za specijalen alergen od asparagus) Oddelnoto ispituvawe na sekoj somnitelen alergen e najevtino, no poradi kombinaciite od razli~ni alergii koi mo`e da gi ima pacientot, tie davaat samo poedine~na informacija poradi {to ne se celosni i efikasni. 18.2.2. Ispituvawe komplet alergeni Kompletite alergeni se ispituvaat kako sme{i od razli~ni alergeni, obi~no po pet alergeni zaedno, i se grupirani spored sli~nost. Sme{ite alergeni se ozna~uvaat so latini~nata bukva Iks (x) posle prvata latini~na bukva koja ja ozna~uva grupata alergeni. Zad niv sledi brojot na sme{ata i eventualno podgrupata. Taka, sme{ata od hrana se ozna~uva kako: fx5E (f1-belka, f2-mleko, f3-riba, f4p~enica, f13-kikiriki, f14-soja) (Tabela 18.6). Treba da se napomene deka postojat ogromen broj sme{i vo sekoja od Institut za imunobiologija i humana genetika Tabela 18.4: Razli~ni vidovi poedine~ni alergeni. ALERGENI OD HRANA Belka od jajce (f1) @ol~ka od jajce (f75) Mleko (f2) Mleko vareno (f231) Riba (f3) P~enica (f4) Kikiriki (f13) Soja (f14) Jagoda (f44) Saccharomyces Cerevisiae (f45) Meso svinsko (f26) Meso tele{ko (f27) Meso pile{ko (f83) α-laktalbumin (f76) β-laktoglobulin(f77) Kazein (f78) Gluten(f79) Sirewe ~adeno (f81) Sirewe muvlosano(f82) Kakao (f93) PRA[INI I @IVOTINSKI BELKOVINI Vlakna od ma~e (e1) Vlakna od ku~e (e5) Dom.pra{ina (h2) D. pteronissinus (d1) D.farinae (d2) INSEKTI I NIVNI OTROVI Otrov od p~ela (i1) Otrov od osa (i3) Otrov od str{len(i5) Blatella germanica (i6) Aedes communis (i71) PROFESIONALNI ALERGENI Pamuk (o1) ANTIBIOTICI Penicilin G (c1) Penicilin V (c2) Ampicilin (c5) Amoksicilin (c6) Cefahlor (c7) GABI I MUVLI Asperg. fumigatus (m3) Candida albicans (m5) Cladosp.herbarum(m2) Penicill. notatum (m1) Alternaria alternata(m6) 201 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Tabela 18.5: Poleni. POLENI OD TREVA Anthoxanthum odora. (g1) - obi~na mirizliva treva Cynodon dactylon (g2) – obi~en troskot Dactylis glomerata (g3) – obi~na e“ovka Festuca elatior (g4) – livadska treva Lolium perene (g5) – pove}egodi{en rajgras-quq Phleum pretense (g6) – ma~kina opa{katreva Lolium perenne (g7)- obi~na trska Poa pratensis (g8)- livadarka Agrostis stolonifera (g9) – plevica Sorghum halepense (g10) - metla Bromus inermis (g11) - klasica Secale cereale (g12) – ‘r` kultiviran Holcus lanatus (g13) – volnesta medovica Avena sativa (g14) – oves Triticum sativum (g15) – p~enica Alopecurus pratensis (g16) – lisi~ja opa{ka Paspalum notatum (g17) – troskot Elymus triticoides (g70) – div rajgras Phalaris arundinacea (g71) – troskovidna svetlivka Hordeum vulgare (g201) – ja~men Zea mays (g202) -p~enka POLENI OD KOROV Ambrosia elatior (w1) - ambrozija Ambrosia psilostachya (w2) – zapadna abrozija Ambrosia trifida (w3) – xinovska ambrozija Franseria acanthicarpa (w4) – la‘na ambrozija Artemisia absinthium (w5) - pelin Artemisia vulgaris (w6) - crn pelin Chrysanthemum leucanthemum (w7) margarita Taraxacum vulgare (w8) – gluvar~e Plantago lanceolata (w9) - tegavec Chenopodium album (w10) – diva loboda Salsola kali (pestifer) (w11) - solenka Solidago virgaurea (w12) - zlatica Xanthium commune(w13) – butrak Amaranthus retroflexus (w14) – {tir Atriplex lentiformis Scale, (w15) – loboda Iva ciliate (w16) – metla Kochia scoparia (w17) – ov~e{ka Rumex acetosella (w18) - kiselec Parietaria officinalis (w19) – ru{itelka Urtica dioica (w20) - kopriva Parietaria judaica (w21) – ru{itelka POLENI OD DRVA Acer negundo (t1) - javor Alnus incana (t2) – evla, bela Betula verrucosa (t3) - breza Corylus avellana (t4) - leska Fagus grandifolia (t5) - buka Juniperus sabinoides (t6) - smreka Quercus alba (t7) - dab Ulmus amerikana (t8) - brest Olea europaea (t9) - maslinka Juglans californica (t10) - orev Platanus acerifolia (t11) – platan, ~inar Salix caprea (t12) – vrba, iva Pop.deltoides-topo. (t14) – crna topola Fraxinus americana (t15) - jasen Pinus strobes (t16) - bor Cryptomeria japonica (t17) – Japonski kedar Eucalyptus spp. (t18) - eukaliptus Acacia longifolia (t19) - akacija Carya pecan (t22) - karija Cupressus sempervirens (t23) - kiparis Morus alba (t70) – crnica, dudinka Arecastrum romanzoffianum (t72) – kralska palma Casuarina equisetifolia (t73) - bor Tilia cordata (t208) - lipa Ligustrum vulgare (t210) - ‘iva ograda 202 navedenite grupi, no tuka se dadeni samo naj~estite. Rezultatot koj se dobiva so ispituvaweto sme{i se iska`uva kvalitativno kako ima (pozitiven naod) ili nema (negativen naod) alergija kon taa sme{a alergeni. Dokolku ima pozitiven naod, toga{ se ispituvaat oddelno site alergeni koi gi ima vo soodvetnata sme{a alergeni, za da se otkrie na koj od niv i so kakov intenzitet reagira pacientot. Vtoriot na~in na grupno ispituvawe se vr{i spored dijagnozata na pacientot, smetaj}i deka predlo`enite alergeni za ispituvawe na soodvetnata bolest se naj~estite predizvikuva~i: Astma g6 - Phleum pretense (treva-ma~kina opa{ka) t3 – Bettula verucosa (breza) t9 – Olea europaea (maslinka) w21 – Parietaria judaica (br{len) e1 – vlakna od ma~e e5 – vlakna od ku~e d1 – Dermatophagoides pteronissinus w6 – Artemisia vulgaris (crn pelin) m2 – cladosporium herbarum (muvla) i6 – Blatella germanica (buba{vaba) Rinitis kaj vozrasni g6 - Phleum pretense (treva-ma~kina opa{ka) t3 – Bettula verucosa (breza) t9 – Olea europaea (maslinka) w21 – Parietaria judaica (br{len) e1 – vlakna od ma~e e5 – vlakna od ku~e d1 – Dermatophagoides pteronissinus w6 – Artemisia vulgaris (crn pelin) m2 – cladosporium herbarum (muvla) i6 – Blatella germanica (buba{vaba) Rinitis kaj deca g6 - Phleum pretense (treva-ma~kina opa{ka) t3 – Bettula verucosa (breza) t9 – Olea europaea (maslinka) w21 – Parietaria judaica (br{len) e1 – vlakna od ma~e e5 – vlakna od ku~e d1 – Dermatophagoides pteronissinus f1 – Belka od jajce f2 – Mleko f13 – Kikiriki Ekcem f1 – Belka od jajce f2 – Mleko f3 – Riba f4 – P~enica f13 – Kikiriki Institut za imunobiologija i humana genetika 18. ANALIZA NA PREOSETLIVOST f17 – Le{nik f14– Soja d1 – Dermatophagoides pteronissinus e1 – vlakna od ma~e e5 – vlakna od ku~e Nastinka so svire`i g6 - Phleum pretense (treva-ma~kina opa{ka) t3 – Bettula verucosa (breza) t9 – Olea europaea (maslinka) Tabela 18.5: Sme{i od alergeni. Sme{a poleni od trevi (gx1) (Cocksfoot-g3, Meadow fescue-g4, Rye- grass-g5, Timothy-g6, Meadow grass, Kentucky blueg8) (obi~na e`ovka ,livadska treva, quq, ma~kina opa{ka, livadarka) Sme{a poleni od drva (tx6) (Acer negundo-t1, Betula verrucosa-t3, Fagus grandifolia-t5, Quercus alba-t7, Juglans californica-t10) (javor, breza, buka, dab, orev) Sme{a poleni od korovi (wx5) (Ambrosia elatior-w1, Artemisia vulgaris-w6, Chrysanthemum leucanthemum-w7, Taraxacum vulgare-w8, Solidago virgaurea-w12) (ambrozija, crn pelin, margarita, gluvar~e, zlatica) Sme{a od hrana (fx5E) (f1-belka, f2-mleko, f3-riba, f4-p~enica, f13-kikiriki, f14-soja) Sme{a od pra{ini (hx2) (Hollister-Stier Labs.-h2, Dermatophagoides pteronissinus-d1, Dermatophagoides farinae-d2, Blatella germanica -i6) Sme{a perduvi (ex73) (e70-perduvi od guska, e85-perduvi od koko{ka, e86-perduvi od patka, e213-perduvi od papagal) Sme{a od meso (fx10) (f26-svinsko meso, f27-tele{ko meso, f83-pile{ko meso, f75-`ol~ka od jajce, f284misirkino meso) Sme{a od muvli (mx2) (Penicillium notatum-m1, Cladosporium herbarum-m2, Aspergillus fumigatus-m3, Candida albicansm5, Alternaria alternata-m6, Helminthosporium halodes-m8) Sme{a od ovo{je (fx15) (f33-portokal, f49-jabolko, f92-banana, f95-praska) Sme{a od apetisani (fx1) (kikiriki-f13, le{nik-f17, brazilski orev-f18, badem-f20, kokos-f36) Sme{a `ivotinski vlakna (ex1) (e1-vlakna od ma~e, e3-vlakna od kow, e4-vlakna od krava, e5-vlakna od ku~e) Sme{a poleni od drva (tx5)(Alnus incana-t2, Corylus avellana-t4, Ulmus americana-t8, Salix caprea-t12, Populus deltoidst14) Sme{a od zelen~uk (fx14) (f25-domat, f214-spana}, f216-zelka, f218-piperka) Sme{a od `itarici (fx20) (f4-p~enica, f5- r‚, f6-ja~men, f9-oriz) Sme{a od morski plodovi (fx2) (f3-riba, f24- rak, f37-{kolka, f40-tuna, f41-losos) w21 – Parietaria judaica (br{len) e1 – vlakna od ma~e e5 – vlakna od ku~e d1 – Dermatophagoides pteronissinus f1 – Belka od jajce f2 – Mleko f13 – Kikiriki ANALIZA NA SLU^AJ 18.2.3. Ispituvawe alergeni spored dijagnoza Atopiski dermatit. Atopiskiot dermatit e prvata manifestacija vo alergiskiot mar{ so vrv na pojavuvawe pred tretiot mesec od `ivotot. Prevalencijata na atopiskiot dermatit e okolu 20%, dodeka 60% od pacientite prvoto pojavuvawe go imaat vo tek na prvata godina od `ivotot i 85% pred pettata godina od `ivotot. Atopiskiot dermatit e docna reakcija (kleto~na reakcija), Institut za imunobiologija i humana genetika Alergiska astma: Slu~ajot na Filip Davidovski, 12 godi{no dete so hroni~na astma i rinit. 203 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM nasproti urtikarijata koja e rana reakcija (vaskularna reakcija). Pacientite so atopiski dermatit imaat hiperreaktivnost na ko`ata kon holinergiski supstanci analogno na bronhijalnata hiperreaktivnost kaj astma. Opi{an e visok procent prevalencija na astma, od 30 do 76%, kaj deca so atopiski dermatit i soodvetstvuva na te`inata na atopiskiot dermatit. Kaj nekoi pacienti mo`e da se vidi i bronhijalna hiperreaktivnost, bez simptomi na astma. Urtikarija. Urtikarijata mo`e da se javi kaj deca ili kaj vozrasni. Kaj deca postoi golema verojatnost deka e povrzana so zgolemeno nivo specifi~en IgE. Alergiski rinit. Najva`ni simptomi na alergiskiot rinit se: kivawe, te~ewe videnesta sluz od nosot, ~e{awe vo nosot i o~ite, zatnat nos. Oralen alergiski sindrom. Oralniot alergiski sindrom (OAS) e vid kontaktna urtikaria koja se javuva nekolku minuti posle vnesuvawe opredelni hrani kon koi{to bil pacientot senzibi-liziran. Simptomite se javuvaat na usnite i na usnata praznina i po definicija ne vklu~uvaat drugi organi. Oralniot alergiski sindrom (OAS) e vtor simptom po frekfencija od grupata IgE ovozmo`eni preosetlivosti na hrana kaj vozrasnite lica. Redosledot e sledniov: urtikarija/angioedem (70%), oralen alergiski sindrom (54%), astma (37%), i anafilaksija 27.5%). Svire`i vo detstvoto. Kaj deca do tri godini svire`ite vo gradite se javuvaat do 30%, dodeka kaj deca do 6 godi{na vozrast tie se zgolemuvaat do 50%. Okolu 60% od decata so svire`i vo gradite gi gubat simptomite posle tretata godina i ne razvivaat astma. Astma. Astma e hroni~no vospalitelno naru{uvawe na di{nite pati{ta vo koe {to u~estvuvaa mnogu kletki, a osobeno mastocitite i eozinofilite. Vo predisponira~ki lica, ova vospalenie mo`e da dovede do razvoj na astma so razli~en stepen, naj~esto povratliv, i so stesnuvawe na di{nite pati{ta. 18.3. Tolkuvawe rezultati od protivglobulinski test 18.3.1. Direkten protivglobulinski test Rezultatot na titarot za protiv-IgG e 48, a za protiv-C3 e 36. Ova se dobiva koga }e se soberat vrednostite koi odgovaraat za soodvetnite stepeni na aglutinacija dobieni 204 Institut za imunobiologija i humana genetika 18. ANALIZA NA PREOSETLIVOST od epruvetite so razli~no razreduvawe na protivglobulinskiot serum. Taka aglutinacijata 4+ odgovara na 10, 3+ odgovara na 8, 2+ odgovara na 6, 1+ na 4, + na 2, a 0 zna~i deka nema aglutinacija. Vakov slu~aj mo`e da se dobie koga bi pome{ale jak monospecifi~en serum i eritrociti silno senzibilizirani so IgG i umereno-silno senzibilizirani so C3, sostojba sli~na kako kaj zabolenite od AIHA predizvikana od topli protivtela. Vo klinikata direktniot protivglobulinski test e korisen pri dijagnozata na: - akutna i docna hemoliti~ka posttransfuziska reakcija, isleduvawe na postransfuziskite reakcii voop{to; - avtoimunite hemoliti~ki rakcii; - hemoliti~kata bolest na novorodeno; - imunolo{kite hemoliti~ki reakcii predizvikani od lekovi; - kako pozitivna avto-kontrola pri krvnogrupnoto tipizirawe, pri prosejuvaweto (skriningot) za protivtela i pri vkrstenata proba. Iako skalata za procenka na ja~inata na aglutinacijata e od golemo zna~ewe pri tolkuvawe na rezultatite dobieni od bolnite od avtoimuna hemoliti~ka anemija (AIHA), sepak nejzinata va`nost ne treba da se prezgolemuva. Iako mo`e da se ka`e deka stepenot na destrukcija na eritrocitite e pravoproporcionalen so koli~inata na protivtela vrzani na niv, sepak postojat brojni isklu~oci. Kako i da e, hemoliza vo primerokot e obi~no prisutna koga imame oblo`uvawe na eritrocitite so golema koli~ina na IgG i C3. DAT titarot i skalata za procenka na ja~inata na aglutinacijata mo`at da ni pozlu`at i pri sledeweto na terapijata kaj pacientite. Iako ne retko se slu~uva protivglobulinskiot test da ostane pozitiven i kaj onie pacienti kaj koi AIHA e vo faza na remisija, sepak i kaj niv titarot na DAT e namalen. ANALIZA NA SLU^AJ Vo slu~aj na pozitiven protivglobulinski test treba da se misli na slednive mo`nosti: - profilaksa so imuni globulini na Rh negativna majka; - postoewe na topli avtoprotivtela bez hemoliti~ka aktivnost; - promeni vo membranata na crvenite kletki, predizvikana naj~esto pri koristeweto na nekoi lekovi (na pr. cefalosporini) i posledo-vatelna nespecifi~na apsorpcija na globulini na niv; - nespecifi~na adsorpcija na globulini pri hipergamaglobulinemija, paraproteinemija; - in vitro aktivacija na komplementot poradi postoewe Institut za imunobiologija i humana genetika Hemoliti~ka bolest na novorodeno: Slu~ajot na Magda Srbinovska, plod vo imunolo{ki distres. 205 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM na ladni avtoprotivtela, na pr. kaj koagulirana krv posle ladewe; - poliaglutinacija, dokolku dojde do izlo`uvawe na skrienite protivgeni (kriptoprotivgeni) ili dokolku protivglobulinskiot serum e zagaden so protiv-T (op{t protivgen normalno prisuten vo membranata na eritrocitite, da ne se me{a so protivT-Li serum). 18.3.2. Indirekten protivglobulinski test Doka`uvawe na protivgeni: Golem broj na protivgeni seu{te se otkrivaat i doka`uvaat so pomo{ na indirektniot protivglobulinski test (na pr. Fya, Fyb, K, k, S, s, Jka, Jkb). Indirektniot protivglobulinski test, dokolku kako sredstvo za miewe so koristi fosfatniot pufer, e metod na izbor pri doka`uvawe na retki protivgeni (Lua, Wra, Kpa ), ~esti protivgeni (Coa, Jsb, Kpb) kako i na slabi protivgenski varijanti (Dslabo, DVI, Cw). Doka`uvawe na protivtela: Indirektniot protivglobulinski test e neophoden del od testovite za prosejuvawe (skrining) na protivtela i vkrstenata proba. Pri toa ponekoga{ e potrebno i da se napravat nekoi modifikacii vo samiot test. Na primer, protivtelata koi se va`ni pri upotrebata na transfuzija na krv najdobro se otkrivaat dokolku se upotrebi albuminskata tehnika (30 min na 370C). Isto taka, izveduvaweto na testot vo epruveti so upotrebata na LISS (fiziolo{ki rastvor so niska koncentracija na joni), ja zgolemuva senzitivnosta vo otkrivaweto na protivtelata kon Rh protivgenot, iako ponekoga{ neuspeva da go otkrie prisustvoto na protiv-K. Osoben problem mo`e da prestavuvaat i ladnite protivtela so {irok temperaturen optimum na deluvawe. Vo dene{no vreme metodot so epruvetki, koi se upotrebuvaat za izveduvawe na indirektniot protivglobulinski test, se pove}e se zamenuvaat so upotreba na posenzitivni metodi, (kakvi {to se gel testovite ili tehnikite so cvrsta faza), osobeno pri prosejuvaweto (skriningot) i identifikacijata na protivtela. Indirektniot protivglobulinski test, so upotreba na albuminskata tehnika, seu{te e metodot na izbor pri procenkata na klini~koto zna~ewe na protivtelata koi se otkrivaat na ovoj na~in. Toj, isto taka, pretstavuva standarden test i pri titracijata na protivtelata. Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod) Data Student (ime i prezime) Asistent (potpis i pe~at) ______________ ____________________________ __________________________ 206 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 19: SISTEMSKI AVTOIMUNITET BLOK 7 BLOK 7- AVTOIMUNITET U^EBNI CELI: VE@BA 19. SITEMSKI AVTOIMUNITET (1 ~as) Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat da: go definiraat mestoto na sistemskiot avtoimunitet; opredelat antikardiolipinski fosfolipidni protivtela. VE@BA 20. ORGAN SPECIFI^EN IMUNITET (1 ~as) Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat: go definiraat mestoto na organ specifi~niot avtoimunitet; opredelat koli~ina na protivtiroglobulinski protivtela. VE@BA 21. TOLKUVAWE AVTOIMUNITET (1 ~as) Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat da: tolkuvaat rezultati od sistemskiot i organ specifi~niot avtoimunitet; analiziraat slu~ai od avtoimunitetnite zaboluvawa. POENI: PRISUSTVO 1.5 poeni ZNAEWE 3.0 poeni VKUPNO: 4.5 poeni Institut za imunobiologija i humana genetika 207 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 208 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 19: SISTEMSKI AVTOIMUNITET VE@BA 19: SISTEMSKI AVTOIMUNITET 19.1. Voved za avtoimunost Poimot avtoimunost se odnesuva na odredeni patolo{ki sostojbi vo koi se javuva o{tetuvawe na sopstvenoto tkivo poradi aktivacija na imunolo{kiot sistem naso~ena kon komponenti na normalnite tkiva ili organi. Tkivnite o{tetuvawa mo`e da se ograni~eni na oddelni organi (koga se raboti za organ-specifi~a avtoimunost) ili da se manifestiraat so zasegawe na pove}e sistemi, kako na pr. kaj revmatska bolest (koga se raboti za sitemska avtoimunost ili organ-nespecifi~na avtoimunost). Preminot od organ specifi~ni vo sistemski avtoimuni zaboluvawa ne e oster (jasen) tuku tie se prepokrivaat vo oblik na skala na avtoimuni zaboluvawa (Slika 19.1). Od poseben nau~en interes e golemata razlika vo zastapenost na avtoimunite bolesti pome|u polovite, so mnogu pogolema zastapenost (pove}e od 75%) na ovie bolesti me|u pacienti od `enski pol. Humoralni, kleto~ni Slika 19.1: Skala na avtoimunite zaboluvawa. Institut za imunobiologija i humana genetika 209 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM mehanizmi ili i dvata mo`at da se odgovorni za patolo{kite procesi kaj avtoimunite bolesti, a malku podobro karakterizirani se protivtela so razli~na tkivna specifi~nost. Sepak ostanuva da se razjasnat golem broj na pra{awa vo pogled na zapo~nuva~kiot impuls vo avtoimunosta. Postojat dokazi deka nekoi protivtela se patogeni, na pr. transferot na maj~ini IgG protivtela kaj tireotoksikoza rezultiraat so minliva neonatalna tireotoksikoza. Za mnogu drugi protivtela ne mo`e da se doka`e deka direktno se patogeni, no tie pak mo`e da slu`at kako dijagnosti~ki pokazatel za avtoimuna bolest. Tradicionalno, avtoprotivtelata se identifikuvaa naj~esto subjektivno, so koristewe na indirektna imunofluorescencija. Napredokot vo molekulskite i biohemiskite tehniki ovozmo`ija poprecizno identifikuvawe na protivgenite i razvivawe na pove}e imunolo{ki metodi kako na pr. radioimunoesej, precipitacija vo gel, aglutinacija, nefelometrija i osobeno, ELISA. So zgolemuvawe na potencijalot za standardizirawe, kvantificirawe i avtomatizacija, testovite za ispituvawe na avtoprotivtela stanaa dostapni za pove}e laboratorii, Sepak, zna~itelno razli~ie vo odgovorot kon razli~ni komercijalni testovi seu{te postoi, glavno zaradi razli~nata priprema na protivgenot vrzan za cvrstata faza, no i zaradi razlikite vo afinitetot ili aviditetot pome|u protivtelata od razli~ni individui. 19.2. Otkrivawe na avtoprotivtela Avtoprotivtelata prisutni vo biolo{ki te~nosti se otkrivaat isklu~ivo so imunohemiski tehniki bazirani na detekcija na imuni kompleksi formirani pome|u avtoprotivteloto i celniot protivgen koj se nao|a vo tkivata, kletkite ili pak e vo rekombinantna forma. Slika 19.2: Kvantitativna imunoprecipitaciska kriva (Heidelberger-Kendall). 210 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 19: SISTEMSKI AVTOIMUNITET Vo imunohemiskite reakcii, dodavawe na raste~ka koli~ina protivgen na konstantna koli~ina na protivtelo, rezultira so raste~ka precipitacija, dostignuva plato i potoa pa|a, kako {to objasnile u{te vo 1935 godina Heidelberger i Kendal (Slika 19.2). Namaluvaweto na precipitacijata pri povisoki koncentracii na protivgen se dol`i na formiraweto na pomali, polesno rastvorlivi kompleksi i mo`e da vodi do la`no negativen rezultat. 19.2.1. Indirektna imunofluorescencija Indirektna imunofluorescencija e naj~esto koristen test za skrining za prisustvo na avtoprotivtela. Kako supstrat vo reakcijata protivgen - protivtelo se koristi tkivo od gluvci, staorci ili primati koi ne poka`uvaat vkrstena reaktivnost me|u razli~nite `ivotinski vidovi. 19.2.2. Aglutinacija Testovite na aglutinacija vklu~uvaat premostuvawe so specifi~no protivtelo na specifi~ni partikli oblo`eni so protivgeni, so {to se formiraat golemi, makroskopski agregati. Vo najgolem del, prvite testovi za ispituvawe na avtoprotivtela bea bazirani na hemaglutinacija vo koja kako nosa~ za protivgenite se koristele eritrociti. Vo ovie testovi, IgM protivtelata podobro aglutiniraa od IgG protivtelata poradi nivnata pentamerna struktura koja ovozmo`uva postoewe na 10 protivgen - vrzuva~ki mesta po molekula. Pokraj eritrociti, kako nosa~i na protivgeni se koristat `elatin i lateks, a tie obezbeduvaat pogolema inertnost i stabilnost na sistemot. Iako ovie testovi glavno se dizajnirani za otkrivawe na klini~ki va`nite IgG avtoprotivtela, nizok titar na IgM protivtela koi vkrsteno reagiraat ili klasi~niot IgM revmatoiden faktor, potencijalno vlijaat na rezultatot. Ovie metodi se vo golem del nadminati od posenzizitvni i reproducibilni novi tehniki. 19.2.3. Imunodifuzija Imunodifuzijata e tehnika so dobra specifi~nost, no mala senzitivnost. Sozdavaweto na precipitaciska linija vo gel e zavisna od upotrebata na soodvetni koncentracii na protivgen i test protivtelo. 19.2.4. Imunoprecipitacija Imunoprecipitacijata na kleto~ni ekstrakti so avtoimuni serumi e senzitivna tehnika za demonstracija na protivtela kon snRNP ili sli~ni partikli. Principot se sostoi vo analiza na RNP-protivtelo kompleksite spored sodr`inata na RNK po SDS-akrilamidna elektroforeza. Ovaa tehnika e prili~no komplicirana i dolgotrajna, pa ne e pogodna za rutinska laboratoriska primena. Institut za imunobiologija i humana genetika 211 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 19.2.5. Imunoblotirawe Ovaa isklu~itelno senzitivna tehnika e va`na za karakterizacija na specifi~nost na protivtela od ist primerok serum, ili za definitivna identifikacija na poinaku neidentifikuvano protivtelo. Proteinite od kleto~niot ekstrakt (koi gi sodr`at i ispituvanite protivgeni) se razdeluvaat na SDS-PAGE i se prenesuvaat na nitrocelulozna membrana. Damkite od membranata potoa se inkubiraat so serumot koj se ispituva, pa rezultira~kiot kompleks protivgen-protivtelo se vizuelizira so enzimski obele`eni probi. Protivtela kon konformaciski epitopi, kako na pr. SS-A (Ro), se odnesuvaat nekonzistentno vo ovaa tehnika. 19.2.6. ELISA ELISA tehnikata e mnogu senzitivna i reproducibilna. Vo ovie testovi bunar~iwa od mikrotitarska plo~ka se oblo`uvaat so prigotven protivgen. Pritoa, ~istotata na prigotveniot protivgen e od fundamentalno zna~ewe za specifi~nosta na testot. Slobodnite vrzni mesta se blokiraat so inerten protein, a so efikasnosta na blokira~kata stapka mo`e da se vlijae na senzitivnosta na testot. Slika 19.3: VARELISA metod za opredeluvawe avtoprotivtela na Institut za imunobiologija i humana genetika. 212 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 19: SISTEMSKI AVTOIMUNITET 19.2.7. ELIA EliA dvDNK testot se raboti vo bunar~iwa oblo`eni so dvoveri`na plazmidska DNK. Po dodavawe na ispituvaniot serum, nevrzanite protivtela se plaknat, a na formiranite kompleksi DNK-protivtela se dodavaat sekundarni, protiv IgG protivtelata (IgG konjugat) obele`ani so enzim (za da se formira protivtelo-konjugat kompleks). Po odredena inkubacija nevrzaniot konjugat se izmiva i vrzaniot kompleks se inkubira so rastvor za razvivawe na reakcijata. Kvantifikacijata se pravi preku merewe na fluorescencija i sporedba so kalibraciski krivi dobieni vrz osnova na rastvori so poznata koncentracija na protivtela (Slika 19.4). 19.2.8. Primerok za ispituvawe Site serolo{ki testovi za ispituvawe na avtoprotivtela se izveduvaat na primeroci od serum. Tie treba da se ~uvaat na 4 C dodeka se analiziraat ili pak na -20 C, ako treba da se analiziraat po podolgo vreme (nekolku meseci). Za nekoi aglutinaciski testovi, serumot treba prethodno da se zagree 30 min na na 56oC za da se inaktivira komplementot. Pritoa treba da se ima predvid deka temperaturnata inaktivacija go pravi serumot neadekvaten za pove}eto ELISA testovi. 19.2.9. Stabilnost na protivtelata Pove}eto avtoprotivtela se isklu~itelno stabilni. Primerocite serum mo`e da se ~uvaat 2-3 nedeli na 4oC bez da dojde do degradacija, ako primerokot ne se kontaminira so bakterii ili fungi. Isklu~ok od ova se protivtelata kon glikoprotein povrzan so mielinot koi mora da se ~uvaat na -20oC do analizata. Slika 19.4: [ematski prikaz na ELIA metod za opredeluvawe avtoprotivtela na Insttitut za imunobiologija i humana genetika. 19.3. Sistemski avtoimuni zaboluvawa 19.3.1. Protivtela povrzani so revmatska bolest 19.3.1.1. Fosfolipidni protivtela Ova e generi~ko ime za pogolema grupa protivtela, povrzani so istoimeniot sindrom. Protiv-kardiolipinskite protivtela pripa|aat na familija vkrsteno reaktivni protivtela koi reagiraat so negativno naelektrizirani fosfolipidi. Ovie protivtela nao|aat primena vo ispituvaweto na rizik od tromboza kaj pacienti so SLE ili povrzani bolesti, kako i za sledewe na bremenost kaj pacientki so rizik od spontan abortus. Pri Institut za imunobiologija i humana genetika 213 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM toa, niski ili vremeno pozitivni rezultati ne se relevantni za dijagnoza na antifosfolipiden sindrom. Najdobro so ovoj sindrom koreliraat IgG protivtelata. Spored kriteriumite od 1999 godina za antifosfolipiden sindrom se zboruva koga se ispolneti najmalku eden klini~ki i eden laboratoriski kriterium od dvata klini~ki i dvata laboratoriski: Klini~ki kriteriumi: 1. Vaskularna tromboza: edna ili pove}e epizodi na arteriska, venska ili tromboza na mali krvni sadovi vo bilo koe tkivo ili organ. 2. Komplicirana bremenost: edna ili pove}e neobjasneti smrtnosti na morfolo{ki oformen plod po 10-tata nedela na bremenost. Edno ili pove}e predvremeni ra|awa pred 34-nedela na bremenost poradi seriozna pre-eklampsija, eklampsija ili insuficiencija na placentata. Tri ili pove}e neobjasneti posledovatelni spontani abortusi pred 10-tata nedela na bremenost. Laboratoriski kriteriumi: 1. Protivkardiolipinski protivtela: prisustvo na protivkardiolipinski protivtela od IgG ili IgM izotip vo sreden ili visok titar vo dva ili pove}e navrati na rastojanie od 6 nedeli. 2. Lupus antikoagulant: lupus antikoagulant prisuten vo plazmata vo dva ili pove}e navrati na rastojanie od 6 nedeli. 19.3.1.2. Nuklearni protivtela (ANA) Nuklearnite protivtela se heterogena grupa na avtoprotivtela koi ~esto se nao|aat kaj pacienti so sistemski revmatski bolesti. Se delat na dve grupi, protivtela kon strukturni, nerastvorlivi proteini i protivtela kon rastvorlivi proteini. Sistemskiot lupus eritematozus e bolest karakterizirana so mnogu razli~ni avtoprotivtela. Eden prose~en pacient so lupus ima najmalku 3 razli~ni vida na avtoprotivtela. Vakva poliklonalnost na avtoprotivtelata postoi u{te kaj skleroderma. Prevalencata na razli~nite protivtela kaj bolnite od SLE varira od 70% za protivtela kon ednoveri`na DNK, do 3% za protiv AluRNK protivtela. Protivtelata kon nativna ili dvoveri`na DNK se silno povrzani so SLE. 19.3.2. Protivtela kon neutrofilnata citoplazma Opi{ani se protivtela kon razli~ni vnatrekleto~ni enzimi od neutrofilite, a povrzani so nekrotizira~ki vaskulitis i vaskulitisi kaj revmati~na bolest. So indirektna imunofluorescencija na neutrofili fiksirani so etanol, se otkrivaat dva razli~ni oblici na boewe, 214 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 19: SISTEMSKI AVTOIMUNITET edniot so potencirawe na centralniot interlobularen del (t.n. C-ANCA) i vtoriot, perinuklearen ili P-ANCA. Ovoj vid na boewe mo`e da se sretne i kaj prisustvo na protivnuklearni protivtela (ANA), osobeno protivtela kon dvoveri`na DNK i protivhistonski protivtela. 19.3.3. Sistemski lupus eritematozus (SLE) Sistemskiot lupus eritematozus e prototip na avtoimuna bolest, koja se karakterizira so sozdavawe paleta od razli~ni avtoprotivtela i pove}esistemsko zasegawe. Sli~no kako i drugi avtoimuni bolesti, SLE verojatno se dol`i na kombinacija od genetski i faktori od okolinata koi pridonesuvaat za sostojbata na imuna hiperreaktivnost. Glavnata serolo{ka karakteristika na SLE e sozdavawe avtoprotivtela naj~esto naso~eni kon komponenti od kleto~noto jadro. Ovie protivjadreni protivtela (ANA) se vrzuvaat za razli~ni makromolekuli koi vklu~uvaat DNK, RNK, histoni i pove}e kompleksi proteini-RNK nare~eni snRNP (od small nuclear ribonucleoproteins). Kaj SLE, celnite molekuli za ANA se ubikvitarno prisutni vo kletkite, dodeka kaj zdravi individui tie se nedostapni za imuniot sistem. Iako ANA se skoro sekoga{ prisutni vo serumot od bolni so SLE, ovie protivtela ne se edinstveno prisutni kaj bolni so SLE, tuku se javuvaat i kaj bolni so bolesti na svrznoto tkivo, revmatoiden artrit ili sindrom na Sjegren (Sjögren). Ponatamu ANA mo`e da se otkrie i kaj 5% od normalnite lica. Sepak, odredeni ANA se nao|aat isklu~ivo kaj bolni so SLE i mo`e da slu`at kako obele`uva~ za ova zaboluvawe. Taka, protiv-DNK i protiv Sm protivtelata se identifikuvani kako eden od kriteriumite za klasifikacija na pacientite so SLE. Tabela 19.1: Avtoprotivtelata, nivnata molekulska cel i klini~kata asocijacija kaj sistemski lupus aritematozus (SLE). Imaj}i ja predvid heterogenosta na SLE, dijagnozata SLE se postavuva vrz osnova na nekolku kriteriumi koi vklu~uvaat i klini~ki i laboratoriski naodi (Tabela 19.1). 19.3.3.1. O{tetuvawe na tkivoto Od razli~nite manifestacii na SLE, nefritisot ja Institut za imunobiologija i humana genetika 215 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM ilustrira kompleksnosta na bolesta. Toj se dol`i na talo`eweto imuni kompleksi vo glomerulite koi go aktiviraat komplementniot sistem i promoviraat vospalenie. Vo imunite kompleksi, protiv-DNK protivtelata se glavna pri~ina za glomerulskoto o{tetuvawe. Tie se del od golemiot spektar na protivtela naso~eni kon nukleozomot, forma na DNK prisutna vo jadroto koja sodr`i i proteinska i nukleinska komonenta. Bidej}i DNK e vrzana za histonskoto jadro, oddelni pacienti mo`e povremeno da sozdavaat protivtela kon DNK, histoni, ili nukleozomi. Sozdavaweto imuni kompleksi mo`e da se slu~i vo cirkulacijata so protivtela koi vrzuvaat DNK ili nukleozomi oslobodeni od mrtvi kletki. Alternativno, kompleksite mo`e da se napravat vo bubregot so proces nare~en in situ sozdavawe na imuni kompleksi. Pokraj nefritot, avtoprotivtelata mo`e da posreduvaat vo hematolo{kite manifestacii na bolesta. Citopenii, kako avtoimuna hemoliti~ka anemija i trombocitopenija, mo`e da se rezultat na vrzuvawe na avtoprotivtelata na povr{inskite protivgeni od crvenite kletki (eritrocitite) ili trombocitite, po {to sleduva liza posreduvana od komplement ili protivtelno posreduvana citotoksi~nost. Zasegawe na centralniot nerven sistem, venski i arteriski trombozi, kako i drugi antifosfolipidni sindromi mo`at da bidat povrzani so SLE. 19.4. Zada~a 19.4.1. Opredeluvawe IgM protivkardiolipinski protivtela 19.4.1.1. Potreben materjal za izveduvawe na ve`bata Za odreduvawe IgM protivkardiolipinskite protivtela (PKP) vo serum/plazma neophodni se: - primerok na serum/plazma; - plasti~en nosa~ za stripovi; - stripovi (sekoj strip ima 8 bunar~iwa); - razreduva~ na primerocite; - pufer za plaknewe; - standardi za PKP (0 E/ml; 4 E/ml; 8 E/ml; 20 E/ml; 40 E/ ml; 100 E/ml) vo SFP, koj sodr`i BSA, 0.095% natrium azid i human serum serum; - pozitivna kontrola; SFP koj sodr`i BSA, 0.095% natrium azid i human serum; - negativna konrola; SFP koj sodr`i BSA, 0.095% natrium azid i human serum; 216 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 19: SISTEMSKI AVTOIMUNITET - IgM HRP (horse-radish peroxidase) kowugat; - TMB substrat (3,3',5,5' - tetrametilbezidin); - rastvor za stopirawe na reakcijata (0.5 M H2SO4); - pipeti od 10 mkL, 50 mkL, 100 mkL i 1000 mkL; - plasti~ni prodol`etoci; - kontejneri za puferot za plaknewe i razreduva~ot za primerocite; - destilirana ili dejonizirana voda; - aparat za avtomatsko plaknewe; - spektrofotometar (Victor2) sposoben da ja izmeri absorbancata na 450 nm. 19.4.1.2. Priprema na pufer za plaknewe Se zemaat 50 mL od koncentratot za plaknewe i se prefrlaat vo ~ista kolba od 1000 mL. Koncentratot se razreduva 20 pati so dodavawe na 960 mL destilirana voda ili dejonizirana voda. 19.4.1.3. Priprema na rastvor za razreduvawe Mnogu e va`no rastvorot za razreduvawe da ja otslikuva prirodnata sredina na primerokot. Se priprema neposredno pred stavaweto vo koli~ina ne pogolema od onaa neophodna za soodvetniot broj na bunar~iwa. Za eden strip e dovolen 1.5 mL od koncentratot na razreduva~ot za primeroci. Na ovaa koli~ina se dodava 6 mL destilirana ili dejonizirana voda. Vaka pripremeniot razreduva~ za primerocite e stabilen 2 nedeli na temperatura od +2 do +8oC, dokolku se ~uva vo dobro zatvoren kontejner. 19.4.1.4. Primerok Za odreduvawe koncentracijata na PKP potrebno e 1 mL primerok. Dokolku se koristi serum, krvta se zema so venepunkcija, se ostava da sosiri i se odvojuva serumot so centrifugirawe (5 minuti na 4000 vvm). Za dobivawe plazma se koristi krv zemena so Heparin ili EDTA. Hemoliti~nite (hemoglobin ≤500 mg/dL), lipemi~nite (≤125 mg/ dL), ikteri~nite primeroci (bilirubin ≤30 mg/dL) ili primerocite zagadeni so mikroorganizmi mo`at da vlijaat vrz to~nosta na rezultatite pa poradi toa ne treba da se upotrebuvaat. Ne treba da se koristat primeroci koi stoele nesmrzanti pove}e od 24 ~asa. Stabilnosta na primerokot iznesuva okolu 24 ~asa na temperatura od 4-8oC. Dokolu e potrebno podolgotrajno ~uvawe na primerokot, toga{ toa treba da se napravi na temperaturi poniski od -25oC. Pred da se premine na izveduvawe na testot, primerokot treba da se razredi so specijalen razreduva~ vo odnos 1:101. Ova razreduvawe se pravi koga na 10 mkL od primerokot }e mu se dodadat 1000 mkL od razreduva~ot. Institut za imunobiologija i humana genetika 217 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 19.4.1.5. Protokol za rabota Site standardi i primeroci se rabotat vo duplikat. Za sekoj test treba da se napravi nova standardna prava. Site hemikalii i primeroci pred da se po~ne so rabota treba da se zagreat na sobna temperatura (+20 do +250C). 1. Se razreduva serumot/plazmata vo odnos 1:101. 2. Vo ramkata se mestat potrebniot broj na stripovi. 3. Bunar~iwata neposredno pred po~etokot na rabota se izmivaat so pufer za plaknewe. Izmivaweto se vr{i na toj na~in {to bunar~iwata se polnat so 300 mkL pufer za plaknewe. Puferot stoi vo bunar~iwata 20 sekundi i potoa se frla. 4. Vo soodvetnite bunar~iwa se dodava po 100 mkL od standardite, kontrolite i razredenite primeroci (Slika 19.5) 5. Se ikubira 30 minuti na sobna temperatura (18-250C) bez da se me{a. 6. Po inkubacijata site bunar~iwa se plaknat 3 pati so pufer za plaknewe. Slika 19.5: [ema za postavuvawe standardi, kontroli i primeroci od pacienti za opredeluvawe avtoprotivtela so VARELISA. 7. Vo site bunar~iwa se dodava 100 mkL od kowugatot. 8. Se ikubira 30 minuti na sobna temperatura (18-250C) bez da se me{a. 9. Po inkubacijata site bunar~iwa povtorno se plaknat 3 pati so pufer za plaknewe. 10. Vo site bunar~iwa, direktno od {i{enceto, se dodava po 100 mkL od 3,3',5,5' - tetrametilbenzidin (TMB) substratot. 11. Se inkubira 10 minuti na temno na sobna temperatura (18-250C) bez da se me{a. 12. Vo site bunar~iwa se dodava po 50 mkL od rastvorot za stopirawe na reakcijata. 13. Se proveruva dali sekoj strip e pravilno namesten 218 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 19: SISTEMSKI AVTOIMUNITET vo svoeto le`i{te i se meri absorbancata na 450 nm so pomo{ na spektrofotometar (Victor2). Se prepora~uva absorbancata da se izmeri vo rok od 30 minuti po dodavaweto na rastvorot za stopirawe na reakcijata, za da se izbegne bilo kakvo vlijanie na nadvore{nite faktori. 19.4.1.6. Presmetuvawe na rezultatite Za sekoj test se pravi nova standardna prava. Najprvin se presmetuvaat srednite vrednosti na standardite i se nanesuvaat na bilogaritamski grafikon vo odnos na nivnite koncentracii. Nepoznatite primeroci se ot~ituvaat od standardnata prava. Primerocite koi imaat absorbanca pogolema od vrednosta na najgolemiot standard se ozna~uvaat so >100 E/mL. Ovie primeroci treba da se razredat i povtorno da se odredi koncentracijata na protivkardiolipinskite protivtela. Kvalitativno presmetuvawe: Vo kvalitativnite presmetki najprvin se odreduva OGcut-off na sekoj ispituvan primerok posebno. OGcut-off se odreduva na sledniov na~in: OGcut-off = OGpozitivna kontrola x Faktor Vrednosta na faktorot za pozitivnata kontrola se zema od sertifikatot za kontrola koj se nao|a vo sekoj komplet za rabota. Primer (Tabela 19.2): OGpozitivna kontrola = 0.587 Faktor = 0.3 OGcut-off = 0.587 x 0.3 = 0.18 Presmetuvawe na soodnosot: Za da se dobie pretstava kolku eden pacient e pozitiven za dadenata analiza treba da se presmeta soodnosot. Soodnosot za sekoj primerok posebno se presmetuva na sledniot na~in: Soodnos = OGispituvan primerok / OGcut-off Primer (Tabela 19.2): OGcut-off = 0.18 OGispituvan primerok = 0.235 Soodnos = 0.235/0.18= 1.30 19.4.1.7. Presmetuvawe koncentracija na IgM protivkardiolipinskite protivtela Koncentracijata na IgM protivkardiolipinskite protivtela se presmetuva spored prethodno opi{aniot protokol. Rezultatite se vnesuvat vo Tabela 19. Institut za imunobiologija i humana genetika 219 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Tabela 19.2: Primer za presmetuvawe koncentracija na avtoprotivtela (gore) i mesto za presmetuvawe (dolu). Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod) Data Student (ime i prezime) Asistent (potpis i pe~at) ______________ ____________________________ __________________________ 220 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 20: ORGAN SPECIFI^EN AVTOIMUNITET VE@BA 20: ORGAN SPECIFI^EN AVTOIMUNITET 20.1. Organ specifi~ni avtoimuni zaboluvawa 20.1.1. Endokrini avtoimuni bolesti Protivtelata kon parietalnite gastri~ni kletki i intrinzi~niot faktor, sekretoren produkt na parietalnite kletki, se silno povrzani so avtoimuniot (tip A) gastritis i perniciozna anemija. Vo kombinacija, dvete avto-protivtela se visoko specifi~ni (90%) za avtoimun gastritis i perniciozna anemija, dodeka ne postoi povrzanost so antralniot (tip B) gastritis koj tipi~no se sretnuva kaj duodenalen ulkus i infekcija so Helicobacter pylori. 20.1.1.1. Protivtela kon parietalni gastri~ni kletki Avtoprotivtelata kon gastri~nite parietalni kletki ~esto (40%) se prisutni kaj drugi organ-specifi~ni avtoimuni bolesti, osobeno kaj bolni od avtoimuna tiroidna bolest. Prisutni se vo pomal titar kaj 10-15% od postari pacienti bez da postoi nekakov dokaz za prisustvo na avtoimuna bolest. Ovie protivtela se specifi~ni za parietalnite kletki i reagiraat ili so beta-podedinicata od H+ i K+ ATP-aza ili so intrinzik faktorot. 20.1.1.2. Protivtela kon intrinzik faktorot Intrinzik faktorot e glikoprotein so masa 70 kDa sekretiran od parietalnite kletki od gastri~nata mukoza, a slu`i kako vrzuva~ki i transporten protein za vitaminot B12. Avtoprotivtelata naso~eni kon nego mo`e da se Institut za imunobiologija i humana genetika 221 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM podelat vo dve grupi. Tip 1 protivtelata se blokira~ki protivtela koi go inhibiraat vrzuvaweto na vitamin B12 i se sretnuvaat kaj 70% od bolnite so perniciozna anemija. Tip 2 protivtelata se vrzuva~ki protivtela koi se vrzuvaat za intrinzik faktorot i za kompleksot intrinzik faktor-vitamin B12 i taka spre~uvaat da dojde do apsorbcija vo crevata, a se sretnuvaat kaj okolu 35% od bolnite so perniciozna anemija. 20.1.1.3. Avtoprotivtela povrzani so dijabetes Postojat pove}e avtoprotivtela povrzani so insulin zavisniot dijabetes, no site se so ograni~eno klini~ko zna~ewe za terapijata na bolesta. Nivnoto zna~ewe e za eventualno predviduvawe razvojot na bolesta kaj rodnini na bolni so dijabetes. Pri ispituvawe na asimptomatska, a visoko rizi~na populacija za dijabetes, pozitiven odgovor na dve ili pove}e protivtela od avtoprotivtelata kon dekarboksilaza na glutaminskata kiselina, kon kletki od pankreasnite ostrov~iwa ili kon insulin, e povrzan so visoka incidenca za po~etok na dijabet vo slednite 5 do 7 godini. Naj~esto, okolu 75% od pacientite so dijabet se pozitivni za avtoprotivtela kon pankreasnite ostrov~iwa vo momentot na dijagnoza na bolesta. Ovie protivtela se reaktivni so celite ostrov~iwa, vklu~itelno so alfa- i beta-kletkite, a prepoznavaat i kletki koi sozdavaat glukagon, somatostatin i insulin. Protivinsulinskite protivtela se prisutni kaj okolu 40% od novo dijagnosticiranite pacienti so dijabet. Nivnata koncentracija se namaluva so vozrasta pa taka prisutni se skoro kaj site pacienti pod 4 godini starost, no samo kaj okolu 4% od vozrasnite. 20.1.1.4.Tiroidni avtoprotivtela Postojat razli~ni avtoprotivtela povrzani so avtoimunata tiroidna bolest, koi se karakterizirani kako primarni (naso~eni kon membranskite receptori i se direktno patogeni) ili sekundarni (ne se direktno patogeni, no slu`at kako korisni dijagnosti~ki markeri). Primarni tiroidni protivtela. Najdobro poznatoto primarno tiroidno avtoprotivtelo e dolgo-deluva~kiot tiroiden stimulator LATS (long-acting thyroid stimulator), koe e IgG protivtelo naso~eno kon ekstracelularniot domen na TSH receptorot. Ova stimulatorno protivtelo e od zna~ewe za dijagnostika na Graves-ova bolest i ima golemo zna~ewe za to~na klasifikacija na neonatalna tiroidna disfunkcija. Sekundarni tiroidni protivtela. Najva`ni vo ovaa grupa avtoprotivtela se protivtela kon tiroglobulinot (TG) i protivtela kon tiroidnata peroksidaza (TPO). Poka`ano e deka samo kaj 1% od pacientite so avtoimuna tiroidna bolest mo`e da se utvrdat protiv-TG protivtela vo otsustvo na protiv-TPO protivtela. Taka, klini~koto zna~ewe na protiv-TG protivtelata e ograni~ena na mala grupa na 222 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 20: ORGAN SPECIFI^EN AVTOIMUNITET pacienti so simptomi za avtoimuna tiroidna bolest koi se negativni za protiv-TPO protivtela. 20.1.2. Gastrointestinalni avtoimuni bolesti 20.1.2.1. Protivtela povrzani so celijakija Celijakijata e postojana intolerancija na gluten koja vodi do atrofija na crevnite resi~ki kaj osetlivite lica za gluten, {to pretstavuva definitivna dijagnoza na celijakijata. Za pove}eto kleto~ni i humoralni imunolo{ki abnormalnosti, odgovoren e alfa-glijadinot, proteinska frakcija od p~enicata. Za dijagnoza na celijakijata se koristi skrining na protiv-glijadinski protivtela, protivtela kon retikulin i protiv-endomizijalni protivtela. Sekoj od ovie testovi e so razli~na specifi~nost i senzitivnost. Cirkulira~kite IgA protivtela kon glijadin imaat skoro 100% specifi~nost, no se so relativno niska senzitivnost. IgG protivtelata kon glijadin, pak, imaat poniska specifi~nost, no povisoka senzitivnost. Ako se koristat istovremeno, dvata vida protivtela ovozmo`uvaat specifi~nost od 90% i senzitivnost od 95% vo dijagnosticiraweto na celijakija. IgG protivtela kon glijadin mo`e da se sretnat kaj mal procent na bolni od ulcerativen kolitis, IgA nefropatija, Kronova bolest, revmatoiden artrit i intolerancija na kravjo mleko. 20.1.3. Avtoimuna bolest na crniot drob Naj~esto, protivtela koi se povrzuvaat so avtoimuni bolesti na crniot drob se mitohondrijalni protivtela, Tabela 20.1: Protivtela povrzani so avtoimuna bolest na crniot drob. Institut za imunobiologija i humana genetika 223 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM protivtela kon maznite muskuli i protivtela kon crnodrobni/bubre`ni mikrozomi. Vo najgolem del od slu~aite, titarot na ovie protivtela e od klini~ko zna~ewe. Taka, visok titar na mitohondrijalni protivtela e povrzan so primarna bilijarna ciroza vo pove}e od 95% od slu~aite, dodeka nizok titar na ovie protivtela se sretnuva kaj hroni~en aktiven hepatit, mehani~ka bilijarna opstrukcija i nekolku drugi avtoimuni bolesti. Za pove}eto od razli~nite mitohondrijalni protivtela, numerirani od M1 do M9, glavno se poznati protivgenskite celi, a povrzani se so razli~ni bolesti. 20.1.4. Protivtela povrzani so nevromuskularni bolesti 20.1.4.1. Protivtela kon acetilholinski receptori Ovie protivtela se otkrieni kaj bolni so mijastenija gravis, a se sretnuvaat vo poniska koncentracija i kaj bolni so okularna mijastenija. Postojat 3 tipa vakvi protivtela: vrzuva~ki, blokira~ki ili modulira~ki protivtela. Vrzuva~kite protitela se reaktivni kon nekolku epitopi od motornata plo~a i ne go prepoznavaat acetilholinskoto vrzuva~ko mesto. Se sretnuvaat kaj 88% od bolnite so aktivna mijastenija. Blokira~kite protivtela reagiraat so acetilholinskoto vrzuva~ko mesto i se sretnuvaat kaj 50% od bolnite so aktivna bolest. Modulira~kite protivtela nekoga{ se od pomo{ za dijagnoza na bolni so mijastenija gravis, koi se negativni za ostanatite dva vida na protivtela. 20.1.5. Avtoprotivtela povrzani so bubre`na bolest 20.1.5.1. Protivtela kon glomerulskata bazalna membrana Ovie protivtela se sretnuvaat kaj klasi~en nelekuvan Gudpasterov sindrom (Goodpasture syndrom) i se naso~eni kon nekolagenskiot del od alfa-3 verigata vo tip IV kolagenot. Klasi~nata prezentacija na ovaa bolest e rapidno progresiven glomerulonefrit. Poradi sli~nosta na protivgenskite epitopi pome|u renalnata i belodrobnata alveolarna membrana, mo`na e istovremena pojava i na pulmonalni hemoragii i hemoptizii. Visok titar na ovie protivtela mo`e da perzistira duri i po klini~ka remisija i sporo se namaluva vo tek na nekolku meseci. Renalna transplantacija e opcija za lekuvawe samo kaj pacienti negativni za protivtela, zaradi izbegnuvawe na remisija na bolesta. 224 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 20: ORGAN SPECIFI^EN AVTOIMUNITET 20.2. Zada~i 20.2.1. Opredeli koncentracija na tiroidni avtoprotivtela (TG i TPO) Koncentracijata na tiroidnite avtoprotivtela na Institutot za imunobiologija i humana genetika se opredeluva so UniCap-101 posvten samo za taa namena (Slika 20.1). Poradi visokata fluorescencija koja se koristi pri opredeluvaweto na avtoprotivtelata, istovremenoto koristewe na aparatot za ispituvawe alergii i za ispituvawe avtoprotivtela doveduva do zagaduvawe na diskot, poradi {to e najdobro da se koristat dva oddelni aparati za ovie dve nameni. Prvo se vklu~uva kompjuterot, a vedna{ potoa aparatot. So dvojno kliknuvawe na ikonata ImmnunoCAP Information Data Manager se vleguva vo programata (softver) preku koja se povrzani aparatot i kompjuterot. Otkoga }e se vklu~i progarmata na ekranot so slika se prika`ani dvata aparata (UniCap 100 i UniCap 101), a pod niv na dolniot del se gledaat ikoni preku koi se kontrolira rabotata. Vedna{ pod slikata na aparatot mo`e da se vidi dali aparatot e vklu~en (vo toj slu~aj ima `olto svetlo i pi{uva “free”-slobodno), isklu~en (crveno svetlo i pi{uva Slika 20.1: UniKap-101 (UniCap-101) avtomatiziran laboratoriski sistem na Institutot za imunobiologija i humana genetika, Medicinski fakultet, Skopje specijalno namenet za opredeluvawe avtoprotivtela. “off-line”) ili ako raboti imame zeleno svetlo i pi{uva “assay” (Slika 16.3). Koga }e vidime deka aparatot ja postignal potrebnata temperatura i se povrzal so kompjuterot (toa se gleda so `olta boja na ekranot ili na ekranot od samiot aparat pi{uva: prepare run? (podgotvi se za rabota)), kliknuvame edna{ na ikonata na dolniot del od ekranot na koja pi{uva “request” (barawe) ili pritiskame F2. Toga{, ni se prika`uvaat site pacienti koi dotoga{ se izraboteni. Od desnata strana na ekranot ima 3 ikoni preku koi se vnesuvaat novi pacienti (ikonata so oznaka Institut za imunobiologija i humana genetika 225 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Slika 20.2: Ekranot za vnesuvawe avtoprotivtela (paneli) na aparatot UniKap-101 (Uni-Cap-101). “new”), se otvaraat ve}e izrabotenite (ikona – “open“) ili se bri{at nekoi podatoci (ikona – “delete” ) (Slika 20.2). Pod niv ima naredbi so ~ie selektirawe mo`e da se vidat site izraboteni pacienti, onie koi ne se po~nati da se rabotat, onie koi vo momentot se rabotat i podatocite ili rezultatite koi sme gi odobrile ili odbile. So klik na prvata ikona (“new”) vleguvame vo prozorecot kade{to se vnesuva laboratoriskiot broj na pacientot i kade {to se biraat analizite koi treba da se izrabotat. Vo kvadrat~eto so oznaka “Sample Id” se vnesuva laboratoriskiot broj na pacientot i se pritiska “enter”. Sega od stranata ni se aktiviraat dve ikoni od koi vo prvata gi ima site testovi koi se rabotat so ovoj aparat, a vo vtorata se testovi koi se rabotat spored dijagnozata na pacientot i se narekuvaat paneli. So klik na prvata ikona "add test" se poka`uva tabela koja e podelena na dva dela. Od levata strana se metodite koi se rabotat na ovoj aparat. Metodot se bira so negovo ozna~uvawe i pritiskawe na “enter”. Na desnata strana se nao|aat specifi~nite alergeni koi se biraat na Slika 20.3: Ekranot za izbor na metodite koi sakame da gi rabotime na aparatot UniKap-101 (UniCap-101). 226 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 20: ORGAN SPECIFI^EN AVTOIMUNITET Slika 20.4: Ekranot za izbor na pacientite koi sakame da gi rabotime na aparatot UniKap-101 (UniCap-101). ist na~in. Potoa se zatvora tabelata i se kliknuva na ikonata “save” za da se zapametat baranite podatoci. Na ovoj na~in se vnesuvaat site pacienti (Slika 20.3). Po vnesuvaweto na pacientite i nivnite analizi se vra}ame na po~etnata strana (stranata na koja {to ima slika od aparatite) so pritiskawe na ikona na koja {to pi{uva “back” . Potoa kliknuvame dva pati na aparatot koj {to sakame da go pu{time. Ni se otvaraat dve tabeli. Na levata strana gi gledame site metodi koi se rabotat so ovoj aparat i so kliknuvawe na praznite kvadrat~iwa se biraat metodite koi planirame da gi rabotime (Slika 20.4). So samoto birawe na metodot na desnata strana ni se prika`uvaat site laboratoriski broevi na vnesenite neizraboteni pacienti koi gi sodr`at baranite analizi. Otkoga }e go odbereme metodot i }e ni se poka`at na ekranot pacientite koi treba da se rabotat po~nuvame so nivno selektirawe na ist na~in odnosno so kliknuvawe na kockite pred laboratoriskiot broj. Slika 20.5: Lista na raspredelba (Distribution list) e na aparatot Uni-Kap101 (UniCap-101). Institut za imunobiologija i humana genetika 227 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Site stapki od ponatamo{niot proces se avtomatizirani i od ekranot na samiot aparat ~itame {to treba da se napravi. Prvo ne pra{uva dali gore opi{anite kanti~ki se polni i pravilno rasporedeni. Odgovorot se vr{i so pritiskawe na kop~iwata "yes" i "no" na tastaturata od samiot aparat. Potoa se vnesuvaat serumite na pacientite (ima to~no opredelena pozicija za sekoj serum, a taa mo`e da se vidi i od listata na raspredelba). Otkoga }e se vnesat serumite se stava kontrola za kalibracionata kriva koja e so oznaka EL-GCC1. Potoa se vnesuvaat reagensite koi ni se potrebni. Kowugatot za ELIAIgG, stoi sekoga{ na pozicija A na nadvore{niot nosa~. Pri stavaweto na kowugatot aparatot bara da se vnese specifi~niot kod od kalibracijata za toj mesec. Tabela 20.2: Vnesuvawe rezultati od avtoprotivtela od UniCap-101. Se vnesuva razvoen rastvor (development solution) na pozicija E i zapira~ki rastvor (stop solution ) na pozicija H i se vnesuva rastvor za razreduvawe (diluent) na pozicija G. Pri vnesuvawe na serumite, posle sekoj serum se stava prazna epruvetka vo koj samiot aparat avtomatski pravi razreduvawe na serumot od pacientot. Potoa zapo~nuva so edna slepa proba koja{to trae 2 min, pri{to toj gi proveruva kanti~kite i dali se e staveno na soodvetnoto mesto. Od ekranot mo`e da vidime koe avtoprotiv-telo treba da se vnese. Avtoprotivtelata se redat na vnatre{niot nosa~. Vo ovoj sistem avtoprotivtelata se fiksirani na top~iwa koi se naredeni vo penkala. Od nadvor se postavuva penkaloto, a aparatot sam gi zema i gi redi na to~no opredelenata pozicija. Dobienite rezultati se vnesuvaat vo formular pogoden za taa namena (Tabela 20.2). Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod) Data Student (ime i prezime) Asistent (potpis i pe~at) ______________ ____________________________ __________________________ 228 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 21: ANALIZA NA AVTOIMUNI ZABOLUVAWA VE@BA 21: ANALIZA NA AVTOIMUNI ZABOLUVAWA 21.1. Normalni vrednosti za sistemski avtoprotivtela Normalnite vrednosti za sistemskite avtoprotivtela se iska`uvaat razli~no zavisno od upotrebenata metoda. Vo morfolo{kite ispituvawa, kako {to e imunofluorescencijata, tie se definiraat kako pozitivni (so iska`uvawa na intenzitet vo oblik na plusevi) ili negativni. Imunofluorescencijata mo`e da dade i opisni rezultati, kako na primer vo koj del od kletkata se gleda fluorescencijata, kakov oblik ima i sli~no. Vo kvantitaivnite merewa avtoprotivtelata mo`at da se iska`at kako titar na avtoprotivtela (titar e recipro~na vrednost vo najgolemoto razreduvawe koga e vidliva reakcija), kako apsolutna vrednost vo me|unarodni edinici vo eden mililitar (IE/mL), ili kako relativni kvantitativni soodnosi (Tabela 21.1). Na tabelata se dadeni sme{i i oddelni avtoprotivtela. Sme{ite se ispituvaat koga sakame da vidime dali voop{to postoi zgolemuvawe na bilo koe od sostavnite avtoprotivtela. Ako e rezultatot negativen ne pravime dopolnitelni ispituvawa, no dokolku e pozitiven se ispituvaat site oddelni avtoprotivtela koi gi ima vo sme{ata. Na toj na~in se racionalizira potrebniot broj ispituvawa, se {tedat vreme i pari. Za polesno komunicirawe so klini~kite doktori vneseni se krateni za sekoe avtoprotivtelo, kako i metodot so koj se ispituvaat (VARELISA ili ELIA). Interpretacijata na rezultatite mo`e da bide kvantitativna i/ili kvalitativna. Se gleda deka sme{ite od protivtela mo`at da se analiziraat samo kvalitativno (negativno, grani~no ili pozitivno), dodeka oddelnite avtoprotivtela mo`at da bidat analizirani samo kvantitativno (negativno, grani~no ili pozitivno) ili i na dvata na~ini. Sekako deka vrednostite na oddelnite avtoprotivtela variraat zavisno od osetlivosta na upotrebenata metoda i od nivnata koli~ina vo serumot. Institut za imunobiologija i humana genetika 229 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM Tabela 21.1: Normalni vrednosti na avtoprotivtelata kaj sistemskite zaboluvawa. 21.2. Normalni vrednosti za organ specifi~ni protivtela Normalnite vrednosti za organ specifi~nite avtoprotivtela se dadeni na Tabela 21.2. Nivnoto prika`uvawe e sli~no kako i kaj sistemskite avtoprotivtela, samo {to molekulite koi se ispituvaat se odnesuvaat specifi~no za opredelen organ. Na tabelata se dadeni normalnite vrednosti na avtoprotvtelata vo endokriniot sistem i avtoprotivtelata vo gastrointestinalniot sistem, dodeka normalnite vrednosti za avtoprotivtelata na drugite organski sistemi ne se dadeni. 230 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 21: ANALIZA NA AVTOIMUNI ZABOLUVAWA Tabela 21.2: Normalni vrednosti na avtoprotivtelata kaj organ specifi~nite zaboluvawa. 21.3. Tolkuvawe sistemski avtoprotivtela Princip na procedurata. EliA bunar~iwata se oblo`eni so soodveten protivgen. Dokolku se prisutni vo analiziraniot primerok, avtoprotivtelata se vrzuvaat za protivgenot. Po plaknewe na nevrzanite protivtela, protiv IgG protivtelata obele`ani so enzim (IgG kowugat) se dodavaat za da se formira protivtelo-kowugat kompleks. Po inkubacija nevrzaniot kowugat se izmiva i vrzaniot kompleks se inkubira so rastvor za razvivawe. Potoa se meri fluorescencija i se sporeduva so standardna prava izrabotena za soodvetni kalibratori po {to se dobiva kvantitativen rezultat izrazen kako IE/mL (internacionalni edinici na mililitar). Presmetuvawe i interpretacija na rezultatite. Aparatot meri koncentracija na IgG vo mg/L. So koristewe faktor na konverzija definiran od specifi~niot kod na EliA rezultatite avtomatski se konvertiraat vo IE/mL (internacionalni edinici na mililitar) (IE/ml). Institut za imunobiologija i humana genetika 231 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 21.3.1. Avtoprotivtela kon dvoveri`na DNK (dvDNK) Primena. EliA dvDNK testot slu`i za kvantitativna in vitro detekcija na IgG protivtela naso~eni kon dvoveri`na DNK vo serum ili plazma. Spa|a vo antinuklearni antitela (ANA) i e visoko specifi~en obele`uva~ koj pretstavuva eden od dijagnosti~kite kriteriumi za SLE. Duri 90% od pacientite so aktiven SLE imaaat avto protivtela kon dvoveri`na DNK. Ovoj marker e va`en i za sledewe na aktivnosta na bolesta, osobeno kaj onie bolni so zasegawe na bubrezite preku sledewe titarot na avto protivtelata. 21.3.2. U1RNP Primena. EliA U1RNP testot slu`i za in vitro kvantitativno merewe na IgG protivtela kon U1RNP vo ~ove~ki serum i plazma, koi se va`ni vo klini~kata dijagnoza na me{ana bolest na svrznoto tkivo i sistemski lupus eritematozus. Objasnenie na testot. Odreduvaweto na antinuklearnite antitela (ANA) e od centralno zna~ewe za klini~ka dijagnoza na bolesti na svrznoto tkivo. U1-snRNP protivtelata tipi~no se prisutni kaj bolni od SLE (vo 3040% od slu~aite) i me{ana bolest na svrznite tkiva (sindrom na Sharp), kade se neophodni za postavuvawe na dijagnozata. Iako imunolo{kiot odgovor so protiv-U1snRNP protivtela podrazbira prisustvo kon trite proteinski komponenti (70 kDa, A, C), protiv-70 kDa protivtelata - osobeno kaj slu~aite so visok titar, se pospecifi~ni za me{ana bolest na svrznite tkiva, bidej}i se poretko prisutni kaj bolni so SLE (pribli`no kaj 12%), otkolku protivtelata kon A i C proteinite (pribli`no kaj 23%). Nekolku studii poka`uvaat deka protiv-U1-snRNP odgovor vo otsustvo na protiv-70 kDa protivtela e silno asociran so SLE. 21.3.3. RNP70 Primena. EliA RNP70 testot slu`i za in vitro kvantitativno merewe na IgG protivtela kon RNP70 vo ~ove~ki serum i plazma, koi se va`ni vo klini~kata dijagnoza na me{ana bolest na svrznoto tkivo i sistemski lupus eritematozus. 21.3.4. Sm Primena. EliA Sm testot slu`i za in vitro kvantitativno merewe na IgG protivtela kon Sm vo ~ove~ki serum i plazma, koi se va`ni vo klini~kata dijagnoza na sistemski lupus eritematozus. 232 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 21: ANALIZA NA AVTOIMUNI ZABOLUVAWA 21.3.5. Ro ANALIZA NA SLU^AJ Primena. EliA Ro testot slu`i za in vitro kvantitativno merewe na IgG protivtela kon Ro vo ~ove~ki serum i plazma, koi se va`ni vo klini~kata dijagnoza na Sjegrenov sindrom i sistemski lupus eritematozus. 21.3.6. La Primena. EliA La testot slu`i za in vitro kvantitativno merewe na IgG protivtela kon La vo ~ove~ki serum i plazma, koi se va`ni vo klini~kata dijagnoza na Sjegrenov sindrom i sistemski lupus eritematozus. 21.3.7. CENP Sistemski lupus eritematozus: Slu~ajot na Nikolina Cekovska, premnogu sonce na pla`a. Primena. EliA CENP testot slu`i za in vitro kvantitativno merewe na IgG protivtela kon CENP vo ~ove~ki serum i plazma, koi se va`ni vo klini~kata dijagnoza na sklerodermija (CREST sindrom). 21.3.8. Scl-70 Primena. EliA Scl-70 testot slu`i za in vitro kvantitativno merewe na IgG protivtela kon Scl-70 vo ~ove~ki serum i plazma, koi se va`ni vo klini~kata dijagnoza na sklerodermija (difuzna forma). 21.3.9. Jo-1 Primena. EliA Jo-1 testot slu`i za in vitro kvantitativno merewe na IgG protivtela kon Jo-1 vo ~ove~ki serum i plazma, koi se va`ni vo klini~kata dijagnoza na polimiozitis/dermatomiozitis. 21.3.10. Avtoprotiv tela kon proteinaza 3 (PR3) So ovaa metoda se vr{i in vitro kvantitativno merewe na IgG protivtela naso~eni kon proteinaza 3 (PR3) vo serum i plazma. Spa|a vo ANKA i e marker za Vegenerova granulomatoza (visoko specifi~ni - 97%, i senzitivni - 81%), a pozitiven e i kaj pacienti so mikroskopski poliangiitis (vaskulitis na malite krvni sadovi), Chrug – Strauss Sy (alergi~en granulomatozen vaskulit), nekrotizira~ki glomerulonefritis. 21.3.11. Avtoprotiv tela kon mieloperoksidaza (MPO) So ovaa metoda se vr{i in vitro kvantitativno merewe na IgG protivtela naso~eni kon mieloperoksidaza (MPO) Institut za imunobiologija i humana genetika 233 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM vo serum i plazma. Spa|a vo ANKA i e pozitiven kaj pacienti so mikroskopski poliangiitis (vaskulitis na malite krvni sadovi), Chrug – Strauss Sy (alergi~en granulomatozen vaskulit), nekrotizira~ki glomerulonefritis. 21.3.12. Avtoprotiv tela kon alfa3 lanecot na kolagen 4 (GBM) So ovaa metoda se vr{i in vitro kvantitativno merewe na IgG protivtela naso~eni kon alfa3 verigata od kolagen 4. Spa|a vo ANKA i e pozitiven kaj pacienti so Gudpasteroviot sindrom (Goodpasteure syndrom), anti-GBM bolest, ANKA asociran vaskulitis. 21.3.13. Kardiolipinski protivtela Primena. Varelisa testot za kardiolipinski protivtela (PKP) slu`i za semikvantitativno i kvalitativno odreduvawe na IgG ili IgM protivtela kon kardiolipin vo human serum ili plazma, koi se va`ni za dijagnoza na primarna antifosfolipiden sindrom i za evaluacija na trombo-ti~niot rizik kaj pacienti so SLE. Objasnenie na testot. Antikardiolipinskite protivtela pripa|aat na grupata antifosfolipidni protivtela. Najprvo tie bile otkrieni kaj bolni od sifilis, a pokasno i kaj bolni od SLE i drugi revmatski bolesti. Antifosfolipidniot sindrom poznat i kako sindrom na Hughes, se karakterizira so tipi~na klini~ka slika koja vklu~uva arteriska/venska tromboza ili rekurentni abortusi i prisutni antifosfolipidni protivtela. Okolu 5% od normalnata navidum zdrava populacija mo`e da bide pozitivna za PKP. Goleminata na ovaa grupa se zgolemuva so tekot na stareeweto. Protiv-kardiolipinskite protivtela se karakteristi~ni za protivfosfolipidniot sindrom (PFS) (primaren ili sekundaren), a se sre}avaat so prevalenca od 30-40% i kaj pacientite so SLE. Nivna klini~ka manifestacija bi bila pojavata na tromboza, povtoruva~ki abortusi, trombo-citopenija, nevrolo{ki poremetuvawa i dr. PKP kaj protivfosfolipidniot sindrom se sretnuvaat so slednava prevalenca: a) Kaj primaren PFS - Kardiolipinski IgG 81%, IgM 40% i IgA 24%. b) Kaj sekundaren PFS - Kardiolipinski IgG 85%, IgM 65% i IgA 10%. Normalnite vrednosti mo`at da variraat vo zavisnost od Tabela 21.3: Normalni vrednosti na protivkardiolipinski protivtela (PKP). 234 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 21: ANALIZA NA AVTOIMUNI ZABOLUVAWA populacijata, na~inot na ishrana, laboratoriskite tehniki koi se koristat i od selekcijata na kontrolnata grupa od koja se izvedeni. Anti kardiolipinskite protivtela prisutni kaj infektivni bolesti ili kaj antifosfolipiden sindrom mo`e da se razlikuvaat spored nivnata zavisnost od kofaktori: kaj pacientite so infektivna bolest protivtelata se naso~eni kon ~ist fosfolipid kako protivgen, dodeka protivtelata kaj pacienti so PFS baraat glikoprotein 1 kako kofaktor. Ovie protivtela se zna~ajni zaradi zgolemena tendencija za venska/arteriska tromboza (vklu~itelno apopleksija), trombocitopenija, ~esti abortusi i neurolo{ki manifestacii na pacienti pozitivni za ovie protivtela. Zgolemeni nivoa na ovie protivtela se sretnuvaat i kaj pacienti so cerebrovaskularna insuficiencija ili miokarden infarkt. 21.4. Tolkuvawe organ specifi~ni avtoprotivtela 21.4.1. Antitiroglobulinski protivtela (TG) Primena. Varelisa TG (Tiroglobulin) testot slu`i za kvantitativno i kvalitativno odreduvawe na protivtiroglobulinski protivtela vo serum ili plazma koi se va`ni za klini~ka dijagnoza na tiroidna bolest kako na pr. avtoimun tiroiditis i Graves-ova bolest. Objasnenie na testot. Tiroidnite avtoimuni bolesti se grupa na razli~ni, no patogenetski povrzani organspecifi~ni zaboluvawa na tiroidnata `lezda, karakterizirani pred se so prisustvo na avto protivtela kon tiroidni protivgeni, kako na pr. tiroglobulinot (TG), tiroidnata peroksidaza (TPO) ili TSH receptorot. Pove}e od 98% od bolnite so tiroiditis imaat protivtela kon TG, TPO ili i dvata. Avtoprotivtela kon TG se prisutni kaj pove}eto pacienti so gu{avost (Ha{imotov tiroidit), kaj pove}e od 30% od bolnite so Graves-ova bolest i vo varijabilen procent od pacienti so druga avtoimuna bolest na tiroideja, kako na pr. tivok tiroiditis, postpartalen tiroiditis, ili pak perniciozna anemija, dijabet i Adisonova bolest. Zgolemeni nivoa na TG protivtela se sretnuvaat i kaj zdravi individui (od 3,2% do 17,8% vo selektirana `enska populacija). 21.4.2. TPO Primena. Varelisa TPO testot slu`i za kvantitativno i kvalitativno odreduvawe na protiv-TPO (tiroidna peroksidaza) protivtela vo serum ili plazma koi se va`ni Institut za imunobiologija i humana genetika ANALIZA NA SLU^AJ Ha{imotov tiroidit: Slu~ajot na Blaguwa Setolska, bezbolno ote~uvawe na vratot. 235 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM za klini~ka dijagnoza na tiroidna bolest kako na pr. avtoimun tiroiditis i Graves-ova bolest. Objasnenie na testot. Hroni~niot avtoimun tiroiditis (Ha{imoto tiroiditis) e originalnata paradigma za avtomuna bolest voop{to. Gi zafa}a `enite 4 do 20 pati po~esto od ma`ite, a naj~esto se javuva kaj `eni na vozrast pome|u 30 i 60 godini. Protivtela kon TPO imaat pove}e od 70% od bolnite so Graves-ova bolest i vo razli~en procent pacienti so netiroidna avtoimuna bolest i normalni individui. Titarot na ovie avtoprotivtela ne korelira so funkcionalniot tiroiden status. 21.4.3. Protivtela kon parietalni kletki Primena. Varelisa testot za avtoprotivtela kon parietalni kletki slu`i za semikvantitativno i kvalitativno odreduvawe na ovie protivtela vo serum ili plazma koi se va`ni za klini~ka dijagnoza na perniciozna anemija. Objasnenie na testot. Pernicioznata anemija e organ specifi~na avtoimuna bolest na gastri~nata mukoza, koja se karakterizira so hroni~en atrofi~en gastritis od tip A, ahlorhidrija, nedostatok na produkcija na intrinzik faktor, malapsorbcija na vit. B12 i prisustvo na protivtela kon parietalnite kletki i kon intrinzik faktorot. Bolesta prete`no zafa}a belci so Severno evropsko poteklo. Naj~esta pri~ina e deficit na vit. B12. Kaj pove}e od 90% od site pacienti so perniciozna anemija mo`e da se detektiraat cirkulira~ki protivtela kon parietalnite kletki. Ovie protivtela ~esto mo`e da se najdat i kaj rodnini na pacienti so perniciozna anemija (20-30%). 21.4.4. Test za GBM protivtela Primena. Varelisa testot GBM slu`i za semikvantitativno i kvalitativno odreduvawe na protivtela kon konstituent na glomerularnata bazalna membrana (alfa3 verigata od kolagen tip 4) vo human serum ili plazma, a va`ni se za dijagnoza na bubre`ni zaboluvawa. Objasnenie na testot. Protivtelata kon bazalnata glomerularna membrana se eden od trite specifi~ni kriteriumi za dijagnoza na Gudpasteroviot sindrom. Ostanatite dva kriteriumi za organ-specifi~no avtoimuno zaboluvawe vklu~uvaat rapidno progresiven glomrulonefritis i pulmonalni hemoragii. Dopolnitelno i drugi avtoimuni bolesti (kako ANCA asociran vaskulitis) mo`e da se pridru`eni na Gudpasteroviot sindrom. Bidej}i GBM protivtelata se patogeni za bubregot, nivno detektirawe uka`uva na visok rizik za razvivawe na akutna bubre`na slabost. Zatoa nivnoto otkrivawe ne e samo va`no za dijagnoza na ovoj sindrom, tuku e va`no i za pacienti so glomerulonefritis, pozitiven rezultat za 236 Institut za imunobiologija i humana genetika VE@BA 21: ANALIZA NA AVTOIMUNI ZABOLUVAWA ANCA ili vo priprema na transplantacija. Protivgenot za koj GBM protivtelata se specifi~ni se nao|a skoro isklu~ivo vo bazalnite membrani na bubregot i belite drobovi. Bidej}i protivtelata se naso~eni kon t.n. “nekolageni” domeni koi se skrieni vo nivnata nativna struktura, za detekcija na protivtelata se koristi denaturiran protivgen. Toa e te{ko da se postigne so indirektnata imunofluorescencija i zaradi toa ovie testovi se so mala senzitivnost. Toa gi pravi ELISA testovite koi koristat denaturiran pro~isten protivgen (vklu~itelno i Varelisa GBM testot) metod od izbor za detekcija na GBM protivtelata. 21.4.5. Test za protivspermalni protivtela Primena. Varelisa testot za protivspermalni protivtela slu`i za semikvantitativno i kvalitativno odreduvawe na ovie protivtela vo human serum ili plazma, koi se va`ni za dijagnoza na imunolo{ki uslovena subfertilnost ili infertilnost. Objasnenie na testot. Vo zapadnite op{testva, incidencata na infertilnost se dvi`i pome|u 10 i 15%. Postoeweto na protivtela kon spermatozoidi se pretpostavuvalo dolgo vreme. Denes so sigurnost se znae deka i ma`ite i `enite sozdavaat protivspermalni protivtela, {to vo golema mera mo`e negativno da vlijae na uspehot vo reprodukcijata. Iako pri~inite za postoeweto na ovie protivtela seu{te ne se jasno definirani, tie se priznati kako zna~aen faktor vo etiologijata na imunolo{ki uslovenata subfertilnost. Kaj ma`ite, spermatozoidite se skrieni od imuniot sistem so pomo{ na t.n. krvnotestikularna bariera. Koga ovaa bariera e poremetena, kako pri testikularna trauma, vazektomija, opstrukcija na kanalot na epididimis ili infekcija, spermatozoidite stanuvaat imunogeni. Pomalku se znae za uslovite pod koi se sozdavaat izoprotivtelata kaj `eni. Se pretpostavuva deka nespecifi~ni bakteriski ili virusni infekcii mo`e da vodat do sozdavawe na protivtela koi vkrsteno gi prepoznavaat spermatozoidite. Edinstveni protivtela so klini~ko zna~ewe se onie koi se specifi~ni za spermalnata plazmatska membrana. Tie go zasegaat motilitetot na spermatozoidite i voop{to nivnoto u~estvo vo oploduvaweto preku pre~ki vo penetracijata niz cervikalniot mukus, prika~uvaweto na spermatozoidot za jajce kletkata, kako i negovata penetracija vo jajce kletkata i kone~no samoto oploduvawe. 21.4.6. Protivmitohondrijalni protivtela Primena. Varelisa M2 testot slu`i za semikvantitativno i kvalitativno odreduvawe na mitohondrijalni M2 Institut za imunobiologija i humana genetika 237 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM protivtela vo human serum ili plazma, koi se va`ni za dijagnoza na primarna bilijarna ciroza. Objasnenie na testot. Primarnata bilijarna ciroza e hroni~na inflamatorna bolest na crniot drob. Ranata faza na bolesta histolo{ki se karakterizira so inflamatorni infiltrati vo periportalnite porostori, osobeno vo regionot na septalnite i interlobularni `ol~ni kanali. Bolesta napreduva kon progresivna destrukcija na malite i srednite `ol~ni kanali {to vodi do crnodrobna fibroza, a vo terminalniot stadium na bolesta doa|a do kompletna ciroza. Bolesta mo`e dolgo vreme da perzistira bez simptomi. Naj~esto zapo~nuva me|u 40 i 60 godini vozrast, a 6 do 10 pati e po~esta kaj `eni. Etiologijata seu{te ne e poznata, no se pretpostavuva deka e od avtoimuna priroda. Tipi~na karakteristika na bolesta e prisustvo na avtoprotivtela naso~eni kon mitohondrijalni protivgeni. Denes se razlikuvaat 9 razli~ni protiv-mitohondrijalni protivtela (M1 do M9). Od zna~ewe za primarnata bilijarna ciroza se M2, M4, M8 i M9. M2 protivtelata se sretnuvaat kaj okolu 95% od bolni so ovaa bolest. 21.4.7. LKM1 protivtela Primena. Varelisa LKM1 testot slu`i za semikvantitativno i kvalitativno odreduvawe na LKM1 protivtela vo human serum ili plazma, koi se va`ni za dijagnoza na avtoimun hepatitis (AIH). Objasnenie na testot. Generalno, na avtoimuniot hepatitis otpa|aat 10-40% od site hroni~ni aktivni hepatitisi koi se negativni za HbsAg. Postojat nekolku pove}e ili pomalku specifi~ni protivtela koi se sretnuvaat kaj AIH. Antinuklearnite protivtela (ANA) i protivtelata kon mazni muskuli i aktin se dijagnosti~ki relevantni za AIH tip1, poznat kako lupoiden AIH. Toa e klasi~niot i naj~est tip na avtoimun hepatitis. AIH tip 2 se javuva kaj pove}e od 50% od decata so AIH. Se karakterizira so protivtela kon mikrozomite od bubreg/ crn drob (LKM). Tie reagiraat predominantno so 50 kD protein identifikuvan kako P450 2D6. Vo ovoj test se koristi rekombinanten human citohrom P450 2D6 protivgen. Serolo{koto razdvojuvawe na dvata tipa na AIH e zna~ajno bidej}i AIH tip 2 se smeta za poprogresiven i kaj nego pobrzo se razviva ciroza na crn drob. 82% od bolnite so AIH tip 2, nasproti 43% od bolnite so AIH tip 1 razvivaat ciroza vo tek na 3 godini. Retko postoi pozitiven rezultat za LKM protivtelata i kaj virusen hepatit C (HCV). Bidej}i terapijata na avtoimun i virusen hepatit e razli~na, terapevtskite ~ekori treba vnimatelno da se izbiraat. Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod) Data Student (ime i prezime) Asistent (potpis i pe~at) ______________ ____________________________ __________________________ 238 Institut za imunobiologija i humana genetika 22: OSNOVNI LABORATORISKI PRAVILA 22. OSNOVNI LABORATORISKI PRAVILA 1. Za poefikasno da gi sovladate prakti~nite ve`bi po imunologija, predvidenata sodr`ina nau~ete ja pred doa|awe na ve`bi; 2. Ne e dozvoleno zamenuvawe na ve`bite (vo isklu~itelni sostojbi konsultirajte se so [efot na katedrata); 3. Za{titna obleka (mantil) mora da se nosi za celo vreme na izveduvawe na ve`bite/eksperimentite; 4. Sekoj student e odgovoren za odr`uvawe na negovata uredna i sredena rabotna povr{ina; 5. Ne frlajte hartija, staklo ili plastika vo mijalnicite; 6. Ne koristete mobilni telefoni za vreme na izveduvaweto na prakti~nata nastava; 7. Za o{tetuvawe na oprema ili prekumerno tro{ewe na reagensi }e se napla}a soodveten pari~en nadomestok. Bezbedonosta e va{a osnovna gri`a za vreme na va{iot prestoj vo laboratoriite, zatoa zemete gi vo predvid slednive preporaki: 1. Biolo{kite primeroci koi se koristat vo laboratoriskite testovi (na pr. krv) treba sekoga{ da se tretiraat kako potencijalno infektivni. Primerocite od visoko rizi~ni pacienti se posebno ozna~eni i se rabotat vo izdvoeni rabotni povr{ini. 2. Direktno izlo`uvawe na ultravioletno svetlo mo`e da dovede do akutno o{tetuvawe na retinata od 30 minuti do 24 ~asa po izlo`uvaweto. Zatoa UV svetloto sekoga{ se gleda preku soodvetno za{titno staklo; 3. Ne jadete, ne pijte i ne pu{ete vo laboratoriite; 4. Ne rabotete vo laboratoriite, osven vo vremeto prevideno za izveduvawe na ve`bi; 5. Ne vnesuvajte posetiteli vo laboratoriite bez prethodna dozvola na nastavnicite; 6. Ne probuvajte da pravite eksperimenti koi ne se predvideni. Za bilo kakvi modifikacii vo rabotata, prethodno pobarajte dozvola od nastavnikot; 7. Ne tr~ajte niz laboratoriite. Koga rabotite so hemikalii: 8. Ne pipetirajte so usta, sekoga{ koristete pipetori so prodol`etoci za edna upotreba; 9. Sekoga{ nosete za{titni rakavici i izbegnuvajte kontakt na ko`ata so reagensite, kontrolnite primeroci ili primerocite za ispituvawe; 10. Nikoga{ ne dodavajte voda na koncentrirani bazi ili kiselini; 11. Nikoga{ ne me{ajte koncentrirani bazi i kiselini; 12. Nikoga{ ne isturajte zapalivi supstancii vo blizina na plamen; 13. Nikoga{ ne vra}ajte koristen reagens vo novo {i{ence. Vo slu~aj na nesre}a: 14. Za bilo kakov incident (duri i isturawe nekolku kapki od nekoj reagens) vedna{ izvestete go va{iot nastavnik. Institut za imunobiologija i humana genetika 239 Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM 23. LITERATURA 1. Hyde RM. National Medical Series for Independent Study. Immunology. Williams & Wilkins: Philadelphia, 1995:1-316. 2. Spiroski M, Kolevski P. Osnovni imunolo{ki metodi. MEDIS - informatika: Skopje, 1995. 3. Roitt I. Roitt’s Essential Immunology. Blackwell Science: Oxford, 1997. 4. Spiroski M@. IMUNOST - 1. Imunolo{ka {kola. Katedra za imunologija: Skopje, 1998. 5. Andreis I, ^ulo F, Maru{i} M, Taradi M. Imunologija. Medicinska Naklada - Zagreb, 1998. 6. Paul WE. Fundamental Immunology. Lippincott - Raven: Philadelphia, 1999. 7. Janeway CA, Travers PWalport M, Capra JD. Immunobiology. The Immune System in Health and Disease. Current Biology Publications: London, 1999. 8. Roitt I, Brostoff J, Male D. Immunology. Mosby: London, 2000. 9. Goldsby RA, Kindt TJ, Osborne BA. Kuby Immunology. Freeman: New York, 2000. 10. Abbas AK, Lichtamn AH, Pober JS. Cellular and Molecular Immunology. Saunders Company: Philadelphia, 2000. 11. Nastavni sodr`ini od imunologija 1999/2000. Institut za imunobiologija i humana genetika, Instituti, Medicinski fakultet: Skopje 2000. 12. Spiroski M, Trajkov D, Petli~kovski A, Arsov T, Strezova A, Efinska-Mladenovska O. Imunolo{ki praktikum. Institut za imunobiologija i humana genetika, Instituti, Medicinski fakultet: Skopje 2005. 240 Institut za imunobiologija i humana genetika
© Copyright 2024 Paperzz