Οκτώβριος 2010 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ Τμήμα Γεωπονίας, Φυτικής Παραγωγής & Αγροτικού Περιβάλλοντος Εργαστηριακές Ασκήσεις Γενικής Βιολογίας & Βιολογίας Kυττάρου ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Μορφολογία φυτικών ιστών Μορφολογία οργανιδίων Κυτταρικός κύκλος σε ακρορρίζια κρεμμυδιού Χρώση αμυλοκόκκων ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ‐ Χρώση κατά Gram ΩΣΜΩΤΙΚΗ ΙΣΟΡΡΟΠΙΑ ‐ Πλασμόλυση ΑΥΞΗΣΗ – ΑΝΑΠΤΥΞΗ Βλάστηση παρουσία αυξητικών ορμονών Ωρίμανση Οικολογία ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΟΡΓΑΝΙΔΙΑ ‐ Απομόνωση ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ Φωτοσύνθεση ‐ Εκχύλιση και χρωματογραφία χλωροφύλλης ΑΡΤΕΜΙΣΙΑΦΟΙΒΗ Κυτταρικό τοίχωμα – Κυτταρίνη ΝΙΦΛΗ Απομόνωση αμυλόζης και αμυλοπηκτίνης ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 Γενική Βιολογία & Βιολογία Kυττάρου Εργαστηριακές Ασκήσεις Αντικείμενο της Βιολογίας αποτελούν οι έμβιοι οργανισμοί. Έμβιος οργανισμός καλείται κάθε αυτόνομη βιολογική μονάδα, η οποία διαθέτει τουλάχιστον μία από τις ακόλουθες ιδιότητες: 9 αίσθηση και αντίδραση σε ερεθίσματα 9 αναπαραγωγή 9 αύξηση 9 ανάπτυξη ή/και 9 ομοιόσταση. Οι έμβιοι οργανισμοί εμφανίζουν ομοιότητες και διαφορές, όπως αυτές έχουν διαμορφωθεί κατά την διάρκεια της εξέλιξης και ταξινομούνται σε προκαρυωτικούς (βακτήρια και αρχαία) και ευκαρυωτικούς (πρωτόζωα, φυτά, μύκητες και ζώα) [βλέπε ακόλουθη Εικόνα]. Το παρόν εργαστήριο εξυπηρετεί την εξοικείωση με την παρατήρηση των ιστών και των κυττάρων των οργανισμών, κυρίως φυτικών, και την μελέτη απλών και θεμελιωδών βιολογικών φαινομένων. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 2 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 ANIMALIA FUNGI PLANTAE PROTOZOA EUKARYA ARCHAEA ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ BACTERIA Σελίδα 3 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Εισαγωγή στη μικροσκοπία σελ 5 Μορφολογία φυτικών ιστών και κυτταρικών οργανιδίων σελ 6 Κυτταρικός κύκλος σε ακρορρίζια κρεμμυδιού σελ 10 Χρώση αμυλοκόκκων σελ 13 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ‐ Χρώση κατά Gram σελ 14 ΩΣΜΩΤΙΚΗ ΙΣΟΡΡΟΠΙΑ – Πλασμόλυση σελ 16 Βλάστηση παρουσία αυξητικών ορμονών σελ 19 Ωρίμανση σελ 21 Οικολογία σελ 22 σελ 24 Φωτοσύνθεση ‐ Εκχύλιση και χρωματογραφία χλωροφύλλης σελ 26 Κυτταρικό τοίχωμα – Απομόνωση κυτταρίνης σελ 30 Απομόνωση αμυλόζης και αμυλοπηκτίνης σελ 32 ΑΥΞΗΣΗ – ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΟΡΓΑΝΙΔΙΑ – Απομόνωση ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 4 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΦΥΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΩΝ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ Η παρατήρηση των κυττάρων δεν είναι δυνατή διά γυμνού οφθαλμού, λόγω του μικρού μεγέθους τους (1‐100 μm). Στην συνήθη εργαστηριακή πρακτική χρησιμοποιούμε οπτικό μικροσκόπιο το οποίο επιτρέπει έως και 1000 φορές την μεγέθυνση του προς παρατήρηση αντικειμένου. Προσοφθάλμιοι φακοί Αντικειμενοφόροι φακοί Τράπεζα Δείγμα Ρυθμιστής συμπυκνωτή Διάφραγμα και Μακρομετρικός & συμπυκνωτής μικρομετρικός κοχλίας Φωτεινή πηγή εστίασης Διάφραγμα φωτεινής πηγής Για την τρισδιάστατη παρατήρηση ιστών θα χρησιμοποιήσουμε στερεοσκόπιο. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 5 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ ΦΥΤΙΚΩΝ ΙΣΤΩΝ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΟΡΓΑΝΙΔΙΩΝ Η παρατήρηση των φυτικών παρασκευασμάτων στο μικροσκόπιο είναι σχετικά εύκολη, καθώς τα φυτικά κύτταρα διαθέτουν κυτταρικό τοίχωμα. Η δομή αυτή εξασφαλίζει αντίθεση στο οπτικό μικροσκόπιο και διευκολύνει την παρατήρηση της μορφολογίας των ιστών: δομή των στομάτων στα φύλλα, αγγειακό σύστημα (αγγεία και ηθμοσωλήνες), αναπαραγωγικά στοιχεία, αδένες. Επίσης, η παρουσία χρωστικών στους ιστούς επιτρέπει άμεση παρατήρηση κυτταρικών και υποκυτταρικών δομών σε οπτικό μικροσκόπιο. Εναλλακτικά, είτε για να αυξήσουμε την αντίθεση μεταξύ των δομών είτε για να δούμε άγχρωμες δομές, εφαρμόζουμε διαδικασία χρώσεως. Μία από τις συνηθέστερες χρώσεις στη Βοτανική είναι η χρώση με Safranin Red, το οποίο προσδένεται και βάφει κόκκινα τα κυτταρικά τοιχώματα (κηρούς, λιγνίνη, φαινολικές ουσίες και ταννίνες), όπως επίσης την χρωματίνη και τους χλωροπλάστες. Παράλληλα με την Safranin για την δημιουργία χρωματικής αντίθεσης και την διευκόλυνση της παρατήρησης χρησιμοποιείται η χρωστική Fast Green, η οποία βάφει την κυτταρίνη πράσινη. ΥΛΙΚΑ Φρέσκα φρούτα, φύλλα και λαχανικά Ξυραφάκια Αντικειμενοφόροι Καλυπτρίδες Μικροσκόπιο ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ • Κόβουμε με το ξυραφάκι λεπτές τομές καρπών και φύλλων. • Τοποθετούμε πάνω σε μία αντικειμενοφόρο. • Για να μην στεγνώσει το δείγμα μας, προσθέτουμε μερικές σταγόνες φυσιολογικό ορό. • Καλύπτουμε με καλυπτρίδα. • Τοποθετούμε στο μικροσκόπιο. • Εστιάζουμε. • Επιλέγουμε την κατάλληλη μεγέθυνση, ανάλογα με το μέγεθος της προς παρατήρηση δομής. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 6 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΕΣ ΔΟΜΕΣ Παρεγχυματικός ιστός Ο παρεγχυματικός ιστός αποτελείται από μεγάλα κύτταρα με σχετικά εύκαμπτο κυτταρικό τοίχωμα. Απαντάται σε αναπτυσσόμενα μαλακά μέρη του φυτού, όπου παρατηρείται έντονη μιτωτική δραστηριότητα, όπως σε νεοαναπτυσσόμενους βλαστούς και ρίζες και οφθαλμούς αλλά και στα φύλλα (μεσόφυλλο) και την σάρκα των καρπών. Το κυτταρικό τοίχωμα στο παρέγχυμα περιέχει κυτταρίνη. Αριστερά: Εγκάρσια όψη φύλλου. Δεξιά: Κάτω επιδερμίδα φύλλου με στόματα. Κολλέγχυμα Το κολλέγχυμα αποτελείται από κύτταρα με σχετικά παχύ και ανομοιόμορφο τοίχωμα. Προσφέρει στηριστικό ρόλο σε αναπτυσσόμενους ιστούς. Το κυτταρικό τοίχωμα στο κολλέγχυμα αποτελείται από κυτταρίνη και πηκτίνη. Εγκάρσια άποψη κολλεγχύματος από βλαστό σέλινου. Σκληρέγχυμα Το σκληρέγχυμα σχηματίζει τα σκληρά μέρη του φυτού, τα οποία προσφέρουν θρέψη και υποστήριξη. Αντιστοιχεί σε κύτταρα που έχουν πάψει να αυξάνονται σε μέγεθος ή σε νεκρά κύτταρα. Το τοίχωμά τους περιέχει κυτταρίνη, ημικυτταρίνη και λιγνίνη. Σκληρέγχυμα εντοπίζεται και στη σάρκα καρπών. Χαρακτηριστική περίπτωση αποτελεί ο καρπός του αχλαδιού (Εικόνα δεξιά). ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 7 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 Φλούδα πορτοκαλιού (Citrus aurantium) ΕΓΧΡΩΜΕΣ ΔΟΜΕΣ Χλωροπλάστες σε στόματα φύλλων Επιδερμίδα κρεμμυδιού (Allium cepa) Διακριτά κυτταρικά τοιχώματα. Ελαφρά ιώδες χρώμα. Εάν χρησιμοποιήσετε μωβ κρεμμύδια, θα μπορέσετε να παρατηρήσετε ιώδη χυμοτόπια. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Κόκκινη πιπεριά (Capsicum sp) Παρατήρηση έγχρωμων πλαστιδίων (χρωμοπλαστών) στην επιδερμίδα του καρπού. Σελίδα 8 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 ΕΤΟΙΜΑ ΔΙΑΘΕΣΙΜΑ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΑ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑΤΑ ΒΑΤΡΑΧΟΥ ΠΛΑΣΜΟΔΕΣΜΑΤΑ ΦΥΛΛΟ LILAC ΦΥΛΛΟ ΚΑΛΑΜΠΟΚΙΟΥ ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΠΕΥΚΟΥ ΞΥΛΩΜΑ SAMBUCUS ΡΙΖΑ RANUNCULUS ΚΩΝΟΣ ΠΕΥΚΟΥ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΡΕΜΜΥΔΙΟΥ ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 9 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΔΙΑΙΡΕΣΗ ΜΙΤΩΣΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ ΣΕ ΑΚΡΟΡΡΙΖΙΑ ΚΡΕΜΜΥΔΙΟΥ Η ανάπτυξη όλων των πολυκύτταρων οργανισμών, φαινομενικά αύξηση του όγκου/μάζας, στηρίζεται κυρίως στην αύξηση του αριθμού των κυττάρων και σε μικρότερο βαθμό στην συσσώρευση ενδοκυττάριων συστατικών. Προκειμένου να δημιουργηθούν νέα σωματικά κύτταρα, θα πρέπει τα γονικά να διπλασιάσουν καταρχήν το γενετικό τους υλικό και στη συνέχεια να το διαμοιράσουν ισόποσα στα θυγατρικά κύτταρα. Η διαδικασία αυτή ονομάζεται κυτταρικός κύκλος και περιλαμβάνει την μεσόφαση και την κυτταροδιαίρεση, γνωστή ως ΜΙΤΩΣΗ. ΥΛΙΚΑ Πλαστικά ποτήρια Κρεμμύδια ξηρά (Allium cepa) Λαβίδες Διαγραμμισμένοι σωλήνες Βάση για σωλήνες Μονιμοποιητικό διάλυμα οξικού οξέος : μεθανόλης, 1:3 (V/V) Διάλυμα ΗCl 1Μ dH2O Διάλυμα Feulgen για την χρώση του DNA Διάλυμα οξικού οξέος Θερμαντική εστία Κατσαρόλα Αντικειμενοφόροι Καλυπτρίδες Μαρκαδόρος Μικροσκόπιο Χαρτί κουζίνας ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Προεργασία: Πλένουμε καλά τα ξηρά κρεμμύδια n και τα τοποθετούμε σε πλαστικά ποτήρια, με το κάτω άκρο να βυθίζεται σε dH2O, όπως περιγράφεται στην εικόνα, ώστε να αναπτυχθούν τα ακρορρίζια. Η ανάπτυξη των ακρορριζίων απαιτεί τουλάχιστον 2‐3 ημέρες. Για την προετοιμασία του εργαστηρίου τα τοποθετούμε μία εβδομάδα νωρίτερα. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 10 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 2. Αφαιρούμε τα ακρορρίζια με ξυραφάκι. Κρατάμε το κατώτερο τμήμα. Τα κύτταρα που εμφανίζουν έντονη μιτωτική δραστηριότητα εντοπίζονται στο μερίστωμα της ρίζας (~ 3 mm Εικόνα 3, βέλος). Τοποθετούμε σε σωλήνες (τύπου Falcon). Ξεπλένουμε με dH2O. p o 4. XΡΩΣΗ FEULGEN • Μονιμοποιούμε, προσθέτοντας στα ακρορρίζια διάλυμα οξικού οξέος/μεθανόλης (1:3, V/V) για 15 min. • Προετοιμάζουμε νέους σωλήνες, όπου προσθέτουμε 5 ml διάλυμα 1M HCl σε καθέναν. • Με τη βοήθεια μιας λαβίδας, μεταφέρουμε τα ακρορρίζια στους νέους σωλήνες και τους τοποθετούμε υπό την επίβλεψη του διδάσκοντος σε υδατόλουτρο (σταθερά στους 60oC). Αφήνουμε για 10 min, προκειμένου να υδρολυθεί το δείγμα. • Αφαιρούμε προσεκτικά το διάλυμα. • Προσθέτουμε στα ακρορρίζια σταγόνες διαλύματος Feulgen, ώστε να καλυφθούν πλήρως. Επωάζουμε για 15 min. • Αφαιρούμε προσεκτικά την χρωστική. • Ξεπλένουμε με οξικό οξύ. ΠΡΟΣΟΧΗ: Η χρωστική Feulgen φαίνεται άχρωμη, αλλά βάφει μόνιμα το δέρμα και τα ρούχα. Όλα τα αντιδραστήρια δεν πρέπει να έρχονται σε επαφή με το δέρμα ή να εισπνέονται. Φοράμε προστατευτικά γάντια και ποδιά και απορρίπτουμε σε ειδικό δοχείο. Αν κατά λάθος ακουμπήσουμε τα αντιδραστήρια, ξεπλένουμε με άφθονο νερό και ενημερώνουμε τον διδάσκοντα. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 11 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 5. Τοποθετούμε ένα μικρό τμήμα 0.5 cm βαμμένου ακρορριζίου μεταξύ μιας αντικειμενοφόρου πλάκας και μιας καλυπτρίδας. Καλύπτουμε με μαλακό χαρτί. Συνθλίβουμε προσεκτικά το δείγμα, με τη βοήθεια ενός μαρκαδόρου, κυλίοντάς τον πάνω στην καλυπτρίδα. Αν χρειαστεί επαναλαμβάνουμε. Σκοπός είναι να διευκολύνουμε την παρατήρηση. r s 6. Παρατηρούμε στο μικροσκόπιο. Μεγέθυνση 40x. Κάθε κύτταρο αντιστοιχεί σε διαφορετική φάση της μιτωτικής διαίρεσης. ZKαταμετρούμε τα κύτταρα ανάλογα με την φάση του κυτταρικού κύκλου. ΜΕΣΟΦΑΣΗ ΠΡΟΦΑΣΗ ΑΝΑΦΑΣΗ ΜΕΤΑΦΑΣΗ ΤΕΛΟΦΑΣΗ ZΥπολογίζουμε την διάρκεια κάθε φάσης, αν η συνολική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου είναι 18 h. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 12 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 ΧΡΩΣΗ ΑΜΥΛΟΚΟΚΚΩΝ Η γλυκόζη αποτελεί μία από τις βασικές πηγές ενέργειας στους έμβιους οργανισμούς και αποθηκεύεται ως πολυμερές (γλυκογόνο στους ζωϊκούς οργανισμούς και άμυλο στους φυτικούς). Προκειμένου να επιβιώσουν όταν οι λειτουργικές τους ανάγκες είναι αυξημένες, τα φυτά αποθηκεύουν ενδοκυττάρια μεγάλες ποσότητες του σακχάρου, ιδιαίτερα στους σπόρους, τις ρίζες και τους κονδύλους. Το άμυλο συγκεντρώνεται ενδοκυττάρια σε εξειδικευμένα πλαστίδια (αμυλοπλάστες). Σχηματίζει μία ενιαία συμπαγή δομή ή μικρότερες – γνωστές ως αμυλόκοκκοι, με μέγεθος <1 µm έως 200 µm. Αμυλόκοκκοι σχηματίζονται επίσης προσωρινά και σε λειτουργικούς χλωροπλάστες. Η δημιουργία των αμυλοκόκκων γίνεται σταδιακά. Ειδικά στην πατάτα μπορεί κανείς να παρατηρήσει ομόκεντρους δακτυλίους αύξησης, ανάλογους με αυτούς στον κορμό των φυτών κατά την ετήσια αύξησή τους. ΥΛΙΚΑ Πατάτες και σπόροι dH2O Ξυραφάκι Διάλυμα Ι2 σε ΚΙ (Lugol’s) Αντικειμενοφόροι Καλυπτρίδες Μικροσκόπιο ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ • Κόβετε μία λεπτή τομή από τον κόνδυλο της πατάτας και την τοποθετείτε σε αντικειμενοφόρο. • Προσθέτετε μία σταγόνα διαλύματος ιωδίου. Περιμένετε μερικά λεπτά. • Αφαιρείτε την περίσσεια της χρωστικής με απορροφητικό χαρτί. • Ξεπλένετε την τομή με νερό. • Καλύπτετε με καλυπτρίδα και παρατηρείτε στο μικροσκόπιο. • Την ίδια διαδικασία μπορείτε να ακολουθήσετε για υδατικό διάλυμα αλεύρων και την παρατήρηση μεμονωμένων αμυλοκόκκων. Κέντρο Αυξητικοί δακτύλιοι Κόνδυλος πατάτας (Solanum tuberosum) Αμυλοπλάστες μετά από χρώση με ιώδιο. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 13 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΧΡΩΣΗ ΚΑΤΑ GRAM H χρώση κατά Gram εφαρμόσθηκε για πρώτη φορά το 1882 για την ταυτοποίηση βακτηρίων Klebsiella pneumonia και την διαφοροποίησή τους από πνευμονιοκόκκους σε ιστούς πνευμόνων. Στην χρώση αυτή στηρίζεται η ταυτοποίηση και κατηγοριοποίηση των (ευ)βακτηρίων σε δύο μεγάλες ομάδες (Gram+ και Gram‐). Αν και ο μηχανισμός διαφοροποίησης της χρώσης δεν έχει δειχθεί ακόμη, εικάζεται ότι οφείλεται στα συστατικά του βακτηριακού κυτταρικού τοιχώματος. Το διάλυμα αλκοόλης καθιστά μη διαπερατό το τοίχωμα των Gram+, με αποτέλεσμα να κατακρατείται η χρωστική. Αντίθετα, εκλούει τα λιπίδια του τοιχώματος των Gram‐ βακτηρίων και επιτρέπει την έκπλυση του crystal violet. ΥΛΙΚΑ Τριβλία Petri 2xYT Καμινέτο Κρίκος ενοφθαλμισμού Αντικειμενοφόροι ‐ Καλυπτρίδες Crystal violet 0.3% (σε 5:5:90 ισοπροπανόλη:αιθανόλη:dH2O) Πρόστυμμα ιωδίου (0.33 % Ι2 και 0.66 % ΚΙ) Διάλυμα αιθανόλης:ακετόνης, 1 V:1V Safranin Ο 0.4% (σε 20% αιθανόλη) Λάδι μικροσκοπίας Μικροσκόπιο Προεργασία Ετοιμάζουμε καλλιέργειες μικροοργανισμών σε τριβλία Petri. Ενοφθαλμίζουμε δείγματα από μικροοργανισμούς του εδάφους ή του δέρματος. Αφήνουμε τα τριβλία προκειμένου να αναπτυχθούν οι καλλιέργειες στους 37oC για 2 ημέρες. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 14 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Επιλέγουμε αποικίες με διαφορετική μορφολογία και απλώνουμε μία ποσότητα των μικροοργανισμών σε αντικειμενοφόρους. Μονιμοποιούμε τα επιχρίσματα με φλόγα για 30 sec. Προσθέτουμε Crystal violet για 1 min. Ξεπλένουμε με dH2O. Προσθέτουμε πρόστυμμα ιωδίου για 1 min. Ξεπλένουμε με dH2O. Αποχρωματίζουμε για 3‐60 sec με αιθανόλη: ακετόνη, έως ότου ο διαλύτης που εκρέει να είναι άχρωμος. Προχωρούμε σε αντιχρώση με safranin για 30‐60 sec. Ξεπλένουμε με dH2O. Στεγνώνουμε στον αέρα. Παρατηρούμε στο μικροσκόπιο. Τα βακτήρια έχουν μέγεθος 1‐10μm, οπότε είναι απαραίτητη η χρήση μεγάλης μεγέθυνσης και καταδυτικού φακού. Με την κατά Gram χρώση είναι δυνατόν να παρατηρήσετε και κύτταρα μυκήτων. Σημειώστε διαφορές στην μορφολογία και το μέγεθος. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 15 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 ΩΣΜΩΤΙΚΗ ΙΣΟΡΡΟΠΙΑ ΠΛΑΣΜΟΛΥΣΗ Η πλασματική μεμβράνη διασφαλίζει σε κάθε κύτταρο την ανεξαρτησία του, οριοθετώντας τον εξωκυττάριο χώρο από τον ενδοκυττάριο, όπου και διαμορφώνονται οι κατάλληλες συνθήκες (αλατότητα, pH, παρουσία ή/και κρίσιμη συγκέντρωση ουσιών) για την διεξαγωγή των βιοχημικών διεργασιών. Ανάλογο ρόλο διαδραματίζουν και οι υπόλοιπες κυτταρικές μεμβράνες, οι οποίες περιβάλλουν τα κυτταρικά οργανίδια. Η μετακίνηση ουσιών προς και από το κύτταρο μπορεί να γίνει με παθητική διάχυση, να ακολουθεί την ωσμωτική ισορροπία ή να γίνεται ενεργητικά. Η διάχυση μιας ουσίας περιλαμβάνει την μεταφορά της ουσίας από περιοχές υψηλής συγκέντρωσης σε περιοχές χαμηλής συγκέντρωσης, όπως συμβαίνει στην περίπτωση διάχυσης του Ο2 από τους πνεύμονες στα ερυθρά αιμοσφαίρια, ή κατά την διαπνοή των φυτών. Σε άλλες περιπτώσεις, τα κύτταρα επιλέγουν να προσλαμβάνουν ενώσεις, ανεξάρτητα από την συγκέντρωσή τους στον εξωκυττάριο χώρο, με τη βοήθεια αντλιών ή μεταφορέων, και την παράλληλη κατανάλωση ενέργειας. Η παθητική διάχυση και η ενεργητική μεταφορά καθορίζουν την συγκέντρωση μια ουσίας ενδοκυττάρια και συνολικά διαμορφώνουν το μεμβρανικό δυναμικό. Σημαντικό ρόλο στην διατήρηση του δυναμικού και της ακεραιότητος του κυττάρου διαδραματίζει το νερό, καθώς αποτελεί περίπου το 70% των κυτταρικών συστατικών, και αποτελεί και το μέσο στο οποίο βρίσκονται διαλυμένες οι ουσίες που καθορίζουν το δυναμικό. Όλες οι κυτταρικές μεμβράνες είναι ημιδιαπερατές, ώστε να μην επιτρέπουν την ανεξέλεγκτη μετακίνηση ουσιών προς και από το κύτταρο, είναι όμως πλήρως διαπερατές στο νερό. Κατά τις μεταβολές της ωσμωτικής πίεσης, όταν το κύτταρο δεν μπορεί να ανταποκριθεί με μετακίνηση των διαλυμένων ουσιών, αναγκάζεται να προχωρήσει σε αποβολή ή προσρόφηση νερού. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 16 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 Τέτοια φαινόμενα έχουν ως αποτέλεσμα την συρρίκνωση ή διόγκωση των κυττάρων αντιστοίχως και τελικά την καταστροφή τους. Τα φυτικά κύτταρα είναι λιγότερο ευαίσθητα σε σχέση με τα ζωϊκά σε υποτονικές συνθήκες (μικρή εξωκυττάρια συγκέντρωση διαλυμένων ουσιών), χάρη στο σκληρό τους τοίχωμα και δεν διαρρηγνύονται άμεσα. Σε υπέρτονες συνθήκες (υψηλή εξωκυττάρια συγκέντρωση), τα μεν ζωϊκά κύτταρα συρρικνώνονται, τα δε φυτικά υφίστανται πλασμόλυση: η πλασματική μεμβράνη διαχωρίζεται από το κυτταρικό τοίχωμα και το κύτταρο αποβάλλει νερό και συρρικνώνεται. Στο ακόλουθο σχήμα φαίνονται οι μεταβολές που υφίστανται τα κύτταρα ανάλογα με την φύση της εξωκυττάριας φάσης: Η πλασμόλυση είναι εύκολο να παρατηρηθεί σε φυτικά κύτταρα με έγχρωμα χυμοτόπια. Κατά την εφαρμογή ενός υπέρτονου διαλύματος το μέγεθος των χυμοτοπίων μειώνεται λόγω της αποβολής του περιεχόμενου νερού, παράλληλα όμως συμπυκνώνονται και οι χρωστικές που περιέχουν. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 17 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 ΥΛΙΚΑ Βολβοί έγχρωμων κρεμμυδιών Φύλλα Λαβίδα Υπέρτονα διαλύματα (1 και 5 Μ σουκρόζη και 2, 4 και 6 % ΝαCl) Αντικειμενοφόροι Καλυπτρίδες Μικροσκόπιο ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ • Αφαιρούμε προσεκτικά την επιδερμίδα από τα φύλλα του βολβού του κρεμμυδιού με τη βοήθεια της λαβίδας. • Τοποθετούμε σε μία σταγόνα από υπέρτονο διάλυμα και αφήνουμε για 10 min (κάθε ομάδα επιλέγει μία συγκέντρωση σουκρόζης και μία άλατος). • Αφαιρούμε επίσης προσεκτικά την επιδερμίδα των φύλλων. • Τοποθετούμε σε μία σταγόνα από υπέρτονο διάλυμα και αφήνουμε για 10 min • Μετράμε άμεσα τα κύτταρα που έχουν πλασμολυθεί, καθώς και τον συνολικό αριθμό των κυττάρων που παρατηρούμε. • Υπολογίζουμε το ποσοστό της πλασμόλυσης, ανά συνθήκη και κατασκευάζουμε γραφική παράσταση. • Ελέγχουμε αν τα κύτταρα επανακτούν την μορφολογία τους όταν τοποθετηθούν σε ισότονο μέσο (0.4 Μ σουκρόζη ή 0.9% NaCl). ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 18 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 ΑΥΞΗΣΗ – ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΒΛΑΣΤΗΣΗ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΑΥΞΗΤΙΚΩΝ ΟΡΜΟΝΩΝ ΑΥΞΙΝΗ (ΙΑΑ) Η ανάπτυξη των φυτών ελέγχεται από μικρά μόρια γνωστά ως ορμόνες. Τρεις μεγάλες κατηγορίες είναι γνωστές: οι αυξίνες, με κυριότερο εκπρόσωπο το ινδολ‐3‐ οξικό οξύ (ΙΑΑ), οι γιββερελλίνες και το αιθυλένιο. Η αυξίνη προωθεί την επιμήκυνση των κυττάρων, μέσω «χάλασης» του κυτταρικού τοιχώματος από τις ελαστίνες. Με αυτόν τον τρόπο, τα κύτταρα του καμβίου μπορούν να αυξάνονται σε μέγεθος και αριθμό. Η αυξίνη δρα συνεργατικά με άλλες ορμόνες (γιββερελλίνες και κυτοκίνες). Η δράση της είναι πιο έντονη παρουσία γιββερελλινών. Παρουσία κυτοκινών, οι αυξίνες προωθούν την έκπτυξη ριζών σε κάλλους, ή την δημιουργία ξυλώματος. Σε αναπτυσσόμενα μοσχεύματα η αυξίνη ευνοεί την ριζογένεση. Μεταλλάξεις που επηρεάζουν τον εντοπισμό της αυξίνης στις ρίζες προκαλούν την δημιουργία ριζών (πράσινο) σε μέρη όπου φυσιολογικά θα σχηματίζονταν φύλλα (κόκκινο) [Dhonukshe Ρ, 2008]. Η αυξίνη συμμετέχει σε «αισθητικές» λειτουργίες των φυτών, όπως την απόκριση στο φως, την βαρύτητα και το νερό, καθώς διευκολύνει αντίστοιχα τον φωτοτροπισμό, τον γεωτροπισμό και τον υδροτροπισμό τους. Η δράση της αυξίνης μπορεί να μελετηθεί σε: ‐ μοσχεύματα φυτών, όπου προωθεί την αύξηση της ρίζας (ριζογένεση) και αναστέλλει παράλληλα την ανάπτυξη του βλαστού ή ‐ βλαστούς, όπου έχει αφαιρεθεί ο κορυφαίος οφθαλμός, ο οποίος παράγει αυξίνη. Σε αυτή την περίπτωση καταστέλλεται η κυριαρχία κορυφής και ευνοείται η αύξηση των πλευρικών οφθαλμών. ΥΛΙΚΑ Σπόροι τομάτας Γλαστράκια Η2Ο ΙΑΑ (διαλύματα 1000 ppm) Ξυραφάκια Αλουμινόχαρτο Χάρακας ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 19 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ • Τοποθετήστε του σπόρους τομάτας σε γλαστράκια και αφήνουμε να βλαστήσουν. • Χωρίζετε τα φυτά σε 5 ομάδες, με τουλάχιστον 3 φυτά ανά ομάδα. • Αφού βλαστήσουν, ακολουθείστε τους χειρισμούς, όπως φαίνεται στο σχήμα που ακολουθεί: 1 • 2 3 4 5 1. Μάρτυρας 2. Αφαιρούμε τον κορυφαίο οφθαλμό 3. Καλύπτουμε με αλουμινόχαρτο 4. Ποτίζουμε με διάλυμα αυξίνης 1000 ppm 5. Αφαιρούμε τον κορυφαίο οφθαλμό και ψεκάζουμε με διάλυμα αυξίνης 1000 ppm. Παρακολουθείστε ανά εβδομάδα την αύξηση των φυτών σε ύψος και την δημιουργία πλευρικών κλάδων. Z Κατασκευάστε γραφική παράσταση με τις σχετικές τιμές. Z Σχολιάστε αν η αυξίνη επηρεάζει την ανάπτυξη των φυτών. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 20 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 ΑΥΞΗΣΗ – ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΒΛΑΣΤΗΣΗ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΑΥΞΗΤΙΚΩΝ ΟΡΜΟΝΩΝ ΓΙΒΒΕΡΕΛΛΙΝΗ Η γιββερελλίνη αποτελεί μία από τις βασικές ορμόνες που ελέγχουν την ανάπτυξη στα φυτά. Κύριος ρόλος της είναι: ‐ η έκπτυξη των βλαστών και ‐ η φύτρωση των σπερμάτων. Η γιββερελλίνη επάγει την έκφραση του γονιδίου της α‐αμυλάσης και την υδρόλυση του αμύλου. ΥΛΙΚΑ Σπέρματα μαρουλιού Η2Ο Γιββερελλίνη Τριβλία Διηθητικό χαρτί ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ • Προσθέτετε ένα κομμάτι διηθητικού χαρτιού μέσα σε τριβλία. • Τοποθετείτε επάνω τους σπόρους • Διαβρέχεται με νερό ή διάλυμα γιββερελλίνης • Ελέγχεται ανά ημέρα την φύτρωση των σπόρων • Συγκρίνετε τα αποτελέσματά σας με τις ακόλουθες εικόνες: • Σχεδιάστε ένα πείραμα ώστε να ελέγξετε την δράση της αμυλάσης. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 21 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 ΑΥΞΗΣΗ – ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΩΡΙΜΑΝΣΗ Σκοπός της άσκησης είναι η έμμεση απόδειξη της ύπαρξης πτητικών παραγόντων που επηρεάζουν την ωρίμανση των φυτών. Μεταξύ των φυτικών ορμονών, συγκαταλέγεται το αιθυλένιο (C2H4), το οποίο προωθεί την ωρίμανση των καρπών και την άνθηση. Το αιθυλένιο παράγεται από τα φυτά κατά την ανάπτυξη, την βλάστηση, την ωρίμανση των καρπών, την αποκοπή των φύλλων, αλλά και σε απόκριση σε συνθήκες stress. Λόγω του πτητικού του χαρακτήρα, δεν επηρεάζει μόνο το φυτό όπου παράγεται, αλλά και τα γειτονικά του. Αριστερά: Παραγωγή αιθυλενίου στον καρπό της φράουλας κατά την ωρίμανση. Δεξιά: Περιγραφή των αλλαγών στον καρπό της ντομάτας κατά την ωρίμανση, λόγω της δράσης του αιθυλενίου. ΥΛΙΚΑ Φρούτα (Μπανάνες, ώριμες και άγουρες, μήλα, αχλάδια) Πλαστικές σακκούλες Διάλυμα ιωδίου ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ • Χωριστείτε σε ομάδες των πέντε ατόμων. • Πέντε ημέρες πριν το εργαστήριο, τοποθετείστε σε σακκούλες: Σακκούλα Μπανάνα Μήλο ή Αχλάδι ή Ντομάτα 1 Άγουρη + 2 Ώριμη + 3 ‐ + Ώριμη, τυλιγμένη καλά σε ανεξάρτητη 4 + σακκούλα ή μεμβράνη ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 22 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 και κλείστε σχετικά καλά. • Ανά ημέρα, καταγράφεται τις παρατηρήσεις σας. • Με το πέρας των πέντε ημερών, φέρνετε στο εργαστήριο τα φρούτα. • Κόβετε τους καρπούς στη μέση. • Προσθέτετε διάλυμα ιωδίου. Z Καταγράφετε τις διαφορές στην χρώση. Z Εξηγήστε τις διαφορές στην περιεκτικότητα αμύλου. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το άμυλο των καρπών αποτελεί μία πολυμερισμένη μορφή γλυκόζης και διακρίνεται σε αμυλόζη, μακριές αλυσίδες και αμυλοπηκτίνη, πλάγιες μικρότερες διακλαδώσεις της έλικας αμυλόζης. Το ιώδιο προσδένεται στις έλικες της αμυλόζης, με αποτέλεσμα ένα έντονο κυανό – μαύρο χρώμα. Η αμυλοπηκτίνη, λόγω του μικρότερου μεγέθους των αλυσίδων της, δεν μπορεί να κατακρατήσει το ιώδιο και γι’αυτό δεν χρωματίζεται (προκύπτει ένα κίτρινο ‘η πορτοκαλί χρώμα). Ανάλογα, όταν το άμυλο υδρολύεται στα μονομερή του (γλυκόζη) δεν χρωματίζεται με ιώδιο. Έλικα αμυλοπηκτίνης που έχει προσροφήσει Ι3‐ και μονομερές γλυκόζης. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 23 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 ΑΥΞΗΣΗ – ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΟΙΚΟΛΟΓΙΑ Στόχος της άσκησης είναι η μελέτη της ανάπτυξης των φυτών σε περιβάλλον, όπου η διαθεσιμότητα των θρεπτικών είναι περιορισμένη. ΥΛΙΚΑ Σπόροι ραδικιού Χώμα Γλαστράκια Η2Ο ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ • Φυτεύουμε διαφορετικό αριθμό σπόρων σε κάθε γλαστράκι. • Τοποθετείστε σπόρους σε αποστάσεις 1 και 2 cm μεταξύ τους. • Αφήνουμε να βλαστήσουν. • Ποτίζουμε ανά τακτά χρονικά διαστήματα. • Μετράμε ανά 2 ημέρες τον αριθμό των φυτών που βλάστησαν. • Αφότου βλαστήσουν μετράμε επίσης το ύψος των φυτών. Z Κατασκευάστε γραφική παράσταση με τις τιμές. Z Παρατηρήστε τις διαφορές και σχολιάστε. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 24 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΟΡΓΑΝΙΔΙΑ – ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ Τα κυτταρικά οργανίδια περιβάλλονται από μεμβράνη, ανάλογη της πλασματικής μεμβράνης και διεκπεραιώνουν συγκεκριμένες βιοχημικές διαδικασίες. Ειδικά τα μιτοχόνδρια και οι χλωροπλάστες θεωρούνται ημιανεξάρτητες οντότητες καθώς περιέχουν και γενετικό υλικό. Επικρατεί η άποψη ότι προέκυψαν από ενδοσυμβιωτικά βακτήρια. Λόγω της διαφορετικής σύστασης (πυκνότητος) κάθε οργανιδίου, είναι δυνατός ο διαχωρισμός του από ένα ολικό κυτταρικό εκχύλισμα με διαδοχικές φυγοκεντρίσεις ή κλασμάτωση σε μέσο διαβαθμισμένης πυκνότητος. Σκοπός της άσκησης είναι η απομόνωση και παρατήρηση χλωροπλαστών από φύλλα σπανακιού. ΥΛΙΚΑ Φρέσκα φύλλα σπανακιού Διάλυμα κυτταρικής λύσης (Ο.5 Μ σουκρόζη) Επιφάνεια κοπής και μαχαίρι Παγωμένο ιγδίο Σωλήνες και βάση Γάζα Ψυχόμενη φυγόκεντρος Διάλυμα επανάκτησης (0.035 M NaCl) Αντικειμενοφόροι και καλυπτρίδες Μικροσκόπιο ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ • Αφαιρούμε τα αγγεία από τα φύλλα σπανακιού και κόβουμε σε πολύ μικρά κομμάτια. • Ζυγίζουμε 4 g και τα μεταφέρουμε σε παγωμένο ιγδίο. • Προσθέτουμε σταδιακά 15 ml διαλύματος λύσης και συνθλίβουμε μέχρι να έχουμε μία ομοιογενή μάζα. • Φιλτράρουμε από τριπλή γάζα. • Φυγοκεντρούμε στα 100 g για 10 min στους 4° C, ώστε να απομακρύνουμε άθικτα κύτταρα και θραύσματα. • Μεταφέρουμε το υπερκείμενο σε νέο σωλήνα και επαναφυγοκεντρούμε στα 1000 g για 10 min στους 4° C. • Κρατάμε το ίζημα, στο οποίο περιέχονται οι χλωροπλάστες, ξεχωριστά. • Προσθέτουμε 5 ml παγωμένο διάλυμα επανάκτησης. • Επαναδιαλύουμε με πολύ αργές και προσεκτικές κινήσεις. • Τοποθετούμε μία σταγόνα από κάθε κλάσμα της διαδικασίας σε αντικειμενοφόρο. • Παρατηρούμε σε μικροσκόπιο. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 25 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 ΦΩΤΟΣΥΝΘΕΣΗ ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΧΛΩΡΟΦΥΛΛΗΣ ΚΑΙ ΑΛΛΩΝ ΧΡΩΣΤΙΚΩΝ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΟΙΒΑΔΟΣ Όλα τα φυτά, ακόμη και οι πιο απλοί μονοκύτταροι φυτικοί οργανισμοί, εξ ορισμού είναι ικανοί να φωτοσυνθέτουν, δηλαδή να μετατρέπουν την ακτινοβολία του φωτός σε χημική ενέργεια ‐ δεσμούς, τουτέστιν πολύπλοκες χημικές ουσίες. H φωτοσύνθεση περιγράφεται από την ακόλουθη απλουστευμένη αντίδραση: CO2 + 6H2O Ö C6H12O6 + 6O2 Προκειμένου να δεσμεύσουν την ηλιακή ακτινοβολία, τα φυτά διαθέτουν ποικιλία μορίων, με κυριότερο εκπρόσωπο τις χλωροφύλλες, που εντοπίζονται ‐ συγκεντρώνονται στους χλωροπλάστες. Η παραγωγή χλωροφύλλης επάγεται επίσης από το φως, φυσικό ή τεχνητό, εξ ου και φυτά που δεν εκτίθενται στο φως είναι κιτρινωπά (χλωρωτικά). Στην παρούσα άσκηση θα χρησιμοποιήσουμε την τεχνική της χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδος για των διαχωρισμό των χρωστικών των φύλλων. Οι πλέον συχνά απαντώμενες χρωστικές στο φυτικό βασίλειο φαίνονται στον ακόλουθο Πίνακα: Χρωστική Χρώμα Καροτενοειδή ‐ ξανθοφύλλες Κίτρινο – χρυσό Φαιοφυτίνη Λαδί Χλωροφύλλη α Μπλε πράσινο Χλωροφύλλη β Κιτρινοπράσινο Λουτεΐνη Κίτρινο Βιολαξανθίνη Κίτρινο Νεοξανθίνη Κίτρινο Η χρωματογραφία λεπτής στοιβάδος αποτελεί μία από τις αρχαιότερες αναλυτικές τεχνικές στην εργαστηριακή πρακτική. Στηρίζεται στην διαφορετική συνάφεια ουσιών μικρού μοριακού βάρους με διαλύτες, γεγονός που επιτρέπει τον διαχωρισμό τους πάνω σε μία λεπτή επιφάνεια silica (SiO2, διοξειδίου του πυριτίου). Χάρη σε τριχοειδή φαινόμενα, ο διαλύτης διαποτίζει την πορώδη επιφάνεια του πυριτίου και «παρασύρει» και τις ουσίες που είναι διαλυτές σε αυτόν. Με αυτόν τον τρόπο, εκλούονται πρώτες οι πλέον ελαφριές και πλέον διαλυτές σε αυτόν. Η μέθοδος είναι σχετικά γρήγορη και μας επιτρέπει να διαχωρίσουμε περαιτέρω ουσίες σε τρεις διαστάσεις σε μία δισδιάστατη 5 ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 26 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 επιφάνεια, όπως και να εκχυλίσουμε ουσίες, απομονώνοντας μία μεμονωμένη περιοχή της silica. ΥΛΙΚΑ Φρέσκα φύλλα από διάφορα φυτά (εναλλακτικά μπορούμε να φυτέψουμε διάφορα φυτά και να καλύψουμε τα φύλλα τους με αλουμινόχαρτο για μερικές εβδομάδες) Γλαστράκια Χώμα Σπόρους Αλουμινόχαρτο Ψαλίδι και ξυραφάκια Λαβίδα Κατσαρόλα και εστία Ιγδίο Διηθητικό χαρτί (φίλτρο καφέ) Γυάλινο δοχείο χρωματογραφίας Διαλύτες (αιθανόλη, ακετόνη) Προαιρετική κινητή φάση (100 ml πετρελαϊκού αιθέρα‐ κοινώς νέφτι, 11 ml ισοπροπανόλης και 5 σταγόνες dH2O) Πιπέττες παστέρ Δοκιμαστικοί σωλήνες Βάση για δοκιμαστικούς σωλήνες ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Α. ΕΚΧΥΛΙΣΗ • Κόβουμε φύλλα από διάφορα φυτά. [Προαιρετικά: Βράζουμε τα φύλλα σε dH2O για 1 min. Στεγνώνουμε.] • Αφαιρούμε τα αγγεία και κόβουμε σε μικρότερα κομμάτια. Προσθέτουμε στο ιγδίο. • Τοποθετούμε σταδιακά έως 5ml ακετόνη ή αιθανόλη ανά φύλλο και πολτοποιούμε. • Ανακατεύουμε καλά και αφήνουμε προκειμένου να εκχυλισθούν οι χρωστικές. (Για να συντομεύσουμε τη διαδικασία εκχύλισης, μπορούμε να βράσουμε απευθείας το υλικό στον διαλύτη σε bain‐marie. Χρειάζεται προσοχή, καθώς οι διαλύτες είναι πτητικοί και εύφλεκτοι!). • Φυγοκεντρούμε. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 27 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ • 2010 Οι χρωστικές που έχουν εκχυλισθεί περιέχονται στην υπερκείμενη φάση του διαλύτη. Παρατηρούμε την αλλαγή χρώματος του διαλύτη, ανάλογα με το αρχικό φυτικό υλικό και τον διαλύτη. Β. ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΧΡΩΣΤΙΚΩΝ ΜΕ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΟΙΒΑΔΟΣ Για την χρωματογραφία θα χρειαστούμε ειδική επιφάνεια διαχωρισμού πυριτίου (Silica Gel G TLC plates). Η επιφάνεια είναι εξαιρετικά ευαίσθητη. Δεν αγγίζουμε με γυμνά χέρια και την χειριζόμαστε από τις άκρες. Οι βασικές αρχές της χρωματογραφίας μπορούν να εφαρμοσθούν και με απλά υλικά, αντικαθιστώντας την επιφάνεια πυριτίου με διηθητικό ή απορροφητικό χαρτί (Whatman). • Κόβουμε ένα ορθογώνιο κομμάτι διηθητικού χαρτιού, ύψους 15 cm. • Σημειώνουμε με μολύβι σε απόσταση 2cm από την άκρη του χαρτιού και τρίβουμε στο σημείο αυτό ένα κομμάτι φύλλο, ώστε να αποτυπωθεί μια παχιά έγχρωμη γραμμή. • Μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε φύλλα από φυτά που έχουν ή όχι εκτεθεί στο φως. Όπως επίσης και φύλλα πράσινα, ή κόκκινα. • Εναλλακτικά μπορούμε να προσθέσουμε μια σταγόνα από τις χρωστικές που εκχυλίσαμε στο βήμα Α. • Τοποθετούμε σε ένα γυάλινο δοχείο μια ποσότητα κινητής φάσης (100 ml πετρελαϊκού αιθέρα / 11 ml ισοπροπανόλης / 5 σταγόνες dH2O ή ακετόνη ή αιθανόλη), ικανή να καλύπτει μετά βίας το ένα άκρο του διηθητικού χαρτιού (~1cm) και το αφήνουμε κλειστό για λίγο, ώστε να κορεσθεί σε ατμούς. • Βυθίζουμε το διηθητικό χαρτί στο διαλύτη. ΠΡΟΣΟΧΗ: Αν βυθιστεί το σημείο φόρτωσης στο διαλύτη, οι χρωστικές θα μεταφερθούν στο διαλύτη‐δοχείο και ΔΕΝ θα διαχωρισθούν. • Κλείνουμε το δοχείο και περιμένουμε 15‐30 min. • Λόγω των τριχοειδών φαινομένων, ο διαλύτης διαχέεται προς τα επάνω, παρασύροντας τις χρωστικές. • Η ταχύτητα διαχωρισμού εξαρτάται από την χρωστική και τον διαλύτη. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 28 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ • 2010 Ένα τυπικό χρωματογράφημα χρωστικών φύλλου σπανακιού με κλασσικό πρωτόκολλο διαχωρισμού σε αιθανόλη απεικονίζεται στην εικόνα. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 29 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΤΟΙΧΩΜΑ – ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΥΤΤΑΡΙΝΗΣ Τα φυτικά κύτταρα διαθέτουν εξωτερικά, σε αντίθεση με τα ζωϊκά κύτταρα, μία συμπαγή δομή, το κυτταρικό τοίχωμα. Το τοίχωμα προσδίδει σταθερότητα και σχήμα και εξασφαλίζει προστασία έναντι της ξηρασίας, τραυματισμών και παθογόνων. Αποτελείται κυρίως από κυτταρίνη, ημικυτταρίνη και λιγνάνες. Η κυτταρίνη είναι πολυμερές της γλυκόζης και λόγω της σταθερότητας της και της αντοχής της έχει ποικίλες εφαρμογές. Μία από αυτές είναι στην βιομηχανία χάρτου. ΥΛΙΚΑ Πριονίδι Οξικό οξύ Benzene Αιθέρας NaOH NaClO2 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ • Ζυγίζουμε 25 g πριονίδι. • Αν χρησιμοποιούμε ξύλο κωνοφόρου απαιτείται μία πρόπλυση του υλικού με διάλυμα benzene:αιθανόλης 2:1. • Προσθέτουμε 800 ml χλιαρού νερού, 3 ml οξικού οξέος και 7.5 g NaClO2. • Αναδεύουμε σε υδατόλουτρο (70oC) σε απαγωγό, έως ότου λευκανθεί το πριονίδι. Η διαδικασία απαιτεί τουλάχιστον 30 min. • Διηθούμε. • Ξεπλένουμε με 2L dH2O. • Στεγνώνουμε. • Προσθέτουμε 1 L 12% NaOH και αναδεύουμε σε περιστρεφόμενη φιάλη στις 6000 rpm για 24 h, σε ατμόσφαιρα αζώτου. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 30 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ • • • • 2010 Διηθούμε σε φίλτρο υάλου. Κρατάμε το εκχύλισμα. Επαναλαμβάνουμε την αλκαλική επεξεργασία αρκετές φορές. Στεγνώνουμε. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 31 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΑΜΥΛΟΖΗΣ ΚΑΙ ΑΜΥΛΟΠΗΚΤΙΝΗΣ Στους φυτικούς οργανισμούς η γλυκόζη αποθηκεύεται ως πολυμερές – άμυλο. Ανάλογα με τους δεσμούς που αναπτύσσονται μεταξύ των μορίων της γλυκόζης, σχηματίζονται μακριές αλυσίδες α‐1,4‐ γλυκοσιδικού δεσμού, από τις οποίες προκύπτει η αμυλόζη και μικρές πλευρικές διακλαδώσεις α‐1,6‐γλυκοσιδικού δεσμού, που αντιστοιχούν στην αμυλοπηκτίνη. Μετά από επίδραση βάσεως, η αμυλοπηκτίνη σχηματίζει πηκτή (gel), ενώ η αμυλόζη μπορεί να κατακρημνισθεί με την επίδραση βουτανόλης. ΥΛΙΚΑ Πατάτες Ζυγός Επιφάνεια κοπής και μαχαίρι Μπλέντερ Γάζα Φυγόκεντρος Αναδευτήρας ‐ Μαγνήτης Βουτανόλη HCl NaOH NaCl ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 32 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ – ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2010 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ • Αφαιρούμε τον φλοιό από τις πατάτες και κόβουμε σε μικρά κομμάτια. • Ζυγίζουμε 250 g από αυτές και πολτοποιούμε σε μπλέντερ, αφού προς • θέσουμε 750 ml 1% NaCl. • Διηθούμε από γάζα. • Ξεπλένουμε τη γάζα με επιπλέον 150 ml 1% NaCl. • Αφήνουμε να καθιζήσουν οι αμυλόκοκκοι. • Πετάμε την υπερκείμενη υγρή φάση (πιθανόν να περιέχει και αδιάλυτα κομμάτια κυτταρίνης). • Ξεπλένουμε τους αμυλοκόκκους τρεις φορές με διάλυμα 1% NaCl. • Ξεπλένουμε τους αμυλοκόκκους με διάλυμα 0.01Ν NaOH. • Ξεπλένουμε τους αμυλοκόκκους τρις με dH2O. • Τοποθετούμε στους 4οC, έως να καθιζήσουν. • Αφαιρούμε το υπερκείμενο και κρατάμε το ίζημα. Ζυγίζουμε (αναμένουμε περίπου 40 g μεικτού βάρους ή 20 g ξηρού βάρους ). • Επαναδιαλύουμε με πολύ απαλές κινήσεις το άμυλο σε 260 ml H2O και προσθέτουμε σταδιακά σε 3.3. L NaOH. Aναδεύουμε για 5 min, έως ότου διαλυθεί σε θερμοκρασία τουλάχιστον 22oC. • Προσθέτουμε 915 ml 5% NaCl. • Ρυθμίζουμε το pΗ στο 6.5‐7.5 με τη βοήθεια ηλεκτροδίου, προσθέτοντας προσεκτικά 1Ν HCl. • Αφήνουμε Ο/Ν. 1. Η αμυλοπηκτίνη σχηματίζει μία πηκτή στο κάτω μέρος του δοχείο, που αντιστοιχεί περίπου στο 1/3 του όγκου του. 2. Η υπερκείμενη φάση περιέχει αμυλόζη. Μεταφέρουμε σε νέο καθαρό δοχείο. 1.2. Συλλέγουμε την πηκτή και φυγοκεντρούμε για 20 min. Αφαιρούμε το υπερκείμενο. Μπορούμε να καθαρίσουμε περαιτέρω την αμυλοπηκτίνη προσθέτοντας επιπλέον 1% NaCl (100 ml/4g αμύλου), και επαναλαμβάνοντας την διαλυτοποίηση και φυγοκέντριση. 2.2. Διηθούμε την φάση αμυλόζης. Προσθέτουμε αρκετή ποσότητα βουτανόλης, ώστε να κορεσθεί το διάλυμα και τοποθετούμε σε μηχανικό αναδευτήρα για 1 h. Αφήνουμε να κατακρημνισθεί η αμυλόζη για 2‐3 h. Αφού αφαιρέσουμε το υπερκείμενο, μπορούμε να συγκεντρώσουμε με φυγοκέντριση στις 3000rpm 15 min και να επαναλάβουμε την διαδικασία κατακρήμνισης‐καθαρισμού με κορεσμένη σε νερό βουτανόλη. Η καθαρότητα των διαλυμάτων αμυλόζης και αμυλοπηκτίνης σε κάθε στάδιο μπορεί να ελεγχθεί με την προσθήκη διαλύματος Ι2/ΚΙ, εφόσον κάθε πολυμερές χρωματίζεται διαφορετικά. ΑΡΤΕΜΙΣΙΑ‐ΦΟΙΒΗ ΝΙΦΛΗ Σελίδα 33