1
• ΔΙΟΙΚΗΤΙΚΟ ΣΥΜΒΟΥΛΙΟ
Πρόεδρος: Ψαρρά Κατερίνα
Αντιπρόεδρος: Κρούπης Χρήστος
Γενικός Γραμματέας: Χαλιάσος Αλέξανδρος
Αναπλ. Γεν. Γραμματέας: Σπυροπούλου Διακουμή Παναγιώτα
Ταμίας: Μπότουλα Έφη
Μέλη: Λόη Βασιλική, Κώνστα Ευγενία
ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΣΥΝΕΔΡΙΟΥ: ΕΦΗ ΜΠΟΤΟΥΛΑ
ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ
Πρόεδρος: Κρούπης Χρήστος
Μέλη:
Βογιατζάκης Ευαγγελος
Καράμπαμπα Φωτεινή
Καρίκας Γιώργος
Καψιμάλη Βιολέττα
Κολιάκος Γιώργος
Κολιός Γιώργος
Λεϊμονή Ειρήνη
Λιάκος Παναγιώτης
Λιανίδου Ευρύκλεια
Μπαϊρακτάρη Ελένη
Παπασωτηρίου Ιωάννης
Ρίζος Δημήτρης
Σπυρόπουλος Βασίλης
Σπυροπούλου Παναγιώτα
Τσατσάνης Χρήστος
Χριστόπουλος Θεόδωρος
Ψαχούλια Χριστίνα
ΟΡΓΑΝΩΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ
Αθανασιάδης Θεόφιλος
Δήμα Κλεάνθη
Καρακαλούσος Πέτρος
Κώνστα Εύη
Λόη Βασιλική
Μοίρα Λία
Ματσάγγος Σπύρος
Ρίζου Μυρτώ
2
12ο Πανελλήνιο Συνέδριο Κλινικής Χημείας,
Πολεμικό Μουσείο
Αθήνα
Αγαπητοί Συνάδελφοι
Η Ελληνική Εταιρία Κλινικής Χημείας – Κλινικής Βιοχημείας, οργανώνει το
12ο Πανελλήνιο Συνέδριο Κλινικής Χημείας, που θα διεξαχθεί στην Αθήνα στο Αμφιθέατρο του
Πολεμικού Μουσείου, στις 7 και 8 Νοεμβρίου 2014.
Το Συνέδριο απευθύνεται σε όλους όσους απασχολούνται σε Διαγνωστικά ή Ερευνητικά
Εργαστήρια και Κέντρα, με αντικείμενο την Κλινική Χημεία και γενικότερα την Εργαστηριακή
Ιατρική.
Σκοπός του Συνεδρίου είναι η παρουσίαση των ερευνητικών δραστηριοτήτων και
επιτευγμάτων των συναδέλφων, στα Νοσοκομεία, στα Ερευνητικά Ιδρύματα και στα ΑΕΙ της χώρας
μας, καθώς και η συνεχής ενημέρωσή μας, στις σύγχρονες τεχνολογίες και μεθόδους, που
αφορούν στην in vitro Διαγνωστική Τεχνολογία.
Μέσα από αυτή την παρουσίαση των νεώτερων εξελίξεων, το δημιουργικό διάλογο, τον
προβληματισμό και την ανταλλαγή απόψεων, το Συνέδριο φιλοδοξεί να συμβάλει στη δημιουργία
μιας σφαιρικής αντίληψης των συναδέλφων, γύρω από τις συνεχώς αναδυόμενες νέες
τεχνολογικές και αναλυτικές τάσεις, στο ευρύτερο γνωστικό μας αντικείμενο. Όμως, αυτή πρέπει
να συνδυαστεί και με την ανάγκη για περαιτέρω εξειδίκευση, ιδιαίτερα για τους νέους
συναδέλφους, που προσπαθούν εντατικά να ενταχθούν και αυτοί, οργανικά και επαγγελματικά,
στη σύγχρονη Εργαστηριακή Ιατρική.
Σας προσκαλούμε λοιπόν να συμμετέχετε ενεργά, είτε παρουσιάζοντας το
επιστημονικό σας έργο, είτε με τη δημιουργική παρουσία σας, συμβάλλοντας έτσι στην επιτυχία
του Συνεδρίου.
Με εκτίμηση,
Η Πρόεδρος
Ε. Μπότουλα
3
12ο Πανελλήνιο Συνέδριο Κλινικής Χημείας,
Πολεμικό Μουσείο
Αθήνα
Επιστημονικό Πρόγραμμα
Πέμπτη 06/11/2014
17:00-22:00
Προσυνεδριακή ημερίδα υπό την αιγίδα του Πανεπιστημίου Αθηνών και της Ελληνικής Εταιρίας
Κλινικής Χημείας-Κλινικής Βιοχημείας στο κτήριο «Κωστής Παλαμάς» (οδός Ακαδημίας 48)
«Ημερίδα για τα 20 χρόνια λειτουργίας του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Κλινικής Χημείας του Χημικού
Τμήματος του Πανεπιστημίου Αθηνών»
Παρασκευή, 07/11/2014
09:00-09:30 Εγγραφές
09:30-11:00 Προφορικές ανακοινώσεις
Προεδρείο: Ανδριανή Γρηγοράτου, Ελένη Μπαϊρακτάρη
ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙΝΟΤΟΜΩΝ REAL-TIME qPCR ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΙΔΙΚΗ ΚΑΙ ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ
ΤΩΝ ΙΣΟΜΟΡΦΩΝ ΤΟΥ COL11A1 mRNA ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΟΥΣ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΙΣΤΩΝ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ
ΜΑΣΤΟΥ
Καραγλάνη Μ., Τούμπουλης Ι., Γούτας Ν., Πουμπουρίδου Ν., Βλαχοδημητρόπουλος Δ., Βασίλαρος Σ., Ρίζος Ι.,
Κρούπης Χ.
mRNA ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ PALB2 ΚΑΙ ΕΠΙΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΟΥ ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΤΟΝ ΣΠΟΡΑΔΙΚΟ ΚΑΡΚΙΝΟ
ΜΑΣΤΟΥ
Πουμπουρίδου N., Acha-Sagredo A., Γούτας N., Βλαχοδημητρόπουλος Δ.,
Λιανίδου E., Βασίλαρος Σ.,
Λιλόγλου T., Κρούπης Χ.
ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΕΤΡΑΠΛΗΣ ΠΟΣΟΤΙΚΗΣ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (RT-qPCR) ΓΙΑ ΤΗ ΜΕΛΕΤΗ
ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ER, PR, HER-2 ΚΑΙ EGFR ΣΕ ΚΥΚΛΟΦΟΡΟΥΝΤΑ ΚΑΡΚΙΝΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ (CTCs) ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ
ΚΑΡΚΙΝΟ ΜΑΣΤΟΥ
Στρατή A., Μαλάμος Ν., Γεωργούλιας Β., Λιανίδου E.
4
ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ PIK3CA ΣΤΑ ΚΥΚΛΟΦΟΡΟΥΝΤΑ ΚΑΡΚΙΝΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ
ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΚΑΡΚΙΝΟ ΜΑΣΤΟΥ
Mάρκou A., Φάρκωνα Σ., Σχίζα Χ., Ευσταθίου Α., Κουνέλλη Σ., Μαλάμος Ν., Γεωργούλιας Β., Λιανίδου E.
ΜΕΛΕΤΗ ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ miRNAS ΣΕ CTC, CELL FREE DNA ΚΑΙ
ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΟΥΣ ΠΡΩΤΟΠΑΘΕΙΣ ΟΓΚΟΥΣ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΜΕΤΑΣΤΑΤΙΚΟ ΚΑΡΚΙΝΟ ΜΑΣΤΟΥ
Mάρκou A., Zαβρίδου M., Σουρβίνου I., Μαλάμος Ν., Γεωργούλιας Β., Λιανίδου E.
ΜΕΛΕΤΗ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗΣ ΥΠΟΚΙΝΗΤΗ ΤΟΥ ΟΓΚΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ SOX17 ΣΕ CTC, CELL FREE DNA
ΚΑΙ ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΟΥΣ ΠΡΩΤΟΠΑΘΕΙΣ ΟΓΚΟΥΣ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟΥ
Χειμωνίδου M., Στρατή A., Μαλάμος Ν., Γεωργούλιας Β., Λιανίδου E.
ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΚΥΚΛΟΦΟΡΟΥΝΤΩΝ miR-155 ΚΑΙ miR-146a ΜΕ ΑΝΔΡΙΚΗ ΥΠΟΓΟΝΙΜΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΠΑΧΥΣΑΡΚΙΑ
Δερμιτζάκη Ε., Bobjer J., Κατρινάκη Μ., Rastkhani H., Λυρώνη Κ., Μαργιωρής Α.Ν., Giwercman L.Y.,
Giwercman A., Τσατσάνης Χ.
ΕΠΙΔΡΑΣΗ Zn ΣΤΟ ΛΙΠΙΔΑΙΜΙΚΟ ΠΡΟΦΙΛ ΤΟΥ ΗΠΑΤΟΣ ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΩΝ ΠΟΝΤΙΚΩΝ ΠΟΥ ΕΚΦΡΑΖΟΥΝ ΤΗΝ
Ηsp70 ΠΡΩΤΕΙΝΗ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ 1H-NMRΛέκκας Π., Κωσταρά Χ., Μπαϊρακτάρη Ε., Δεληγιάννης Ι.,
Ζερικιώτης Σ., Τζάλλας Χ. , Αγγελίδης Χ., Βεζυράκη Π., Καλφακάκου Β.
11:00-11:30 Διάλειμμα - Καφές
11:30-13:30 Στρογγυλό Τραπέζι
«Αναδυόμενες νέες και παλιές λοιμώξεις»
Προεδρείο: Ευάγγελος Βογιατζάκης, Παναγιώτα Σπυροπούλου
Ιός Ebola Σωτήρης Τσιόδρας
Μοριακή διάγνωση φυματίωσης και γονοτυπικός έλεγχος αντοχής στα αντιφυματικά φάρμακα
Παναγιώτης Ιωαννίδης
Νέα δεδομένα για τον ιό MERS Σιμόνα Καράμπελα
Ιός West Nile Βασίλειος Ζευγώλης
13:30-15:00 Μεσημεριανή Διακοπή – Ελαφρύ γεύμα
15:00-17:00 Στρογγυλό Τραπέζι
«Μοριακή Διαγνωστική»
Προεδρείο: Χρήστος Κρούπης, Ευρύκλεια Λιανίδου
Next Generation Sequencing Αγγελική Απέσσου
Non-Invasive Prenatal Diagnostics (NIPD) Φένια Τσόπλου
Ανίχνευση σωματικών μεταλλάξεων στον καρκινικό ιστό και επιλογή στοχευμένης θεραπείας
Γεώργιος Νασιούλας
5
Υγρή Βιοψία: Κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα, κυκλοφορούν DNA, κυκλοφορούντα miRNAs:
το τέλος της βιοψίας? Εφαρμογές και προβληματισμοί Ευρύκλεια Λιανίδου
17:00-17:45 Δορυφορική Διάλεξη με την ευγενική χορηγία της Εταιρείας LERIVA
Προεδρείο: Ευγενία Κώνστα, Ανδρέας Κολιοπάνος
Αυτοματοποίηση στο σύγχρονο κλινικό εργαστήριο Ιωάννης Βαμβουκάκης
17:45-18:15 Διάλειμμα – Καφές
18:15-18:30 Έναρξη – Χαιρετισμοί
Προεδρείο: Κατερίνα Ψαρρά, Έφη Μπότουλα
18:30-18:45 Ομιλία
Αφιέρωμα στη ζωή και το έργο του καθηγητή Κ. Σεφεριάδη Ελένη Μπαϊρακτάρη
18:45-19:30 Εναρκτήρια Ομιλία
Προεδρείο: Bernard Gouget, Αλέξανδρος Χαλιάσος
Vitamin D and pathophysiology of bone Howard Morris
19:30: Μουσική Εκδήλωση με τη Μαντώ Παναγιωτάκη στο τραγούδι και τον Όθωνα
Παναγιωτάκη στο πιάνο.
20:30 Δεξίωση
Σάββατο, 08/11/2014
09:30-11:00 Προφορικές ανακοινώσεις
Προεδρείο: Βασιλική Λόη, Φωτεινή Καράμπαμπα
ΜΕΛΕΤΗ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΜΕΤΑΜΟΣΧΕΥΣΗ ΜΥΕΛΟΥ ΤΩΝ ΟΣΤΩΝ ΠΟΥ ΛΑΜΒΑΝΟΥΝ ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΗ
ΑΓΩΓΗ ΚΑΙ ΠΑΡΟΥΣΙΑΖΟΥΝ ΛΟΙΜΩΞΗ ΑΠΟ CLOSTRIDIUM DIFFICILE
Γρηγοράτου Α., Μπελεσιώτου Ε., Μελπίδου Α., Μπάρκα, Περιβολιώτη Ε., Πρατικάκη Μ., Πάντζιου Χ.,
Νέπκα Μ., Ψαρουδάκη Ζ., Ιωαννίδου Σ.
ΤΑ ΕΠΙΠΕΔΑ ΤΗΣ ΛΙΠΟΚΑΛΙΝΗΣ-2 (NGAL) ΕΙΝΑΙ ΣΗΜΑΝΤΙΚΑ ΑΥΞΗΜΕΝΑ ΣΤΟΝ ΟΡΟ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ
ΘΑΛΑΣΣΑΙΜΙΚΑ ΚΑΙ ΔΡΕΠΑΝΟΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΣΥΝΔΡΟΜΑ: ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΜΕ ΤΗ ΝΕΦΡΙΚΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ
Παπασωτηρίου Ι., Βοσκαρίδου Ε., Μαργέλη Α., Κοτρώτσου Α., Κυριακοπούλου Δ., Nwagha T., Ποζιόπουλος
Χ., Καττάμης Α.
Η ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΑ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΤΟΥ ΔΙΑΛΥΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΟΥ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΗ ΠΛΑΣΜΙΝΟΓΟΝΟΥ
ΤΥΠΟΥ ΟΥΡΟΚΙΝΑΣΗΣ (suPAR) ΣΕ ΤΕΛΕΙΟΜΗΝΑ ΝΕΟΓΝΑ ΜΕ ΛΟΙΜΩΞΗ Η ΣΗΨΗ: ΜΙΑ ΠΡΟΟΠΤΙΚΗ
ΜΕΛΕΤΗ
Σιαχανίδου Τ., Μαργέλη Α., Τσιρογιάννη Χ., Χαρώνη Σ., Γιαννάκη Μ., Βαβουράκης Ε., Χαρισιάδου Α.,
Παπασωτηρίου Ι.
6
ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΗΠΑΤΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΕΞΩΤΕΡΙΚΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΥΠΟ ΑΝΤΙΕΠΙΛΗΠΤΙΚΗ ΑΓΩΓΗΜπρακούλια
Β., Αγγελίδης Η., Γρηγοράτου Α., Μελπίδου Α., Πρατικάκη Μ., Πολίτου Δ, Ιωαννίδου Σ., Λιανίδου Ε.
ΈΛΕΓΧΟΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΕΞΩΤΕΡΙΚΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΠΟΥ ΛΑΜΒΑΝΟΥΝ ΑΝΤΙΕΠΙΛΗΠΤΙΚΑ
Αγγελίδης Η., Μπρακούλια Β., Γρηγοράτου Α., Μελπίδου Α., Πάντζιου Χ., Ιωαννίδου Σ., Λιανίδου Ε.
ΤΑ ΧΑΜΗΛΑ ΕΠΙΠΕΔΑ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ DICKKOPF-1 ΣΕ ΠΑΧΥΣΑΡΚΑ ΠΑΙΔΙΑ ΔΕΙΧΝΟΥΝ ΔΙΑΤΑΡΑΧΗ ΤΗΣ
ΚΑΤΑΣΤΟΛΗΣ ΤΗΣ ΚΑΝΟΝΙΚΗΣ Wnt ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗΣ
Παπασωτηρίου I., Τέρπος E., Γαλάνη Α., Κανακά-Gantenbein Χ., Χρούσος Γ.
ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΑΚΡΑΙΟΥ ΦΥΣΙΚΟΥ STRESS ΣΤΑ ΚΥΚΛΟΦΟΡΟΥΝΤΑ ΒΛΑΣΤΙΚΑ/ΠΡΟΓΟΝΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΟΥ
ΕΜΠΛΕΚΟΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΕΠΟΥΛΩΣΗ ΤΩΝ ΙΣΤΩΝ: ΠΙΘΑΝΕΣ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΠΡΟΕΚΤΑΣΕΙΣ
Παπασωτηρίου I., Σκενδέρη K., Tσιρώνη Μ., Γαλάνη Α., Χρούσος Γ., Γουσέτης E.
ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΟΥ ΛΙΠΩΔΟΥΣ ΙΣΤΟΥ ΚΑΙ ΤΗΣ ΟΣΤΙΚΗΣ
ΑΝΑΚΑΤΑΣΚΕΥΗΣ ΣΕ ΝΟΡΜΟΒΑΡΗ ΚΑΙ ΠΑΧΥΣΑΡΚΑ ΚΟΡΙΤΣΙΑ
Παπασωτηρίου I., Kanaka-Gantenbein X., Maργέλη A., Γαλάνη Α., Χρούσος Γ., Τέρπος E.
11:00-11:30 Διάλειμμα-καφές
11:30-12:30 Στρογγυλό Τραπέζι
«Bone turnover markers; Biochemistry and Clinical Utility»
Προεδρείο: Κωνσταντίνος Μακρής, Δημήτρης Ρίζος
Νέοι βιοχημικοί δείκτες: από την ανακάλυψη στη χρήση τους στη κλινική πράξη Κωνσταντίνος
Μακρής
The biochemistry of bone turnover markers Howard Morris
Ο ρόλος των βιοχημικών δεικτών του οστικού μεταβολισμού στη διαχείριση της οστεοπόρωσης
Συμεών Τουρνής
12:30-13:30 Στρογγυλό Τραπέζι
«S-100 ως Βιοδείκτης»
Προεδρείο: Χριστίνα Ψαχούλια, Ιωάννης Παπασωτηρίου
Η πρωτεΐνη S100B Χριστίνα Ψαχούλια
Η πρωτεΐνη S100B στην εγκεφαλική βλάβη Στέφανος Κορφιάς
Πρωτεΐνη S100B και κύηση υψηλού κινδύνου Αγγελική Παπαδημητρίου
13:30-14:15 Δορυφορική Διάλεξη με την ευγενική χορηγία της Εταιρείας ABBOTT
Προεδρείο: Ειρήνη Λεϊμονή, Βασίλης Παπαδημητρόπουλος
New developments in Cardiology – High Sensitivity Troponin I Lieselotte Lennartz
14:15-15:30 Μεσημεριανή Διακοπή- Ελαφρύ γεύμα
7
15:30 -17:00 Στρογγυλό Τραπέζι
«Point of care Testing (POCT)»
Προεδρείο: Βιολέττα Καψιμάλη, Βασίλης Σπυρόπουλος
Παρακλίνια μηχανήματα: παρόν και μέλλον, κατευθυντήριες οδηγίες, σχέση με το εργαστήριο
Κλεάνθη Δήμα
The Promises and Pitfalls of POCT in Molecular Diagnostics Sam Murray
Ανασκόπηση και προοπτικές της χρήσης Κβαντικών Κηλίδων (Quantum Dots) στην in vitro
Διαγνωστική Βασίλης Σπυρόπουλος
17:00-18:00 Στρογγυλό Τραπέζι
«Επαγγελματικά θέματα»
Προεδρείο: Γιώργος Καρίκας, Χρήστος Τσατσάνης
Προτεινόμενη ταξινόμηση για τα in Vitro Διαγνωστικά Χρήστος Κρούπης
Νέος Κανονισμός για τα in Vitro Διαγνωστικά. Αλλαγές και προκλήσεις για τη βιομηχανία και
τους εργαστηριακούς επιστήμονες Χρύσανθος Μητρόπουλος
Το μέλλον του επαγγέλματός μας: Κλινική Χημεία ή Ειδικευμένος/η στην Εργαστηριακή Ιατρική;
Η νέα Ευρωπαϊκή οδηγία για τα επαγγελματικά δικαιώματα Δημήτριος Ρίζος
18:00-19:30 Στρογγυλό Τραπέζι
«Present and future challenges for Laboratory Medicine»
Προεδρείο: Bernard Gouget, Αλέξανδρος Χαλιάσος
Verification of in vitro medical diagnostics (IVD) metrological traceability: Responsibilities and
strategies in the EU context Mauro Panteghini
m-Health - New Horizons for Health and Laboratory Medicine Bernard Gouget
P4 Medicine: Predictive, Preventive, Personalized and Participatory. A new trend in Laboratory
Medicine Maurizio Ferrari
19:30-20:00 Κλείσιμο συνεδρίου –Απονομή βραβείων Κατερίνα Ψαρρά, Έφη Μπότουλα
8
Διαλέξεις
ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗΣ ΚΑΙ ΓΟΝΟΤΥΠΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΑ
ΑΝΤΙΦΥΜΑΤΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ
Π. Ιωαννίδης
Εθνικό Κέντρο Αναφοράς Μυκοβακτηριδίων (ΕΚΑΜ), Μικροβιολογικο Εργαστήριο, Νοσοκομείο
"Σωτηρία"
Στις αρχές του 21ου αιώνα η φυματίωση παραμένει ένα από τα κυριότερα λοιμώδη νοσήματα. Το
2012 υπήρχαν παγκοσμίως 8,6 εκατομμύρια νέα περιστατικά και ~1,3 εκατομμύρια θύματα, με
συνέπεια η φυματίωση να αποτελεί τη δεύτερη αιτία θανάτου από μολυσματικό νόσημα, μετά το
AIDS [1].
Περίπου το 1/3 του παγκόσμιου πληθυσμού έχει μολυνθεί από τον βάκιλο
Μycobacterium tuberculosis (MΤΒ), που παραμένει όμως στην συντριπτική πλειοψηφία των
περιπτώσεων υπό τον έλεγχο του ανοσοποιητικού συστήματος (λανθάνουσα νόσος). Ο βάκιλος
μπορεί να ενεργοποιηθεί και να οδηγήσει σε ενεργό νόσο, με την πτώση του ανοσοποιητικού
συστήματος και αυτό μπορεί να συμβεί φυσιολογικά με την γήρανση ή λόγω παθολογικών
καταστάσεων όπως η ΗΙV λοίμωξη, ορισμένες κακοήθειες, ο διαβήτης ή αλλά παθολογικά αίτια,
αλλά και εξ' αιτίας παραγόντων που υποβαθμίζουν το επίπεδο ζωής. Ιστορικά η φυματίωση έχει
συνδεθεί με την φτώχεια, και κατά συνέπεια , η τρέχουσα οικονομική κρίση, ενέχει κινδύνους
αναζωπύρωσης της, ακόμη και σε χώρες ή περιοχές με χαμηλό επιπολασμό της νόσου [2]. Στην
χώρα μας, τα επίσημα στοιχεία, με βάση τα καταγεγραμμένα κρούσματα, δείχνουν χαμηλό
επιπολασμό της νόσου. Όμως αυτό δεν πρέπει να αποτελεί στοιχείο εφησυχασμού, γιατί: α)
υπάρχει, σημαντικό ποσοστό υποδήλωσης, που εκτιμάται ότι μπορεί να αγγίζει ακόμη και το 80%
[3], β) γιατί υπάρχουν ήδη καταγεγραμμένα ανησυχητικά δεδομένα για τις επιπτώσεις της
οικονομικής κρίσης σε άλλα νοσήματα, όπως η λοίμωξη από τον ιό HIV [4] και γ) η χώρα αποτελεί
πύλη εισόδου προς την Ε.Ε. μεταναστών από περιοχές με υψηλό επιπολασμό της νόσου.
Σημαντικό πρόβλημα για την αντιμετώπιση της νόσου αποτελεί η ανάδειξη και διασπορά
πολυανθεκτικών (MDR-TB: αντοχή στα κυρία αντιφυματικά φάρμακα ριφαμπικίνη και ισονιαζίδη)
και υπερ-ανθεκτικών (XDR-TB: με επιπρόσθετη αντοχή και στα δευτερεύοντα αντιφυματικά
κινολόνες και αμινογλυκοσίδες/κυκλικά πεπτίδια) στελεχών του βακίλου. Οι μορφές αυτές της
νόσου αποτελούν ιδιαίτερη πρόκληση για το σύστημα υγείας, λόγω της υψηλού κόστους
μακροχρόνιας θεραπείας, την ανάγκη νοσηλείας σε ειδικές συνθήκες (ατομικούς θαλάμους
9
αρνητικής πίεσης), αλλά και την ίδια την αποτελεσματικότητα της θεραπείας, ιδιαίτερα για
ασθενείς με XDR-TB. Η αντοχή του βακίλου της φυματίωσης, οφείλεται σε χρωμοσωμικές
μεταλλάξεις σε διαφορετικούς γενετικούς τόπους, για τα διάφορα φάρμακα. Οι μεταλλάξεις
αυτές, που συμβαίνουν τυχαία, επιλέγονται και συσσωρεύονται, λόγω ελλιπούς αγωγής ή μη
συμμόρφωσης στην θεραπευτική αγωγή, που είναι πολυφαρμακευτική και πολύμηνη και απαιτεί
συνεχή ιατρική/νοσηλευτική παρακολούθηση για την πιστή τήρηση της . Η έξαρση της εμφάνισης
τέτοιων μορφών της νόσου παρατηρείται σε χώρες που αντιμετώπισαν ή αντιμετωπίζουν
σημαντικά προβλήματα στο υγειονομικό τους σύστημα. Αρχικά υπήρχε η εκτίμηση ότι οι
μεταλλάξεις που συνδέονται με αντοχή μειώνουν το προσαρμοστικότητα (fitness) των στελεχών
και ως εκ τούτου τη μολυσματικότητα και την διασπορά τους. Σήμερα, όμως είναι σαφές ότι
συγκεκριμένες μεταλλάξεις ή συνδυασμοί τους δεν μειώνουν την προσαρμοστικότητα λόγω
εμφάνισης και επιλογής αντισταθμιστικών μεταλλάξεων [5].
Η εργαστηριακή διάγνωση της φυματίωσης στηρίζεται σε συνδυασμό διαφορετικών
μεθοδολογιών, που αναπτύσσονται σε βάθος χρόνου μιας και η ανάπτυξη του βακίλου στην
καλλιέργεια, μπορεί να απαιτήσει έως και 40 ημέρες. Αν μάλιστα συνυπολογιστεί και ο έλεγχος
της φαρμακευτικής αντοχής με την μέθοδο της καλλιέργειας, το διάστημα μπορεί να φτάσει έως
και τις 60 ημέρες. Ο χρόνος αυτός είναι πολύτιμός - ιδιαίτερα σε περιπτώσεις MDR/XDR-TB - τόσο
για τον ασθενή όσο και για τον έλεγχο της διασποράς της νόσου. Το μεγάλο πλεονέκτημα των
μοριακών τεχνικών είναι η ταχύτητα και η υψηλή ευαισθησία τους, που σε συνδυασμό με την
μεγάλη διαγνωστική ακρίβεια και επαναληψιμότητα, τις καθιστούν πολύτιμες για τη διάγνωση,
ταυτοποίηση, αλλά και τον έλεγχο της ευαισθησίας του M. tuberculosis στα αντιφυματικά
φάρμακα μέσω της ανίχνευσης γενετικών μεταλλάξεων. Ο ΠΟΥ έχει πρόσφατα υιοθετήσει μια
σειρά από αυτές τις διαγνωστικές προσεγγίσεις (μέθοδοι ανάστροφου υβριδισμού, Gene Xpert
MTB/RIF) [6]. Ωστόσο, ακόμη και οι μέθοδοι που θα μπορούσαν να χαρακτηριστούν ως "παρά τη
κλίνη" προσεγγίσεις, συνιστάται να χρησιμοποιούνται ενταγμένες στον διαγνωστικό αλγόριθμο,
στον οποίο η
κλασική διαγνωστική προσέγγιση με την καλλιέργεια, παραμένει η μέθοδος
αναφοράς τόσο για την ανίχνευση όσο και για τον έλεγχο ευαισθησίας στα αντιφυματικά φάρμακα
[7]. Η εφαρμογή των μεθόδων πρέπει να γίνεται από κατάλληλα εκπαιδευμένο προσωπικό με
διακριβωμένο εξοπλισμό και να εφαρμόζεται τόσο Εσωτερικός όσο και Εξωτερικός Έλεγχος
Ποιότητας , ο οποίος για το ΕΚΑΜ παρέχεται από το 2010, από τον Οργανισμό Instand e.V, με
10
άριστα αποτελέσματα, στo πλαίσιο του Ευρωπαίκού Δικτύου Εργαστηρίων Φυματίωσης (ERLNTB).
Στην επιδημιολογική διερεύνηση της φυματίωσης, η γενετική ανάλυση διαδραματίζει σημαντικό
ρόλο, αφού ο δημιουργία του γενετικού αποτυπώματος των επιμέρους στελεχών παρέχει την
δυνατότητα της ομαδοποίησης τους με βάση τον βαθμό της συγγένειας τους. Η μοριακή
επιδημιολογία έχει αποκαλύψει την ύπαρξη μεγάλων οικογενειών στελεχών του ΜΤΒ, με
κυρίαρχη μεν παρουσία σε συγκεκριμένες περιοχές, αλλά και παγκόσμια διασπορά από την αρχική
γεωγραφική/πληθυσμιακή αφετηρία τους. Ιδιαίτερα ανησυχητική είναι η παγκόσμια διασπορά
στελεχών της οικογένειας Beijing που φαίνεται να εμφανίζουν αυξημένη μολυσματικότητα και
παθογένεια, ενδογενή αντοχή σε αντιφυματικά φάρμακα και συνδέονται με επιδημίες MDR-TB
κυρίως στις χώρες της Α. Ευρώπης και της Άπω Ανατολής. Τα MDR-TB στελέχη της οικογένειας
αυτής, ενδεχόμενα να αποτελούν μια πηγή καλά προσαρμοσμένων, ιδιαίτερα μολυσματικών και
παθογόνων στελεχών, με τους αντίστοιχούς κινδύνους που αυτό συνεπάγεται [8] . Κάποια από
αυτά τα στελέχη, με αφετηρία τις χώρες της Βαλτικής, εμφανίζουν πλέον ενεργή διασπορά στο
σύνολο της ευρωπαϊκής ηπείρου. Επιπρόσθετα η μοριακή επιδημιολογία, στις χώρες στις οποίες
είναι ενταγμένη στο σύστημα ενεργού διερεύνησης της νόσου, έχει αναδειχθεί σε σημαντικό
εργαλείο για την αποκάλυψη επιδημικών εξάρσεων , την εύρεση της αλυσίδας της μετάδοσης και
την λήψη προληπτικών μέτρων, αλλά και για τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας των
αντιφυματικών προγραμμάτων [9].
Όπως και σε άλλα πεδία, η μοριακή γενετική επαναστατικοποίησε τόσο την διάγνωσή όσο και την
επιδημιολογική διερεύνηση της φυματίωση τα τελευταία 10-15 χρόνια. Η ανάπτυξή των νέων
μεθοδολογιών που κάνουν πολύ εύκολη και οικονομικά προσιτή την ανάγνωση όλου του
γενετικού υλικού των οργανισμών , δίνει ήδη σημαντικά δεδομένα τόσο στην αποκάλυψή της
γενετικής βάσης των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών του βακίλου όσο και στην λεπτομερέστερη
επιδημιολογική διερεύνηση. Η εφαρμογή της στην καθ' ημέρα πράξη θα επαναστατικοποιήση
περεταίρω και την καθημερινότητα της διάγνωσης.
Βιβλιογραφία
1. WHO: Global Tuberculosis Control 2013. http://www.who.int/tb/publications/global_report/en
2. M J van der Werf, J Giesecke, M Sprenger "Can the economic crisis have an impact on tuberculosis in the
EU/EEA ?" Eurosurveillance, (2012) v. 17, Iss. 12,
11
3. Lytras T, Spala G, Bonovas S, Panagiotopoulos T (2012) Evaluation of Tuberculosis Underreporting in
Greece through Comparison with Anti-Tuberculosis Drug Consumption. PLoS ONE 7(11): e50033.
doi:10.1371/journal.pone.0050033
4. ΚΕΕΛΠΝΟ: ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΑ ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΤΗΣ HIV ΛΟΙΜΩΞΗΣ ΣΤΗΝ ΕΛΛΑΔΑ(ΕΩΣ 31/10/2012).
http://www.keelpno.gr/el-gr
5. I. Comas, S. Borrell, A. Roetzer, G. Rose, B. Malla, M. Kato-Maeda, J. Galagan, S. Niemann & S. Gagneux
"Whole-genome sequencing of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies
compensatory mutations in RNA polymerase genes" Nature Genetics, 44,106–110, (2012),
doi:10.1038/ng.1038
6. World Health Organization. Policy statement. Molecular line probe assay for rapid screening of patients at
risk of multidrug-resistant (MDR) TB. Geneva, 2008.
7. Helb D, Jones M, Story E, Boehme C, Wallace E, Ho K, Kop J, Owens MR, Rodgers R, Banada P et al. (2010)
Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis and Rifampin Resistance by Use of On-Demand, NearPatient Technology. J Clin Microbiol. 48: 229-237.
8. European Concerted Action on New Generation Genetic Markers and
Techniques for the Epidemiology and Control of Tuberculosis. Beijing/
W genotype Mycobacterium tuberculosis and drug resistance. Emerg
Infect Dis (2006), 12:736–43.
9. H. van Deutekom, P. Supply, P. E. W. de Haas, E. Willery, S. P. Hoijng, C. Locht, R. A. Coutinho and D. van
Soolingen "Molecular Typing of Mycobacterium tuberculosis by Mycobacterial Interspersed Repetitive UnitVariable-Number Tandem Repeat Analysis, a More Accurate Method for Identifying Epidemiological Links
between Patients with Tuberculosis" J Clin Microbiol. 2005, 43(9): 4473–4479.
12
ΝΕΑ ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΓΙΑ ΤΟΝ ΙΟ MERS
Σιμόνα Καράμπελα
Διεθύντρια ΕΣΥ, Μικροβιολογικό εργαστήριο, ΝΝΘΑ «Η Σωτηρία»
Οι κοροναιοί είναι μία μεγάλη ομάδα ιών, παθογόνων για τον άνθρωπο και τα ζώα. Οι ανθρώπινοι
κοροναιοί όπως NL63, 229E, OC43, HKUI1 εμφανίζονται σε όλο τον κόσμο και προκαλούν ένα
σημαντικό ποσοστό του συνόλου των κρυολογημάτων με συμπτώματα από ήπια έως σοβαρά. Οι
περισσότεροι από τους ιούς αυτούς προέκυψαν με μετάδοση από νυχτερίδες. Περιλαμβάνουν
όμως και τους ιούς υψηλής παθογονικότητας SARS-CoV και στελέχη MERS-CoV, ιοί με σημαντική
νοσηρότητα και θνησιμότητα, κυρίως στους ηλικιωμένους.
Το 2012, ένας νέος κοροναιός που προκαλεί μία σοβαρή λοίμωξη του αναπνευστικού συστήματος,
εμφανίστηκε στην περιοχή της Μέσης Ανατολής. Τον Μάρτιο του 2012, σε μία μονάδα εντατικής
θεραπείας, αναφέρθηκε σοβαρή λοίμωξη του κατώτερου αναπνευστικού σε 11 ασθενείς από τους
οποίους 10 ήταν εργαζόμενοι στον τομέα της υγείας. Δεν βρέθηκε αιτιολογικός παράγοντας
εκείνη τη στιγμή. Μισό χρόνο αργότερα, αυτή η μικροεπιδημία συνδέθηκε
με μία άλλη
περίπτωση, σε ένα ασθενή στη Jeddah της Σουηδικής Αραβίας. Αφορούσε ένα 60χρονο άνδρα,
που τελικά έχασε τη ζωή του ως συνέπεια οξείας αναπνευστικής λοίμωξης και νεφρικής
ανεπάρκειας, μετά από 10 ημέρες νοσηλείας. Άλλος ασθενής, 49 χρονών από το Κατάρ που
νοσηλεύθηκε στο Ηνωμένο Βασίλειο ήταν παρόμοια περίπτωση, την ίδια εποχή.
Επιδημιολογικά στοιχεία
•
Έως τις 22 Μαιού 2014, ο ΠΟΥ ανακοίνωσε 665 εργαστηριακά επιβεβαιωμένα κρούσματα της
λοίμωξης με MERS-CoV στον άνθρωπο, με 205 θανάτους (www.promed.org). Όλες αυτές τις
περιπτώσεις συνδέονται άμεσα ή έμμεσα με τη περιοχή της Μέσης Ανατολής. Οι περιπτώσεις
στo Ηνωμένο Βασίλειο, Γαλλία, Γερμανία, Ιταλία, Ισπανία, Τυνησία επίσης συνδέονται με τη
Μέση Ανατολή.
•
Στην Ελλάδα, τον Απρίλιο του 2014, το Υπουργείο Υγείας ανακοινώνει το πρώτο εργαστηριακά
επιβεβαιωμένο κρούσμα MERS-CoV.
•
2/3 του συνόλου των περιπτώσεων αφορούν άνδρες (σχέση άνδρες/γυναίκες 1/7) και ο μέσος
όρος ηλικίας είναι 49 ετών.
•
13
Από το 2012 έως σήμερα, 111 (17%) περιπτώσεις αφορούν εργαζόμενους σε υπηρεσίες υγείας.
•
Στο 75% των περιπτώσεων, οι ασθενείς είχαν τουλάχιστον 1 υποκειμενική παθολογική νόσο.
Κλινική εκδήλωση λοίμωξης από MERS-CoV
•
Ο μέσος χρόνος επώασης επιβεβαιώθηκε ότι είναι 5,2 ημέρες, με διάστημα εμπιστοσύνης από
1,9 έως 14,7 ημέρες
•
Οξεία σοβαρή αναπνευστική λοίμωξη με πυρετό, βήχα, δύσπνοια
•
Μυαλγίες
•
Συχνά γαστρεντερικά συμπτώματα με διάρροια, εμέτους, κοιλιακό άλγος
•
Επιπλοκές με οξεία νεφρική ανεπάρκεια, πολυοργανική ανεπάρκεια, ARDS, διαταραχές πήξης
αίματος
•
Άτυπη κλινική εικόνα στους ανοσοκατασταλμένους
Ταυτοποίηση και χαρακτηρισμός του MERS-CoV
Η ταυτοποίηση έγινε με την τεχνική της ανάστροφης μεταγραφής PCR. Ενισχύθηκε ένα μικρό
τμήμα μίας εξαιρετικά διατηρημένης περιοχής του γονιδίου RNA- η εξαρτώμενη RNA πολυμεράση
και έτσι αποκαλύφθηκε ο νέος ανθρώπινος κοροναιός. Η φυλογενετική ανάλυση της αλληλουχίας
των αμινοξέων με εκείνα των γνωστών κοροναιών, έδειξε ότι ο MERS-CoV μαζί με CoV νυχτερίδας
HKUA4 και HKUA5 ανήκουν στην υποομάδα 2c της γραμμής Betacoronavirus (υποοικογένεια
Coronavirinae). Είναι ο πρώτος ιός αυτής της γραμμής που μολύνει άνθρωπο. Ο ιός στην αρχή
πήρε το όνομα HCoV-EMC/2012 (GenBank:JX869059), μετονομάστηκε αργότερα σε MERS-CoV
μετά από διαβούλευση με την ομάδα μελέτης της Διεθνούς Επιτροπής Ταξινόμησης των ιών. Το
γονιδίωμα του MERS-CoV αποτελείται από 30119 νουκλεοτίδια και 10 ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης
(ORFs). Είναι μονόκλονος θετικής κατεύθυνσης RNA ιός. Το γονιδίωμα του κωδικοποιεί δομικές και
μη δομικές πρωτεΐνες. Διάσπαρτες μεταξύ και εντός των δομικών πρωτεϊνών, υπάρχουν πέντε
βοηθητικές πρωτεΐνες μοναδικές για το MERS-CoV που δεν έχουν καμία ομολογία με της γνωστές
ιικές πρωτεΐνες ή πρωτεΐνες κάποιου ξενιστή, εκτός από αυτών των νυχτερίδων γνωστές ως
HKU4, HKU5.
Ζωονοσογόνος μετάδοση
Επειδή οι περισσότεροι ανθρώπινοι κοροναιοί υπεύθυνοι για τα κοινά κρυολογήματα, αρχικά
προέκυψαν με τη μετάδοση από νυχτερίδες σε άλλα είδη ζώων και με δεδομένη τη φυλογενετική
σχέση των MERS-CoV με άλλους κοροναιούς νυχτερίδας όπως HKUA4 και HKUA5, το πιο πιθανό
14
είναι ότι και ο MERS-CoV προήλθε από νυχτερίδες, ωστόσο χρειάζεται περαιτέρω έρευνα.
Απόδειξη ότι οι νυχτερίδες είχαν παίξει το πρωταρχικό ρόλο ως ξενιστές για MERS-CoV προκύπτει
και από μελέτες σχετικά με τον υποδοχέα που χρησιμοποιεί ο MERS-CoV στις νυχτερίδες. Η
διπεπτιδυλοπεπτιδάση 4 DPP4 εκφράζεται στο κατώτερο αναπνευστικό σύστημα του ανθρώπου
και δρα ως λειτουργικός υποδοχέας μόλυνσης για MERS-CoV, υπογραμμίζοντας την ιδέα ότι ο ιός
θα μπορούσε να διασχίσει το φράγμα των ειδών και από τις νυχτερίδες να μολύνει τον άνθρωπο.
Λαμβάνοντας υπόψη ότι η άμεση επαφή του ανθρώπου με νυχτερίδες ή με τις εκκρίσεις τους
είναι σπάνια, οι ενδιάμεσοι ξενιστές ευαίσθητοι στο MERS-CoV μπορεί να εμπλέκονται στην
μετάδοση του ιού στον άνθρωπο. Ανάλυση υπολειμμάτων βασικών αμινοξέων του υποδοχέα
DPP4 αποκαλύπτει ότι, οι καμήλες και οι κατσίκες είναι πιο πιθανόν να είναι σε θέση να
χρησιμοποιούν τον DPP4 λειτουργικό υποδοχέα για την είσοδο του MERS-CoV στα κύτταρα, σε
σύγκριση με άλλα ζώα. Επίσης, ορολογικές μελέτες σε δείγματα από διάφορα είδη ζώων παρέχουν
ενδείξεις για την παρουσία αντισωμάτων αντι-MERS-CoV στις καμήλες. Μην ξεχνάμε ότι οι
καμήλες χρησιμοποιούνται
ευρέως σε αρκετές χώρες, επίσης σε αγώνες, σε διαγωνισμούς
ομορφιάς περίοδο κατά την οποία φυλάσσονται σε ομάδες, δημιουργώντας συνθήκες ευνοϊκές για
την εξάπλωση του ιού. Απτές αποδείξεις για την διαδρομή της μετάδοσης του ιού από ζώα σε
άνθρωπο ακόμα απουσιάζουν. Δεν είναι ξεκάθαρο ακόμα εάν οι καμήλες ακόμα και μολυσμένες
παίζουν ρόλο στη μετάδοση του ιού στον άνθρωπο. Επίσης, δεν είναι σαφές εάν ό ιός εισάγεται
πολλές φορές μέσω ζωονοσογόνου μετάδοσης ή εάν η μετάδοση από άνθρωπο σε άνθρωπο είναι
η κινητήρια δύναμη για τη εξάπλωση του ιού.
Μετάδοση από άνθρωπο σε άνθρωπο
Η μετάδοση από άνθρωπο σε άνθρωπο έχει αναφερθεί σε αρκετές ομαδικές περιπτώσεις στη
Γαλλία, Ηνωμένο Βασίλειο, Ιταλία, Ιορδανία, Τυνησία, Σαουδική Αραβία, Ηνωμένα Αραβικά
Εμιράτα, και Κατάρ. Η μετάδοση αφορά μέλη της ίδιας οικογένειας ή εργαζόμενους σε μονάδες
υγείας. Η εξάπλωση του ιού μεταξύ της οικογένειας ή εντός νοσοκομειακών μονάδων
καταδεικνύει ότι η μετάδοση γίνεται μέσω σταγονιδίων ή στενής επαφής με τους αρρώστους. Οι
διαφορές στην έκφραση του υποδοχέα της άνω ή κάτω αναπνευστικής οδού θα μπορούσε
δυνητικά να εξηγήσει τη περιορισμένη μετάδοση από άνθρωπο σε άνθρωπο. Πάντως, φαίνεται ότι
η μετάδοση ευνοείται από την ανοσοκαταστολή ή από την παρουσία μίας υποκείμενης νόσου
όπως ο διαβήτης.
15
Επιτήρηση της λοίμωξης
Το CDC ορίζει:
1. Ασθενής υπό παρακολούθηση- άτομο με οξεία αναπνευστική λοίμωξη (πυρετός, βήχα), υποψία
για πνευμονία ή ARDS βάση κλινικής ή ακτινολογικής εικόνας ΚΑΙ ιστορικό ταξιδιού από την
Αραβική Χερσόνησο ή γειτονικές χώρες εντός 14 ημερών
2. Άτομο που αναπτύσσει σοβαρή οξεία νόσο του κατώτερου αναπνευστικού εντός 14 ημερών
μετά από ταξίδι από Αραβικές ή γειτονικές χώρες και δεν ανταποκρίνεται στην θεραπεία
3. Άτομα που αναπτύσσουν σοβαρή νόσο του κατωτέρου αναπνευστικού τα οποία είχαν στενή
επαφή με συμπτωματικό ταξιδιώτη που παρουσίασε πυρετό και οξεία λοίμωξη του
αναπνευστικού εντός 14 ημερών μετά το ταξίδι από Αραβικές ή γειτονικές χώρες. Στενή
επαφή ορίζονται τα μέλη της οικογένειας, οι εργαζόμενοι σε υπηρεσίες υγείας και
σχετίζονται με τον ασθενή
ή άτομα που παραμένουν στο ίδιο μέρος (επισκέπτης,
συγκάτοικος ή ασθενής συνταξιδιώτης).
Νοσοκομειακή αντιμετώπιση
Σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες της ΠΟΥ, η πρόληψη και ο έλεγχος λοίμωξης σε
υγειονομικές μονάδες απαιτεί την εφαρμογή μέτρων ελέγχου, απαιτεί διοικητικά, μηχανικά και
περιβαλλοντικά μέτρα, αλλά βέβαια και χρήση μέτρων ατομικής προστασίας.
1. Απαραίτητη απομόνωση σε μονόκλινο θάλαμο επαρκώς αεριζόμενο, πάντα με κλειστή πόρτα.
2. Η μετακίνηση του ασθενή θα γίνεται μόνο για τελείως απαραίτητες εξετάσεις
3. Απαγορεύεται η επίσκεψη μη εξουσιοδοτημένων ατόμων αλλά και η είσοδος ιατρικού και
νοσηλευτικού προσωπικού θα πρέπει να είναι σημαντικά περιορισμένη.
4. Τήρηση των κανόνων υγιεινής χεριών, ατομικών μέτρων προστασίας από το νοσηλευτικό
προσωπικό (γάντια, ποδιά, γυαλιά και μάσκες υψηλής προστασίας πχ Ν95 με φίλτρο) και
αποφυγή άμεσης επαφής με τις σωματικές εκκρίσεις του ασθενή.
Εργαστηριακή διάγνωση
ΔΕΙΓΜΑΤΑ: δείγματα του ανώτερου και κατώτερου αναπνευστικού (ρινοφαρυγγικό επίχρισμα,
πτύελα, βρογχικές εκκρίσεις, BAL), οροί, κόπρανα, ιστοί
16
ΜΕΘΟΔΟΙ: Το FDA έχει δώσει την έγκριση για τεχνική: “Novel coronavirus 2012 real-time reverse
transcription-PCR assay” για δείγματα του αναπνευστικού, αίμα και κόπρανα. Επίσης, γίνεται
αναζήτηση αντισωμάτων αντι MERS-CoV στον ορό
Που βρισκόμαστε τώρα;
•
Ο συνολικός αριθμός παραμένει σε σχετικά χαμηλά επίπεδα. Ωστόσο δεν είναι λόγος
εφησυχασμού γιατί ήδη ο ιός έχει εξαπλωθεί στην Ευρώπη και πιθανόν να εξαπλωθεί σε όλο
τον κόσμο.
•
Η μετάδοση από άνθρωπο σε άνθρωπο έχει παρατηρηθεί τόσο στο οικογενειακό περιβάλλον
όσο και στο νοσοκομειακό, όχι μόνο στα άτομα με κάποια υποκειμενική νόσο αλλά και σε υγιή
•
Όπως και άλλοι κοροναιοί, ο MERS-CoV μπορεί να υποστεί μεταλλάξεις και να προσαρμοστεί
καλύτερα ενισχύοντας έτσι τη μεταδοτικότητα και την αναπαραγωγή του.
•
Τα θεραπευτικά μετρά μπορεί να χρειαστεί να συνδυαστούν με μέτρα για τον περιορισμό
εμφάνισης και εξάπλωσης του MERS-CoV μεταξύ των ενδιάμεσων ξενιστών.
•
Η ταχεία ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπευτικών σχημάτων είναι πρώτη προτεραιότητα,
όμως προς το παρόν δεν υπάρχει συγκεκριμένη θεραπεία ή εμβόλιο. Η κλινική εμπειρία από το
SARS CoV, δείχνει ότι μία σειρά από παρεμβάσεις, που περιλαμβάνει αντιρετροικά φάρμακα
όπως ριμπαβιρίνη με ή χωρίς κορτικοστεροειδή, ιντερφρόνη άλφα με κορτικοστεροειδή,
ριμπαβιρίνη με λοπιναβίρ και ριτοναβίρ μπορεί να βελτιώσουν την έκβαση της νόσου με
μείωση της θνησιμότητας, αλλά ακόμη τα στοιχεία δεν είναι πειστικά.
17
IΟΣ ΤΟΥ ΔΥΤΙΚΟΥ ΝΕΙΛΟΥ (WEST NILE VIRUS)
Βασίλης Ζευγώλης, Βιοχημικός, PhD
Εθνικό Κέντρο Αιμοδοσίας (Ε.ΚΕ.Α)
Γενικά χαρακτηριστικά
Ο ιός του Δυτικού Νείλου (ΔΝ) εντοπίστηκε για πρώτη φορά, το 1937, στην επαρχία του Δυτικού
Νείλου της Ουγκάντα, απ’ όπου και πήρε το όνομά του. Πρόκειται για αρμποιό που ανήκει στο
γένος Flavivirus της οικογένειας Flaviviridae. Στην οικογένεια αυτή περιλαμβάνονται διάφοροι ιοί
μεταξύ των οποίων ο ιός του Δάγγειου πυρετού, ο ιός της Ιαπωνικής εγκεφαλίτιδας και ο ιός του
Kίτρινου πυρετού.
Το σχήμα του ιού του ΔΝ είναι σφαιρικό (διάμετρος περίπου 50 nm) με σχετικά λεία πρωτεινικής
φύσης επιφάνεια ενώ το γονιδίωμα του ιού είναι RNA απλής αλύσου θετικής πολικότητας που
καλύπτεται από 20εδρικό καψίδιο που περιβάλλεται από φάκελο. Οσον αφορά τις γενετικές
παραλλαγές του ιού του ΔΝ, τα μέχρι σήμερα παθογόνα στελέχη ανήκουν σε δύο διακριτούς
εξελικτικούς κλάδους του ιού, τον κλάδο 1 (lineage 1) και τον κλάδο 2 (lineage 2). Αν και προς το
παρόν, μόνον αυτοί οι δύο εξελικτικοί κλάδοι είναι αποδεκτοί με τη φυλογενετική ανάλυση,
φαίνεται ότι υπάρχουν τρεις ακόμη κλάδοι που δεν έχουν ταξινομηθεί ακόμη φυλογενετικά.
Ο ιός μεταδίδεται μέσω νύγματος από μολυσμένα κουνούπια, κυρίως του είδους Culex. Στη φύση
τη δεξαμενή (reservoir) του ιού αποτελούν τα άγρια και οικόσιτα πτηνά από τα οποία μέσω
κουνουπιών-διαβιβαστών (vectors) πραγματοποιείται η μετάδοση του ιού προς τους ανθρώπους,
τα ιπποειδή, άλλα θηλαστικά ή σπονδυλωτά που θεωρούνται αδιέξοδοι ξενιστές (dead-endhosts)
καθώς ο τίτλος του ιού στο αίμα τους, κατά τη διάρκεια της ιαιμίας, είναι χαμηλός και δεν επαρκεί
για τη μόλυνση των κουνουπιών.
Λιγότερο συχνός τρόπος μετάδοσης είναι μέσω μετάγγισης μολυσμένου αίματος, ενώ έχουν
παγκοσμίως αναφερθεί μεμονωμένα περιστατικά μετάδοσης μέσω μεταμόσχευσης, από τη
μητέρα στο έμβρυο, με το θηλασμό, με το χειρισμό άρρωστων ζώων ή μολυσμένων δειγμάτων από
άτομα που δουλεύουν σε εργαστηριακό περιβάλλον
Επιδημιολογία του ιού του ΔΝ
Από το 1937 που ο ιός απομονώθηκε για πρώτη φορά μέχρι το 1999, είχαν αναφερθεί σποραδικά
κρούσματα στην Αφρική και στην Ευρώπη. Η πρώτη μεγάλη έξαρση της νόσου παρατηρήθηκε στην
18
Νέα Υόρκη το 1999, με επακόλουθο την εξάπλωση του ιού σε πολλές πολιτείες των ΗΠΑ ενώ στη
συνέχεια περιγράφονται κρούσματα στην Ασία, στη Βόρεια Αφρική, στη Λατινική Αμερική αλλά και
πρόσφατα στην Ευρώπη. Πρόσφατα έχουν αναφερθεί επιδημίες ή μεμονωμένα κρούσματα στη
Ρουμανία, Ουγγαρία, Πορτογαλία και Ρωσία.
Το καλοκαίρι-φθινόπωρο 2010 εμφανίσθηκε για πρώτη φορά στην Ελλάδα επιδημία λοίμωξης από
τον ιό του ΔΝ στην περιοχή της Κεντρικής Μακεδονίας με 262 εργαστηριακά επιβεβαιωμένα
κρούσματα από τα οποία τα 191 παρουσίασαν νευρολογικά συμπτώματα ενώ κατέληξαν 35 όπως
φαίνεται από τα στοιχεία του ΚΕΕΛΠΝΟ (Πίνακας 1). Έκτοτε, καταγράφονται ετησίως -κάθε
καλοκαίρι και φθινόπωρο- κρούσματα της λοίμωξης από τον ιό του Δυτικού Νείλου στην Ελλάδα,
σε ανθρώπους και ζώα. Το 2011 ο ιός εξαπλώθηκε νοτιότερα στη Θεσσαλία και στην Αττική ενώ τα
επόμενα έτη και μέχρι σήμερα καταγράφηκαν κρούσματα στην Ανατολική Μακεδονία και Θράκη
(κυρίως στις Περιφερειακές Ενότητες Ξάνθης και Καβάλας, πέριξ του Νέστου ποταμού), στη Δυτική
Ελλάδα, όπως και σε ορισμένα νησιά.
Πίνακας 1: Αριθμός δηλωθέντων κρουσμάτων λοίμωξης από ιό του Δυτικού Νείλου, με και χωρίς
προσβολή του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) ανά έτος, Ελλάδα, 2010-2014. (Τα στοιχεία
για το έτος 2014 αφορούν περίοδο μέχρι 17.10.2014)
Έτος
Κρούσματα λοίμωξης από τον ιό του ΔΝ
2010
2011
2012
2013
2014
Με προσβολή του ΚΝΣ*
197
75
109
51
14
Χωρίς προσβολή του ΚΝΣ
65
25
52
35
1
Θάνατοι κρουσμάτων
35
9
18
11
6
Σύνολο κρουσμάτων
262
100
161
86
15
* εγκεφαλίτιδα ή/και μηνιγγίτιδα ή/και οξεία χαλαρή παράλυση
Πηγή: ΚΕΕΛΠΝΟ
Κλινική εικόνα
Ο χρόνος επώασης της νόσου υπολογίζεται σε 2-15 ημέρες. Στην πλειονότητα των λοιμώξεων (
80%) των ατόμων που μολύνονται από τον ιό, δεν εκδηλώνεται κανένα απολύτως σύμπτωμα ενώ
19
20% των λοιμώξεων εμφανίζουν ήπια κλινικά συμπτώματα όπως ήπια πυρετική συνδρομή με ή
χωρίς εξάνθημα, και σε ορισμένες περιπτώσεις λεμφαδενοπάθεια, συμπτώματα που διαρκούν
λιγότερο από μια εβδομάδα.
Μικρό ποσοστό (< 1%) των ατόμων που μολύνονται από τον ιό του ΔΝ, κυρίως ηλικιωμένα και
ανοσοκατασταλμένα άτομα ή άτομα με επιβαρυμένο ιστορικό λόγω υποκείμενων νοσημάτων, θα
εμφανίσουν σοβαρή κλινική εικόνα με συμμετοχή του κεντρικού νευρικού συστήματος
(μηνιγγίτιδα, εγκεφαλίτιδα, οξεία χαλαρή παράλυση). Η θνησιμότητα στα περιστατικά με
νευρολογική συνδρομή ανέρχεται στο 10%.
Εργαστηριακή διάγνωση
Η εργαστηριακή διάγνωση των λοιμώξεων από τον ιό του ΔΝ βασίζεται κυρίως σε ορολογικές
εξετάσεις στο αίμα ή/και στο ΕΝΥ. Η ανίχνευση ειδικών IgM αντισωμάτων στο ΕΝΥ με
ανοσοενζυμικές
μεθόδους
και
με
τεχνικές
ανοσοφθορισμού
αποτελεί
εργαστηριακά
επιβεβαιωμένη λοίμωξη από τον ιό του ΔΝ. Ακόμη, η απομόνωση του ιού σε κυτταροκαλλιέργειες
ή σε πειραματόζωα αποτελεί μια κλασική εργαστηριακή μέθοδο διάγνωσης και εφαρμόζεται σε
εργαστήρια αναφοράς.
Όσον αφορά τον έλεγχο των αιμοδοτών εφαρμόζεται μοριακός έλεγχος με τεχνικές ΝΑΤ (Nucleic
Acid Testing) όπως είναι η PCR (Polymerase Chain Reaction) και η TMA (Transcription Mediated
Amplification) σε μικροδεξαμενές δειγμάτων ή σε μοναδιαίες αιμοδοσίες.
Πρέπει να σημειωθεί ότι οι ορολογικές τεχνικές παρουσιάζουν διάφορα προβλήματα (π.χ.
διασταυρούμενες αντιδράσεις με άλλους φλαβοιούς) ενώ ταυτόχρονα υπάρχουν μολυσματικοί
ασυμπτωματικοί δότες με ιαιμία και απουσία αντισωμάτων που μπορούν να μεταδώσουν τον ιό.
Από την άλλη πλευρά η διαγνωστική αξία των μεθόδων μοριακού ελέγχου είναι κάπως
περιορισμένη λόγω της ελαττωμένης και σύντομης ιαιμίας στον άνθρωπο.
Στη χώρα μας από το 2010 που εμφανίστηκε πρώτη φορά ο ιός του ΔΝ εφαρμόζεται
εργαστηριακός έλεγχος με τεχνικές ΝΑΤ σε αιμοδότες που διαμένουν ή επισκέπτονται ενδημικές
περιοχές σε συνδυασμό με μέτρα αποκλεισμού αιμοδοτών, έτσι ώστε να μη δημιουργείται
πρόβλημα στην επάρκεια αίματος και στην ασφάλεια της μετάγγισης. Τα αποτελέσματα των
ελέγχων αυτών μέχρι σήμερα παρουσιάζονται στον πίνακα 2.
20
Μέτρα πρόληψης για τη μετάδοση της λοίμωξης από τον ιό του ΔΝ
Τα σημαντικότερα μέτρα που εφαρμόζονται διεθνώς για την πρόληψη της λοίμωξης από τον ιό του
ΔΝ είναι:
-Η επιδημιολογική επιτήρηση
-το συστηματικό και έγκαιρο πρόγραμμα καταπολέμησης των κουνουπιών και
-η ενημέρωση του κοινού για την προστασία από τα κουνούπια.
Για την προστασία των μεταγγίσεων το Εθνικό Κέντρο Αιμοδοσίας σε συνεργασία με το ΚΕΕΛΠΝΟ
και άλλους εμπλεκόμενους φορείς θεσπίζει μέτρα (Οδηγία 2004/33/ΕΚ – Π.Δ. 138/2005) για την
προστασία των μεταγγιζόμενων ασθενών που είναι
-καθορισμός της περιόδου κυκλοφορίας του ιού και των ενδημικών περιοχών.
-αναβολή πληθυσμιακών αιμοληψιών από ενδημικές περιοχές
-αποκλεισμός των αιμοδοτών που διαμένουν ή επισκέπτονται ενδημικές περιοχές για 28 ημέρες
σε συνδυασμό με εφαρμογή μοριακού ελέγχου στα πλαίσια της διασφάλισης της επάρκειας
αίματος
-αποκλεισμός από την αιμοδοσία ατόμων μολυσμένων από τον ιό τουλάχιστον 4 μήνες από την
διάγνωση της νόσου
Πίνακας 2. Αιμοδοσία και ιός του ΔΝ 2010-2014 (Τα στοιχεία για το έτος 2014 αφορούν περίοδο
μέχρι 17.10.2014)
Αρ.
Περίοδος
Περίοδος
Περίοδος
Περίοδος
Περίοδος
μετάδοσης
μετάδοσης
μετάδοσης
μετάδοσης
μετάδοσης
2010
2011
2012
2013
2014
100.950
39.847
26.910
6.000
5
5
3
1
0
με -
-
2
-
-
Ελεγμένων 27.108
μονάδων αίματος
WNV-RNA Θετικές
Μετάδοση
μετάγγιση
Κόστος ελέγχου
21
2.100.000
210.000
ΙΟΣ EBOLA
Σωτήρης Τσιόδρας
Αναπλ. Καθηγητής Παθολογίας-Λοιμωξιολογίας, Αττικό Παν/κό Γενικό Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή
Πανεπιστημίου Αθηνών και Λοιμωξιολόγος ΚΕΕΛΠΝΟ
Η νόσος από τον ιό Έμπολα είναι μια σπάνια, σοβαρή και συχνά θανατηφόρα ιογενής λοίμωξη η
οποία προσβάλλει ανθρώπους αλλά και άλλα θηλαστικά (πχ πίθηκοι, γορίλλες, χιμπατζήδες,
φρουτοφάγες νυχτερίδες ). Η νόσος είναι γνωστή από το 1976 και κατά καιρούς εμφανίζεται με
επιδημικά κύματα σε χώρες της Αφρικής όπως η Λαϊκή Δημοκρατία του Κονγκό, η Αγκόλα και το
Σουδάν.
Ο ιός μπορεί να μεταδοθεί μετά από άμεση επαφή με το αίμα ή με τα βιολογικά υγρά ενός
προσβεβλημένου ασθενούς ή ζώου (κυρίως πίθηκοι ή οι φρουτοφάγες νυχτερίδες - σε χώρες της
Αφρικής - οι οποίες και θεωρούνται μια από τις κύριες αποθήκες του ιού στην φύση). Δεν έχει
τεκμηριωθεί αερογενής μετάδοση της νόσου. Οι άνδρες επιζώντες είναι σε θέση να μεταδώσουν
τη νόσο μέσω του σπέρματος επί σχεδόν δύο μήνες.
Τα συμπτώματα συνήθως εμφανίζονται δύο μέρες έως και τρεις εβδομάδες μετά την επαφή με τον
ιό και περιλαμβάνουν πυρετό, μυαλγίες, κεφαλαλγία, συμπτώματα από το γαστρεντερικό σύστημα
όπως ναυτία, εμετό και διάρροια και αιμορραγική διάθεση. Δεν υπάρχει ειδική θεραπεία για την
νόσο η οποία συνοδεύεται από υψηλά ποσοστά θνητότητας που φτάνουν έως και το 70-90%
Επιδημία ιογενούς αιμορραγικού πυρετού από τον ιό Ebola είναι σε εξέλιξη σε 3 χώρες της Δυτικής
Αφρικής από τα τέλη του 2013. Η επιδημία ανακοινώθηκε για πρώτη φορά στη Γουινέα της
Δυτικής Αφρικής στις αρχές του 2014. Τα κύρια κράτη που πλήττονται είναι η Σιέρα Λεόνε, η
Γουϊνέα και η Λιβερία. Έχουν εξαχθεί κρούσματα σε άλλες χώρες όπως η Νιγηρία όπου υπήρξε και
μικρή τοπική μετάδοση της νόσου, η Σενεγάλη, το Μαλί, η Ισπανία και οι ΗΠΑ. Μέχρι τις 19
Οκτωβρίου είχαν αναφερθεί 9.936 επιβεβαιωμένα κρούσματα συμπεριλαμβανομένων 4.877
θανάτων, στην προσβεβλημένη περιοχή της Αφρικανικής Ηπείρου. Η πλειονότητα των
κρουσμάτων είναι ενήλικες ηλικίας 15 - 59 ετών. Από τον έλεγχο επιβεβαιωμένων εργαστηριακά
κρουσμάτων με PCR, διαπιστώθηκε η γονιδιακή ομοιότητα του στελέχους σε ποσοστό 98%, με το
στέλεχος που προκάλεσε την επιδημία από ιό Ebola στη Λαϊκή Δημοκρατία του Κονγκό το 2009.
22
Το σημαντικότερο μέτρο περιορισμού της τρεχούσης επιδημίας είναι ο έλεγχος της διασποράς σε
τοπικό επίπεδο στις 3 Αφρικανικές χώρες Σιέρα Λεόνε, Γουϊνέα και Λιβερία. Στρατηγικές
προληπτικού ελέγχου εξόδου από τις 3 προσβεβλημένες χώρες έχουν υιοθετηθεί ενώ κάποιες
χώρες εφαρμόζουν και στρατηγικές ελέγχου εισόδου πιθανών κρουσμάτων από τις 3 Αφρικανικές
χώρες. Λόγω της εξαγωγής κρουσμάτων σε άλλες χώρες υπάρχει μια παγκόσμια ανησυχία για
περαιτέρω εξάπλωση του ιού.
23
ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ ΕΠΟΜΕΝΗΣ ΓΕΝΕΑΣ (NEXT GENERATION SEQUENCING)
Απέσσου Αγγελική, Παπαδοπούλου Ειρήνη, Αγιαννιτόπουλος Κωνσταντίνος,
Μεταξά-Μαριάτου Βασιλική, Τσιριγώτη Αγγελική, Νασιούλας Γεώργιος
Genekor ΙΑΕ, Λ. Σπάτων 52, Γέρακας, Αθήνα
Εισαγωγή
Από το 1977 μέχρι και σήμερα η αλληλούχιση κατά Sanger μας δίνει διαρκώς πολύτιμες
πληροφορίες σε όλους τους τομείς της βιολογίας και θεωρείται μέθοδος αναφοράς όσον αφορά
την επαναληψημότητα (πιστότητα) των ευρημάτων. Ένα από τα μεγαλύτερα επιτεύγματά της ήταν
το Human Genome Project που ολοκληρώθηκε το 20011. Παρόλα αυτά, για αυτό το μεγάλο
εγχείρημα χρειάστηκαν 11 χρόνια και η ανάγκη για νέες τεχνολογίες που θα επισπεύδουν το
διάβασμα πολλών δειγμάτων παράλληλα έγινε αισθητή.
Η αλληλούχιση κατά Sanger θεωρείται ως η πρώτης γενιάς τεχνολογία. Τα τελευταία χρόνια, μία
νέα γενιά αναλυτών, αυτοί της μαζικής παράλληλης αλληλούχισης (massive parallel sequencing) ή
αλληλούχισης επόμενης γενιάς (Next Generation Sequencing) έχει έρθει για να καλύψει τα κενά
της αλληλούχισης κατά Sanger όσον αφορά την ταχύτητα, κόστος και ευαισθησία2.
Αλληλούχιση Επόμενης Γενεάς
Η πρώτη εμπορικά διαθέσιμη τεχνολογία μαζικής παράλληλης αλληλούχισης ήρθε ήδη το 2005
από τη Roche σε συνεργασία με την 454 Genome Sequencing. Ακολούθησαν γρήγορα άλλες
εταιρίες όπως η Illumina με την πλατφόρμα SOLEXA GA, η Life Technogies με το SOLID, η Helicos
BioSciences με το Heliscope, κ.α. Όλες αυτές οι πλατφόρμες ήταν μηχανήματα μαζικής παραγωγής
αλληλουχιών σε πολύ μεγάλη κλίμακα με το αντίστοιχο κόστος με αποτέλεσμα να περιορίζονται σε
ερευνητικά κέντρα. Συνέβαλαν και συνεχίζουν να συμβάλλουν σημαντικά σε διάφορες ειδικότητας
της έρευνας όπως η μεταγενωμική, de-novo αλληλούχιση, de-novo transcriptomics, ιολογία,
«κλείσιμο» κενών αλληλούχισης από τεχνολογίες μικρότερων μηκών (genome finishing), διάβασμα
απρόσιτων περιοχών του γονιδιώματος (π.χ. επαναλήψεις).
Στο τέλος του 2009, η Roche / 454 Life Sciences ανακοίνωσε την δημιουργία της πρώτης «μικρού
μεγέθους» πλατφόρμας (Bench Top Sequencer), γνωστή ως GS Junior System. Η πλατφόρμα αυτή
βασίζεται στις ίδιες αρχές με το μεγαλύτερο μηχάνημα της ίδιας εταιρίας αλλά σε μικρότερη
24
κλίμακα, κάνοντας τη συμβατή με τη χρήση της σε μικρότερα εργαστήρια τόσο ερευνητικά όσο και
διαγνωστικά. Ως αποτέλεσμα, δημοσιεύσεις που αφορούσαν στην χρήση της τεχνολογίας αυτής
στη διάγνωση δεν άργησαν να παρουσιαστούν3-5. Παράλληλα, όλο και περισσότερες ομάδες
εργασίας δημοσιεύουν κατευθυντήριες οδηγίες ως προς τη χρήση της αλληλούχισης επόμενης
γενεάς στην διάγνωση 6-8.
Σύντομα άλλες κατασκευάστριες εταιρίες όπως η Illumina και η Life Technologies, κατασκεύασαν
αντίστοιχες Bench Top πλατφόρμες, την MiSeq και Ion Torrent, αντίστοιχα. Η Illumina μάλιστα
προχώρησε και ένα βήμα παραπέρα και το Νοέμβριο του 2013 καθιέρωσε την πρώτη πλατφόρμα
MiSeqDx, με την έγκριση του FDA για χρήση στην κλινική διάγνωση της κυστικής ίνωσης. Επίσης η
Roche ανακοίνωσε συνεργασία με την Pacific Biosciences στην δημιουργία νέας τεχνολογία που
βασίζεται στην αλληλούχιση μονών μορίων DNA σε πραγματικό χρόνο (Single Molecule Real Time
– SMRT Sequencing) και αναμένεται να παρουσιάσει νέο όργανο για κλινική χρήση με κλινικές
εφαρμογές αλληλούχισης.
Κάθε πλατφόρμα έχει τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματα της. Για παράδειγμα η
μεθοδολογία που χρησιμοποιείται από την πλατφόρμα της ROCHE επιτρέπει την γρηγορότερη
αλληλούχηση μεγαλύτερων τμημάτων DNA, δηλ. περισσότερες από 450 βάσεις σε αντίθεση με τις
100 βάσεις της ILLUMINA. Η τεχνολογία της ILLUMINA είναι πιο επιρρεπής σε λάθη
αντικατάστασης ενώ αυτή της ROCHE σε ψευδείς προσθήκες και ελλείμματα ιδίως σε περιοχές με
ομοπολυμερή. Η επιλογή λοιπόν της πλατφόρμας που θα χρησιμοποιηθεί εξαρτάται αποκλειστικά
από τα ερωτήματα τα οποία στοχεύει ο κάθε ερευνητής να απαντήσει.
Τεχνικά χαρακτηριστικά της τεχνολογίας
Ο συγκεντρωτικός ορισμός Next Generation Sequencing (NGS) περιλαμβάνει μία σειρά μεθόδων
που μπορούν να ομαδοποιηθούν ως προετοιμασία του δείγματος προς ανάλυση, αλληλούχιση και
απεικόνιση. Η χρήση ενός μοναδικού συνδυασμού συγκεκριμένων πρωτοκόλλων σε κάθε στάδιο
διαφοροποιεί τις πλατφόρμες και καθορίζει τα δεδομένα που παράγονται με την κάθε μία και κατ’
επέκταση την ιδανικότερη για την κάθε εφαρμογή.
Παρ’ όλα αυτά, όλες οι εμπορικά διαθέσιμες πλατφόρμες βασίζονται σε κάποια κοινά
χαρακτηριστικά9.
25
1. Σε όλες τις πλατφόρμες τα δείγματα προς αλληλούχιση ενισχύονται (πολλαπλασιάζονται) με
τη χρήση πολυμεράσης μετά από τη δέσμευση τους σε μία στερεή επιφάνεια (γυάλινο
πλακάκι ή μικροσφαιρίδιο). Η ενίσχυση αυτή είναι απαραίτητη ώστε οι αντιδράσεις
αλληλούχισης να παράγουν αρκετό σήμα ούτος ώστε να είναι ανιχνεύσιμες από το οπτικό
σύστημα της πλατφόρμας.
2. Η αλληλούχιση στις πλατφόρμες αυτές πραγματοποιείται ως μία καλά οργανωμένη σειρά
επαναλαμβανόμενων βημάτων, τα οποία λαμβάνουν χώρα και καταγράφονται αυτόματα. Ο
τρόπος που αυτό επιτυγχάνεται, διαφέρει από πλατφόρμα σε πλατφόρμα, τονίζοντας την
εκπληκτική καινοτομία στην χημεία, μοριακή βιολογία και μηχανική η οποία απαιτείται για
να λάβουμε τις πληροφορίες της αλληλουχίας από τις εκατοντάδες μορίων DNA παράλληλα.
Ασχέτως των λεπτομερειών της κάθε πλατφόρμας, η αλληλούχιση επόμενης γενεάς
διακρίνεται από αυτήν κατά Sanger από το γεγονός ότι οι πληροφορίες παράγονται
σταδιακά από βάση σε βάση και όχι από τον ηλεκτροφοριτικό διαχωρισμό και ανίχνευση
των ήδη πραγματοποιημένων αντιδράσεων.
3. Σε κάθε περίπτωση, ο όγκος των πληροφοριών που παράγονται κατά την αλληλούχιση είναι
πάρα πολύ μεγάλος. Η έμφαση στην ανάλυση λοιπόν έχει μετακινηθεί από την παραγωγή
των πληροφοριών στην ανάλυση τους. Το γεγονός αυτό έχει δημιουργήσει την ανάγκη για
νέα εργαλεία βιοπληροφορικής10, τα οποία να συνδυάζουν τις ακόλουθες ιδιότητες:
a. Αρχική
ανάλυση
για
καθορισμό
των
πληροφοριών
που
μπορούν
να
χρησιμοποιηθούν για περαιτέρω ανάλυση (απόρριψη αλληλουχιών κακής ποιότητας,
αλληλουχίες που υπάρχουν εις διπλούν κ.α.)
b. Στοίχιση των αλληλουχιών που προκύπτουν με το γονιδίωμα αναφοράς
c. Σύγκριση και αξιολόγηση των αλληλουχιών με το γονιδίωμα αναφοράς
d. Ταχύτητα
Συμπεράσματα
Τα τελευταία δέκα χρόνια, η ανάλυση του γενετικού υλικού έχει προχωρήσει με τεράστια βήματα
στην χρήση τεχνολογίας επόμενης γενεάς αλληλούχισης σε ερευνητικό επίπεδο με σκοπό να
απαντήσει πληθώρα ερωτημάτων που προέκυψαν από τη χαρτογράφηση του ανθρώπινου (και
άλλων) γονιδιώματος. Η χρήση της τεχνολογίας αυτής μεταφέρεται με ταχύτατους ρυθμούς και
στην κλινική πρακτική, όπου εφαρμόζεται όλο και περισσότερο τόσο για την ταχύτερη διάγνωση
κληρονομούμενων νοσημάτων με γνωστή αιτιολογία, για την ανάλυση πολλών γονιδίων
26
παράλληλα σε σύνδρομα με επικαλυπτόμενο φαινότυπο, όσο και στην ογκολογική διάγνωση με
σκοπό την στοχευμένη θεραπεία.
Βιβλιογραφία
1. Lander ES et al (2001) Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409:860-921.
2. Metzker ML (2010) Sequencing technologies - the next generation. Nat Rev Genet. 11:31-46.
3. Haack TB, Haberberger B, Frisch EM, Wieland T, Iuso A, Gorza M, Strecker V, Graf E, Mayr JA, Herberg
U, Hennermann JB, Klopstock T, et al. (2012) Molecular diagnosis in mitochondrial complex I
deficiency using exome sequencing. J Med Genet 49:277–83.
4. Shanks ME, Downes SM, Copley RR, Lise S, Broxholme J, Hudspith KA, Kwasniewska A, Davies WI,
Hankins MW, Packham ER, Clouston P, Seller A, et al. (2012) Next-generation sequencing (NGS) as a
diagnostic tool for retinal degeneration reveals a much higher detection rate in early-onset disease.
Eur J Hum Genet 21:274–80.
5. Vissers LE, de Ligt J, Gilissen C, Janssen I, Steehouwer M, de VP, van LB, Arts P, Wieskamp N, del RM,
van Bon BW, Hoischen A, et al. (2010). A de novo paradigm for mental retardation. Nat Genet
42:1109–12.
6. Marjan M. Weiss, Bert Van der Zwaag, Jan D. H. Jongbloed, Maartje J. Vogel, Hennie T. Brüggenwirth,
Ronald H. Lekanne Deprez, Olaf Mook, Claudia A. L. Ruivenkamp, Marjon A. van Slegtenhorst, Arthur
van den Wijngaard, Quinten Waisfisz, Marcel R. Nelen and Nienke van der Stoep (2013) Best Practice
Guidelines for the Use of Next-Generation Sequencing Applications in Genome Diagnostics: A
National Collaborative Study of Dutch Genome Diagnostic Laboratories. Human Mutation 34:1313–
21.
7. Rehm HL, Bale SJ, Bayrak-Toydemir P, Berg JS, Brown KK, Deignan JL, Friez MJ, Funke BH, Hegde MR,
Lyon E; Working Group of the American College of Medical Genetics and Genomics Laboratory
Quality Assurance Committee (2013) ACMG clinical laboratory standards for next-generation
sequencing. Genet Med. 15:733-47.
8. Lacroix L, Boichard A, André F, Soria JC (2014) Genomes in the clinic: the Gustave Roussy Cancer
Center experience. Curr Opin Genet Dev. 24:99-106. .
9. Mardis ER (2011) A decade’s perspective on DNA sequencing technology. Nature 470:198–203.
10. Nielsen R, Paul JS, Albrechtsen A, Song YS (2011) Genotype and SNP calling from next-generation
sequencing data. Nat Rev Genet. 12:443-51.
27
ΜΗ ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΟΣ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ
[Non-invasive prenatal testing (NIPT), or diagnosis (NIPD)]
Φένια –Παναγιώτα Τσόπλου
Μοριακή Βιολόγος, GeneDiagnosis
Ο προγεννητικός έλεγχος αποτελεί αναπόσπαστο τμήμα της σύγχρονης γυναικολογίας. Στα
πλαίσια του μια νέα εξέταση που αναπτύσσεται ταχύτατα τα τελευταία χρόνια, δίνει τη
δυνατότητα της μη επεμβατικής λήψης εμβρυϊκού γενετικού υλικού.
Ο μη επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος (NIPT/NIPD) παρέχει τη δυνατότητα υπολογισμού του
κινδύνου ανευπλοειδιών των χρωμοσωμάτων 21, 13, 18, ή χρωμοσωμικών ανωμαλιών που
συνδέονται με το φύλο, στο έμβρυο .
Οι έως σήμερα διαδεδομένες επεμβατικές μέθοδοι της αμνιοπαρακέκτησης και της λήψης
τροφοβλάστης, έχουν μικρό κίνδυνο αποβολής, περίπου 1%. Αντίθετα για την υλοποίηση του μη
επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου, απαιτείται η λήψη περιφερικού αίματος από τη μητέρα και
η μελέτη σε αυτό, του ελεύθερου εμβρυϊκού DNA(cffDNA).
Οι πρώτες προσπάθειες για μη επεμβατική διάγνωση αφορούσαν την απομόνωση ακέραιων
κυττάρων του εμβρύου που κυκλοφορούν στο αίμα της μητέρας. Η σπανιότητα των κυττάρων
αυτών καθώς και η δυνατότητα τους να παραμένουν στην κυκλοφορία ακόμη και μετά από
προηγούμενες κυήσεις, σε συνδυασμό με τη δυσκολία απομόνωσης τους, δεν ευνόησε τη
χρησιμοποίηση τους. Στη συνέχεια το ενδιαφέρον των ερευνητών εστιάσθηκε στο ελεύθερο
εμβρυϊκό DNA, το οποίο ανιχνεύεται στην κυκλοφορία αίματος της μητέρας πολύ νωρίς κατά την
κύηση και η συγκέντρωση του αυξάνει κατά τη διάρκεια της. Στην εγκυμοσύνη, μετά από τη 10η
εβδομάδα, το 4% - 10%, του ελεύθερου DNA προέρχεται από το έμβρυο. Αποτελείται από μικρά
τμήματα, η πλειονότητα των οποίων έχει μέγεθος <200 bp, αποτέλεσμα αποπτωτικής διαδικασίας
τροφοβλαστικών κυττάρων του πλακούντα. Το cffDNA απομακρύνεται από την μητρική
κυκλοφορία, μέσα στην πρώτη ώρα μετά τη γέννηση του εμβρύου. Το σχετικά μικρό ποσοστό του
συγκρινόμενο με το αυτό της μητέρας, αποτελεί έως σήμερα ένα από τα προβλήματα του μη
επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου.
Σήμερα οι κύριες χρωμοσωμικές ανωμαλίες αλλά και άλλα γενετικά νοσήματα είναι εφικτό να
ανιχνευθούν μέσω εξέτασης του cffDNA στο αίμα της μητέρας. Χρησιμοποιείται επίσης στον
καθορισμό του φύλου του εμβρύου, πληροφορία πολύ σημαντική σε περιπτώσεις κυήσεων με
28
αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης φυλοσύνδετου νοσήματος, ή σε κυήσεις με γνωστό οικογενειακό
ιστορικό. Άλλη σημαντική εφαρμογή της μεθόδου είναι ο προσδιορισμός του συστήματος RhD του
εμβρύου, σε γυναίκες RhD αρνητικές. Τέλος, η μέθοδος εφαρμόζεται σε ορισμένες περιπτώσεις
μονογονιδιακών νοσημάτων πατρικής προέλευσης.
Η ευαισθησία και η ειδικότητα του NIPT τεστ είναι –έως σήμερα- χαμηλότερη από αυτή των
επεμβατικών μεθόδων. Η ευαισθησία του ελέγχου αναφορικά με την τρισωμία 21 είναι περίπου
99,5%, ενώ για τις άλλες κοινές χρωμοσωμικές ανωμαλίες (τρισωμία 13 και 18) κυμαίνεται σε
χαμηλότερα ποσοστά, ανάλογα πάντα με την επιλεγόμενη μεθοδολογία που εφαρμόζεται.
Σε κάθε περίπτωση κρίνεται αναγκαία, η πλήρης ενημέρωση των γυναικών για τους περιορισμούς
του μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου, όπως για παράδειγμα, τον μη έλεγχο όλων των
χρωμοσωμάτων του εμβρύου, την πιθανότητα μη έκδοσης αποτελέσματος, την αδυναμία
εφαρμογής του τεστ σε περιπτώσεις πολλαπλής κυοφορίας και τη μικρή αλλά υπαρκτή πιθανότητα
έκδοσης ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων.
Ο μη επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος είναι μια σύγχρονη και ταχύτατα αναπτυσσόμενη
μεθοδολογία, που δεν φέρει κανένα κίνδυνο για το έμβρυο, και απαιτεί συνεχή ενημέρωση και
εναρμόνιση με τις διεθνείς οδηγίες.
29
ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΣΩΜΑΤΙΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΓΩΝ ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΙΚΟ ΙΣΤΟ ΚΑΙ ΕΠΙΛΟΓΗ
ΣΤΟΧΕΥΜΕΝΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ.
Γεώργιος Νασιούλας Ph.D. Επιστημονικός Διευθυντής Genekor
Γεώργιος Νασιούλας, Ειρήνη Παπαδοπούλου, Αγγελική Απέσσου, Βασιλική Μεταξά-Μαριάτου,
Αγγελική Τσιριγώτη, Κωνσταντίνος Αγιαννιτόπουλος.
GENEKOR I.A.E. Λεωφόρος Σπάτων 52, Γέρακας, Αθήνα.
Η πρόοδος στην ανάλυση του γενετικού προφίλ του όγκου οδήγησε στην ανάπτυξη σκευασμάτων
που
στοχεύουν
σε
συγκεκριμένα
μόρια
που
εμπλέκονται
στη
καρκινογένεση.
Η
αποτελεσματικότητα αυτών των φαρμάκων συχνά διαφέρει ανάλογα με την ύπαρξη ή όχι
μεταλλαγών σε γονίδια που κωδικοποιούν για τις πρωτεΐνες-στόχους ή για πρωτεΐνες
που
συμμετέχουν στο ίδιο ενδοκυτταρικό μονοπάτι. Αυτού του είδους η στοχευόμενη θεραπευτική
προσέγγιση καθιστά αναγκαία την μοριακή ανάλυση του όγκου με σκοπό την επιλογή ασθενών με
αυξημένη πιθανότητα ανταπόκρισης στη θεραπεία. Τα τελευταία χρόνια ο αυξανόμενος αριθμός
γονιδίων με εμπλοκή στην ανταπόκριση σε στοχευμένη θεραπεία οδήγησε στη ανάπτυξη νέων
μοριακών τεχνικών όπως η αλληλούχιση επόμενης γενιάς (ΝGS), με στόχο την ταυτόχρονη
ανάλυση μεγαλύτερου αριθμού μεταλλαγών
και κατά συνέπεια τον ακριβέστερο μοριακό
χαρακτηρισμό του όγκου.
Καρκίνος του Παχέος Εντέρου
Τα δύο κύρια ενδοκυτταρικά μονοπάτια που ενεργοποιούνται από τον υποδοχέα EGFR είναι το
μονοπάτι KRAS/RAF/MEK/ERK1/2, το οποίο ελέγχει τη μεταγραφή γονιδίων, την εξέλιξη του
κυτταρικού κύκλου, καθώς και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και το μονοπάτι
PI3K/PTEN/AKT, το οποίο ενεργοποιεί έναν καταρράκτη αντιαποπτωτικών σημάτων και σημάτων
επιβίωσης. Έχει αποδειχτεί ότι μεταλλαγές στα γονίδια που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες KRAS και
NRAS, που ρυθμίζονται από τον EGFR, απομονώνουν το RAS/RAF/MEK/ERK1/2 μονοπάτι από τον
υποδοχέα του και καθιστούν τους αναστολείς του EGFR αναποτελεσματικούς1. Οι μεταλλαγές στα
ΚRAS, και NRAS παρατηρούνται σε περίπου 50% των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου2.
Είναι γνωστό ότι ασθενείς με αυτές τις μεταλλαγές δεν ανταποκρίνονται στη θεραπεία με τα αντιEGFR αντισώματα cetuximab (Erbitux, Merck), και panitumumab (Vectibix, Amgen). Αν και τα
ποσοστά ανταπόκρισης των ασθενών χωρίς μεταλλαγές στα RAS είναι πολύ καλύτερες, είναι
γνωστό ότι κάποιοι από αυτούς δε θα ανταποκριθούν στη θεραπεία. Αυτό υποδεικνύει ότι
30
υπάρχουν και άλλοι μηχανισμοί ανθεκτικότητας στους αναστολείς του EGFR. Μεταλλαγές στο
τρίτο γονίδιο της οικογένειας RAS για παράδειγμα το HRAS, μεταλλαγές στο BRAF καθώς και στο
γονίδιο PIK3CA θα μπορούσαν να ευθύνονται για τη μη ανταπόκριση σε ένα ποσοστό των
φυσιολογικών για KRAS, NRAS ασθενών.
Μεταλλαγές στο γονίδιο BRAF που είναι μέλος της οικογένειας γονιδίων RAF παρατηρούνται σε
περίπου 10% των ασθενών. Θεωρούνται αρνητικός προγνωστικός δείκτης. Επιπλέον υπάρχουν
μελέτες που αναφέρουν ότι έχει και προβλεπτική αξία3. Η ύπαρξη μεταλλαγών στο γονίδιο PIK3CA
παρατηρείται σε περίπου 10-15% των όγκων από ασθενείς με καρκίνο του εντέρου. Το γονίδιο
PIK3CA κωδικοποιεί μια λιπιδική κινάση που εμπλέκεται στο EGFR- ρυθμιζόμενο σηματοδοτικό
μονοπάτι PI3K/PTEN/AKT. Αν και δεν είναι ακόμα ξεκάθαρο, οι πρώτες μελέτες δείχνουν ότι
σχετίζονται με ανθεκτικότητα σε EGFR moAb4.
Στον καρκίνο του παχέος εντέρου παρατηρείται συχνά το φαινόμενο της μικροδορυφορικής
γενετικής αστάθειας (MSI – Microsatellite Instability). Πρόκειται για μικρές αλλαγές στην
αλληλουχία του DNA που συμβαίνουν κατά την αντιγραφή, και είναι συνήθως προσθήκες ή
απαλοιφές μίας ή δυο νουκλεοτιδικών βάσεων. Το φαινόμενο είναι πιο συχνό σε περιοχές του
γονιδιώματος που περιλαμβάνουν επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA με μικρή μονάδα
επανάληψης, από μία έως τέσσερις βάσεις και είναι γνωστές ως μικροδορυφορικές (Microsatellite)
περιοχές5.
Η ανεύρεση μικροδορυφορικής αστάθειας (MSI High) είναι καλός προγνωστικός
δείκτης. Ταυτόχρονα χαρακτηρίζει και το κληρονομούμενο καρκινικό σύνδρομο Lynch σε ποσοστό
που φθάνει το 90%, ενώ συναντάται και στο 10%-15% των σποραδικών καρκίνων του παχέος
εντέρου και του ορθού. Πρόσφατες μελέτες έχουν υποδείξει ότι MSI όγκοι, σποραδικοί ή
κληρονομούμενοι, είναι λιγότερο επιθετικοί από τους υπολοίπους, σχετίζονται λιγότερο με
μακρινές μεταστάσεις ή μεταστάσεις σε λεμφαδένες και έχουν διαφορετική ανταπόκριση στη
χημειοθεραπεία, αφού είναι λιγότερο ευαίσθητοι σε αναστολείς της τοποϊσομεράσης και στη 5FU.
Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα
Στον μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (ΜΜΚΠ) η ανάπτυξη φαρμάκων σήμερα έχει
επικεντρωθεί στις στοχευμένες θεραπείες. Η πιο κοινές σωματικές μεταλλαγές στον ΜΜΚΠΤ
βρίσκονται στα γονίδια EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) and KRAS Kirsten-RAS. Το γονίδιο
EGFR είναι από τα πρώτα μόρια που χρησιμοποιήθηκαν με επιτυχία ως στόχος μοριακών
θεραπειών. Η χορήγηση των πρώτων αναστολέων της τυροσινικής κινάσης αποδείχθηκε ότι
31
αυξάνει την ανταπόκριση καθώς και την επιβίωση σε ασθενείς με μεταλλαγές στην περιοχή
τυροσινικής κινάσης του γονιδίου EGFR (εξώνια 18-21) (Gefitinib Erlotinib)6.
Ο αριθμός των σωματικών μεταλλαγών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως προβλεπτικοί
δείκτες ανταπόκρισης σε στοχευμένη θεραπεία συνεχώς αυξάνεται. Η αναδιάταξη EML4-ALK
θεωρείται ένας χρήσιμος διαγνωστικός μοριακός δείκτης στον μη μικροκυτταρικό καρκίνο του
πνεύμονα καθώς και πολλά υποσχόμενος θεραπευτικός στόχος. Ασθενείς με αυτή την αναδιάταξη
(2-7%) δεν επωφελούνται από θεραπεία με EGFR αναστολείς της κινάσης τυροσίνης (EGFR TKIs).
Αναδιατάξεις του ALK ή του ROS1 είναι δείκτες ανταπόκρισης στη θεραπεία με Crizotinib7.
Επιπλέον για την επιλογή ασθενών για στοχευόμενη θεραπεία μπορούν να χρησιμοποιηθούν οι
μεταλλαγές στο γονίδιο BRAF, μεταλλαγές στο HER2, αναδιατάξεις στο γονίδιο RET καθώς και
επαύξηση του γονιδίου MET και ο κατάλογος συνεχώς αυξάνεται7,8.
Στρωματικοί όγκοι (Gastro Intestinal Tumors, GIST)
Οι στρωματικοί όγκοι (GIST) είναι μεσεγχυματογενείς όγκοι. Η διάγνωσή τους βασίζεται στην
έκφραση του διαμεμβρανικού υποδοχέα κινάσης τυροσίνης ΚΙΤ (tyrosine kinase receptor, KIT).
αφού το 95% των GIST εκφράζουν το αντίσωμα CD 117.
Στο 80-85% των περιπτώσεων
παρατηρούνται επίσης μεταλλαγές στο γονίδιο cKIT (εξώνια 9, 11, 13 και 17) οι οποίες έχουν ως
αποτέλεσμα την συνεχή ενεργοποίηση του υποδοχέα. Επιπλέον στο 10-15% των ασθενών χωρίς
μεταλλαγές στο ΚΙΤ παρατηρούνται μεταλλαγές στο γονίδιο του υποδοχέα κινάσης τυροσίνης
PDGFRA (εξώνια 12, 14, 18)9. Η ανταπόκριση σε στοχευμένη θεραπεία με imatinib εξαρτάται από
τον τύπο μεταλλαγής. Το μεγαλύτερο ποσοστό ανταπόκρισης παρατηρείται σε ασθενείς με
μεταλλαγές στο εξώνιο 11 του ΚΙΤ, ενώ η ύπαρξη μεταλλαγών στο εξώνιο 9 υποδηλώνει ενδιάμεση
ανταπόκριση και
καθιστά αναγκαία τη χορήγηση διπλής δόσης του φαρμάκου. Επιπλέον
υπάρχουν μεταλλαγές στο ΚΙΤ/PDGFRA που προσδίδουν ανθεκτικότητα στο φάρμακο και μπορεί
να παρατηρούνται τόσο στον πρωταρχικό όγκο, πριν τη χορήγηση του φαρμάκου, ή να
εμφανίζονται μετά από χορήγηση φαρμάκου (δευτερεύουσες μεταλλαγές)10.
Μελάνωμα
Σε πολλούς τύπους μελανώματος, μια μεταλλαγμένη πρωτεΐνη BRAF στο μονοπατι της MAPK
διακόπτει τη φυσιολογική ρύθμιση των κυττάρων και προωθεί την αυξημένη παραγωγή κυττάρων.
Περίπου το 50% των ασθενών με μεταστατικό μελάνωμα φέρουν μια μεταλλαγή ενεργοποίησης
στο γονίδιο BRAF11. Θεραπευτικά σκευάσματα ενάντια στο μεταλλαγμένο BRAF (vemurafenib,
debrafenib) σχετίζονται με αυξημένη επιβίωση σε ασθενείς με μεταστατικό μελάνωμα. Επιπλέον
32
σωματικές μεταλλαγές στο γονίδιο KIT παρατηρούνται σε 2-6% των περιπτώσεων κακοήθους
μελανώματος. Η ύπαρξη μεταλλαγών ενεργοποίησης του KIT αυξάνουν την ανταπόκριση στο
imatinib12.
Καρκίνος εγκεφάλου και Γλοιώματα
Το γονίδιο MGMT (Ο6-μεθύλ-γουανινο-DNA μεθυλοτρανσφεράση)) βρίσκεται στο χρωμόσωμα
10q26. Το προϊόν του είναι ένα ένζυμο επιδιόρθωσης του DNA που αναστέλλει το θάνατο των
καρκινικών κυττάρων από αλκυλιωτικούς παράγοντες. Υψηλά επίπεδα αυτού του ενζύμου στους
όγκους προκαλούν ανθεκτικότητα στη χημειοθεραπεία με αλκυλιωτικούς παράγοντες όπως 1,3bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea (BCNU), procarbazine, streptozotocin και temozolomide12. Η
ενεργότητα του ΜGMT ελέγχεται από ένα υποκινητή. Η μεθυλίωση του υποκινητή καταστέλλει την
έκφραση του γονιδίου στον καρκίνο και τα κύτταρα δεν παράγουν πια ΜGMΤ. Τα επίπεδα της
MGMT διαφέρουν ανάλογα με τον τύπο του καρκίνου και μπορεί να διαφέρουν επίσης και μεταξύ
όγκων του ίδιου τύπου. Για παράδειγμα, στο 30% των γλοιωμάτων υπάρχει έλλειψη του MGMT.
Αυτή η έλλειψη του ενζύμου μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία των καρκινικών όγκων στους
αλκυλιωτικούς παράγοντες (όπως το temozolomide). Το γονίδιο MGMT συνήθως δεν παρουσιάζει
μεταλλάξεις ή ελλείψεις. H έλλειψη του MGMT προκαλείται κυρίως μέσω μεθυλίωσης. Θεωρείται
καλός προγνωστικός δείκτης.
Το υλικό για την ανεύρεση σωματικών μεταλλαγών
Το καλύτερο υλικό που έχει σήμερα η επιστημονική είναι τα μπλοκ παραφίνης (Formalin Fixed
Paraffin Embedded Tissue). Με αυτή την τεχνολογία ο καρκινικός ιστός διερευνάται, διατηρείται
και μεταφέρεται αναλλοίωτος.
1. 1. De Roock W, Claes B, Bernasconi D, et al. Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA
mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory
metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncol
2010;11(8):753-62
2. Douillard JY, Oliner KS, Siena S, et al. Panitumumab-FOLFOX4 treatment and RAS mutations
in colorectal cancer. N Engl J Med 2013;369(11):1023-34
33
3. Negru S, Papadopoulou E, Apessos A, Stanculeanu DL,et al. KRAS, NRAS and BRAF mutations
in Greek and Romanian patients with colorectal cancer: a cohort study. BMJ Open. 2014
May 23;4(5)
4. Edmonston TB, Cuesta KH, Burkholder S, et al. Colorectal carcinomas with high
microsatellite instability: Defining a distinct immunologic and molecular entity with respect
to prognostic markers Hum Pathol. 2000 Dec;31(12):1506-14.
5. Sartore-Bianchi A, Martini M, Molinari F, et al. PIK3CA mutations in colorectal cancer are
associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies. Cancer Res.
2009 Mar 1;69(5):1851-7.
6. Lindeman NI, Cagle PT, Beasley MB, et al. Molecular testing guideline for selection of lung
cancer patients for EGFR and ALK tyrosine kinase inhibitors:guideline from the College of
American Pathologists, International Association for the Study of Lung Cancer, and
Association for Molecular Pathology. Arch Pathol Lab Med. 137(6):828–860, 2013.
7. Korpanty GJ, Graham DM, Vincent MD, Leighl NB. Biomarkers That Currently Affect Clinical
Practice in Lung Cancer: EGFR, ALK, MET, ROS-1, and KRAS. Front Oncol. 2014 Aug 11;4:204.
8. Mazières J, Peters S, Lepage B, Cortot AB, et al. Lung cancer that harbors an HER2 mutation:
epidemiologic characteristics and therapeutic perspectives. J Clin Oncol. 2013 Jun
1;31(16):1997-2003.
9. O'Brien KM, Orlow I, Antonescu CR, Ballman K, McCall L, DeMatteo R, Engel LS.
Gastrointestinal stromal tumors, somatic mutations and candidate genetic risk variants.
PLoS One. Apr 18;8(4), 2013
10. von Mehren M, Randall RL, Benjamin RS, Boles S, Bui MM, Casper ES et al. Gastrointestinal
stromal tumors, version 2.2014. J Natl Compr Canc Netw. 2014 Jun;12(6):853-62.
11. Ascierto PA, Kirkwood JM, Grob J-J, et al. The role of BRAF V600 mutation in
melanoma. Journal of Translational Medicine. 2012;10, article 85
12. Curtin JA, Busam K, Pinkel D, Bastian BC. Somatic activation of KIT in distinct subtypes of
melanoma.Journal of Clinical Oncology. 2006;24(26):4340–4346.
13. Hegi ME, Liu L, Herman JG, Stupp R, et al. Correlation of O6-methylguanine
methyltransferase (MGMT) promoter methylation with clinical outcomes in glioblastoma
and clinical strategies to modulate MGMT activity.J Clin Oncol. 2008 Sep 1;26(25):4189-99.
34
CIRCULATING TUMOR CELLS AS A REAL TIME LIQUID BIOPSY: ISOLATION AND
DETECTION SYSTEMS, MOLECULAR CHARACTERIZATION AND CLINICAL
APPLICATIONS
Evi S. Lianidou
Analysis of Circulating Tumor Cells lab, Lab of Analytical Chemistry, Department of Chemistry,
University of Athens, 15771, Greece.
Key words: circulating tumor cells, CTC, liquid biopsy, breast cancer, molecular characterization,
individualized treatment.
ABSTRACT
Detection of Circulating Tumor Cells (CTC) in peripheral blood can serve as a "liquid biopsy"
approach and has thus emerged lately as one of the hottest fields in cancer research. The clinical
significance of CTC has been evaluated in many types of solid cancers, and the CTC enumeration
test in metastatic breast, colorectal and prostate cancer has been cleared by the FDA almost a
decade ago. CTC molecular characterization has a strong potential to be translated into
individualized targeted treatments.
A variety of analytical systems are continuously been developed for CTC isolation, detection and
molecular characterization. The main strategies are based on their separation from peripheral
blood mononuclear cells based on CTC density, size and electric charges and protein expression on
the cell surface of CTC. A variety of microfluidics and filtration devices has been developed and are
currently under evaluation for selection and enumeration of CTCs. CTC detection and molecular
characterization systems are mainly based on protein and image-based approaches like classical
immunocytochemistry, the FDA cleared CellSearch system, and immunofluorescence, and
molecular assays based on the nucleic acid analysis in CTCs like RT-qPCR, multiplex RT-qPCR, and
next generation sequencing technologies. Quality control and standardization of CTC isolation,
detection and molecular characterization methodologies is very important for the incorporation of
CTCs into prospective clinical trials testing their clinical utility.
35
CTC molecular characterization at the single cell level holds considerable promise for the
identification of therapeutic targets and resistance mechanisms in CTCs as well as for the
stratification of patients and real-time monitoring of systemic therapies.
This lecture will be mainly focused on the analytical systems for CTC isolation, enumeration, and
detection and the clinical applications of CTC in many types of solid cancer. We also discuss the
potential of the molecular characterization of CTC as a liquid biopsy in individualized therapy.
36
VITAMIN D AND PATHOPHYSIOLOGY OF BONE
HA Morris
School of Pharmacy and Medical Sciences, University of South Australia, and Chemical Pathology, SA
Pathology, Adelaide, South Australia
The well characterised endocrine pathway of vitamin D metabolism and its activities are solely
responsible for vitamin D regulation of plasma calcium and phosphate homeostasis under control of
serum 1,25-dihydroxyvitamin D, the biologically active metabolite of vitamin D. This pathway
protects against the metabolic bone disease of osteomalacia in adults or rickets in children. The
critical level for serum 25-hydroxyvitamin D to maintain adequate serum 1,25-dihydroxyvitamin D is
20 nmol/L (8 ng/ml). In contrast a large body of data demonstrate that an adequate vitamin D
status protects against osteoporosis, improving bone mineral density and reducing the risk of
fracture. This evidence extends to the relationship between serum 25-hydroxyvitamin D and bone
mineral density and reduction of fracture risk. Serum levels of 1,25-dihydroxyvitamin D do not
relate to osteoporosis nor does administration of 1,25-dihydroxyvitamin D reduce the risk of
fracture. Bone cells metabolise 25-hydroxyvitamin D to 1,25-dihydroxyvitamin D to elicit biological
responses including osteoblast maturation, reducing bone resorption, and enhancing mineral
retention in bone. Such actions protect against bone loss and reduce the risk of fracture in the
elderly. The critical level for serum 25-hydroxyvitamin D for optimising the health of the skeleton is
approximately 75 nmol/L (30 ng/ml). This example from calcium and bone mineral homeostasis of
two critical levels for serum 25-hydroxyvitamin D to protect against either osteomalacia or
osteoporosis arises from the synthesis of 1,25-dihydroxyvitamin D in different organs, the kidney
and skeleton respectively. These organs have different capacities to induce expression of the
enzyme 25-hydroxyvitamin D-1-hydroxylase (CYP27B1) to different levels.
37
ΝΕΟΙ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ: ΑΠΟ ΤΗΝ ΑΝΑΚΑΛΥΨΗ ΣΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΟΥΣ ΣΤΗ ΚΛΙΝΙΚΗ
ΠΡΑΞΗ
Μακρής Κωνσταντίνος
Βιολόγος, Βιοχημικό τμήμα Νοσοκομείο ΚΑΤ
Οι βιοδείκτες χρησιμοποιούνται στην κλινική πρακτική για να περιγράψουν τόσο φυσιολογικές,
όσο και παθολογικές καταστάσεις. Μπορούν επίσης να έχουν προγνωστική διαγνωστική ή και
προβλεπτική ικανότητα. Πριν την διάγνωση μιας νόσου μπορούν να χρησιμοποιηθούν για
πληθυσμιακούς προληπτικούς ελέγχους και για την εκτίμηση του κινδύνου εκδήλωσης ενός
νοσήματος. Κατά τη διάγνωση μπορούν να μας δώσουν πληροφορίες για το στάδιο της νόσου την
βαρύτητα και ακόμη να βοηθήσουνε στην επιλογή της πιο κατάλληλης θεραπείας. Κατά την
διάρκεια της θεραπευτικής αγωγής να μας δώσουν σημαντικές πληροφορίες για την
αποτελεσματικότητα της θεραπευτικής αγωγής την ανάγκη για συμπληρωματική θεραπεία η την
αναζωπύρωση της νόσου. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιούνται όλο και περισσότερο στην ιατρική και
κάθε χρόνο πολλοί νέοι πιθανοί βιοδείκτες προτείνονται.
Σημαντικές εξελίξεις στην βασική έρευνα (γενωμική, πρωτεωμική και στην μοριακή παθολογία) τα
τελευταία χρόνια έχουν αναδείξει πληθώρα υποψήφιων βιοδεικτών οι οποίοι δυνητικά θα
μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στην κλινική πράξη. Ωστόσο, μόνο λίγοι από αυτούς καταλήγουν
να χρησμοποιούνται σε περιβάλλον κλινικής έρευνας, και ακόμη πολύ λιγότεροι έχουν εγκριθεί
για χρήση στην καθημερινή κλινική πράξη. Για να γίνει αυτό απαιτείται η αρκετά επίπονη και
πολλές φορές μακροχρόνια διαδικασία της επικύρωσης του βιοδείκτη. Η επικύρωση συνεπάγεται
αφενός μεν την επίδειξη μιας σύνδεσης με μια σχετική κλινική παράμετρο ή διαδικασία, και
αφετέρου μια ισχυρή και κατάλληλη μέθοδο ανάλυσης.
38
THE BIOCHEMISTRY OF BONE TURNOVER MARKERS
HA Morris
School of Pharmacy and Medical Sciences, University of South Australia, and Chemical Pathology, SA
Pathology, Adelaide, South Australia
Biochemical markers of bone turnover (BTM) offer a means for assessing two major clinical
questions. Can baseline levels of BTM predict the rate of bone loss or future fracture risk? Can BTM
be used to monitor the response to treatments for osteoporosis? Assays for numerous BTM are
readily available on automated clinical chemistry analysers and point-of-care devices including 7
assays to assess bone formation and 8 assays to assess bone resorption. Despite a long history of
use there is still considerable debate as to their clinical utility. A position paper published by the
IOF-IFCC-IOF Working Group on Bone Marker Standards for Osteoporosis recommended that in
future clinical trials serum β-CTX be used to assess bone resorption and serum PINP be used to
assess bone formation. These are well characterised analytes, demonstrate high bone specificity,
are measurable in serum and are available on more than one manufacturers’ automated platform.
One meta-analysis has recently been published indicating a statistically significant but clinically
small prognostic indication that increased serum β-CTX increases the risk of fracture in
postmenopausal women. Currently two automated assays are available for serum β-CTX and
current data suggest that their values are not compatible. In this metaanalyses data from both
assays were combined. A consequence of these recommendations is the need to harmonize the
assays for BTMs. A second working group (IOF-IFCC WG-Standardisation of Bone marker Assays)
aims to undertake these projects.
39
ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ ΟΣΤΙΚΗΣ ΕΝΑΛΛΑΓΗΣ
Δρ. Συμεών Τουρνής
Ενδοκρινολόγος,ΕΕΠΜΣ, ΕΚΠΑ, Νοσοκομείο ΚΑΤ
Μετά την ολοκλήρωση της σκελετικής ανάπτυξης και την απόκτηση της κορυφαίας οστικής μάζας,
ο οστίτης ιστός παραμένει μεταβολικά ενεργός με τη διαδικασία της οστικής ανακατασκευής.
Υπολογίζεται οτι εντός ενός έτους το 28% του σπογγώδους και το 4% του φλοιώδους οστού
αντικαθίσταται από νέο, ενώ εντός 10 ετών το σύνολο του σκελετού έχει αντικατασταθεί. Η οστική
ανακατασκευή είναι απαραίτητη τόσο για την επιδιόρθωση των μικροκακώσεων και με τον τρόπο
αυτό τη διατήρηση της ακεραιότητας του σκελετού όσο και για την ομοιοστασία του ασβεστίου.
Την τελευταία 20ετία η ανακάλυψη και η εισαγωγή στην κλινική πράξη των βιοχημικών δεικτών
οστικής εναλλαγής (ΒΔΟΕ), οι οποίοι είναι περισσότερο ειδικοί για τον οστίτη ιστό κατέστησε
δυνατή τη μη επεμβατική μελέτη των μεταβολικών νοσημάτων των οστών. Οι ΒΔΟΕ αφορούν σε
ένζυμα και μη ενζυμικά πεπτίδια τα οποία παράγονται από τους οστεοβλάστες και τους
οστεοκλάστες ή αποτελούν ουσίες που παράγονται κατά το σχηματισμό και την αποδόμηση του
κολλαγόνου τύπου Ι. Για πρακτικούς λόγους, οι ΒΔΟΕ διακρίνονται σε δείκτες οστικής παραγωγής
και δείκτες οστικής απορρόφησης. Παρόλα αυτά σε άλλοτε άλλο βαθμό, οι βιοχημικοί δείκτες
μπορεί να αντικατοπτρίζουν μεταβολές τόσο στην παραγωγή όσο και στην απορρόφηση, ενώ
ορισμένοι από αυτούς, ιδιαίτερα οι παλαιότεροι, ανευρίσκονται και σε άλλους ιστούς με
αποτέλεσμα η τιμή τους να μεταβάλλεται και από εξωσκελετικές παθολογικές καταστάσεις. Θα
πρέπει να σημειωθεί ότι οι ΒΔΟΕ δεν ειδικοί για μια συγκεκριμένη πάθηση και συγκεκριμένη
περιοχή του σκελετού, αλλά αντικατοπτρίζουν μεταβολές στον οστικό μεταβολισμό συνολικά,
ανεξάρτητα από την υποκείμενη αιτία. Η τιμή τους εξαρτάται από τη συχνότητα ενεργοποίησης
των κύκλων οστικής ανακατασκευής και από το συνολικό ποσό του οστού που απορροφάται και
παράγεται σε κάθε κύκλο οστικής αναδόμησης. Σήμερα προτείνεται ο προσδιορισμός στον ορό
του PINP ως δείκτη οστικής παραγωγής και του CTX ως δείκτη οστικής απορρόφησης. Σε κλινικό
επίπεδο, παρότι παραμένει το πρόβλημα της προτυποποίησης των βιοχημικών δεικτών, ο
προσδιορισμός τους μπορεί να είναι χρήσιμος στην πρόγνωση της απώλειας οστικής πυκνότητας
και καταγμάτων, στην παρακολούθηση ασθενών υπό αγωγή με αντικαταβολικούς και αναβολικούς
παράγοντες για τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας και της συμμόρφωσης, ενώ η μελέτη των
μεταβολών τους μπορεί να βοηθήσουν στην κατανόηση του μηχανισμού δράσης νέων θεραπειών
ή συνδυασμού αυτών.
40
Η ΠΡΩΤΕÏΝΗ S100Β
Χριστίνα Ψαχούλια
Διδάκτωρ Χημικός, Βιοχημικό Τμήμα, ΓΝΑ «Ο Ευαγγελισμός»
Εισαγωγή
Η πρωτεΐνη S100B ανήκει στην οικογένεια των πρωτεϊνών S100, η οποία περιλαμβάνει πρωτεΐνες
χαμηλού μοριακού βάρους (μεταξύ 9 και 12 ΚDa), που δεσμεύουν ιόντα ασβεστίου και οφείλουν
την ονομασία τους, στην ικανότητά τους να είναι 100% διαλυτές στο κορεσμένο θειϊκό αμμώνιο,
σε ουδέτερο pH (pH=7). Μέχρι τώρα έχουν εντοπιστεί περισσότερες από δεκαεννέα S100
πρωτεΐνες, που τοποθετήθηκαν στην οικογένεια αυτή, λόγω ομολογίας στην αλληλουχία των
αμινοξέων (από 25-65%) και λόγω ομοιότητας βασικών δομικών χαρακτηριστικών. Υπάρχει μεγάλο
ερευνητικό ενδιαφέρον για τις S100 πρωτεΐνες και τη σχέση τους με διάφορες κακοήθεις νόσους,
καθόσον αποδεικνύεται ότι αυτές οι πρωτεΐνες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην
καρκινογένεση και στη μεταστατική ικανότητα του όγκου, αλληλεπιδρώντας με πολλές
διαφορετικές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων μεταλλοπρωτεϊνών, κυτταροσκελετικών
πρωτεϊνών, P53, Jab 1, Cox-2, BRCA 1. Οι S100 πρωτεΐνες ευρίσκονται με τη μορφή ομο- ή έτερο
διμερών και με μοριακό βάρος 21KDa, και απαρτίζονται από δύο ανοσολογικά ξεχωρστές
υπομονάδες, τις α και β αλυσίδες.
Ως S100B αναφέρονται: το ομοδιμερές S100ββ και το ετεροδιμερές S100αβ. Είναι ειδική
κυτταροπλασματική πρωτεΐνη δέσμευσης Ca2+ και εκφράζεται κατά προτεραιότητα στα
αστροκύτταρα, ολιγοδενδροκύτταρα, κύτταρα Schwann, και στα επενδυματικά κύτταρα του
νευρικού ιστού. Έχει ανιχνευτεί και μέσα στους ίδιους τους νευρώνες καθώς και σε μεγάλη
ποικιλία κυττάρων εκτός νευρικού συστήματος, όπως μελανοκύτταρα, κύτταρα Langerhans του
δέρματος, χονδροκύτταρα, δενδριτικά κύτταρα στα όργανα του λεμφικού συστήματος και σε
λιποκύτταρα. Κωδικοποιείται από γονίδια του χρωμοσώματος 21 και είχε προταθεί να
συμπεριληφθεί στον προγεννητικό έλεγχο, αλλά μέχρι στιγμής δεν έχει επικρατήσει. Τα επίπεδα
της σε ενήλικα άτομα είναι ανεξάρτητα του φύλου και της ηλικίας. Ο χρόνος ημίσειας ζωής της
πρωτεΐνης κυμαίνεται από 30 λεπτά έως και 2 ώρες, με τα βιβλιογραφικά δεδομένα να ποικίλουν
και να φέρουν επικρατέστερο το χρόνο των 30 λεπτών. Μεταβολίζεται και απεκκρίνεται από τους
νεφρούς και έχει μετρηθεί σε πολλά βιολογικά υγρά, όπως στον ορό του αίματος, στο ΕΝΥ, στο
αμνιακό υγρό, στα ούρα και στο μητρικό γάλα.
41
Στον πίνακα (1) φαίνονται οι ασθένειες στις οποίες παρατηρείται αύξηση των επιπέδων της
πρωτεΐνης S100B. Περισσότερο έχουν μελετηθεί οι μεταβολές των επιπέδων της, στις παθήσεις
του ΚΝΣ και στο μελάνωμα.
ΑΙΜΑ
ΕΝΥ
•
Σχιζοφρένια
•
Σχιζοφρένια
•
Κατάθλιψη και διπολική διαταραχή
•
Κατάθλιψη και διπολική διαταραχή
•
Σκλήρυνση κατά πλάκας
•
Όγκοι εγκεφάλου
•
Έντονη σωματική άσκηση (αθλητές)
•
Σκλήρυνση κατά πλάκας
•
Αγχώδεις καταστάσεις
•
Creutzfeldt-jakob
•
Καρδιοχειρουργικά περιστατικά
•
Νόσος Alzheimer
•
Ανάνηψη μετά από καρδιακή ανακοπή
•
Υποξεία
•
Αιμορραγικό shock
•
Μελάνωμα
•
Περιγεννητική ασφυξία
•
Κύηση (ειδικές καταστάσεις)
•
Κρανιοεγκεφαλικές κακώσεις
ΟΥΡΑ
•
•
•
ΑΜΝΙΑΚΟ ΥΓΡΟ
Περιγεννητική ασφυξία στα
•
Ενδομήτριος θάνατος
τελειόμηνα
•
Συγγενείς ανωμαλίες ΚΝΣ
Πρόωρα νεογνά με εγκεφαλική
•
Τρισωμία 21
αιμορραγία
•
Δίδυμη κύηση
Αγχώδεις καταστάσεις
ΜΗΤΡΙΚΟ ΓΑΛΑ
•
Ωρίμαση του μητρικού γάλακτος
Πίνακας 1: Ασθένειες στις οποίες παρατηρείται αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης S100B
42
Η πρωτεΐνη S100B στο μελάνωμα
Το μελάνωμα είναι μία κακοήθης νόσος δυσμενούς πρόγνωσης, με μικρό αλλά διαρκώς
αυξανόμενο ποσοστό επιπολασμού στον ευρωπαϊκό πληθυσμό. Η ανοσοϊστοχημική έκφραση της
S100, στα κακοήθη νεοπλασματικά κύτταρα μελανώματος με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι
των πρωτεϊνών S100, προτάθηκε το 1982 και εφαρμόζεται ευρέως από εικοσιπενταετίας, για τη
διάγνωση του κακοήθους μελανώματος. Από την πρώτη δημοσίευση της αξιολόγησης της κλινικής
σημασίας του προσδιορισμού των επιπέδων της S100B στον ορό του αίματος ασθενών με
μελάνωμα, που πραγματοποιήθηκε το 1995 και από τις μελέτες που ακολούθησαν, αποδείχθηκε η
χρησιμότητα αυτού του προσδιορισμού και σήμερα έχει καθιερωθεί με βάση τα ευρωπαϊκά
πρωτόκολλα, ως βιοδείκτης παρακολούθησης ασθενών με μελάνωμα και εφαρμόζεται πλέον
ευρύτατα.
Η S100B είναι ο μόνος ανεξάρτητος προγνωστικός βιοδείκτης για ασθενείς με δερματικό
μελάνωμα σταδίων I-III, και έχει αποδειχτεί ότι ασθενείς που παρακολουθούνται και με αυτό το
δείκτη, έχουν μεγαλύτερο χρόνο επιβίωσης έναντι αυτών που παρακολουθούνται μόνον με
απεικονιστικές μεθόδους.
Οι τιμές της S100B στον ορό, συσχετίζονται άμεσα με το στάδιο της νόσου και ειδικά σε
μεταστατικό μελάνωμα, αυξημένες τιμές S100B συνδέονται με λιγότερο χρόνο ελεύθερο νόσου και
λιγότερο συνολικό χρόνο επιβίωσης, καθώς έχει διαπιστωθεί ότι η πρωτεΐνη S100B επάγει την
εξέλιξη της νόσου, αφού αλληλεπιδρά με το p53 και ρυθμίζει αρνητικά την κατασταλτική
λειτουργία του επί του όγκου.
Σταθερά αυξανόμενες τιμές της S100B κατά την τακτική χρονική παρακολούθηση ασθενών
υποδεικνύουν επιδείνωση της ασθένειας και η αύξηση προηγείται πέντε έως είκοσι τρεις
εβδομάδες της ύπαρξης άλλων στοιχείων μεταστατικής εξάπλωσης. Στο 72% ασυμπτωματικών
ασθενών με αυξανόμενες τιμές S100B, εντοπίστηκε υποτροπή της ασθένειας με PET-CT.
Η μείωση των τιμών μετά από οποιαδήποτε θεραπευτική αγωγή αποτελεί μέτρο της επιτυχίας της
και μη ανιχνεύσιμα επίπεδα με τις προαναφερόμενες μεθόδους, υποδεικνύουν ύφεση.
Ο εκτιμώμενος συνολικός χρόνος επιβίωσης ασθενών με τιμές S100B<0,15μg/L είναι σημαντικά
μεγαλύτερος από το χρόνο επιβίωσης ασθενών με τιμές S100B>0,15μg/L, ανεξάρτητα από το
στάδιο της νόσου και όταν οι τιμές S100B είναι >0,6μg/L πενταπλασιάζεται ο κίνδυνος θανάτου.
43
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
1.
.Donato R1, Cannon BR, Sorci G, et al. Functions of S100 proteins Curr Mol Med. 2013 Jan;13(1):24-
57
2.
Harpio R1, Einarsson R. S100 proteins as cancer biomarkers with focus on S100B in malignant
melanoma. Clin Biochem. 2004 Jul;37(7):512-8.Review
3.
Salama I1, Malone PS, Mihaimeed F, Jones JL. A review of the S100 proteins in cancer. Eur J Surg
Oncol. 2008 Apr;34(4):357-64. Epub 2007 Jun 13
4.
Korfias S, Stranjalis G, Papadimitriou A, Psachoulia C, Daskalakis G, Antsaklis A, Sakas DE. Serum S-
100B protein as a biochemical marker of brain injury: a review of current conceptsCurr Med Chem.
2006;13(30):3719-31. Review
5.
Stamataki E1, Stathopoulos A, Garini E, Kokkoris S, Glynos C, Psachoulia C, Pantziou H, Nanas S,
Routsi C. Serum S100B protein is increased and correlates with interleukin 6, hypoperfusion indices, and
outcome in patients admitted for surgical control of hemorrhage. Shock. 2013 Oct;40(4):274-80.
6.
Smit LH, Korse CM, Bonfrer JM. Comparison of four different assays for determination of serum S-
100B.Int J Biol Markers. 2005 Jan-Mar;20(1):34-42
7.
Alber B1, Hein R, Garbe C, Caroli U, Luppa PB Multicenter evaluation of the analytical and clinical
performance of the Elecsys S100 immunoassay in patients with malignant melanoma. Clin Chem Lab Med.
2005;43(5):557-63.
8.
Astrand R, Undén J, Romner B. Clinical use of the calcium-binding S100B protein.Methods Mol Biol.
2013;963:373-84. doi: 10.1007/978-1-62703-230-8_23. Review.
9.
Brandner S, Thaler C, Buchfelder M, Kleindienst A. Brain-derived protein concentrations in the
cerebrospinal fluid: contribution of trauma resulting from ventricular drain insertion. J.Neurotrauma. 2013
Jul 1;30(13):1205-10.
10.
Simone Mocellin†,*, Giorgio Zavagno andDonato Nitti. The prognostic value of serum S100B in
patients with cutaneous melanoma: A meta-analysis International Journal of Cancer. 15 November 2008
Volume 123, Issue 10, pages 2370–2376.
11.
Gogas H, Eggermont AM, Hauschild A, Hersey P, Mohr P, Schadendorf D, Spatz A, Dummer
R.Biomarkers in melanoma.Ann Oncol. 2009 Aug;20 Suppl 6:vi8-13
12.
Peric B, Zagar I, Novakovic S, Zgajnar J, Hocevar M.Role of serum S100B and PET-CT in follow-up of
patients with cutaneous melanoma.BMC Cancer. 2011 Aug 2;11:328
44
Η ΠΡΩΤΕΪΝΗ S-100B ΣΤΗΝ ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΗ ΒΛΑΒΗ
Στέφανος Ι. Κορφιάς
Νευροχειρουργός, Λέκτορας Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Αθηνών, Θεραπευτήριο «Ο
Ευαγγελισμός»
ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Νευρολογικά γεγονότα όπως τραύμα, αιμορραγία, ισχαιμία κ.ά. προκαλούν πρωτοπαθή βλάβη
στα νευρικά και γλοιακά κύτταρα. Αυτή σε συνδυασμό με δευτερογενή επεισόδια απότοκα
υποξίας, υπότασης, επιληπτικών κρίσεων, σήψης ή πυρετού μπορεί να προκαλέσουν δυσμενή
αποτελέσματα στην εγκεφαλική λειτουργία και την τελική νευρολογική έκβαση του ασθενούς.
Η διάγνωση και η αξιολόγηση της εγκεφαλικής βλάβης πραγματοποιείται με κλινικές μεθόδους
(νευρολογική εξέταση, κλίμακα κώματος Γλασκώβης για το επίπεδο συνείδησης, αντίδραση των
κορών των οφθαλμών, κλίμακα έκβασης Γλασκώβης) καθώς και με νευρο-απεικονιστικούς
μεθόδους (αξονική – μαγνητική τομογραφία, διακρανιακό Doppler, PET). Επιπλέον η
ηλεκτρονευροφυσιολογία (προκλητά δυναμικά εγκεφαλικού στελέχους, σωματοαισθητικά /
σωματοκινητικά
δυναμικά,
ηλεκτροεγκεφαλογράφημα),
η
αιμοδυναμική
παραμέτρηση
(καταγραφή της αρτηριακής πίεσης και του σφαγιτιδικού κορεσμού) και η επεμβατική
νευροπαραμέτρηση (ενδοκράνια πίεση, πίεση εγκεφαλικής άρδευσης, εγκεφαλικό ιστικό οξυγόνο,
μικροδιάλυση) αποτελούν επιπλέον εργαλεία για παραμέτρηση της εγκεφαλικής λειτουργίας και
την πρόγνωση της κλινικής πορείας του ασθενούς.
Παρόλα αυτά οι ανωτέρω μέθοδοι συχνά αποδεικνύονται μη επαρκείς στην αξιολόγηση και στην
ποσοτικοποίηση της βαρύτητας της αρχικής καθώς και της εξελισσόμενης δευτερογενούς
εγκεφαλικής βλάβης και κατά συνέπεια δεν είναι δυνατόν να ληφθούν εγκαίρως αποτελεσματικά
θεραπευτικά μέτρα και να γίνει πρόγνωση της τελικής έκβασης. Το πρόβλημα γίνεται ακόμη πιο
εμφανές σε κωματώδεις ασθενείς υπό την επήρεια βαρβιτουρικών, με τραύματα στο προσωπικό
κρανίο, προϋπάρχουσες βλάβες της κόρης των οφθαλμών, σοβαρές εξωκράνιες βλάβες και
ανεπαρκείς κλινικές και εργαστηριακές πληροφορίες. Γίνεται εμφανές ότι η έγκαιρη διάγνωση της
επικείμενης νευρολογικής επιδείνωσης αποτελεί κύρια πρόκληση στην καθημερινή κλινική πράξη.
Σε αντιστοιχία με άλλους βιοχημικούς δείκτες που παρέχουν πληροφορίες για την διάγνωση, τη
βαρύτητα, την πορεία και το αποτέλεσμα της θεραπείας άλλων ασθενειών (troponin, PSA,
creatinine, CAE, a-Fet κ.ά.), ερευνητές τα τελευταία 15 χρόνια ασχολήθηκαν με ειδικούς δείκτες
45
εγκεφαλικής βλάβης με σκοπό να διευκολύνουν τη διάγνωση και την παραμέτρηση της
νευρολογικής βλάβης. Βιοχημικοί δείκτες όπως η NSE, η LDH 1-3, η CK-BB είχαν προταθεί, αλλά
λόγω μειωμένης ειδικότητας και ευαισθησίας η αξιοπιστία του αμφισβητήθηκε. Άλλοι δείκτες
όπως η MBP (myelin basic protein) και η GFAP (glial fibrillary acidic protein) έχουν μετρηθεί στo
αίμα και έχουν προταθεί ως συμπληρωματικοί δείκτες εγκεφαλικής βλάβης.
ΠΡΩΤΕΪΝΗ S-100Β: ΒΙΟΧΗΜΙΑ & ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ
Ένα πλήθος μελετών έδειξε ότι η πρωτεΐνη S-100B αποτελεί τον πιο ιδανικό βιοχημικό δείκτη
εγκεφαλικής βλάβης διότι έχει υψηλή ειδικότητα για τον εγκεφαλικό ιστό, υψηλή ευαισθησία για
την εγκεφαλική βλάβη, δεν παρουσιάζει μεταβλητότητα με την ηλικία και το φύλο, εμφανίζεται
γρήγορα στον ορό του αίματος μετά από την εγκατάσταση της νευρολογικής βλάβης και
παραμένει σταθερή για αρκετό διάστημα χωρίς ανάγκη για άμεση μέτρηση.
Η πρωτεΐνη S-100Β ανήκει στην οικογένεια των πρωτεϊνών με ικανότητα δέσμευσης ασβεστίου και
έλαβε το όνομά της από τη διαλυτότητά της σε 100% κορεσμένο διάλυμα θειικού αμμωνίου
(Moore 1965). Η S-100 αποτελεί ένα ομο- ή ετερο-διμερές από δύο πρωτεΐνες την S-100 Α και S100 Β. Οι τύποι της πρωτεΐνη S-100, S-100 ΑΒ και S-100 ΒΒ περιγράφονται ως S-100Β και
παρουσιάζουν ψηλή ειδικότητα για το νευρικό ιστό. Ειδικότερα αφθονούν στο κυτταρόπλασμα
των γλοιακών κυττάρων του κεντρικού και του περιφερικού νευρικού συστήματος (αστροκύτταρα
και κύτταρα Schwann). Σε πολύ μικρότερες συγκεντρώσεις εκφράζεται σε μελανοκύτταρα και σε
κύτταρα λιπώδους ιστού και χόνδρου.
Για τον υπολογισμό της στο αίμα οι περισσότεροι ερευνητές χρησιμοποιούν την μέθοδο ανοσοφωταύγειας Lia-mat Sangtec 100, (AB Sangtec Medical, Bromma, Sweden), η οποία εντοπίζει τη Β
υπομονάδα της πρωτεΐνης S-100 με χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων. Το διαγνωστικό όριο της
μεθόδου βρίσκεται στα 0,02 μg/L, ενώ τιμές πάνω από 0,5 μg/L θεωρούνται παθολογικές, και
μεταξύ 0,15 και 0,5 οριακές.
Η πρωτεΐνη S-100Β συμμετέχει σε πλήθος ενδοκυττάριες λειτουργίες, διαμορφώνοντας επιπλέον
την κυτταρική μορφολογία, τη νευρολογική ηλεκτρική δραστηριότητα και την ανοσοαντίδραση
μέσω της ρύθμισης της λειτουργίας των μικρογλοιακών κυττάρων. Επιπλέον η S-100Β συμμετέχει
σε εξωκυττάριες λειτουργίες, αν και ο μηχανισμός έκκρισης από τα γλοιακά κύτταρα προς τον
εξωκυττάριο χώρο δεν είναι σαφής. Έχει μάλιστα διατυπωθεί ότι ο η συγκέντρωση της S-100Β στο
αίμα εκφράζει το βαθμό ακεραιότητας του αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Σε νανομοριακές
46
συγκεντρώσεις η S-100Β φαίνεται να έχει νευροπροστατευτική / νευροτροφική δράση. Αντίθετα σε
μικρομοριακές συγκεντρώσεις παρουσιάζει βλαπτική δράση επάγοντας νευρολογική κυτταρική
απόπτωση. Έτσι ασθενείς με σύνδρομο Down, Alzheimer και σχιζοφρένεια παρουσιάζουν
υπερέκφραση της πρωτεΐνης S-100Β σε εγκέφαλο και ορό.
ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΕΣ ΒΛΑΒΕΣ & S-100Β
Α. Βαρειά κάκωση κεφαλής
Μετά από βαρειά κρανιοεγκεφαλική κάκωση S-100Β απελευθερώνεται α) άμεσα ως αποτέλεσμα
της βλάβης του αιματο-εγκεφαλικού φραγμού και β) το διάστημα που ακολουθεί συνεπεία
πιθανής 2ογενούς εγκεφαλικής βλάβης. Οι αρχικές συγκεντρώσεις της S-100Β έχουν βρεθεί να
σχετίζονται άμεσα με το επίπεδο συνείδησης του ασθενούς, την αντίδραση των κορών του
οφθαλμού κατά την εισαγωγή, τη βαρύτητα των νευροακτινολογικών ευρημάτων (σε αξονική
τομογραφία) και την τελική έκβαση των ασθενών. Ειδικότερες τιμές > 2μg/L αποτελούν ισχυρό
προγνωστικό δείκτη δυσμενούς έκβασης (θάνατος). Επίσης για κάθε 1μg/L αύξηση της S-100Β
κατά την εισαγωγή, η πιθανότητα εγκεφαλικού θανάτου αυξάνεται περισσότερο από 2 φορές.
Επιπλέον αυξημένες αρχικές τιμές S-100Β συσχετίστηκαν με διαταραχές της θυρεοειδικής
λειτουργίας, ένα έτος μετά την κάκωση κεφαλής.
Πρέπει εδώ να διευκρινισθεί ότι η ύπαρξη μικρότερων συγκεντρώσεων της S-100Β κυρίως σε
λιπώδη και χόνδρινο ιστό, σε ασθενείς με αμιγές εξωκράνιο τραύμα (ιδιαίτερα σε αυτούς με
κοιλιακό ή θωρακικό τραύμα), προκαλεί μικρότερη αλλά υπολογίσιμη αρχική αύξηση των τιμών
της στο αίμα, οποίες όμως ελαττώνονται γρήγορα και γίνονται φυσιολογικές 2-3 μέρες μετά την
κάκωση. Σε ασθενείς με βαρειά κάκωση κεφαλής και συστηματικό τραύμα, η συμμετοχή της
εξωκράνιας S-100Β στη συνολική αύξηση των τιμών της, είναι αμελητέα.
Β. Ελαφριά κάκωση κεφαλής
Μετά από ελαφριά κάκωση κεφαλής παρατηρήθηκε μικρή αύξηση της S-100Β που ακολουθείται
από γρήγορη πτώσης της. Ιδιαίτερα οι ασθενείς με τιμές > 0,5μg/L παρουσιάζουν αυξημένη
πιθανότητα για νευροακτινολογικά ευρήματα, για επίμονο μεταδιασεισικό σύνδρομο και
διαταραχή της νευροψυχολογικής λειτουργίας μετατραυματικά. Στην κατηγορία των ασθενών με
πολύ ελαφριά κάκωση κεφαλής (επίπεδο συνείδησης 15) χωρίς εξωκράνιο τραύμα, τιμές S-100Β >
0,15μg/L συσχετίσθηκαν με αδυναμία επιστροφής στην εργασία ή τις συνήθεις δραστηριότητες
μία εβδομάδα μετά την κάκωση. Ενδεικτικές μελέτες σε ποδοσφαιριστές έδειξαν μικρή αύξηση της
47
S-100Β (0,18 μg/L) σχετιζόμενη με τον αριθμό των κεφαλιών αλλά με ταχεία επάνοδο στις
φυσιολογικές τιμές.
Γ. Αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο – εγκεφαλική υποξία
Σε ασθενείς με ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο οι τιμές S-100Β σχετίζονται με τον όγκο του
ισχαιμικού εγκεφάλου, τη βαρύτητα της νευρολογικής εικόνας και της τελικής έκβασης, με
μεγαλύτερες τιμές σε ασθενείς με έμφρακτο μέσης εγκεφαλικής αρτηρίας ή έσω καρωτίδας. Σε
ασθενείς που υφίστανται καρωτιδικό stenting ή ενδαρτηρεκτομή, η αύξηση της S-100Β
συσχετίζεται με εμφάνιση μόνιμων νευρολογικών ελλειμμάτων. Επίσης η S-100Β βρέθηκε να
συσχετίζεται με εγκεφαλική βλάβη και μετεγχειρητικά νευρολογικά και νευροψυχολογικά
ελλείμματα, μετά από επέμβαση καρδιάς με καρδιοαναπνευστική παράκαμψη.
Αυξημένες τιμές S-100Β 24 ώρες μετά από εγκεφαλική υποξία, απότοκη καρδιακής ανακοπής,
πνιγμού ή οξείας απόφραξης του αεραγωγού, αποτελούν προγνωστικό παράγοντα μη απόκτησης
της συνείδησης.
Αντιστοίχως η S-100Β αποτελεί προγνωστικό παράγοντα έκβασης της εγκεφαλικής βλάβης σε
νεογέννητα με ισχαιμική εγκεφαλοπάθεια. Αυξημένες τιμές S-100Β αποτελούν εργαλείο
ανίχνευσης ενδοκοιλιακής αιμορραγίας σε πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά και επίσης
παρουσιάζονται στο μητρικό αίμα και στο αίμα του ομφάλιου λώρου κατά τον τοκετό σε
περιπτώσεις εμβρύων με υπολειπόμενη ενδομήτρια ανάπτυξη (IUGR – intrauterine growthretarded foetuses).
Δ. Εγκεφαλική υπαραχνοειδής αιμορραγία
Στην περίπτωση των ασθενών με αυτόματη υπαραχνοειδή αιμορραγία οι παράγοντες που
διαμορφώνουν την έκβαση των ασθενών πέρα από την αρχική αιμορραγία είναι περισσότεροι και
με μεγαλύτεροι βαρύτητα: αγγειόσπασμος, υποξία, οίδημα, επαναιμορραγία, υδροκέφαλος,
εμβολιστικοί / χειρουργικοί χειρισμοί. Ιδιαίτερα σε κωματώδεις κατεσταλμένους και
διασωληνωμένους ασθενείς με ανεπαρκείς κλινικές πληροφορίες, η χρήση βιοχημικών δεικτών
έχει επιπρόσθετη σημασία.
Μελέτες έδειξαν συσχέτιση μεταξύ της S-100Β ορού και κλινικής / απεικονιστικής βαρύτητας του
ασθενούς και της τελικής έκβασής του. Αρχικές τιμές >0,3μg/L διπλασιάζουν τον τελικό κίνδυνο για
δυσοίωνη έκβαση (θάνατο).
48
Ε. Όγκοι εγκεφάλου
Τα μηνιγγιώματα εγκεφάλου είναι κατά βάση καλοήθεις όγκοι, ωστόσο η μετεγχειρητική τους
πορεία επιβαρύνεται συχνά από παράγοντες όπως η επιδείνωση του περιεστιακού αγγειογενούς
οιδήματος, και η πρόκληση μετεγχειρητικού ενδοκράνιου αιματώματος. Η άμεσα μετεγχειρητική
τιμή καθώς και οι επόμενες καθημερινές μετρήσεις της S-100Β ορού βρέθηκε να συσχετίζονται με
όγκους μεγαλύτερου μεγέθους (>4 εκ), σε δύσκολη χειρουργικά θέση, που κατά την εξαίρεσή τους
υπήρχαν «χειρουργικές δυσκολίες», με αυξημένη πιθανότητα για μετεγχειρητική επιδείνωση
συνεπεία αιματώματος ή εγκεφαλικού οιδήματος καθώς και με δυσμενή έκβαση εξαμήνου.
Ασθενείς με μετεγχειρητικές τιμές >0.4 μg/L παρουσίασαν 9 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο για
μετεγχειρητική νευρολογική επιδείνωση και 11 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο για δυσμενή έκβαση.
Σε μία άλλη μελέτη σε γλοιώματα εγκεφάλου, οι ασθενείς με αυξημένες τιμές της S-100Β ορού
βρέθηκαν να έχουν μικρότερη επιβίωση.
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ
Από όλα τα ανωτέρω γίνεται σαφές ότι η πρωτεΐνη S-100Β είναι ένας χρήσιμος βιοχημικός δείκτης
αξιολόγησης της βαρύτητας της εγκεφαλικής βλάβης και της πρόγνωσης της έκβασης των
νευρολογικών ασθενών. Ωστόσο περαιτέρω μελέτες απαιτούνται προκειμένου να καταστεί σαφής
ο ακριβής βιοχημικός και νευροφυσιολογικός της ρόλος.
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
1. Dimopoulou I, Korfias S, Dafni U, Anthi A, Psachoulia C, Jullien G, Sakas DE, Roussos C.
Protein S-100b serum levels in trauma-induced brain death.
Neurology, 2003 Mar 25; 60(6): 947-51.
2. Dimopoulou I, Tsagarakis S, Korfias S, Zervakis D, Douka E, Thalassinos N, Sakas DE, Roussos C.
Relationship of thyroid function to post-traumatic S-100b serum levels in survivors of severe head
injury: preliminary results.
Intensive Care Medicine, 2004 Feb; 30(2):298-301.
3. Stranjalis G, Korfias S, Papapetrou C, Kouyialis AT, Boviatsis EJ, Psachoulia C, Sakas DE.
49
Elevated serum S-100B protein as a predictor of failure to short-term return to work or activities
after mild head injury.
Journal of Neurotrauma, 2004 Aug; 21(8): 1070-1075.
4. Stranjalis G, Korfias S, Psachoulia C, Boviatsis E, Kouyialis A, Protopappa D, Sakas DE.
Serum S-100B as an indicator of early postoperative deterioration after meningioma surgery.
Clinical Chemistry, 2005 Jan; 51(1):202-207.
5. Korfias S, Stranjalis G, Psachoulia C, Vasiliadis C, Pitaridis M, Boviatsis E, Sakas DE.
Slight and short-lasting increase of serum S-100B protein in extracranial trauma.
Brain Injury, 2006 Jul; 28(8): 867-872.
6. Korfias S, G. Stranjalis G, Papadimitriou A, Psachoulia C, Daskalakis G, Antsaklis A, Sakas DE.
Serum S-100B protein as a biochemical marker of brain injury: review current concepts.
Current Medicinal Chemistry, 2006 Dec; 13(30): 3719-3731.
7. Korfias S, Stranjalis G, Boviatsis E, Psachoulia C, Jullien G, Gregson B, Mendelow AD, Sakas DE.
Serum S-100B protein: monitoring in patients with severe traumatic brain injury.
Intensive Care Medicine, 2007 Feb; 33(2): 255-260.
8. Stranjalis G, Korfias S, Psachoulia C, Kouyialis A, Sakas DE, Mendelow AD.
The prognostic value of serum S-100B protein in spontaneous subarachnoid haemorrhage.
Acta Neurochirurgica, 2007 Mar; 149(3): 231-238.
9. Korfias S, Papadimitriou A, Stranjalis G, Bakoula C, Daskalakis G, Antsaklis A, Sakas DE.
Serum biochemical markers of brain injury.
Mini Rev Med Chem, 2009 Feb; 9(2): 227-234.
50
ΠΡΩΤΕΪΝΗ S-100B ΚΑΙ ΚΥΗΣΗ ΥΨΗΛΟΥ ΚΙΝΔΥΝΟΥ
Αγγελική Α. Παπαδημητρίου,
Μαιευτήρ-Γυναικολόγος, Διδάκτωρ Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Αθηνών.
ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Η παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε με σκοπό:
Α. Τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων της πρωτεΐνης S-100B στο αίμα των εγκύων γυναικών
πριν τον τοκετό και τη διερεύνηση της πιθανής συσχετίσεώς τους με το είδος της κύησης
(φυσιολογική ή επιπλεγμένη), καθώς και με τους παράγοντες εκείνους που επιβαρύνουν την υγεία
της μητέρας (δημογραφικά χαρακτηριστικά εγκύου, φαρμακευτική αγωγή, ιατρικό ιστορικό κ.ά.).
Β. Τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων της πρωτεΐνης S-100B στο αίμα των νεογνών αμέσως
μετά τον τοκετό και 24 ώρες μετά από αυτόν και τη διερεύνηση της πιθανής συσχετίσεώς τους με
την προωρότητα καθώς και με τους παράγοντες εκείνους που εκφράζουν και παραμετρούν την
κατάσταση του εμβρύου / νεογνού και προσδιορίζουν την τελική του έκβαση (NST, δημογραφικά
χαρακτηριστικά νεογνού, ανάνηψη, Apgar score, παιδιατρική / νευρολογική εξέταση,
σωματομετρικά χαρακτηριστικά, χολερυθρίνη κ.ά.)
Γ. Τη διερεύνηση και την απεικόνιση της μεταβολής των συγκεντρώσεων της πρωτεΐνης S-100B στο
αίμα των νεογνών μέσα στις πρώτες 24 ώρες μετά τον τοκετό και την αναγνώριση των παραγόντων
εκείνων (σχετιζόμενων με την κύηση ή το νεογνό), που την επηρεάζουν με τρόπο στατιστικά
σημαντικό.
ΥΛΙΚΟ-ΜΕΘΟΔΟΣ
Συνολικά έγινε λήψη αίματος από 67 έγκυες γυναίκες και 72 νεογνά, από τα οποία τα 33 ήταν
άρρενα και 39 θήλεα.
Στις έγκυες τα δείγματα αίματος για μέτρηση πρωτεΐνης S-100B λαμβάνονταν την ημέρα του
τοκετού (πριν από τον τοκετό) και όσο το δυνατόν πλησιέστερα στην ώρα αυτού.
Στα νεογνά τα δείγματα αίματος για μέτρηση πρωτεΐνης S-100B λαμβάνονταν αμέσως μετά τον
τοκετό από την ομφαλική φλέβα και 24 ώρες μετά τον τοκετό από περιφερική φλέβα.
Τα δείγματα αίματος μητέρων και νεογνών υποβάλλονταν σε φυγοκέντρηση και ο ορός ψύχονταν
στους -18 oC και αποθηκεύονταν για ανάλυση. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης S-100B υπολογίζονταν με
51
τη μέθοδο ανοσο-χημειο-φωταύγειας της εταιρίας Sangtec (Liaison Sangtec 100, AB Sangtec
Medical, Bromma, Sweden). Τιμές άνω του 0,5 μg/L θεωρούνται παθολογικές, αυτές μεταξύ 0,15
και 0,5 μg/L, οριακές, ενώ τιμές κάτω του 0,15 μg/L θεωρούνται φυσιολογικές.
Για την αξιολόγηση της S-100B πραγματοποιήθηκε έλεγχος επίδρασης κάθε παράγοντα ξεχωριστά
(μονοπαραγοντική ανάλυση) και κάθε παράγοντα ανά ομάδα νεογνών (πρόωρα, πρόωρα IUGR,
τελειόμηνα, τελειόμηνα IUGR). Οι παράγοντες που επηρεάζουν στατιστικώς σημαντικά την S-100B
συμπεριλήφθηκαν στη πολυπαραγοντική ανάλυση και χρησιμοποιώντας την μέθοδο stepwise και
το κριτήριο Akaike βρέθηκε το βέλτιστο μοντέλο. Όλοι οι έλεγχοι ήταν αμφίπλευροι και το επίπεδο
στατιστικής σημαντικότητας τέθηκε στο 5%. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε μέσω του
στατιστικού λογισμικού προγράμματος SAS V9.2.
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης αναλύονται ως εξής:
Α. Αξιολόγηση της πρωτεΐνης S-100B στο αίμα των εγκύων πριν από τον τοκετό.
1. Έγκυες των οποίων οι κυήσεις κατέληξαν σε πρόωρο τοκετό
έχουν αυξημένα επίπεδα
πρωτεΐνης S-100B.
2. Έγκυες που λάμβαναν αντιυπερτασική ή άλλου είδους αγωγή (αντιεπιληπτικά, αντιπηκτικά,
φάρμακα για θυρεοειδοπάθειες, ινσουλίνη) έχουν αυξημένες τιμές S-100B.
3. Έγκυες με προϋπάρχουσα νόσο όπως σακχαρώδης διαβήτης, επιληψία, θυρεοειδοπάθεια,
νοσήματα του γαστρεντερικού (έλκος 12δακτύλου, γαστρίτιδα, χολοκυστοπάθεια), υψηλή μυωπία,
είχαν αυξημένες τιμές S-100B έναντι εκείνων με ελεύθερο ιστορικό.
4. Έγκυες που υποβλήθηκαν σε επείγουσα καισαρική τομή είχαν αυξημένες τιμές S-100B.
Β1. Αξιολόγηση της πρωτεΐνης S-100B στο αίμα των νεογνών αμέσως μετά τον τοκετό.
1. Τα πρόωρα IUGR νεογνά ξεκινούν με χαμηλότερες τιμές S-100B αίματος όπως τα τελειόμηνα.
2. Πρόωρα IUGR νεογνά με μεγαλύτερο βάρος έχουν και μεγαλύτερη S-100B.
3. Τα πρόωρα νεογνά έχουν αυξημένες τιμές S-100B έναντι των υπολοίπων ομάδων.
52
Β2. Αξιολόγηση της πρωτεΐνης S-100B στο αίμα των νεογνών 24 ώρες μετά τον τοκετό.
1. Τα νεογνά που δισωληνώθηκαν έχουν μειωμένες τιμές S-100B σε σχέση με αυτά που δεν
υποβλήθηκαν σε ανάνηψη ή τους χορηγήθηκε Ο2.
2. Όσο μεγαλύτερη ήταν η ηλικία της μητέρας τόσο μικρότερη ήταν η τιμή της S-100B στα πρόωρα
νεογνά.
3. Οι τιμές της S-100B είναι ελαττωμένες σε IUGR νεογνά με μεγαλύτερη περίμετρο κεφαλής.
4. Οι αυξημένες τιμές χολερυθρίνης συσχετίζονται με
αυξημένες τιμές S-100B στα πρόωρα
νεογνά.
5. Τα πρόωρα IUGR νεογνά έχουν στατιστικά σημαντικά πιο αυξημένες τιμές πρωτεΐνης S-100B
έναντι των υπολοίπων ομάδων.
Γ. Αξιολόγηση της μεταβολής των επιπέδων της πρωτεΐνης S-100B στο αίμα των νεογνών στο
χρόνο.
1. Πρόωρα IUGR νεογνά με αυξημένο βάρος και μήκος έναντι των υπολοίπων, παρουσιάζουν
μεγαλύτερη μεταβολή των τιμών της S-100B στο 24ωρο.
2. Οι τιμές της S-100B στο 24ωρο βαίνουν αυξανόμενες με την υπερηχογραφική ηλικία κύησης.
3. Η μεταβολή στο χρόνο της S-100B διαφέρει στατιστικά σημαντικά μεταξύ των νεογνών και
παρουσιάζει το μεγαλύτερο βαθμό και ρυθμό αύξησης στα IUGR νεογνά.
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ
Με τα ευρήματα αυτής της μελέτης μπορεί να υποστηριχθεί η άποψη ότι, ο προσδιορισμός των
επιπέδων της πρωτεΐνης S-100Β στο αίμα τόσο στις μητέρες όσο και στα νεογνά, μπορεί να
αποτελέσει έναν αξιόπιστο βιοχημικό δείκτη ελέγχου της υγείας της μητέρας και των νεογνών και
ιδιαίτερα των προώρων IUGR τις πρώτες ημέρες μετά τον τοκετό και συμβάλλει στην έγκαιρη
λήψη θεραπευτικών αποφάσεων (π.χ. χορήγηση κατάλληλης αγωγής στη μητέρα, πρόκληση
πρόωρου τοκετού, διενέργεια επείγουσας καισαρικής τομής, εισαγωγή σε ΜΕΝΝ κ.ά.).
53
ΠΑΡΑΚΛΙΝΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ-POCT
Eίναι κλινικές εργαστηριακές εξετάσεις που διενεργούνται «παρά τον ασθενή»
από κλινικό μη εργαστηριακό προσωπικό.
Δήμα Κλεάνθη
Επίκ. Καθηγήτρια Κλινικής Βιοχημείας, Αττικό Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή
Πανεπιστημίου Αθηνών
Εάν τα παρακλίνια μηχανήματα “χρησιμοποιούνται” σωστά βελτιώνουν την έκβαση της θεραπείας
του ασθενούς γιατί δίνουν γρήγορα αποτελέσματα Όταν γίνεται κατάχρηση ή δεν
χρησιμοποιούνται σωστά αποτελούν κίνδυνο για τον ασθενή Τα παρακλίνια μηχανήματα δεν
αποτελούν απομονωμένη διαδικασία. Πρέπει να ενσωματώνονται στην συνολική φροντίδα του
ασθενούς. Δεν αντικαθιστούν το Εργαστήριο, το βοηθούν στη ροή της δουλειάς του και εκείνο
τους βοηθά στην δική τους . Η συνεργασία με τους κλινικούς γιατρούς είναι σημαντική για την
σωστή αξιολόγηση των παρακλινίων εξετάσεων.
Το 1998 οι εξετάσεις των παρακλινίων αποτελούσαν διεθνώς
το 25% των IVD
Το 2015 οι εξετάσεις των παρακλινίων θα αποτελούν διεθνώς το 31% -50% των IVD
Οι δείκτες που συνήθως μετρώνται είναι:
Ενέργεια
Σάκχαρο,Hb,Ht,pO2,ΗβΑ1
Αγωγιμότητα
Κ+, Να+, Μg++,Ca++
Σύσπαση
Γαλακτικό οξύ
Οξεοβασική ισορροπία
pH,pO2,TCO2,HCO3
Oμεόσταση
P, Cl, κρεατινίνη, ουρία,WBC
Καρδιακή ισχαιμία
Μυοσφαιρίνη,CK-MB, Pro-BNP Τροπονίνη Ι/Τ, D-Dimer
Αιμόσταση
PT, PTT, ACT, Ht,αιμοπετάλια
HIV,βHCG, ανάλυση ούρων
54
Τα τμήματα που κυρίως χρησιμοποιούν παρακλίνια μηχανήματα είναι :
Οι Εντατικές μονάδες-------------Σήψη, Αέρια αίματος,Σάκχαρο
Τα ΤΕΠ-------------Καρδιακοί Δείκτες
Τα Χειρουργεία------------Έλεγχος Γλυκαιμίας, Πήξη
Οι Θαλάμους/Κλινικές για διαβητικούς ασθενείς, καρδιολογικούς ασθενείς
Τα πλεονεκτήματα των παρακλινίων μηχανημάτων
Άμεσα αποτελέσματα-βελτιωμένος χρόνος διεκπεραίωσης(ΤΑΤ)
Μικρός όγκος δείγματος-ευκολότερη λήψη
Ελάττωση του προαναλυτικού λάθους
Ελάττωση χρόνου παραμονής στα ΤΕΠ ή/και στο Νοσοκομείο
Πιο άμεση φροντίδα του ασθενούς
Ο ασθενής είναι περισσότερο ικανοποιημένος
Ταχύτερη διαχείριση των βαρέως πασχόντων
Τα μειονεκτήματα των παρακλινίων μηχανημάτων
Μεγαλύτερο κόστος
Εκπαίδευση
Συντήρηση του ποιοτικού ελέγχου και διασφάλιση ποιότητας ώστε τα αποτελέσματα να
είναι αξιόπιστα;
Έλεγχος της διαγνωστικής διαδικασία
Προαναλυτικό λάθος*
55
Άλλα πλεονεκτήματα των παρακλινίων μηχανημάτων
1. Καθόλου σωληνάκια
2. Μετακινούμενα όργανα-εύκολη εγκατάσταση
3. Ασφάλεια
4. Μικρή ποσότητα δείγματος
5. Γρήγορος χρόνος διεκπεραίωσης
6. Καλό συνολικό κόστος
7. Μικρό προαναλυτικό λάθος
8. Εύκολη διαχείριση από τον γιατρό
9.Ενσωμάτωση της εξέτασης στην κλινική διαδικασία
Διαπίστευση
Η CLIA (clinical laboratory improvement amendment regulations) το 1988 ορίζει ότι για όλες τις
εργαστηριακές εξετάσεις ανεξαρτήτως του τόπου διεξαγωγής τους απαιτούνται τα ίδια κριτήρια
διαπίστευσης
Οι οργανισμοί που δίνουν διαπίστευση είναι
CAP , College of American Pathologists , TJC , Joint Comission
Oι οργανισμοί που δημιουργούν τα πρότυπα είναι
CLSI
Clinical and Laboratory Standard Institute
IFCC
International Federation of Clinical Chemistry
Η CLIA ταξινόμησε τις εργαστηριακές εξετάσεις σε 2 κατηγορίες βάσει της πολυπλοκότητας τους
“Waived”
Απλές και Ακριβείς με ελάχιστη πιθανότητα λάθους. Ακολουθούνται οι οδηγίες του Κατασκευαστή
“No waived”
Μικροσκοσκοπικές, Μεσαίας πολυπλοκότητας, Yψηλής πολυπλοκότητας
56
Οι παρακλίνιες εξετάσεις είναι κυρίως “waived” ή μεσαίας πολυπλοκότητας .
Και για τις 2 κατηγορίες απαιτείται διαπίστευση όταν διενεργούνται σε ένα ίδρυμα.
Οι χρήστες των παρακλινίων συσκευών είναι υπεύθυνοι για την διεκπεραίωση των δειγμάτων. Το
εργαστήριο είναι υπεύθυνο για την διασφάλιση αξιόπιστων αποτελεσμάτων και την γνωστική
επάρκεια των χρηστών
Μία Πολυκεντρική Επιτροπή (γιατροί, νοσηλευτές, εργαστηριακοί , άτομα της πληροφορικής,
άτομα από το γραφείο προμηθειών, άτομα από την επιτροπή λοιμώξεων) εγκαθιστά και επιβλέπει
όλα τα προγράμματα των παρακλίνιων εξετάσεων ,δημιουργεί διαδικασίες και κανόνες ,μελετά
τις προτάσεις για νέα παρακλίνια μηχανήματα .
Η Επιτροπή των χρηστών που χειρίζονται τις συσκευές διασφαλίζει την καλή χρήση τους.
Ο Συντονιστής των παρακλινίων (Point of care coordinator )επιβλέπει όλες τις διαδικασίες.
Βασικά χαρακτηριστικά μιας παρακλίνιας συσκευής
Αυτόνομη και ευέλικτη
Απλή στην χρήση
Δείγμα: ολικό αίμα ή ούρα
Εύκολη συντήρηση
Bar-code για αντιδραστήρια και ορούς ελέγχου
Αντιδραστήρια σταθερά σε θερμοκρασία δωματίου
Εκτύπωση αποτελεσμάτων
Διασύνδεση με LIS
‘Εξυπνο Λογισμικό
57
THE WHERE AND WHEN OF POCT
Dr Samuel Murray
BioMarkers Solutions Ltd, England
Our current perception of Point of Care Testing (POCT) is a little obscure principally due to
technological advances, inadequacies in guidance and standards, but also on the availability of an
increasing number of devices and small home based testing kits. For over a decade homepregnancy tests have been drummed home by Hollywood, however, in todays –omics revolution of
personalised medicine POCT creates many challenges and potentially many conundrums.
Technological and ethical movement from more simplified Home Based Tests (HBT) such as
monitoring of blood glucose levels for Diabetes sufferer’s re-Insulin injection (a common practice in
over 13M people, HBT approaching $30B by 2017) to a hand held device that screens for FMF as a
routine requirement before nuptials requires several levels of monitoring. These include
technological assessment (IVD versus CE Mark status), performance in the field (Point of Care) with
current requirements ISO 15189 plus ISO 22870 (POCT) and local authority approval (EOF).
To date there are several smaller low level technology POCT devices available which are in essence
HBTs. Regulatory authorities are however going to face several dilemmas and challenges in the
immediate future with an underlying series of POCT devices that will significantly challenge
regulators with respect to monitoring and ensuring safety in reporting output and quality. After
years of external quality assessment programmes for all levels of standard diagnostics
(microbiological, biochemical, genetic, etc) both the EU and individuals involved in quality
assessment realise the possible level of known ‘dangers’, and are foretelling the ‘unknown’ dangers
of a plethora of devices that have as their target not only the POCT market but also the HBT market.
The highest threshold for escape from the umbrella of regulation is a thin line between POCT and
HBT. Obviously there are merits for several diagnostics flowing into the HBT category, inclusive of
high level diagnostics, however, is the technology robust enough for your genome to be read in
your local pharmacy?
58
ΟΡΙΣΜΕΝΕΣ ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ ΤΩΝ ΚΒΑΝΤΙΚΩΝ ΤΕΛΕΙΩΝ (QUANTUM DOTS) ΣΤΗΝ IN
VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ
Β. Σπυρόπουλος
Καθηγητής Τμήματος Βιοϊατρικής Τεχνολογίας ΤΕΙ Αθήνας
1. Εισαγωγή
Κατά τα τελευταία 30 χρόνια, έχουν αναπτυχθεί πολλά είδη «κβαντικών τελειών» (κουκίδων,
κηλίδων, quantum dots, QDs) σε διάφορους τομείς εφαρμογής, βασισμένες σε νανοκρυστάλλους
από στοιχεία των ομάδων III-V , II - VI , ή IV -VI του περιοδικού πίνακα (π.χ. CdS , CdSe , CdTe κλπ.),
που έχουν δώσει εξαιρετικά αποτελέσματα σε Βιοανιχνευτές και στην in νίνο απεικόνιση. Ο
προσδιορισμός της κβαντικής τελείας ως περίπτωσης ενός ημιαγωγού, αυστηρά μηδενικής
μαθηματικά διάστασης, στην πράξη δεν ισχύει, γιατί η κβαντική τελεία είναι μια δομή με μέγεθος
από μερικά νανόμετρα μέχρι μερικές δεκάδες νανόμετρα. Για τον λόγο αυτό οι όροι κηλίδες ή
κουκκίδες θα ήταν ακριβέτεροι.
Η παρατηρούμενη κυτταροτοξικότητα των υλικών και κυρίως των ιόντων Καδμίου, οδήγησε την
Έρευνα στην κατεύθυνση της ανάπτυξης QDs Πυριτίου, Άνθρακα και Γραφενίων συμβατών για την
εφαρμογή τους στην Ιατρική και στη Βιολογία. Σε αυτή την εργασία θα εξετάσουμε:
•
Τι είναι οι κβαντικές τελείες και τα τα είδη των «παραδοσιακών» QDs.
•
Tην συγγένεια και τη συνέργειά τους με τις Διόδους LASER.
•
Θα παρουσιάσουμε τις αναδυόμενες QDs Πυριτίου, Άνθρακα και κυρίως Γραφενίων.
•
Θα αναφερθούμε σύντομα στα μεταλλικά Νανοσυμπλέγματα (Nanoclusters), ως μια άλλη
εναλλακτική αναδυόμενη λύση Φωτο-φωταύγειας, στην in vitro Διαγνωστική.
•
Θα προσεγγίσουμε την εξέλιξη των Τεχνολογιών αυτών των ιδιαίτερων Νανοδομών και των
εφαρμογών τους, όπως εμφανίζεται κυρίως σε Έγγραφα Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας.
•
Τέλος, θα προσπαθήσουμε να βγάλουμε κάποια συμπεράσματα για τις μελλοντικές προοπτικές
τους στην in vitro Διαγνωστική.
2. Τι είναι οι κβαντικές τελείες;
Μια κβαντική τελεία είναι συνήθως ένας νανοκρύσταλλος ημιαγώγιμου υλικού, που είναι αρκετά
μικρός, ώστε να εμφανίζονται κβαντομηχανικές ιδιότητες και φαινόμενα. Οι φυσικές ιδιότητες των
59
υλικών αυτών είναι ανάμεσα σε αυτές των ευμεγεθών ημιαγωγών και των διακριτών τυπικών
«μορίων». . Έχουν μελετηθεί εφαρμογές των QDs σε κρυσταλλοτριόδους, σε ηλιακά κύτταρα, σε
LED, σε LASER-διόδων, σε οθόνες κλπ. και οι σχετικές εργασίες εμφανίζονται στις Εικόνες 1-2.
Εικόνα 1. Η Eργασία (1981) των Ekimov & Onushchenko [Pis’ma Zh. Eksp. Teor. Fiz. 34, No. 6, 363366].
Εικόνα 2. Ο τίτλος και η Περίληψη της εργασίας των Rosseti, Nakahara & Brus. (1983). [Βλ.
ιστότοπο: http://www.columbia.edu/cu/chemistry/fac-bios/brus/group/pdffiles/semi_nano_website_2007.pdf].
60
Οι κβαντικές τελείες εντοπίσθηκαν σε στερεή φάση από τον Alexei Ekimov και σε κολλοειδή
διαλύματα από τον Louis E. Brus
Οι φυσικές ιδιότητες μιας κβαντικής τελείας, έχουν στενή σχέση με το μέγεθος και το σχήμα της.
Για παράδειγμα, το χάσμα των ενεργειακών ζωνών σε μια κβαντική τελεία, το οποίο καθορίζει την
περιοχή συχνοτήτων του εκπεμπόμενου φωτός, είναι αντιστρόφως ανάλογο προς το μέγεθος της.
H συχνότητα του εκπεμπόμενου φωτός αυξάνει καθώς το μέγεθος των κβαντικών τελειών
μειώνεται, δηλαδή το χρώμα του φωτός που εκπέμπεται μεταβάλλεται από το κόκκινο προς το
κυανούν. Η διέγερση και η εκπομπή των κβαντικών τελειών μπορεί να ελέγχεται με ακρίβεια,
δεδομένου ότι το μέγεθος των QDs προσδιορίζεται επακριβώς στην διάρκεια της διαδικασίας
παραγωγή τους.
Αυτό συμβαίνει, γιατί τα «εξιτόνια» τους περιορίζονται στις τρεις χωρικές διαστάσεις. Το εξιτόνιο
είναι ένα ζεύγος ηλεκτρονίου-οπής (ημισωμάτιο), που προκύπτει κατά τη διέγερση ενός
ηλεκτρονίου από τη ζώνη σθένους και τη μετάβασή του, στη ζώνη αγωγιμότητας. Σε έναν «κόκκο»
ημιαγωγού κρυστάλλου, του οποίου η διάμετρος είναι μικρότερη από το μέγεθος της εξιτονικής
ακτίνας του, δηλαδή της απόστασης ανάμεσα στο ηλεκτρόνιο και στην οπή που δημιούργησε, τα
εξιτόνια συμπιέζονται, οδηγώντας στο φαινόμενο του «Kβαντικού Εντοπισμού». Ο κβαντικός
εντοπισμός συνίσταται στην εμφάνιση διακριτών ενεργειακών σταθμών στη θέση της ζώνης
αγωγιμότητας, που οφείλεται στον σχετικά περιορισμένο αριθμό ατόμων, που απαρτίζουν την
κβαντική τελεία.
Η μετατροπή των συνεχών ζωνών αγωγιμότητας και σθένους, σε διακριτές ενεργειακές στάθμες,
ορίζει τη μετάβαση από τον εκτεταμένο ημιαγωγό στην κβαντική τελεία και ερμηνεύει την
εξάρτηση του μήκους κύματος (δηλαδή του χρώματος) της εκπεμπομένης ακτινοβολίας
αποδιέγερσης των νανοκρυστάλλων ημιαγωγών, από το μέγεθός τους.
Στην Εικόνα 3 εμφανίζεται και εξηγείται σχηματικά, το γιατί η τιμή του Ενεργειακού Χάσματος
είναι αντιστρόφως ανάλογη με το μέγεθος του νανοκρυστάλλου και ταυτόχρονα το γιατί η
συχνότητα του εκπεμπόμενου φωτός αυξάνει, καθώς το μέγεθος των κβαντικών τελειών
μειώνεται.
61
Α
Β
Γ
Εικόνα 3. Α: Τιμές εξιτονικών ακτίνων Bohr για συνήθεις ημιαγωγούς. Β: Εξιτόνιο (Wannier-Mott)
σε ημιαγωγό με την απόσταση ηλεκτρονίου-οπής να είναι μεγαλύτερη από τη σταθερά του
πλέγματος. Γ: Η εμφάνιση του κβαντικού εντοπισμού και η διαμόρφωση του ενεργειακού
χάσματος, σύμφωνα με το μέγεθος του νανοκρυστάλλου της κβαντικής τελείας [Βλ. Α. Φ.
Ολζιέρσκυ, Μελέτη και Ανάπτυξη Συστοιχιών Νανοκρυσταλλιτών Ημιαγωγών σε Μήτρα Μονωτικού
για Εφαρμογές σε Μνήμες, Διδακτορική Διατριβή, ΕΚΠΑ, Αθήνα 2006].
62
3. LASERs Διόδων (LDs) και Κβαντικών Τελειών (QDs)
Μια δίοδος LASER (LD), είναι ένα ηλεκτρικά αντλούμενο LASER ημιαγωγών, στο οποίο το δραστικό
μέσον σχηματίζεται από μία p-n επαφή μιας διόδου ημιαγωγού,
παρόμοια με αυτές που
βρίσκονται σε μια δίοδο εκπομπής φωτός (LED).
Η LD είναι ο πιο κοινός τύπος LASER και έχει ένα ευρύτατο φάσμα χρήσεων (επικοινωνίες μέσω
οπτικών ινών , αναγνώστες barcode , δείκτες LASER , συσκευές CD / DVD / Blu-ray, εκτύπωση με
LASER κλπ.).
Number of Patent Documents related with general
applications of each LASER type included
Ruby; 374
KTP; 253
Nd:YAG; 1522
Alexandrite; 61
Argon; 1861
Krypton; 219
CO2; 3275
Ho:YAG; 42
Excimer; 7201
Copper Vapor;
206
Diode ; 27066
Εικόνα 4. Αριστερά: Αριθμός Διπλωμάτων Ευρεσιτεχνίας (1960-2010) για διάφορους τύπους LASER
με κυρίαρχες τις LDs. [Βλ. B. Spyropoulos, 50 years LASERS: In vitro Diagnostics, Clinical Applications
and Perspectives, Clin. Lab. 2011;57, pp. 131-142]. Δεξιά: Η πρωτοπόρα Εργασία της ομάδας του R.
Hall (1962) “Coherent Light emission from GaAs junctions” [Βλ. Physical Review Letters, Vol. 9, Nr.
9].
Τα QDs – LASERs είναι LASERs ημιαγωγών, που χρησιμοποιούν κβαντικές τελείες ως ενεργό μέσο.
Λόγω του «στενού» περιορισμού των φορέων φορτίου σε κβαντικές τελείες, τα QDs – LASERs
παρουσιάζουν μια ηλεκτρονική δομή, παρόμοια με τα άτομα. Τα QDs – LASERs βρίσκονται πιο
κοντά στις επιδόσεις των LASERs Αερίων και δεν εμφανίζουν μερικές από τις αρνητικές πτυχές των
παραδοσιακών LASERs ημιαγωγών, που βασίζονται π.χ. σε χύδην ημιαγώγιμα υλικά, όπως το
εύρος διαμόρφωσης, το κατώφλιο εκπομπής, η σχέση έντασης-θορύβου κλπ. Η ενεργή περιοχή
μπορεί επίσης να κατασκευάζεται για να λειτουργεί σε διαφορετικά μήκη κύματος, μεταβάλλοντας
το μέγεθος και τη σύνθεση του LASER κβαντικής τελείας, που δεν ήταν διαθέσιμα προηγουμένως.
63
Εικόνα 5. Σχηματική απόδοση της δομής των ενεργειακών ζωνών ενός QD-LASER με
αυτοοργανούμενες QDs με ορθή πόλωση. Απεικονίζονται σχηματικά τρισδιάστατες συστοιχίες
QDs, ευθυγραμμισμένες εγκάρσια,
πολλαπλών
προς την
κατεύθυνση της ανάπτυξης των επάλληλων
στρωμάτων
τους
[Βλ.
http://www.ece.rochester.edu/courses/ECE580/docs/Quantum_Dot_Lasers.pdf ].
Γίνεται αμέσως κατανοητή η στενή συγγένεια των LASERs Διόδων (LDs) και των Κβαντικών Τελειών
(QDs), τόσο αναφορικά με τις βασικές αρχές της Κβαντικής Φυσικής που διέπουν τις λειτουργίες
τους, όσο και με τα πεδία εφαρμογών τους, τα οποία γειτνιάζουν και αλληλοσυμπληρώνονται. Ο
συνδυασμός τους υπόσχεται να παράξει σύντομα μικροσκοπικά όργανα, που θα συνδυάζουν
μικρο- ή νάνο QD-LASERs, τα οποία θα μπορούν να διεγείρουν δυσάριθμες Κβαντικές Τελείες,
κάθε μία από τις οποίες θα μας μεταφέρουν σημαντικές πληροφορίες, για πολλές και μεγάλες
ομάδες κρίσιμων και διαφορετικών μεταξύ τους Βιομορίων.
Όμως ουδέν καλόν αμιγές κακού...
Number of QDs related IP-Docs per Publication Year
QD-LASER related IP-Docs published vs. Priority Year
700
645
500
421 426
400
449
345
300
294
235
200
169
100
0
1990
45 52
19 27 36 25
1995
2000
194
97 90 114
77
2005
QDs related IP-Docs per year
2010
2015
IP-Docs per Year
624
600
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
1990
9
5
4
3
1
1995
5
4
3
3 3
2 2
2
1
4
2
2
1
1 1
2000
2005
2010
2015
Priority Year
QDs LASERS related IP-Docs
Εικόνα 6. Η χρονική εξέλιξη των σχετιζόμενων με QDs (Αριστερά) και QD-LASERs (Δεξιά) εγγράφων
Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας συναρτήσει της χρονολογίας προτεραιότητας (1990-2014).
64
Εικόνα 7. Αριστερά: Η συνθετική διαδικασία παραγωγής μιας από τις νεώτερες QDs, δηλαδή της
CdSeTe επί ZnS-SiO2 [He Y, Lu HT, Sai LM, Su YY, Hu M, Fan CH, Huang W, Wang LH (2008)
Microwave synthesis of water-dispersed CdTe/CdS/ZnS core-shell-shell quantum dots with excellent
photostability and biocompatibility. Adv Mater 20(18):3416–3421]. Δεξιά: Δομή μιας πολυδύναμης
Κβαντικής Τελείας. Εμφανίζεται το «κάλυμμα» ΤΟΡΟ,
ένα εγκιβωτίζον πολυμερές στρώμα,
επίτοποι που στοχεύουν όγκους, (όπως Πεπτίδια, Αντισώματα, ή μικρά μόρια αναστολέων) και
Πολυαιθυλ. Γλυκόλη (PEG) [X. Gao, Y. Cui, R.M. Levisohn, L.W. Chung and S. Nie, In vivo cancer
targeting and imaging with semiconductor quantum dots, Nat Biotechnology 22 (2004), 969–976].
4. QDs Πυριτίου Άνθρακα και Γραφενίων
Το Πυρίτιο
Οι ανησυχίες για την εξαιρετικά πιθανή τοξικότητα των συμβατικών QDs που περιέχουν μέταλλα,
έχουν στρέψει το ερευνητικό ενδιαφέρον, στους κολλοειδείς Νανοκρυστάλλους πυριτίου (Si-NCs )
ή σε Κβαντικές τελείες πυριτίου (Si-QDs) με εφαρμογές φθοριζόντων βιο-επισημασμένων
παραγόντων.
Την τελευταία δεκαετία έχει σημειωθεί σημαντική πρόοδος στην κατανόηση της θεμελιώδους
Φυσικής και των επιφανειακών ιδιοτήτων των νανοσωματιδίων Πυριτίου, που βασίζεται στην
65
δυνατότητα
προετοιμασίας
και
χαρακτηρισμού
κολλοειδών
νανοκρυστάλλων
Πυριτίου,
αδρανοποιημένων πάνω σε κατάλληλες επιφάνειες.
Εικόνα 8. Αριστερά: Φάσμα εκπομπής QDs ημιαγωγών ανάλογα με το μέγεθος των
Νανοκρυστάλλων
[Βλ.
π.χ.
http://informationdisplay.org/IDArchive/2013/JanuaryFebruary/FrontlineTechnologyQuantumDotD
isplays.aspx]. Δεξιά: Φάσμα εκπομπής QDs Πυριτίου (Si-QDs) [Βλ. π.χ. “Xiaoyu Cheng et al. Chem.
Soc. Rev., 2014, 43, 2680” και “A. Gupta, M. T. Swihart and H. Wiggers, Adv. Funct. Mater.,2009, 19,
696–703”].
Τα διαφορετικά πιθανά εμπόδια (φράγματα) Δυναμικού, επηρεάζουν τις ιδιότητες της
Φωτοφωταύγειας (Ρhotoluminescence, PL), συμπεριλαμβανομένων:
• Των μηκών κύματος της κορυφής της Φωτοεκπομπής,
• Της κβαντικής απόδοσης (quantum yield QY),
• Την εμφάνιση των «θυγατρικών κορυφών».
• Την διάρκεια ζωής Φθορισμού (t).
66
Εικόνα 9. Σχηματική αναπαράσταση των βασικών στρατηγικών της τροποποίησης της επιφάνειας
των κολλοειδών Κβαντικών Τελειών Πυριτίου, σχηματίζοντας Ομοιοπολικούς Δεσμούς. Από
αριστερά: Η επιφάνεια των SiQDs, οι στρατηγικές τροποποίησης της επιφάνειάς τους και
παραδείγματα των απομακρυσμένων Μορίων [Xiaoyu Cheng, Chem. Soc. Rev., 2014, 43, 2680-2700].
Η απουσία ενός κελύφους ημιαγωγού, μειώνει το βαθμό του «Kβαντικού Εντοπισμού» των
Εξιτονίων στον πυρήνα και συνεπώς διευρύνει την κορυφή εκπομπής, όπως φαίνεται στην Εικόνα
8. Αντίθετα με τις συμβατικές κβαντικές τελείες πλέγματος ημιαγωγών, με διάκριση πυρήνα κελύφους, οι κβαντικές τελείες Πυριτίου (Si-QDs) παρασκευάζονται συνήθως με «τερματική
επιφάνεια» Υδρογόνου, Αλογόνου ή Οξείδιων (Βλ. Εικόνα 9).
Λόγω της απουσίας στρώματος φραγμού ημιαγωγών (lattice-matched semi-conductor barrier
layer), οι επιφανειακές τους ιδιότητες έχουν ιδιαίτερη σημασία στον καθορισμό της Φωτοφυσικής
των Si-QDs. Στην πράξη, τα Si-QDs που παρασκευάζονται μέσω μέθοδων κολλοειδών διαλυμάτων,
εκπέμπουν κυρίως στην περοχή κυανού–πρασίνου, ενώ οι κβαντικές τελείες που εκπέμπουν στο
κόκκινο, μπορούν να παρασκευαστούν μέχρι σήμερα, μόνο μέσω μεθόδων υψηλής θερμοκρασίας
ή με νανο-χαρακτική (nano-etching).
Σε σύγκριση με τα διαθέσιμα πρωτόκολλα παρασκευής Κβαντικών Τελειών με βάση το Kάδμιο, τα
αντίστοιχα πρωτόκολλα για τη σύνθεση Si-QDs είναι περιορισμένα και περιλαμβάνουν κυρίως:
•
Μεθόδους φάσης διαλύματος.
•
Σύνθεση μικρογαλακτώματος.
•
Θερμικά επαγόμενη δυσαναλογοποίηση του στερεού Ηydrogen Silsesquioxane (HSQ) σε
αναγωγική ατμόσφαιρα.
Ο Άνθρακας και τα Γραφένια
Ο Άνθρακας είναι ένα άφθονο και φθηνό υλικό και η μοναδική δομή του, έχει ένα πλεονέκτημα σε
σχέση με τις καθαρά sp2- (αλλοτροπικές) μορφές του, για την παραγωγή κβαντικών τελειών. Ο
κρυσταλλικός άνθρακας εκτοπίζεται οξειδωτικά ευκολώτερα από τις καθαρές δομές sp2-άνθρακα
που χρησιμοποιείται, οδηγώντας σε μεγέθους νανομέτρων κβαντικές τελείες Γραφενίου, με
άμορφο άνθρακα στις ακμές. Οι κβαντικές τελείες γραφενίου, που απομονώνονται με απόδοση
67
μέχρι και 20% από τον άνθρακα, είναι διαλυτές και φθορίζουσες σε υδατικό διάλυμα,
υποσχόμενες πολλές Βιοϊατρικές εφαρμογές.
Οι τελείες Άνθρακα (Carbon Dots, CDs) είναι μια νέα κατηγορία των Νανοϋλικών του Άνθρακα, με
μεγέθη κάτω των 10 nm, που απομονώθηκαν για πρώτη φορά, κατά τη διάρκεια καθαρισμού του
μονού τοιχώματος νανοσωλήνων Άνθρακα, μέσω παρασκευαστικής Ηλεκτροφόρησης το 2004 [Xu
XY et al. 2004), “Electrophoretic analysis and purification of fluorescent single-walled carbon
nanotube fragments, J Am Chem Soc 126(40):12736–12737” ].
Όταν το μέγεθος και η δομή του γραφενίου ελέγχονται σωστά, επάγεται φωτοφωταύγεια
γραφενίου , με αποτέλεσμα το λεγόμενο Φθορίζον Γραφένιο (FG). Η φωταύγεια του FG εξαρτάται
από το μέγεθος, την «πλεγματική βλάβη» και το μήκος κύματος εκπομπής, δηλαδή από
παρόμοιους παράγοντες με τις «παραδοσιακές» Κβαντικές Τελείες ημιαγωγών. Επιπλέον, με:
•
Την εξαιρετική χημική σταθερότητα.
•
Την βιοσυμβατότητα.
•
Την χαμηλή τοξικότητα.
•
Την δυνατότητα up-conversion εκπομπών (μετατροπή ενός σήματος σε σήμα υψηλότερης
ανάλυσης).
•
Την ευαισθησία στις μεταβολές του pH.
•
Την αντίσταση στη φωτολεύκανση κλπ.
τα FGs υπόσχoνται σημαντικές εφαρμογές σε πολλούς τομείς των Βιοεπιστημών.
Επιπλέον, τα CDs
μπορούν να εμφανίζουν εκπομπή Φωτο-φωταύγεια (PL) στην φασματική
περιοχή του εγγύς Υπερύθρου (Νear-infrared, NIR ), περιοχή ιδιαίτερα σημαντική και χρήσιμη στην
in vivo Διαγνωστική, λόγω του χαμηλού Αυτοφθορισμού και την υψηλή διαφάνεια των ιστών στην
περιοχή του NIR.
68
Οι συνθετικές μέθοδοι για την για τη σύνθεση των C-QDs και των G-QDs, κατατάσσονται σε δύο
κατηγορίες, στις top-down και bottom–up μεθόδους:
Εικόνα 10. Σχηματικό διάγραμμα της ηλεκτροχημικής κατασκευή του Κβαντικών Τελειών Άνθρακα
(a) και η υδροθερμική κοπή των οξειδωμένων φύλλων Γραφενίου σε G-QDs (b). Μια μικτή εποξική
αλυσίδα αποτελείται από ομάδες ζευγών εποξικών και καρβονυλίων (αριστερά) και μετατρέπεται
σε μια πλήρη τομή (δεξιά) στο πλαίσιο της υδροθερμικής επεξεργασίας. [Βλ. Li HT, Kang ZH, Liu Y,
Lee S-T (2012) Carbon nanodots: synthesis, properties and applications. J Mater Chem 22:24230–
24253 καθώς και το Pan DY, Zhang JC, Li Z, Wu MH (2010) Hydrothermal route for cutting graphene
sheets into blue-luminescent graphene quantum dots. Adv Mater 22(6):734–738 ].
•
Οι μέθοδοι top-down συνήθως κάνουν χρήση της εκτομής με LASER και Ηλεκτροχημική
οξείδωση, όπου οι C-QDs και G-QDs σχηματίζονται ή αποσπώνται από μια μεγαλύτερη δομή
του άνθρακα και μεγαλύτερα φύλλα γραφενίου αντίστοιχα.
•
Οι bottom-up προσεγγίσεις συνήθως αναφέρονται σε μεθόδους Χημείας Διαλυμάτων, κατά τη
διάρκεια των οποίων, οι C-QDs και G-QDs σχηματίζονται από μόρια πρόδρομων ουσιών.
69
Εικόνα 11. (α) Εικόνα μέσω Μικροσκοπίας Ατομικών Δυνάμεων (AFM) των G-QDs που έχουν
εναποτεθεί πάνω σε πρόσφατα υποστρώματα Μαρμαρυγία, (β) Ύψος προφίλ κατά μήκος της
γραμμής στο (α) και (γ) Κατανομή Ύψους των G-QDs [Βλ. Minmin Xie et al. Blue and green
photoluminescence graphene quantum dots synthesized from carbonfibers, Materials Letters 93
(2013) 161–164].
5. Νανοσυμπλέγματα Mετάλλων (Metal Nanoclusters, NCs)
Πρόσφατες πρόοδοι στην Έρευνα στα Νανοϋλικά έχουν οδηγήσει σε μία νέα κατηγορία μορίωνΒιοανιχνευτών συνδυσμένων με φθορίζοντες ιχνηθέτες, που βασίζονται σε Νανοσυμπλέγματα
ευγενών μετάλλων, όπως ο Au και ο Ag κλπ. Ειδικότερα, το μήκος κύματος εκπομπής του
μεταλλικού νανο-συμπλέγματος, μπορεί να ρυθμιστεί με την αλλαγή των μορίων-«καλυμάτων»,
ενώ απαιτείται μια μοναδική φωτεινή πηγή για την ταυτόχρονη διέγερση, όλων των διαφορετικών
νανοσυμπλεγμάτων, με παρόμοιο τρόπο που συμπεριφέρονται, οι κβαντικές τελείες ημιαγωγών.
Όσον αφορα στη Βιομοριακής σύζευξη και την κατά συνέπεια Βιοϊατρική εφαρμογή της, τα
μεταλλικά νανοσυμπλέγματα εκπομπής χρώματος, παράγονται χρησιμοποιώντας τη σύνθεση που
βασίζεται στην ήδη υπάρχουσα εμπειρία και με καινοτόμες βελτιώσεις των πρότυπων. Ενδεικτικά
χρησιμοποιούνται:
70
•
Δενδριμερή.
•
Ολιγονουκλεοτίδια.
•
Πρωτεΐνες.
•
Πολυηλεκτρολύτες.
•
Πολυμερή.
σε συνδυασμό με σύνθεση μονοστρωματικά προστατευμένων Νανοσυμπλεγμάτων (monolayerprotected Νanoclusters, MP-C ή MP-NC).
Τα υψηλής ποιότητας Νανοσυμπλέγματα ευγενών μετάλλων, είναι σχετικά Βιοσυμβατά και
περισσότερο σταθερά, έναντι της φωτολεύκανσης, σε σύγκριση με τις οργανικές χρωστικές ουσίες
και αυτές οι οπτικές ιδιότητες τα καθιστούν κατάλληλα «Φθοριοχρώματα», για Βιοϊατρικές
πολυχρωματικές εφαρμογές και
εφαρμογές
πολυπλεξίας μικροσυστοιχιών, σε αυτόματους
Αναλυτές και σε εφαρμογές lab-on-a-chip.
Εικόνα 12. Αριστερά: Χαρακτηριστικά Νανοσυμπλέγματα ευγενών μετάλλων σε αύξουσα κλίμακα
του μήκους κύματος εκπομπής τους, για τα συγκεκριμένα προστατευόμενα μόρια. Δεξιά: Εικόνα
Ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου (SEM) του AuNC@Διυδρολιποϊκό Οξύ (DHLA), καθώς και τέσσερα
διακριτά χρώματα εκπομπής Νανοσυμπλεγμάτων φθορίζοντος Χρυσού, με διέγερση από λευκό
φώς και από λυχνία UV. [Βλ. Cheng-An J. Lin et al. Review: Synthesis of Fluorescent Metallic
Nanoclusters toward Biomedical Application: Recent Progress and Present Challenges, J. Med. Biol.
Eng., Vol. 277 29. No. 6 2009].
71
Εικόνα 13. Σχηματική αναπαράσταση της σύνθεσης του DNA-σταθεροποιουμένου Ag-NC [Βλ. Petty
JT, Zheng J, Hud NV, Dickson RM (2004) DNA-templated Ag-Nanoclusterssr formation, J Am Chem
Soc 126:5207–5212].
6. Η εξέλιξη της Τεχνολογίας των Κβαντικών Τελειών και των Βιοϊατρικών εφαρμογών τους
όπως εμφανίζονται σε δημοσιευμένα Έγγραφα Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας.
Ο στόχος της παραγράφου αυτής είναι να ανακεφαλαιώσει την εξέλιξη της Τεχνολογίας των
Κβαντικών Τελειών, στην in vitro Διαγνωστική (IVD), όπως αυτή αποτυπώνεται σε πρόσφατα
σχετικά Έγγραφα Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας. Τα πλέον σχετικά Έγγραφα Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας,
ανακτήθηκαν κυρίως με την χρήση της on-line μηχανής αναζήτησης esp@cenet του Ευρωπαϊκού
Γραφείου Διπλωμάτων Ευρεσιτεχνίας (ΕΡΟ).
Μέσω της αξιολόγησής τους, επιχειρήθηκε μια πρώτη χαρτογράφηση των αναδυόμενων σχετικών
Τεχνολογιών και με τον τρόπο αυτό, καθίσταται δυνατή μια βάσιμη πρόβλεψη των τάσεων και
στην αντίστοιχη Αγορά της in vitro Διαγνωστικής, για τα επόμενα χρόνια [Βλ. Β. Spyropoulos et al,
In vitro Diagnostics employment of Quantum Dots as depicted in Industrial Property Documents,
22nd International Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC Worldlab 2014),
Istanbul, June 2014, in Clin. Chem. Med. Lab. 52 Special Suppl. p. S207].
Οι ακόλουθες διακριτές ομάδες QD-IVD Έγγράφων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας, που σχετίζονται με
τις Κβαντικές Τελείες, που χρησιμοποιούνται σε σημαντικές έρευνες και εφαρμογές στην IVD,
ανασύρθησαν και αξιολογήθηκαν και τα αποτελέσματα συνοψίζονται στην Εικόνα 13.
B io lo g ic a l E n titie s D o c s
o r M e th o d s
N rs
A n tib o d ie s
91
A n tig e n s
37
A p ta m e rs
13
B a c te ria
17
C e lls
227
DNA
54
RNA
8
Im m u n o a s s a ys
17
Im m u n o flu o re sc e n c e
13
L a te ra l F lo w
3
P ro te in s
65
PCR
8
V iru se s
20
72
Distribution of filed QD related IP-Docs according to
Patent Office issuing the Priority Date (1995-2014)
GB; 2; 1%
TW; 14; 5%
DE; 1; 0%
KR; 26; 10%
US; 80; 31%
JP; 24; 9%
EP; 9; 3%
WO; 21; 8%
CN; 82; 33%
US
EP
WO
CN
JP
KR
GB
TW
DE
Εικόνα 13. Αριστερά: Αριθμός σχετικών με τη χρήση QDs στην ΙVD Έγγράφων Βιομηχανικής
Ιδιοκτησίας ανά σημαντική αντίστοιχη Οντότητα ή Μέθοδο. Δεξιά: Κατανομή των σχετικών με τις
QDs σύμφωνα με το Γραφείο Διπλωμάτων Ευρεσιτεχνίας που απονέμει την Ημερομηνία
Προτεραιότητας.
Number of QDs related IP-Docs per Publica tion Year
Number of QDs and Antibody related IP- Docs per Publication Year
700
40
35
30
25
20
15
10
5
0
2004
500
421426
400
449
345
300
294
235
194
169
200
100
36 25
19 27
0
1990
1995
45 52
97 90
77
2000
38
I P -D o c s p e r Y e a r
645
624
600
114
19
12
1
3
2006
9
10
12
5
2
2008
2010
2012
2014
2016
Year
2005
2010
2015
Number of QDs and Antibody related IP- Docs per Publication Year
QDs related IP-Docs per year
Εικόνα 14. Αριστερά: Αριθμός σχετικών με τη χρήση QDs στην ΙVD Έγγράφων Βιομηχανικής
Ιδιοκτησίας ανά έτος (1990-2015). Δεξιά: Αριθμός σχετικών με τη χρήση QDs και Αντισωμάτων
στην ΙVD Έγγράφων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας ανά έτος (2005-2014).
Industrial Property Documents related to Silicon, to Carbon and
to Graphene QDs vs. Priority Year of the filed application
14
Number of IP-Docs
12
10
8
6
4
2
0
1995
1997
1999
2001
2003
2005
2007
2009
2011
2013
Year
Si QDs
73
Carbon QDs
Graphene QDs
2015
Εικόνα 15. Αριθμός εγγράφων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας σχετιζομένων με Κβαντικές Τελείες
Πυριτίου, Άνθρακα και Γραφενίων, συναρτήσει της Χρονολογίας Προτεραιότητας των
κατατεθειμένων Αιτήσεων.
Μελετώντας το Γράφημα της Εικόνας 13 (δεξιά) γίνεται σαφές ότι στη Κίνα καταχωρήθηκε το 33%
των σχετικών αιτήσεων ενώ στις ΗΠΑ το 31%, καθιστώντας τη Κίνα βαθμιαία την σημαντικώτερη
αγορά και Νέων Τεχνολογιών παγκοσμίως. Η Εικόνα 14 δείχνει μια εκθετική ανάπτυξη γενικά της
Τεχνολογίας των QDs μετά το 1995, ενώ μετά το 2005, παρατηρείται το ίδιο και στο τομέα της IVD
Τεχνολογίας.
Όσον αφορά στον εσωτερικό ανταγωνισμό των επιμέρους αναδυομένων Τεχνολογιών QDs,
παρατηρούμε ότι η έρευνα στρέφεται σοβαρά τα τελευταία χρόνια στην ανάπτυξη QDs, χωρίς
βαρέα μέταλλα. Οι QDs Πυριτίου κατακτούν την πρώτη θέση (25%) σε Αιτήσεις σχετικών
Διπλωμάτων Ευρεσιτεχνίας, οι QDs Ινδίου την δεύτερη (24%), οι «Βιοσυμβατές» QDs Άνθρακα και
Γραφενίων καλύπτουν αθροιστικά το 29% των Αιτήσεων, ενώ τέλος το δυνητικά επικίνδυνο,
τουλάχιστον στην in vivo Διαγνωστική και Απεικόνιση, Κάδμιο, περιορίζεται στο 12%.
Absolute numbers of IP-Docs related in their titles
to important QDs-Elements
Indium QDs;
50; 24%
Gold QDs;
6; 3%
Silver QDs;
5; 2%
Graphene QDs;
24; 11%
Carbon QDs;
38; 18%
Gallium QDs;
2; 1%
Germanium
QDs; 9; 4%
Cadmium QDs;
25; 12%
74
Silicon QDs;
51; 25%
Graphene QDs
Carbon QDs
Silicon QDs
Cadmium QDs
Germanium QDs
Gallium QDs
Indium QDs
Gold QDs
Silver QDs
Εικόνα 16. Αριθμός εγγράφων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας των οποίων οι τίτλοι σχετίζονται με
Στοιχεία που αποτελούν βασικό συστατικό σημαντικών Κβαντικών Τελειών.
Numbers of IP-Docs per NCs-type mentioned in their
titles and/or abstracts
148
Number of IP-Docs
160
140
120
106
100
80
60
47
40
40
20
15
3
8
5
47
17
0
Platinum NCs
Gold NCs
Silver NCs
Metal NCs
Other NCs
Type of NCs Retrieved
NCs in Title
NCs in Title or Abstract
Εικόνα 17. Αριθμός εγγράφων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας ανά τύπο Νανοσυμπλεγμάτων Μετάλλων
και αναφερομένων στον Τίτλο ή/και στην Περίληψή τους.
Η Εικόνα 17 αποκαλύπτει μια γραμμική ανάπτυξη του ερευνητικού ενδιαφέροντος για τα
Μεταλλικά Νανοσυμπλέγματα, αλλά και σε περιοχές γύρω από αυτά. Το υψηλότερο κόστος των
σπανίων γαιών και των ευγενών μετάλλων, δρα ανασταλτικά γενικώς, ενώ στη περιοχή της
Βιοϊατρικής Τεχνολογίας, παρά τα θετικά πειραματικά αποτελέσματα που αναφέρθηκαν
προηγουμένως, δεν παρατηρείται κάποια «εκρηκτική» εκθετική τάση, επειδή και τα περισσότερα
ευγενή μέταλλα ενέχουν κινδύνους, παρά τις χαμηλές διαγνωστικές και θεραπευτικές
συγκεντρώσεις, που χρησιμοποιούνται στις Κλινικές Εφαρμογές.
Η χρονική εξέλιξη του αριθμού των εγγράφων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας, τα οποία αφορούν στα
Νανοσυμπλέγματα Mετάλλων, εμφανίζεται στην Εικόνα 18 και παρουσιάζει ένα μικρό τοπικό
μέγιστο (2002-2003) και ένα απόλυτο μέγιστο (2010-2012) και στη συνέχεια μια απότομη
καθοδική πορεία.
75
Η καθοδική αυτή πορεία, συμπίπτει με την απότομη ανοδική πορεία που εμφανίζεται την περίοδο
2011-2013, στις καταχωρήσεις ευρεσιτεχνιών σχετικών με τις «ανταγωνιστικές» Κβαντικές Τελείες
Πυριτίου, Άνθρακα και Γραφενίων, πιθανόν γιατί η Βιοσυμβατότητα των τελευταίων, δίνει
καλύτερες προοπτικές, στη στοχοθεσία συγγενών ερευνητικών πεδίων.
IP-Docs related to Metal Nanostructures vs. Priority Year
14
13
IP-Docs retrieved
13
12
12
10
8
8
6
6
6
5
4
4
3
2
2
5
4
4
2007
2009
4
3
2
2
1
0
1995
1997
1999
2001
2003
2005
2011
2013
2015
Priority Year
Priority Year
Εικόνα 18. Αριθμός δημοσιευμένων εγγράφων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας σχετιζόμενων στον τίτλο
τους με Καινοτομίες στην Τεχνολογία Νανοσυμπλεγμάτων Μετάλλων.
76
7. Συμπεράσματα για τις μελλοντικές προοπτικές στην in vitro Διαγνωστική.
Biological Entities or Methods
3%
17%
11%
1%
1%
6%
2%
2%
3%
1%
3%
9%
41%
Antibodies
Antigens
Aptamers
Bacteria
Cells
DNA
RNA
Immunoassays
Immunofluorescence
Lateral Flow
Proteins
PCR
Viruses
Εικόνα 19. Αριστερά: Μια σχηματική γενικευμένη παρουσίαση των διαφόρων μεθόδων για την
παρασκευή των διαφόρων τύπων βιοσυζυγών-QDs και εν δυνάμει εφαρμογών τους. [Βλ. Zhu, J.-J.,
Li, J.-J., Huang, H.-P., Cheng, F.-F., Quantum Dots for DNA Biosensing, Springer Briefs in Molecular
Science, 2013, VIII]. Δεξιά: Στον αριθμό σχετικών με τη χρήση QDs στην ΙVD Έγγράφων
Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας προηγείται η σήμανση Κυττάρων (41%) και ακολουθούν τα Αντισώματα
(17%) και οι Πρωτεϊνες (11%).
Μολονότι βρισκόμαστε στο μέσον ενός «ερευνητικού ανταγωνισμού», τόσο τα Χημικά–Τεχνικά –
Βιολογικά χαρακτηριστικά των Κβαντικών Τελειών Άνθρακα και Γραφενίων, όσο και η δυναμική
της Έρευνας τα τελεταία 10 χρόνια, όπως αυτή εκφράστηκε μέσα από το παράδειγμα του “Patent
Mapping”, που παρουσιάστηκε, δείχνουν ότι υπάρχουν δικαιολογημένες προσδοκίες, τα επόμενα
χρόνια να έχουμε μια
μεγάλης κλίμακας αξιοποίησης των QDs στην
ΙVD, ιδιαίτερα στην
Κυτταρομετρία Ροής, σε Βιοϊατρικές πολυχρωματικές εφαρμογές και σε εφαρμογές πολυπλεξίας
μικροσυστοιχιών.
Αν και το Φάσμα εκπομπής των QDs ημιαγωγών υπερέχει έναντι αυτού των Si-QDs (Εικόνα 8) και
των QDs Άνθρακα και Γραφενίων (Εικόνα 11), τα υπόλοιπα συγκριτικά πλεονεκτήματά τους,
77
παρέχου ένα ισχυρό κίνητρο έντασης της έρευνας στα πεδία αυτά στο άμεσο μέλλον. Είναι βέβαιο
ότι στη διάρκεια της επόμενης δεκαετίας, το πεδίο εφαρμογής των QDs θα συνεχίσει να
αναπτύσσεται και ο ανταγωνισμός των Τεχνικών, για την κατάκτηση σοβαρού μεριδίου της
Αγοράς, θα παραμείνει ζωηρός. Στην in vitro Διαγνωστική θα επιβιώσουν για αρκετά χρόνια τα
QDs ημιαγωγών, όμως στην in vivo Διαγνωστική και στην Ιατρική Απεικόνιση, η έρευνα θα ενταθεί,
ώστε να περιορισθούν οι κίνδυνοι από το Κάδμιο και άλλα στοιχεία, αλλά και από τα ευγενή
μέταλλα, μέσω της αντικατάστασής τους, από πλεον Βιοσυμβατά υλικά.
Εικόνα 20. Όσον αφορά στη χώρα που θα παίξει πρωταγωνιστικό ρόλο στον τομέα των QDs στα
Νανοσυμπλέγματα, το “Patent Mapping” δείχνει με βεβαιότητα προς Ανατολάς...
78
ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΗ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΓΙΑ ΤΑ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΑ (IVD)
Κρούπης Χρήστος
ΜSc, PhD, EurClinChem, Επικ. Καθηγητής Κλινικής Βιοχημείας και Μοριακής Διαγνωστικής
Αττικό Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο
Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών
IVD-WG Chair, EFLM
Στα πλαίσια της επιτροπής Ποιότητας και Κανονισμών (Quality and Regulation Committee) της
EFLM (European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine) εργάζονται δύο ομάδες
εργασίας (Working Groups): η ομάδα εργασίας για την διαπίστευση και τα πρότυπα ISO
(Accreditation/ISO WG) και η ομάδα εργασίας για την Ευρωπαϊκή οδηγία για τα in-vitro
διαγνωστικά προϊόντα (IVD-WG). Οι ομάδες εργασίας είναι ανεξάρτητες ωστόσο σε κάποια θέματα
συντονίζονται και συλλειτουργούν.
Κυριότερο έργο της IVD-WG, αποτελεί η ενημέρωση των αρμοδίων αρχών και των επαγγελματιών
υγείας στα διεθνή φόρα ως προς τις απόψεις της EFLM για την αναθεώρηση της Οδηγίας 98/79/EC
που αφορά την διακίνηση και τον έλεγχο των in vitro διαγνωστικών προϊόντων στην Ευρωπαϊκή
Ένωση. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν προϊόντα που χρησιμοποιούνται από τα κλινικά εργαστήρια:
τα εμπορικά διαθέσιμα διαγνωστικά kits των κατασκευαστών αλλά και όσα in-house tests
χρησιμοποιούνται για διαγνωστική χρήση (και όχι για ερευνητικούς σκοπούς), δηλαδή όλα όσα θα
καλύπτονταν οικονομικά μερικώς ή ολικώς από τα συστήματα υγείας ανά τον κόσμο (κρατικούς
και ιδιωτικούς ασφαλιστικούς οργανισμούς). Μετά από δημόσια διαβούλευση με τους
ενδιαφερόμενους φορείς που διήρκεσε περίπου 2 χρόνια, η Ευρωπαϊκή επιτροπή (Commission)
στις 26/09/2012 δημοσίευσε προτεινόμενο Κανονισμό –πλέον- και ξεκίνησαν οι διαδικασίες για
την ψήφισή του. Στο Ευρωπαϊκό Κοινοβούλιο ψηφίστηκε με σημαντικές τροποποιήσεις στις 24
Οκτωβρίου 2013 και έκτοτε γίνεται διαπραγμάτευση με το Ευρωπαϊκό συμβούλιο (council) ώστε
τα 3 μέρη (trilogue) για την τελική συμφωνία που αντιπροσωπεύεται από τις εκάστοτε Προεδρίες.
Είναι γεγονός ότι από την υιοθέτηση της οδηγίας το 1998 έως τώρα, έχουν προκύψει καινούργια
δεδομένα καθώς έχουν εισαχθεί πολλές νέες εργαστηριακές παράμετροι αλλά και υπάρχει
αυξημένη πίεση από ευρωπαϊκές ενώσεις ασθενών και Οργανισμούς Υγείας για βελτιωμένη
ποιότητα και ασφάλεια όλων αυτών των αντιδραστηρίων τα οποία συμμορφώνονται με την
79
οδηγία και συνεπώς κυκλοφορούν με το σήμα CE-IVD (Conformité Europeéne). Στην ισχύουσα
οδηγία προβλέπονται απαιτήσεις επικύρωσης της χρήσης και αυξημένου στατιστικού ελέγχου της
παραγωγής μόνο όσων αντιδραστηρίων χρησιμοποιούνταν για την ανάλυση παραμέτρων κυρίως
της Λίστας Α (HIV1/2, HTLV, HBV, HCV, HDV, ABO, Rhesus) και κατά δεύτερο λόγο της Λίστας Β
(TORCH, HLA A/B/DR, τρισωμία 21, φαινυλοκετονουρία, PSA, POCT Glu).
Ο προτεινόμενος κανονισμός στηρίζει την προτεινόμενη από την GHTF (Global Harmonization Task
Force, πλέον το νέο όνομα της είναι International Medical Device Regulators Forum) ορθολογική
κατάταξη των αντιδραστηρίων σε 4 κατηγορίες (από το A έως το D) με βάση 7 κανόνες (rules-based
classification) που αξιολογούν τον ατομικό και δημόσιο κίνδυνο του νοσήματος που ελέγχει το υπό
εξέταση αντιδραστήριο. Η κατάταξη αυτή θα αντιστοιχεί σε αυξανόμενες απαιτήσεις τόσο στον
κατασκευαστή (manufacturer) για τη διατήρηση συστημάτων ολικής διαχείρισης ποιότητας και για
την υποβολή πλήρους φακέλου με τη σχετική τεκμηρίωση για την αναλυτική και κλινική
επικύρωση των παραγόμενων αντιδραστηρίων όσο και στην εκάστοτε ελέγχουσα Αρχή (Regulatory
Authority/Notifying Body) για επιτόπιους ελέγχους της συμμόρφωσης του κατασκευαστή
(Conformity assessment), της παραγωγής τους και των συστημάτων παρακολούθησης
προβλημάτων που απορρέουν από τη χρήση τους (post-market surveillance). Επίσης τα in-house
tests που χρησιμοποιούνται για διαγνωστική χρήση θα πρέπει να εκτελούνται σε κλινικά
εργαστήρια διαπιστευμένα σύμφωνα με το πρότυπο ISO15189 που απαιτεί πλήρη επικύρωση των
μεθόδων που χρησιμοποιούν.
Η προτεινόμενη κατάταξη θα πολλαπλασιάσει σημαντικά τον αριθμό των εργαστηριακών
παραμέτρων με αυξημένες απαιτήσεις και κατά συνέπεια και το τελικό κόστος σε κατασκευαστές
και εργαστήρια. Στόχος της αναθεώρησης της οδηγίας είναι ο συγκερασμός των απόψεων του
κοινού για αυξημένη ασφάλεια και των κατασκευαστών ώστε να συνεχίσουν να παράγουν και να
προσφέρουν αντιδραστήρια στην Ευρωπαϊκή αγορά καθώς επίσης και να βελτιώνουν τα προϊόντα
τους ή να αναζητούν λύσεις σε σπάνια νοσήματα.
80
ΝΕΟΣ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ ΓΙΑ ΤΑ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΑ. ΑΛΛΑΓΕΣ ΚΑΙ ΠΡΟΚΛΗΣΕΙΣ ΓΙΑ
ΤΗ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΑ ΚΑΙ ΤΟΥΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΥΣ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΕΣ.
Σάκης Μητρόπουλος
ΓΓ ΣΕΙΒ
Η αναθεώρηση της Οδηγίας 98/79ΕΚ είναι πλέον αναγκαία, μετά από τα …15 χρόνια εφαρμογής
της και νέες εξελίξεις που απαιτούν ξεχωριστή αντιμετώπιση. Ήδη έχει προταθεί αντί Οδηγίας να
ψηφιστεί Κανονισμός, που, εφόσον ψηφισθεί από το Ευρωπαϊκό Συμβούλιο, θα είναι
υποχρεωτική η υιοθέτησή του από όλα τα κράτη-μέλη και θα πρέπει να εφαρμοστεί αυτούσια,
χωρίς την δυνατότητα Εθνικής προσαρμογής.
ΙΣΤΟΡΙΚΟ
Για πολλά χρόνια η εταιρεία PIP (Poly Implant Prothèse) χρησιμοποιούσε βιομηχανική σιλικόνη
στην κατασκευή εμφυτευμάτων στήθους. Στο διάστημα αυτό δεν γίνονταν εργαστηριακοί έλεγχοι
και η εταιρεία «διόρθωνε» τα αρχεία της καθώς οι έλεγχοι από τον Κοινοποιημένο οργανισμό ήταν
κατόπιν προειδοποίησης. Τελικά ο μεγάλος αριθμός διάρρηξης εμφυτευμάτων κίνησε το
ενδιαφέρον των αρχών και το σκάνδαλο αποκαλύφθηκε.
Υπολογίζεται ότι 400.000 γυναίκες έλαβαν εμφυτεύματα PIP παγκοσμίως και τουλάχιστον 1
θάνατος αποδείχτηκε ότι οφειλόταν σε αυτά. Μετά το σκάνδαλο οι Ευρωπαϊκές αρχές αντέδρασαν
με μάλλον εξαιρετικά απότομο τρόπο, φέροντας προς ψήφιση νέους Κανονισμούς για τα
Φάρμακα, τα Ιατροτεχνολογικά Υλικά και τα IVDs.
Λαμβάνοντας υπόψη τις θέσεις του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου, (ψήφισμα P7_TA-PROV(2013)0427
της 22ας Οκτωβρίου 2013) ο Σύνδεσμος Επιχειρήσεων Ιατρικών & Βιοτεχνολογικών Προϊόντων
(ΣΕΙΒ) θεωρεί ότι πρέπει να επισημάνει ορισμένα θέματα θεμελιώδους σημασίας, σχετικά με τις
θέσεις του Ευρωκοινοβουλίου, όπως εκφράζονται με την πρόταση Κανονισμού, ώστε να
εξασφαλισθεί ότι ο Κανονισμός που θα ψηφισθεί θα υποστηρίζει πραγματικά την ασφάλεια των
προϊόντων, χωρίς όμως συμβιβασμούς με τον καινοτόμο χαρακτήρα που απαιτείται σε αυτόν τον
τομέα της τεχνολογίας.
TA IVDs ΚΑΙ Ο ΝΕΟΣ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ
Τα IVDs προορίζονται για μη-επεμβατικές δοκιμασίες, που γίνονται σε βιολογικά υλικά (πχ αίμα,
ούρα, ιστούς) για να προσδιορισθεί η κατάσταση της υγείας του ατόμου. Χρησιμοποιούνται για τη
81
διάγνωση, τον μαζικό προκαταρκτικό έλεγχο, την εκτίμηση της προδιάθεσης σε μία ασθένεια και
την παρακολούθηση της θεραπευτικής πορείας των ασθενειών. Η καινοτομία στα IVD αποτελεί
σημαντικό παράγοντα μείωσης του κόστους των συστημάτων υγειονομικής περίθαλψης. Το
ευρύτατο πεδίο των IVD ξεκινάει από τις απλές εξετάσεις αυτοδιάγνωσης που εκτελούνται στο
σπίτι, όπως πχ test εγκυμοσύνης, παρακολούθηση σακχάρου και επεκτείνεται στις πολύ
εξελιγμένες εξετάσεις που διενεργούνται σε Εργαστήρια.
Η σημαντική διαφορά μεταξύ των IVD και των άλλων Ιατροτεχνολογικών υλικών είναι ότι τα πρώτα
δεν έρχονται ποτέ σε απευθείας επαφή με το άτομο, ως εκ τούτου η αξία τους έγκειται στην
ποιότητα της πληροφορίας που παρέχουν και μόνο. Δεν γίνεται διάγνωση με τα IVD, απλώς
παρέχουν σημαντική πληροφορία στον ασθενή ή στον επιστήμονα υγείας, που τους επιτρέπουν
την επιλογή της θεραπείας. Για τους ίδιους λόγους διαφέρουν και από τα φαρμακευτικά προϊόντα
διότι τα τελευταία είναι σχεδιασμένα να έρχονται σε επαφή με το άτομο και να απορροφώνται
από το σώμα, με σκοπό να θεραπεύσουν μια κατάσταση ή μια ασθένεια.
Τα κύρια σημεία του προς ψήφιση κανονισμού, που προκαλούν ανησυχία είναι τα εξής:
1. ΟΡΙΣΜΟΣ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΟΥ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ
Η πρόταση της Επιτροπής σχετικά με τον ορισμό των IVDs επεκτάθηκε από το Ευρωπαϊκό
Κοινοβούλιο ώστε να συμπεριλάβει όλες τις συσκευές «που παρέχουν πληροφορίες σχετικά με την
άμεση ή έμμεση επίπτωση στην υγεία».
Όπως έχουν τα πράγματα σήμερα, το κείμενο διευρύνει το πεδίο του τι συνιστά IVD - και με τον
τρόπο αυτό το πεδίο εφαρμογής του κανονισμού – ώστε περιλαμβάνει προϊόντα όπως κινητά
τηλέφωνα, γενικά προγράμματα λογισμικού, εργαστηριακό εξοπλισμό ή ακόμη και διαδικτυακές
υπηρεσίες, όπως η Wikipedia. Η επέκταση αυτή δεν είναι κατάλληλη διότι υπερβαίνει κατά πολύ
τον τυπικό ορισμό των IVD προϊόντων με τα οποία εκτελούνται εξετάσεις σε δείγματα που
προέρχονται από το ανθρώπινο σώμα σε ένα «τεχνητό» (in Vitro) περιβάλλον. Λογισμικά
προγράμματα και εργαστηριακός εξοπλισμός δεν καλύπτουν και δεν μπορούν να καλύψουν τα
ίδια κριτήρια ασφαλείας και ελέγχου που χρησιμοποιούνται συνήθως για τον ορισμό ενός
προϊόντος IVD.
Η πρόταση της Βιομηχανίας είναι να διατηρηθεί το αρχικό κείμενο της Ευρωπαϊκής Επιτροπής και
να παραλειφθεί η τροπολογία του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου με το οποίο επιχειρείται η
διεύρυνση του πεδίου εφαρμογής του ορισμού των IVD προϊόντων.
82
2. ΚΑΝΟΝΕΣ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗΣ ΤΩΝ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΩΝ ΙΑΤΡΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ
Καθιερώνεται ένα παγκόσμια εναρμονισμένο σύστημα ταξινόμησης που βασίζεται στις συστάσεις
της GHTF (Global Harmonization Task Force), με κατάταξη όλων των IVDs σε 4 κατηγορίες
επικινδυνότητας A, B, C, D.
Εδώ παρουσιάζονται δυσκολίες, καθώς πληθώρα προϊόντων αλλάζουν κατηγορία, με
αυστηροποίηση των ελέγχων, ενώ τα POCT βρίσκονται στην ίδια κατηγορία με τα
αυτοδιαγνωστικά προϊόντα, γεγονός που αναμένεται να αυξήσει σημαντικά το κόστος τους.
3. ΚΟΙΝΟΠΟΙΗΜΕΝΟΙ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ
Με το νέο Κανονισμό ενισχύεται ο ρόλος των ΚΟ, ενώ θεσπίζεται η υποχρέωση τους για
απροειδοποίητους ελέγχους. Ταυτόχρονα θεσπίζεται μικρότερο χρονικό διάστημα μεταβατικής
περιόδου, ώστε οι ΚΟ να προετοιμαστούν για τη νέα κατάσταση.
Αυτό αυξάνει σημαντικά το βαθμό δυσκολίας των ελέγχων των ΚΟ, ενώ εκτοξεύει το κόστος
συμμόρφωσης για τους κατασκευαστές.
4. ΚΛΙΝΙΚΑ ΤΕΚΜΗΡΙΑ ΚΑΙ ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ ΜΕΤΑ ΤΗΝ ΔΙΑΘΕΣΗ ΣΤΗΝ ΑΓΟΡΑ
H Επιτροπή με τον νέο Κανονισμό εισάγει για πρώτη φορά την άποψη ότι οι κατασκευαστές IVD
οφείλουν να αποδείξουν με κλινικές δοκιμές την «κλινική χρησιμότητα» των προϊόντων που
εισάγουν στην αγορά. Η αμφιλεγόμενη αυτή απαίτηση, που μεταφέρει στους κατασκευαστές
«βάρος» που ως τώρα ήταν αποκλειστικά έργο ερευνητικών κέντρων, πανεπιστημίων και κλινικών,
μοιραία αναμένεται να αυξήσει σημαντικά τόσο το κόστος των IVD όσο και τον χρόνο εισαγωγής
τους στην αγορά, με ανυπολόγιστες συνέπειες στην πρόσβαση ασθενών σε νέα προϊόντα.
Όσον αφορά την αυστηροποίηση του καθεστώτος περί κλινικών δοκιμών, η Επιτροπή προσφέρει
την κατάλληλη ισορροπία ασφάλειας και αποδοτικότητας, αναγνωρίζοντας ότι οι δοκιμές για τα
IVD διεξάγονται χωρίς άμεση επίδραση στους ασθενείς, καθόσον βασίζονται είτε σε
εναπομείναντα δείγματα είτε σε δείγματα Τραπεζών βιολογικών δειγμάτων.
Υπάρχει ωστόσο ανησυχία για ορισμένα σημεία του προτεινόμενου κειμένου της Επιτροπής,
σχετικά με μια νέα υποχρέωση για άμεση παρακολούθηση, μετά την διάθεση στην αγορά, κάθε
IVD προϊόντος. Η απαίτηση αυτή δεν χρησιμεύει πουθενά ούτε είναι σχετική με τα προϊόντα IVD,
διότι αυτά διαφοροποιούνται από τα άλλα Ι/Π από το γεγονός ότι δεν έρχονται σε άμεση επαφή
με τον ασθενή.
83
5. ΔΙΑΦΑΝΕΙΑ
Η διαφάνεια στον τομέα της υγείας είναι πολύ σημαντική και η Βιομηχανία θεωρεί ότι η αυξημένη
διαφάνεια και η διάχυση σημαντικών πληροφοριών στους ασθενείς είναι προς τη σωστή
κατεύθυνση. Το Ευρωπαϊκό Κοινοβούλιο με τις τροπολογίες του, πρότεινε την σημαντική ενίσχυση
των διατάξεων περί διαφάνειας στην Βιομηχανία των IVD. Κατά την Βιομηχανία όμως, η πρόταση
του Ευρωκοινοβουλίου δεν διατηρεί ισορροπία μεταξύ του επιπέδου των πληροφοριών που
απαιτούνται για λόγους ασφαλείας και της προστασίας των δικαιωμάτων πνευματικής
ιδιοκτησίας.
Η θέση της Βιομηχανίας είναι, να μην επιτρέπεται πλήρης πρόσβαση από τρίτους στον τεχνικό
φάκελο και στα ανεπεξέργαστα δεδομένα κάθε μελέτης, αλλά να τίθεται στην διάθεση του κοινού
μια συνοπτική έκθεση της μελέτης, όπως π.χ. εφαρμόζεται στις ΗΠΑ. Με τον τρόπο αυτό θα
προστατευθεί η καινοτομία, λαμβάνοντας ταυτόχρονα υπόψη το ενδεχόμενο παραβίασης των
δικαιωμάτων της πνευματικής ιδιοκτησίας.
6. ΑΠΑΛΛΑΓΗ ΤΩΝ IVD ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ «ΕΝΤΟΣ ΤΩΝ ΙΔΡΥΜΑΤΩΝ»
Η πρόταση της Ευρωπαϊκής Επιτροπής προβλέπει τη λεγόμενη «απαλλαγή των εντός των
Ιδρυμάτων παραγομένων» IVD, επιτρέποντας ουσιαστικά σε υψηλού κινδύνου διαγνωστικά που
εμπίπτουν στην νέα κατηγορία “D” να παράγονται και να χρησιμοποιούνται σε μεμονωμένα
Ιδρύματα Υγείας.
Για τα υλικά αυτά δεν απαιτείται να υποβάλλονται σε κλινικές μελέτες και σε μελέτες απόδοσης,
υπό την προϋπόθεση ότι δεν κυκλοφορούν στο εμπόριο ανάλογα, συγκρίσιμα προϊόντα. Το μέτρο
αυτό έχει ως στόχο να ενθαρρύνει την καινοτομία και την ανάπτυξη οικονομικά πιο αποδοτικών
προσεγγίσεων για την υγειονομική περίθαλψη. Η πρόταση της Ευρωπαϊκής Βιομηχανίας είναι να
επιτρέπεται στα IVD που παράγονται και αναπτύσσονται μέσα σε Ιδρύματα Υγείας να
επωφελούνται από την απαλλαγή δοκιμασίας μόνο σε περιπτώσεις που δεν υπάρχει ισοδύναμο
εμπορικό test διαθέσιμο. Αυτό άλλωστε είναι σύμφωνο και με τις απαιτήσεις για τα προϊόντα της
κατηγορίας «D».
7. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΣΥΜΜΟΡΦΩΣΗΣ ΓΙΑ ΒΟΗΘΗΜΑΤΑ ΣΥΝΟΔΟΥ ΔΙΑΓΝΩΣΗΣ
Η Ευρωπαϊκή Επιτροπή προτείνει μια διαδικασία για την αξιολόγηση συμμόρφωσης για τα
βοηθήματα συνοδού διάγνωσης, που εμπλέκει τον Ευρωπαϊκό Οργανισμό Φαρμάκων - European
Medicines Agency (EMA) - για κάθε αναθεώρηση, παράλληλα με τον ορισθέντα Κοινοποιημένο
84
Οργανισμό. Η Βιομηχανία θεωρεί ότι η συμμετοχή της EMA δεν θα είναι αποτελεσματική και το
πιο πιθανό είναι ότι θα επιβαρύνει την διαδικασία με περιττό κανονιστικό και διοικητικό βάρος,
χωρίς εμφανή αύξηση της ασφάλειας.
Ο έλεγχος των βοηθημάτων συνοδού διάγνωσης μέσω ενός συστήματος Κοινών Τεχνικών
Προδιαγραφών - Common Technical Specifications (CTS) - σημαίνει ότι αυτά θα πληρούν απολύτως
τις απαιτήσεις των αυστηρών ελέγχων που προβλέπονται για τα προϊόντα της κατηγορίας «D»
(ακόμη και αν αυτά είναι κατηγορίας «C»), καθιστώντας περιττό τον έλεγχο από τον Ευρωπαϊκό
Οργανισμό Φαρμάκων (ΕΜΑ).
8. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΚΑΙ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΝΑ ΑΠΟΔΕΣΜΕΥΟΜΕΝΗ ΠΑΡΤΙΔΑ
Το Ευρωπαϊκό Κοινοβούλιο ενέκρινε σειρά τροπολογιών για την περαιτέρω βελτίωση της
πρότασης της Ευρωπαϊκής Επιτροπής σχετικά με τον ρόλο των Εθνικών Εργαστηρίων Αναφοράς,
τον έλεγχο των συσκευών IVD υψηλού κινδύνου και την παρακολούθησή τους μετά τη διάθεσή
τους στην αγορά. Εξακολουθεί ωστόσο να υπάρχει έλλειψη σαφήνειας σε σχέση με την
διακυβέρνηση των Εργαστηρίων Αναφοράς καθώς και με την εμπλοκή τους στις δραστηριότητες
παρακολούθησης μετά την διάθεση των προϊόντων στην αγορά.
Η διακυβέρνηση των εργαστηρίων αναφοράς θα πρέπει να διευκρινιστεί, απέναντι σε ποιους
έχουν ευθύνη και πώς πρέπει να επιλύονται οι τυχόν αντιθέσεις σε εκτιμήσεις. Ο τρόπος
συνεισφοράς των Εργαστηρίων Αναφοράς στις Κοινές Τεχνικές Προδιαγραφές - Common Technical
Specifications (CTS) - και ο ρόλος τους στον έλεγχο ανά αποδεσμευμένη παρτίδα, πρέπει να
καθοριστούν.
9. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΕΛΕΓΧΟΥ
Το Ευρωπαϊκό Κοινοβούλιο τροποποίησε την πρόταση της Ευρωπαϊκής Επιτροπής για τον έλεγχο
των IVDs, με δύο περαιτέρω διαδικασίες για τον επιπλέον έλεγχο προϊόντων υψηλού κινδύνου:
την «ανά περίπτωση» αξιολόγηση και την «Πρόσθετη διαδικασία αξιολόγησης των έκτακτων
περιστάσεων». Η Ευρωπαϊκή Βιομηχανία θεωρεί ότι δύο παρόμοιες διαδικασίες για την εφαρμογή
πρόσθετων μέτρων ελέγχου προϊόντων IVD υψηλού κινδύνου, οδηγούν σε περιττές
αλληλοεπικαλύψεις και νομοθετικές επιβαρύνσεις.
Η επιπρόσθετη διαδικασία αξιολόγησης «έκτακτων περιστάσεων» είναι η σωστή προσέγγιση και η
πλέον κατάλληλη για τα προϊόντα IVD, διότι η διαδικασία αυτή δίνει την δυνατότητα στις Αρμόδιες
85
Αρχές των Κρατών Μελών να αποκτήσουν την απαραίτητη εξουσία για να αποφασίζουν ποιούς
φακέλους να αναθεωρούν και να προβαίνουν στις διαδικασίες αξιολόγησης.
Ως εκ τούτου, η «ανά περίπτωση» αξιολόγηση είναι περιττή διότι η «συμπληρωματική διαδικασία
αξιολόγησης των εκτάκτων περιστάσεων» εξασφαλίζει μια ισορροπημένη προσέγγιση για την
ασφάλεια των ασθενών, που είναι κατάλληλη και επαρκής για την επικρατούσα πραγματικότητα
της αγοράς των IVD προϊόντων.
10. ΜΕΤΑΒΑΤΙΚΗ ΠΕΡΙΟΔΟΣ
Ενώ η Ευρωπαϊκή Επιτροπή είχε αρχικά προτείνει μια μεταβατική περίοδο 5 ετών, το
Ευρωκοινοβούλιο πρότεινε αυτή να μειωθεί στα 3 χρόνια.
Η επιδιωκόμενη εναρμόνιση των κανόνων και των ελέγχων σε ολόκληρη την Ευρώπη είναι
αποδεκτή από την Βιομηχανία IVD και θα αποβεί σε μεγάλο βαθμό προς όφελος της ασφάλειας
των πολιτών, εντούτοις χρειάζεται επαρκής χρόνος για να μπορέσουν όλοι οι εμπλεκόμενοι φορείς
(Κοινοποιημένοι Οργανισμοί, Κατασκευαστές, Εισαγωγείς, Διανομείς, κτλ) να εφαρμόσουν με
επιτυχία τις τεράστιες αναμενόμενες αλλαγές.
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ
Το προς ψήφιση νέο κανονιστικό πλαίσιο πρέπει να διαφυλάξει και να εγγυηθεί την πλήρη
ασφάλεια των χρησιμοποιουμένων αγαθών, χωρίς να εκτινάξει το κόστος σε δυσθεώρητα ύψη,
ενώ εκφράζονται φόβοι από τη βιομηχανία των IVDs για σοβαρό μειονέκτημα στην ανάπτυξη
καινοτομίας όσο και στην πρόσβαση σε ασφαλή διαγνωστική τεχνολογία.
ΣΗΜΕΙΩΣΗ
Μετά την πρόσφατη κατάταξη των Ιατροτεχνολογικών Βοηθημάτων στις αρμοδιότητες του
Επιτρόπου Ανταγωνιστικότητας είναι άγνωστος ο βαθμός προτεραιότητας σχετικά με την ψήφιση
του νέου Κανονισμού. Κάθε ενδεχόμενο είναι πιθανό, αφού πλέον δεν γνωρίζουμε αν θα ψηφιστεί
ο Κανονισμός ή αν θα υπάρξουν αλλαγές. Το τρέχον κείμενο πάντως είναι ενδεικτικό του πώς
αντιλαμβάνεται το Ευρωπαϊκό κοινό τις ευθύνες των κατασκευαστών ιατροτεχνολογικού υλικού
και πόσο μεγεθύνονται οι απαιτήσεις ασφάλειας που χρήστες και κατασκευαστές πρέπει να
παρέχουν.
86
ΤΟ ΜΕΛΛΟΝ ΤΟΥ ΕΠΑΓΓΕΛΜΑΤΟΣ ΜΑΣ: ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ Η ΕΙΔΙΚΕΥΜΕΝΟΣ/Η
ΣΤΗΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΤΡΙΚΗ; Η ΝΕΑ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗ ΟΔΗΓΙΑ ΓΙΑ ΤΑ ΕΠΑΓΓΕΛΜΑΤΙΚΑ
ΔΙΚΑΙΩΜΑΤΑ.
Δημήτρης Ρίζος, PhD, EuSpLM
Αναπληρωτής Καθηγητής Κλινικής Χημείας, Ιατρική Σχολή ΕΚΠΑ, Ορμονολογικό Εργαστήριο,
ΑΡΕΤΑΙΕΙΟ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟ
Τον Νοέμβριο του 2013, ψηφίστηκε από το Ευρωπαϊκό Κοινοβούλιο η οδηγία 2013/55/ΕΕ του
Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου. Η οδηγία αφορούσε την τροποποίηση της οδηγίας
2005/36/ΕΚ σχετικά με την αναγνώριση των επαγγελματικών προσόντων και του κανονισμού (ΕΕ)
αριθ. 1024/2012 σχετικά με τη διοικητική συνεργασία μέσω του συστήματος πληροφόρησης της
εσωτερικής αγοράς («κανονισμός IMI»).
Οι βασικές τροποποιήσεις που επέφερε οι οδηγία ήταν:
Εισαγωγή κοινών πλαισίων εκπαίδευσης
Καθιέρωση Ευρωπαϊκής επαγγελματικής κάρτας
Διαφάνεια των νομοθετικά κατοχυρωμένων επαγγελμάτων
Συνεχής επαγγελματική βελτίωση για τα αυτόματα ρυθμιζόμενα επαγγέλματα
Μερική πρόσβαση σε επαγγέλματα
Δημιουργία μηχανισμού προειδοποίησης για επαγγελματικές αλλαγές
Ανάγκη γλωσσικών δεξιοτήτων για άσκηση επαγγέλματος σε άλλη χώρα
Αναγνώριση της πρακτικής άσκησης των νέων ειδικευομένων
Η σημαντικότερη από τις τροποποιήσεις αφορά την εισαγωγή των κοινών πλαισίων εκπαίδευσης
(common training frameworks) στη θέση των common training platforms που αναφέρονταν στην
οδηγία του 2005. Σκοπός της εισαγωγής των κοινών πλαισίων εκπαίδευσης είναι να προωθεί :
«ένα πιο αυτόματο σύστημα αναγνώρισης των επαγγελματικών προσόντων για τα επαγγέλματα
που επί του παρόντος δεν επωφελούνται από την οδηγία»
Όπως ορίζεται στην οδηγία, τα κοινά πλαίσια εκπαίδευσης θα πρέπει να βασίζονται: «σε ένα κοινό
σύνολο γνώσεων, δεξιοτήτων και ικανοτήτων ή σε κοινές δοκιμασίες εκπαίδευσης. Θα πρέπει
87
επίσης να είναι δυνατό για κοινά πλαίσια εκπαίδευσης να καλύπτουν ειδικότητες που δεν
υπόκεινται επί του παρόντος στις διατάξεις για την αυτόματη αναγνώριση βάσει της οδηγίας
2005/36/ΕΚ και που αφορούν επαγγέλματα που καλύπτονται από το κεφάλαιο III του τίτλου III και
που έχουν σαφώς καθορισμένες ειδικές δραστηριότητες που εκτελούνται αποκλειστικά στο
πλαίσιο αυτών.»
Σύμφωνα με την οδηγία: «Επαγγελματικές οργανώσεις που είναι αντιπροσωπευτικές σε επίπεδο
Ευρωπαϊκής Ένωσης και, σε ορισμένες περιστάσεις, εθνικές επαγγελματικές οργανώσεις ή
αρμόδιες αρχές, θα πρέπει να είναι σε θέση να υποβάλλουν προτάσεις όσον αφορά τις κοινές
αρχές εκπαίδευσης στην Ευρωπαϊκή Επιτροπή»
Για να γίνει αποδεκτή ως κοινό πλαίσιο εκπαίδευσης μια ειδικότητα-επάγγελμα θα πρέπει να
«είναι κοινό τουλάχιστον στα δύο πέμπτα των κρατών μελών» οπότε: «Τα επαγγελματικά
προσόντα που αποκτώνται στο πλαίσιο των κοινών πλαισίων εκπαίδευσης θα πρέπει να
αναγνωρίζονται αυτόματα από τα κράτη μέλη».
Στις παραπάνω τροποποιήσεις, οι οποίες μπορεί να αποδειχθούν πολύ σημαντικές για την
αναγνώριση της ειδικότητας, συνέβαλε καθοριστικά η Επιτροπή Μητρώου της EC4 και ιδιαίτερα ο
Πρόεδρός της Rob Jansen καθώς και η Simone Zerah Πρόεδρος της Επιτροπής επαγγελματικών
υποθέσεων της EFLM.
Με βάση την παραπάνω Οδηγία, οι προϋποθέσεις ώστε να αναγνωριστεί το επάγγελμά μας ως
κοινό πλαίσιο εκπαίδευσης και να ενταχθεί στα αυτομάτως αναγνωριζόμενα επαγγέλματα σε όλη
την Ευρωπαϊκή Ένωση είναι:
1. Να υπάρχει ένα κοινό σύνολο γνώσεων και κοινά αποδεκτές διαδικασίες επαγγελματικής
εκπαίδευσης.
2. Να έχει ένα ενιαίο όνομα σε όλες τις Ευρωπαϊκές χώρες
3. Να προσδιοριστούν 9 ευρωπαϊκά κράτη στα οποία το επάγγελμα, με βάση τα πρότυπα της
EC4, αναγνωρίζεται επίσημα από την πολιτεία
Με απόφαση της EFLM και μετά από ψηφοφορία μεταξύ των κρατών μελών, επιλέχτηκε ως ενιαίο
όνομα του επαγγέλματός μας το : SPECIALIST IN LABORATORY MEDICINE: ΕΙΔΙΚΕΥΜΕΝΟΣ ΣΤΗΝ
ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΤΡΙΚΗ (Zerah S, McMurray J, Horvath AR. EFLM Position Statement Our profession
now has a European name: Specialist in Laboratory Medicine. Biochimia Medica 2012, 22:272-3)
88
Όσον αφορά την 1η προϋπόθεση, είναι φανερό ότι δημιουργία και η λειτουργία του Ευρωπαϊκού
Μητρώου των ειδικευμένων στην Εργαστηριακή Ιατρική της EC4 (European Register of Specialists
in Laboratory Medicine), στηρίζεται σε κοινά αποδεκτά standards πανεπιστημιακής εκπαίδευσης
και επαγγελματικής κατάρτισης που πληρούν τα κριτήρια ενός κοινού πλαισίου εκπαίδευσης. Έτσι
το κοινό πλαίσιο εκπαίδευσης που θα προτείνει η EFLM-EC4 στην Ευρωπαϊκή Επιτροπή είναι:
1. Ακαδημαϊκή εκπαίδευση και επαγγελματική κατάρτιση για τουλάχιστον 10 έτη
2. Πέντε χρόνια ακαδημαϊκής εκπαίδευσης, συμπεριλαμβανομένου ενός μεταπτυχιακού ή
ισότιμου προσόντος σε Ιατρική, Φαρμακευτική, Βιολογία, Βιοχημεία, Χημεία.
3. Πέντε χρόνια εξειδικευμένης κατάρτισης μετά την αποφοίτηση, οι οποία καταλήγει σε
συγκεκριμένο «πιστοποιητικό» εξόδου.
4. Το περιεχόμενο της ειδικευμένης κατάρτισης πρέπει να περιλαμβάνει ένα συγκεκριμένο
πρόγραμμα εκπαίδευσης στους παρακάτω 4 κύριους κλάδους: Γενικής χημείας (κλινική
χημεία- ανοσολογία κλπ), αιματολογίας-αιμοδοσίας, μικροβιολογίας και εξωσωματικής
γονιμοποίησης- γενετικής.
5. Το περιεχόμενο του προγράμματος εκπαίδευσης θα πρέπει να αποτελείται από:
Γενική χημεία τουλάχιστον κατά 35%
Δύο κύριους κλάδους (π.χ. γενική χημεία και αιματολογία) τουλάχιστον κατά 65%
Ευελιξία ως προς το υπόλοιπο 35%, συμπεριλαμβανομένης της γενικής χημείας,
αιματολογίας, μικροβιολογίας και της γενετικής-εξωσωματικής γονιμοποίησης, σε
ποσοστό σύμφωνο με τις απαιτήσεις της χώρας προορισμού
Αυτή τη χρονική περίοδο, η EFLM-EC4 βρίσκεται στη φάση των συνεννοήσεων για τον
προσδιορισμό των 9 Ευρωπαϊκών κρατών στα οποία η ειδικότητα αναγνωρίζεται επίσημα και στη
συγκέντρωση των απαραίτητων ντοκουμέντων για την κατάθεση της πρότασης για κοινό πλαίσιο
εκπαίδευσης με το όνομα Specialist in Laboratory Medicine.
89
"mHEALTH – NEW HORIZONS FOR HEALTH AND LAB MED »
Gouget Bernard, Treasurer IFCC, Asst. Professor
University Hospital , Paris Descartes, Conseiller Santé Publique, Fédération Hospitalière de France,
France
It is not a secret that technology is transforming health care. According to the green paper
on
mobile Health ("mHealth") : « Mobile health (hereafter “mHealth”) covers “medical and public
health practice supported by mobile devices, such as mobile phones, patient monitoring devices,
personal digital assistants (PDAs), and other wireless devices”.It also includes applications
(hereafter "apps") such as lifestyle and wellbeing apps that may connect to medical devices or
sensors (e.g. bracelets or watches) as well as personal guidance systems, health information and
medication reminders provided by sms and telemedicine provided wirelessly. mHealth is an
emerging and rapidly developing field which has the potential to play a part in the transformation
of healthcare and increase its quality and efficiency. mHealth solutions cover various technological
solutions, that among others measure vital signs such as heart rate, blood glucose level, blood
pressure, body temperature and brain activities. Prominent examples of apps are communication,
information and motivation tools, such as medication reminders or tools offering fitness and
dietary recommendations. The expanding spread of smartphones as well as 3G and 4G networks
has boosted the use of mobile apps offering healthcare services. The availability of satellite
navigation technologies in mobile devices provides the possibility to improve the safety and
autonomy of patients. Through sensors and mobile apps, mHealth allows the collection of
considerable medical, physiological, lifestyle, daily activity and environmental data. This could serve
as a basis for evidence-driven care practice and research activities, while facilitating patients' access
to their health information anywhere and at any time. mHealth could also support the delivery of
high-quality healthcare, and enable more accurate diagnosis and treatment. It can support
healthcare professionals in treating patients more efficiently as mobile apps can encourage
adherence to a healthy lifestyle, resulting in more personalised medication and treatment It can
contribute to the empowerment of patients as they could manage their health more actively, living
more independent lives in their own home environment thanks to self- assessment or remote
monitoring solutions and monitoring of environmental factors such as changes in air quality that
might influence medical conditions. »
90
The presentation will allow to illustrate the rapidly evolving landscape of mobile applications and
individualized medicine ad the democratization of medical information through digitalization that
will empower patients to make their own healthcare decisions. Nevertheless, mHealth is not
intended to replace healthcare professionals who remain central to providing healthcare but rather
is considered to be a supportive tool for the management and provision of healthcare.
91
VERIFICATION OF IN VITRO MEDICAL DIAGNOSTICS (IVD) METROLOGICAL
TRACEABILITY: RESPONSIBILITIES AND STRATEGIES IN THE EU CONTEXT
Mauro Panteghini
Centre for Metrological Traceability in Laboratory Medicine (CIRME), University of Milan, Milan,
Italy
To be accurate and equivalent, laboratory results should be traceable to higher-order references.
Furthermore, their analytical quality should fulfil acceptable measurement uncertainty defined to
fit the intended clinical use. With this aim, IVD manufacturers should define a calibration hierarchy
to assign traceable values to their system calibrators and to fulfil during this process uncertainty
limits for calibrators, which should represent a proportion of the uncertainty budget allowed for
clinical laboratory results. It is therefore important that, from one hand, laboratory profession
clearly defines the clinically acceptable uncertainty for relevant tests and, from the other hand,
end-users may know and verify how manufacturers have implemented the traceability of their
calibrators and estimated the corresponding uncertainty, including, if any, the employed goal.
However, full information about traceability and combined uncertainty of calibrators is usually not
available as manufacturers only provide the name of higher-order reference material or procedure
to which the assay calibration is traceable without any description of steps and their corresponding
uncertainty of the implemented traceability chain. In general, it should be possible to establish if
the current status of the measurement uncertainty budget associated with the proposed
traceability chain is suitable or not for clinical application of the test. Important tools for IVD
traceability surveillance are the verification by clinical laboratories of the consistency of declared
performance during daily routine operations performed in accordance with the manufacturer’s
instructions and the organization of appropriately structured External Quality Assessment (EQA)
programs. The former activity should be accomplished by analyzing system control materials and
confirming that current measurements are in the manufacturer’s established control range, with no
clinically significant changes in the assumed unbiased results. With regard to EQA, it is mandatory
that target values for control materials (including their uncertainty) are assigned with reference
procedures by accredited reference laboratories, that materials are commutable and that a
clinically allowable inaccuracy for participant’s results is defined in order to prove the suitability of
laboratory measurements in the clinical setting.
92
P4 Medicine: Predictive, Preventive, Personalized and Participatory. A new trend in
Laboratory Medicine.
Maurizio Ferrari
Vita-Salute San Raffaele University,and Genomic Unit for the Diagnosis of Human Pathologies, San
Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy.
Personalized medicine, which simply means selection of treatment best suited for an individual,
involves integration and translation of several new technologies in clinical care of patients. The
scope is much broader than indicated by the term genomic medicine because many non-genomic
factors are taken into consideration in developing personalized medicine.
The wide and public availability of the human genome sequence and the other tools spawned by
the Human Genome Project have helped to create an unparalleled era of biomedical discovery.
Researchers have discovered hundreds of genes that harbour variations contributing to human
illness, identified genetic variability in patients' responses to dozens of treatments, and begun to
target the molecular causes of some diseases. In addition, scientists are developing and using
diagnostic tests based on genetics or other molecular mechanisms to better predict patients'
responses to targeted therapy. Since the completion of the mapping of the human genome, we
have seen whole new areas of research evolve such as genomics, proteomics, and metabalomics.
Advances in DNA analysis to develop methods, which are increasingly specific, sensitive, fast,
simple, automatable, and cost-effective, are considered paramount. These demands are currently
driving the rapid evolution of a diverse range of newer technologies.
For the future of genomics is demanding the rapid evolution of miniaturization (nanotechnogy) and
high-throughput genotyping technologies (next generation sequencing) toward increased speed
and reduced cost.
Although the potential diagnostic applications are unlimited, most important current applications
are foreseen in the areas of biomarker research, cancer diagnosis and detection of infectious
microorganisms.
There has been an explosion in the number of validated markers but relatively little independent
analysis of the validity of the tests used to identify them in biologic specimens. The success of
93
personalized medicine depends on having accurate diagnostic tests that identify patients who can
benefit from targeted therapies.
Another important step will be expanding efforts to develop tissue banks containing specimens
along with information linking them to clinical outcomes.
In this arena Laboratory Medicine should play a major role.
94
ΠΡΟΦΟΡΙΚΕΣ ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ
Π.Α.01
ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙΝΟΤΟΜΩΝ REAL-TIME QPCR ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΙΔΙΚΗ ΚΑΙ ΠΟΣΟΤΙΚΗ
ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΙΣΟΜΟΡΦΩΝ ΤΟΥ COL11A1 MRNA ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΟΥΣ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΙΣΤΩΝ
ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟΥ
Καραγλάνη Μ.1, Τούμπουλης Ι.2, Γούτας Ν.3, Πουμπουρίδου Ν.1, Βλαχοδημητρόπουλος Δ.3,
Βασίλαρος Σ.4, Ρίζος Ι.5, Κρούπης Χ.1*
1Εργαστήριο
Κλινικής Βιοχημείας, ΑΤΤΙΚΟΝ Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή
Πανεπιστημίου Αθηνών
2Καρδιοχειρουργική Κλινική, ΑΤΤΙΚΟΝ Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή, Αθήνα
3Παθολογοανατομικό εργαστήριο, Ευγενίδειο Θεραπευτήριο, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου
Αθηνών 4Πρόληψις Κλινική καρκίνου του μαστού, Αθήνα
5Καρδιολογική Κλινική, ΑΤΤΙΚΟΝ Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή ΕΚΠΑ, Αθήνα
*e-mail: [email protected]
Εισαγωγή: Έχει αποδειχθεί ότι η έκφραση των κολλαγόνων αλλάζει στις κακοήθειες, ιδίως εκείνη
του κολλαγόνου XI. Αυτό θα μπορούσε να επηρεάσει την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να
εισβάλλουν στο στρώμα και να δημιουργούν μεταστάσεις. Το κολλαγόνο XI αποτελείται από τρεις
άλφα αλυσίδες. Μία από αυτές τις αλυσίδες, η α1 (XI) η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο
COL11A1, μεταγράφεται μέσω εναλλακτικού ματίσματος σε τουλάχιστον τέσσερις διαφορετικές
ισομορφές (Α, Β, C και Ε) που διαφέρουν ως προς την πρωτεόλυση του Ν-τελικού άκρου και
δυνητικά, στον τρόπο που διευθετούν την εξωκυττάρια μήτρα. Οι ισομορφές δεν έχουν
προηγουμένως μελετηθεί στον καρκίνο του μαστού ούτε υπάρχει μέθοδος για την ειδική ποσοτική
ανίχνευσή τους. Σκοπός της μελέτης ήταν αφού αναπτυχθούν οι μεθοδολογίες, να διερευνηθεί η
πιθανή συσχέτιση μεταξύ της διαφορικής έκφρασης των ισομορφών του γονιδίου COL11A1 και
προγνωστικών παραμέτρων στον καρκίνο του μαστού.
Ασθενείς και μέθοδοι: Απομονώθηκε RNA με στήλες από 90 παγωμένους ιστούς ασθενών με
σποραδικό καρκίνο του μαστού υπό παρακολούθηση με γνωστά ιστοπαθολογικά δεδομένα (τύπος
και grade μέσω ιστολογικής έκθεσης, ορμονικοί υποδοχείς με IHC, HER2 ογκογονίδιο με IHC/CISH).
Το RNA αφού μετρήθηκε μετατράπηκε σε cDNA με το Transcriptor kit (Roche) και αναπτύχθηκαν
τα ακόλουθα εργαλεία: α) απλή συμβατική PCR για την γενική ανίχνευση της έκφρασης του
γονιδίου COL11A1 σε κοινή περιοχή όλων των ισομορφών και β) real-time qPCR με διπλούς
ανιχνευτές υβριδισμού στον θερμοκυκλοποιητή LightCycler 1.5 (Roche) για τον ποσοτικό
προσδιορισμό καθεμιάς ξεχωριστά από τις ισομορφές. Στη συνέχεια, αξιολογήθηκε η έκφρασή
τους στους ασθενείς σε σχέση με ιστοπαθολογικά και κλινικά δεδομένα με τη βοήθεια στατιστικού
λογισμικού (SPSS).
Αποτελέσματα: Οι qPCR μεθοδολογίες που αναπτύχθηκαν ήταν ταχείες, γραμμικές, ευαίσθητες
(χαμηλό LOD) καθώς και ειδικές για κάθε ισομορφή. Όλα τα δείγματα ήταν θετικά ως προς το
γενικό COL11A1 μετάγραφο. Η ισομορφή Α ανιχνεύθηκε σε 30 δείγματα και η ισομορφή Ε σε 62.
Οι ισομορφές Β και C δεν ανιχνεύθηκαν καθόλου. Σε 28 δείγματα ανιχνεύθηκαν και οι δύο
ισομορφές Α και Ε ενώ σε 26 δείγματα δεν ανιχνεύθηκε καμία από τις 4 ισομορφές. Μεταξύ των
αντιγράφων της Α και της E ισομορφής υπήρχε μια μικρή αλλά στατιστικά σημαντική θετική
95
γραμμική συσχέτιση (rho = 0,368, p=0,05). Στατιστικά σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μόνο
ανάμεσα στην παρουσία της ισομορφής Ε και τους λεμφαδένες και τη μετάσταση (χ2 τεστ, p=0,037
και p=0,041 αντίστοιχα). Η απουσία και των δύο Α και Ε ισομορφών επίσης συσχετίζεται με
απουσία μετάστασης (p=0,043). Στην ανάλυση επιβίωσης πάλι η ισομορφή Ε έδειξε τάση
συσχέτισης (p=0,060).
Συμπεράσματα: Η μελέτη αυτή ήταν η πρώτη στην οποία μελετήθηκε η διαφορική έκφραση των
ισομορφών του γονιδίου COL11A1 στον καρκίνο του μαστού: δεν παρατηρήθηκε καμία στατιστικά
σημαντική συσχέτιση με τους κλασσικούς προγνωστικούς παράγοντες ωστόσο τουλάχιστον η
ισομορφή Ε έδειξε ότι αποτελεί υποσχόμενο βιοδείκτη για θετικούς λεμφαδένες και
απομακρυσμένες μεταστάσεις. Το γεγονός ότι σε 26 δείγματα δεν ανιχνεύθηκε καμία ισομορφή παρά την παρουσία του γενικού μεταγράφου- αξίζει να διερευνηθεί περαιτέρω στο μέλλον.
96
Π.Α.02
mRNA ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ PALB2 ΚΑΙ ΕΠΙΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΟΥ ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΤΟΝ ΣΠΟΡΑΔΙΚΟ
ΚΑΡΚΙΝΟ ΜΑΣΤΟΥ
Πουμπουρίδου N.1, Acha-Sagredo A.2, Γούτας N.3, Βλαχοδημητρόπουλος Δ.3, Λιανίδου E.4,
Βασίλαρος Σ.5, Λιλόγλου T.2, Κρούπης Χ.1
1Εργαστήριο
Κλινικής Βιοχημείας, Αττικόν Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο
Αθηνών, Ιατρική Σχολή, Ελλάδα
2Τμήμα Μοριακής και Κλινικής Ιατρικής του καρκίνου, Πανεπιστήμιο του Liverpool, Αγγλία
3Παθολογοανατομικό εργαστήριο, Ευγενίδειο Θεραπευτήριο, Πανεπιστήμιο Αθηνών, Ιατρική
Σχολή, Ελλάδα
4Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Αθηνών, Ελλάδα
5 Πρόληψις Κλινική καρκίνου του μαστού, Αθήνα, Ελλάδα
Εισαγωγή: Πρόσφατες μελέτες συμπεριλαμβάνουν το γονίδιο PALB2 (Partner and localizer of
BRCA2) στην συνεχώς αυξανόμενη λίστα των γονιδίων κληρονομούμενου καρκίνου του μαστού. Οι
μεταλλάξεις του προσδίδουν έναν σοβαρό κίνδυνο καρκίνου του μαστού στους ετεροζυγώτες και
αναιμία Fanconi στους φορείς διαλληλικών μεταλλάξεων (αλλιώς ονομάζεται και FANCN). Η
πρωτεΐνη PALB2 αποτελεί τον συνδετικό κρίκο των BRCA2 και BRCA1 που εντοπίζονται στον
πυρήνα και συμμετέχει στην επιδιόρθωση των σπασιμάτων της διπλής έλικας του DNA μέσω
ομόλογου ανασυνδυασμού. Η σημαντική του συνεισφορά θα μπορούσε να περιοριστεί αρκετά εάν
επηρεαζόταν από επιγενετικούς μηχανισμούς όπως την μεθυλίωση των CpG νησίδων του
υποκινητή.
Ασθενείς και μέθοδοι: Απομονώθηκε DNA και RNA με στήλες από 96 παγωμένους ιστούς
καρκίνου του μαστού: από 92 ασθενείς με σποραδικό καρκίνο του μαστού υπό παρακολούθηση με
γνωστά ιστοπαθολογικά δεδομένα (τύπος και grade μέσω ιστολογικής έκθεσης, ορμονικοί
υποδοχείς με IHC, HER2 ογκογονίδιο με IHC/CISH) καθώς και από 4 δείγματα ελέγχου με καλοήθεις
όγκους. Το RNA μετατράπηκε σε cDNA με το Transcriptor cDNA Synthesis Kit (Roche) και
αναλύθηκε ποσοτικά με την καινούρια μέθοδο real-time PCR που αναπτύχθηκε, με τη χρήση
ανιχνευτών Taqman στο Light Cycler. Το DNA υποβλήθηκε στην αντίδραση της μετατροπής με
όξινο θειώδες νάτριο (Zymo). Αναλύθηκε με τη μέθοδο pyrosequencing στο μηχάνημα Q96
Pyromark (Qiagen) με τη χρήση κατάλληλων εκκινητών για την PCR αντίδραση που σχεδιάστηκαν
in silico στο λογισμικό PyroMark Assay Design. Οι εκκινητές καλύπτουν μια περιοχή μεταξύ nt-174
και -288 (σε σχέση με το κωδικόνιο έναρξης ATG) η οποία περιέχει 11 CpG δινουκλεοτίδια σε μια
CpG νησίδα 1402 bp (με βάση το λογισμικό CpG Island Searcher). Ανά δινουκλεοτίδιο, μετρείται το
ποσοστό μεθυλίωσης και το αποτέλεσμα λαμβάνεται ως μέσος όρος της μεθυλίωσης των 11 CpGs.
Τα ληφθέντα αποτελέσματα επεξεργάστηκαν στατιστικώς με χρήση του ΙΒΜ SPSS vs21.
Αποτελέσματα: Όλα τα δείγματα βρέθηκαν αρνητικά στην ανάλυση μεθυλίωσης του PALB2
υποκινητή. Όλα εκτός από τέσσερα δείγματα ήταν θετικά στην έκφραση του mRNA του PALB2. O
μέσος όρος των αντιγράφων ήταν 7,23×104 copies/μg ολικού RNA, ενώ η μέση τιμή ήταν 1,34×104
copies/μg (εύρος 3,51×10 to 1,23×106 copies/μg). Τα αποτελέσματα των μεταγράφων PALB2
συγκρίθηκαν με τα ιστοπαθολογικά δεδομένα αλλά δεν βρέθηκε καμία στατιστικά σημαντική
συσχέτιση.
97
Συμπεράσματα: Στη μελέτη αυτή, όλα τα δείγματα βρέθηκαν αρνητικά στην μεθυλίωση DNA του
PALB2 υποκινητή -σε αντίθεση με προηγούμενη μελέτη- έτσι η μεθυλίωση του DNA δεν είναι ένας
μηχανισμός στον οποίο οφείλεται η αποσιώπηση της έκφρασής του. Το γεγονός ότι το γονίδιο
PALB2 δεν εμφάνισε έκφραση σε τέσσερα δείγματα αξίζει περισσότερης διερεύνησης στο μέλλον.
Μέχρι στιγμής η PALB2 έκφραση δεν φαίνεται να είναι ένας υποσχόμενος προγνωστικός και
προβλεπτικός βιοδείκτης στον σποραδικό καρκίνο του μαστού.
98
Π.Α. 03
ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΕΤΡΑΠΛΗΣ ΠΟΣΟΤΙΚΗΣ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (RT-QPCR) ΓΙΑ ΤΗ
ΜΕΛΕΤΗ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ER, PR, HER-2 ΚΑΙ EGFR ΣΕ ΚΥΚΛΟΦΟΡΟΥΝΤΑ ΚΑΡΚΙΝΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ
(CTCS) ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΚΑΡΚΙΝΟ ΜΑΣΤΟΥ
Aρετή Στρατή1, Νίκος Mαλάμος2, Βασίλης Γεωργούλιας3 και Eύη Λιανίδου1
1
Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Αθηνών, 15771, Αθήνα.
Μονάδα Ιατρική Ογκολογίας, Νοσοκομείο Έλενα Βενιζέλου, Αθήνα.
3
Τμήμα Ιατρικής Ογκολογίας, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Ηρακλείου, Ιατρική σχολή Πανεπιστημίου
Κρήτης, 71110, Ηράκλειο
2
Εισαγωγή: Κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών η προσέγγιση της «υγρής βιοψίας» για την
θεραπευτική αντιμετώπιση ασθενών με καρκίνο αποκτά εξαιρετικό ενδιαφέρον. Έχει δειχθεί σε
πολλές μελέτες ότι η ανίχνευση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (CTCs) στο περιφερικό
αίμα ασθενών με συμπαγείς όγκους, αποτελεί ένα ισχυρό δείκτη πρόγνωσης. Ο μοριακός
χαρακτηρισμός των κυττάρων αυτών πέρα από την απλή ανίχνευση και καταμέτρησή τους, είναι
πολύ σημαντικός για την ταυτοποίηση θεραπευτικών στόχων στα κύτταρα αυτά και για την
πρώιμη ανίχνευση στην αντοχή σε στοχευμένες θεραπείες. Ειδικά στον καρκίνο του μαστού η
παρουσία των υποδοχέων οιστρογόνων (ER), και προγεστερόνης (PR) καθώς και του υποδοχέα 2
του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (HER-2), αποτελεί σημαντικό κριτήριο για την επιλογή της
κατάλληλης θεραπείας
Σκοπός: Η ανάπτυξη τετραπλής ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-qPCR) για τη
μελέτη έκφρασης των ER, PR, HER-2 και EGFR σε CTCs ασθενών με καρκίνο μαστού.
Υλικά και μέθοδοι: Έπειτα από εκτεταμένη in-silico μελέτη για τον σχεδιασμό των εκκινητών και
ειδικών ζευγών ανιχνευτών αναπτύχθηκε μεθοδολογία τετραπλής ποσοτικής RT-qPCR για τον
ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό των ER, PR, HER-2 και EGFR στα CTCs. Η μέθοδος
χαρακτηρίζεται από εξαιρετική αναλυτική ευαισθησία και αναλυτική ειδικότητα και εφαρμόσθηκε
σε 91 ασθενείς με πρώιμο καρκίνο μαστού και 16 υγιείς εθελοντές. Η μέθοδος βασίζεται στην
ανίχνευση ειδικών ανιχνευτών υβριδισμού, και αναπτύχθηκε στην IVD πλατφόρμα LightCycler 2.0
(Roche, Diagnostics).
Αποτελέσματα: Η μεθοδολογία αυτή μπορεί να ανιχνεύει ειδικά μέχρι και 10 αντίγραφα/ μL
αντίδρασης για κάθε ένα από τα διαφορετικά μετάγραφα των ER, PR, HER-2 και EGFR. Στους 91
ασθενείς με χειρουργήσιμο καρκίνο μαστού, το κλάσμα των CTC βρέθηκε θετικό για το mRNA του
ER σε 4/91 (4,4%) ασθενείς, του PR σε 1/91 (1,1%) ασθενείς, του HER-2 σε 16/91 (17,6%) ασθενείς
και του EGFR σε 0/91 (0%) ασθενείς. Με βάση την παθολογο-ανατομική εξέταση του
πρωτοπαθούς όγκου 53/91 (61%) όγκοι ήταν θετικοί στο ER, 44/91 (50,6%) θετικοί στο PR και
29/91 (33,7%) θετικοί στο HER-2. Το ποσοστό συμφωνίας μεταξύ του πρωτοπαθούς όγκου και των
CTC για τους υποδοχείς ήταν: α) ER: 36/91 (41,4%), β) PR : 42/91 (48,3%) και γ) HER-2: 49/91
(56,3%). Οι ασθενείς με τριπλά αρνητικό καρκίνο μαστού (ER, PR, HER-2) ήταν 21/91 (24,4%), ενώ
αντίστοιχα στα CTC το ποσοστό ήταν σημαντικά μεγαλύτερο 68/91 (79,1%).
Συμπεράσματα: Η μελέτη μας έδειξε μια αξιοσημείωτη ετερογένεια στην έκφραση του mRNA των
ER, PR, και HER-2 υποδοχέων στα CTC σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού. Τα περισσότερα CTC
βρέθηκαν να είναι ER / PR-αρνητικά, παρά την παρουσία ενός ER / PR-θετικού πρωτοπαθούς
όγκου. Η ορμονοθεραπεία μπορεί να μην είναι αποτελεσματική σε ασθενείς με καρκίνο μαστού
δεδομένου ότι ο φαινότυπος έχει αλλάξει κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της νόσου.
99
Π.Α. 04
ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ PIK3CA ΣΤΑ ΚΥΚΛΟΦΟΡΟΥΝΤΑ ΚΑΡΚΙΝΙΚΑ
ΚΥΤΤΑΡΑ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΚΑΡΚΙΝΟ ΜΑΣΤΟΥ.
Αθηνά Μάρκου1, Σοφία Φάρκωνα1, Χριστίνα Σχίζα1, Αντωνία Ευσταθίου1, Σοφία Κουνέλλη2, Νίκος
Μαλάμος2, Βασίλης Γεωργούλιας3 και Εύη Λιανίδου1
1Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Αθηνών, 15771, Αθήνα.
2 Μονάδα Ιατρική Ογκολογίας, Νοσοκομείο Έλενα Βενιζέλου, Αθήνα.
3Τμήμα
Ιατρικής Ογκολογίας, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Ηρακλείου, Ιατρική σχολή
Πανεπιστημίου Κρήτης, 71110, Ηράκλειο
Εισαγωγή: Ο μοριακός χαρακτηρισμός των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (CTC) πέρα από
την απλή ανίχνευση και καταμέτρησή τους, είναι πολύ σημαντικός για την ταυτοποίηση
θεραπευτικών στόχων στα κύτταρα αυτά και για την πρώιμη ανίχνευση στην αντοχή σε
στοχευμένες θεραπείες. Η παρουσία σωματικών μεταλλάξεων στο γονίδιο PIK3CA στον
πρωτοπαθή όγκο διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανταπόκριση της θεραπείας σε Trastuzumab
(Herceptin).
Σκοπός: Στην παρούσα εργασία αναπτύξαμε και επικυρώσαμε μία νέα υπερευαίσθητη μεθοδο για
την ανίχνευση των μεταλλάξεων του γονιδίου PIK3CA που βασίζεται σε ένα συνδυασμό
αλληλοειδικής, ασύμμετρης rapid PCR και ανάλυσης καμπυλών τήξεως. Με βάση την μέθοδο αυτή
διερευνήσαμε την παρουσία των PIK3CA μεταλλάξεων στα CTC καθώς και την συσχέτισή τους με
την κλινική έκβαση των ασθενών με καρκίνο του μαστού.
Ασθενείς και Μέθοδοι: Με βάση την αναπτυχθείσα εξαιρετικά ευαίσθητη μέθοδο μελετήθηκαν οι
hotspot PIK3CA μεταλλάξεις σε: α) μια δοκιμαστική ομάδα που αποτελείται από το EpCAM θετικό
κλάσμα των CTC 37 ασθενών με κλινικά επιβεβαιωμένη μετάσταση, 26 υγιών αιμοδοτών και 15
πρωτοπαθών όγκων καθώς και σε β) μια ανεξάρτητη ομάδα που αποτελείται από το EpCAM
θετικό κλάσμα των CTC 57 ασθενών με επιβεβαιωμένη μετάσταση, 118 ασθενών με πρώιμο
καρκίνο του μαστού και 76 αντίστοιχα πρωτοπαθών όγκων.
Αποτελέσματα: Με βάση την αναπτυχθείσα μεθοδολογία μπορεί να ανιχνευθεί 0,05% του
μεταλλαγμένου dsDNA παρουσία του 99,95% wtDNA για τα δύο εξόνια (9 και 20) ενώ παράλληλα
χαρακτηρίζεται από υψηλή εξειδίκευση (0/26 υγιείς δότες). PIK3CA μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν στο
EpCAM θετικό κλάσμα: σε 20/57 (35,1%) ασθενείς με επιβεβαιωμένη μετάσταση, σε 23/118
(19,5%) ασθενείς με πρώιμο καρκίνο του μαστού, και σε 45/76 (59,2%) πρωτοπαθείς ιστούς.
Επιπλέον προέκυψε ότι οι PIK3CA μεταλλάξεις στα CTC μπορεί να εμφανιστούν κατά τη διάρκεια
της εξέλιξης της νόσου ενώ σχετίζονται με χειρότερη πρόγνωση στους ασθενείς με επιβεβαιωμένη
μετάσταση (P = 0,047).
Συμπεράσματα: Οι hotspot μεταλλάξεις της PIK3CA ανιχνεύθηκαν σε υψηλό ποσοστό στα CTC και
η παρουσία τους σχετίζεται με χειρότερη πρόγνωση στους ασθενείς με επιβεβαιωμένη μετάσταση.
Τέλος η ανίχνευση των μεταλλάξεων αυτών στα CTC μπορεί μελλοντικά να αποτελέσει μια πιθανή
κλινική εφαρμογή.
Η συγκεκριμένη εργασία έγινε δεκτή για δημοσίευση στο Clinical Cancer Research.
100
Π.Α. 05
ΜΕΛΕΤΗ ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ MIRNAS ΣΕ CTC, CELL FREE DNA ΚΑΙ
ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΟΥΣ ΠΡΩΤΟΠΑΘΕΙΣ ΟΓΚΟΥΣ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΜΕΤΑΣΤΑΤΙΚΟ ΚΑΡΚΙΝΟ ΜΑΣΤΟΥ
Αθηνά Μάρκου1a, Μάρθα Ζαβρίδου1a, Ιωάννα Σουρβίνου1b, Νίκος Μαλάμος2, Βασίλης
Γεωργούλιας3 και Εύη Λιανίδου 1
1Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Αθηνών, 15771, Αθήνα.
2 Μονάδα Ιατρική Ογκολογίας, Νοσοκομείο Έλενα Βενιζέλου, Αθήνα.
3Τμήμα
Ιατρικής Ογκολογίας, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Ηρακλείου, Ιατρική σχολή
Πανεπιστημίου Κρήτης, 71110, Ηράκλειο
A:
ίση συνεισφορά
Εισαγωγή: Κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών η προσέγγιση της «υγρής βιοψίας» για την
θεραπευτική αντιμετώπιση ασθενών με καρκίνο αποκτά εξαιρετικό ενδιαφέρον. Εχει δειχθεί σε
πολλές μελέτες ότι η ανίχνευση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (CTCs) στο περιφερικό
αίμα ασθενών με συμπαγείς όγκους, αποτελεί ένα ισχυρό δείκτη πρόγνωσης και ειδικά για τον
μεταστατικό καρκίνο του μαστού (MBC) έχει εγκριθεί ως εξέταση από το FDA. Η ομάδα μας έχει
ήδη δείξει ότι η ανίχνευση της έκφρασης της κυτοκερατίνης-19 (CK-19) σε ασθενείς με καρκίνο του
μαστού σχετίζεται με κακή κλινική έκβαση.
Σκοπός: Διερεύνηση των επιπέδων έκφρασης 5 miRNAs που σχετίζονται με την μετάσταση στο
EpCAM-θετικό κλάσμα των CTC και τα αντίστοιχα δείγματα πλάσματος των ασθενών με
μεταστατικό καρκίνο του μαστού και αξιολόγηση της κλινικής σημασίας τους.
Υλικά και Μέθοδοι: Εξετάσαμε την έκφραση των miR-21, miR-31a, miR-146, miR-200c και miR-210
στο EpCAM-θετικό κλάσμα των CTC και στα αντίστοιχα δείγματα πλάσματος από 66 ασθενείς με
καρκίνο του μαστού με επιβεβαιωμένη μετάσταση και σε 19 υγιείς αιμοδότες. Η έκφραση της CK19 mRNA αξιολογήθηκε επίσης στο EpCAM θετικό κλάσμα CTC όλων των δειγμάτων με RT-qPCR.
Χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση των CTC 20mL περιφερικό αίμα, στην συνέχεια
απομονώθηκε το RNA από το EpCAM θετικό κλάσμα των CTC, ενώ τα κυκλοφορούντα miRNAs
απομονώθηκαν από 200μL των αντίστοιχων δειγμάτων πλάσματος. Η μελέτη της έκφρασης των
miRNAs πραγματοποιήθηκε τόσο στο EpCAM-θετικό κλάσμα όσο και στο αντίστοιχο πλάσμα με RTqPCR στο LightCycler 2.0 (Roche, Germany).
Αποτελέσματα: Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, η έκφραση όλων των miRNAs διέφερε
σημαντικά στο EpCAM-θετικό κλάσμα των CTC των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο του μαστού
σε σχέση με τους υγιείς δότες. Επιπλέον διαπιστώθηκε, ότι στους ασθενείς όπου εκφράζεται η CK19 και υποεκφράζονται τα miR-31 ή miR-146 ή miR-200C παρατηρήθηκε μικρότερη διάρκεια
επιβίωσης (Ρ = 0,020, Ρ = 0.004 και Ρ = 0.044, αντίστοιχα). Επιπλέον, οι ασθενείς που έχουν χαμηλή
έκφραση του miR-146 είχαν μικρότερο ελεύθερου νόσου διάστημα από εκείνους που είχαν
υψηλά επίπεδα έκφρασης (P = 0,042).
Συμπεράσματα: Αυτή είναι η πρώτη μελέτη όπου αξιολογήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης
συγκεκριμένων miRNAs στο θετικό EpCAM κλάσμα των CTC και στα αντίστοιχα δείγματα
πλάσματος των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο του μαστού. Τα αποτελέσματά μας χρειάζονται
περαιτέρω επαλήθευση σε μεγαλύτερη ομάδα της δειγμάτων.
101
Π.Α. 06
ΜΕΛΕΤΗ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗΣ ΥΠΟΚΙΝΗΤΗ ΤΟΥ ΟΓΚΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ SOX17 ΣΕ CTC, CELL
FREE DNA ΚΑΙ ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΟΥΣ ΠΡΩΤΟΠΑΘΕΙΣ ΟΓΚΟΥΣ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟΥ
Μαρία Χειμωνίδου 1, Αρετή Στρατή 1, Νίκος Μαλάμος 2, Βασίλης Γεωργούλιας 3, Εύη Λιανίδου 1
1Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Αθηνών, 15771, Αθήνα.
2 Μονάδα Ιατρική Ογκολογίας, Νοσοκομείο Έλενα Βενιζέλου, Αθήνα.
3Τμήμα
Ιατρικής Ογκολογίας, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Ηρακλείου, Ιατρική σχολή
Πανεπιστημίου Κρήτης, 71110, Ηράκλειο
Εισαγωγή:Η ετερογενής μορφολογία του όγκου αποτελεί ένα από τα μείζονα προβλήματα που
περιορίζουν την αποτελεσματικότητα της στοχευμένης θεραπείας. Επί τη βάσει των τεχνολογικών
εξελίξεων, η υγρή βιοψία, συμπεριλαμβανομένου των CTCs και του cfDNA, θεωρείται το νέο
διαγνωστικό εργαλείο, ειδικά για τους ασθενείς με καρκίνο σε προχωρημένο στάδιο, επιτρέποντας
στο θεράποντα ιατρό να παρακολουθεί ανά τακτά χρονικά διαστήματα τις μεταβολές κατά την
εξέλιξη της νόσου. Συνδυάζοντας τις αναλύσεις του cfDNA και των CTCs παρέχονται πληροφορίες
για τη μοριακή σταδιοποίηση των όγκων και την παρακολούθηση της εξέλιξης του όγκου.
Σκοπός:Ο πρωταρχικός στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσουμε σε ποιο βαθμό το
DNA που απομονώθηκε από CTCs και το cfDNA που απομονώθηκε από το πλάσμα των ιδίων
ασθενών κατά την ίδια αιμοληψία, αντιπροσωπεύουν τον αντίστοιχο πρωτοπαθή όγκο φέροντας
παρόμοιο προφίλ μεθυλίωσης. Παράλληλα διερευνήθηκε η κλινική αξιολόγηση του δείκτη
μεθυλίωσης SOX17 στα τρία αυτά βιολογικά δείγματα σε ασθενείς με χειρουργήσιμο και
μεταστατικό καρκίνο του μαστού.
Υλικά και Μέθοδοι: Στο πρώτο στάδιο της μελέτης αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε η μέθοδος
ανίχνευσης της μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου SOX17 με Real Time Methylation Specific
PCR (real time MSP). Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε περιφερικό αίμα (20 ml σε EDTA) από τον
κάθε ασθενή και μελετήθηκε η μεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου SOX17 σε: α) 153 δείγματα
CTC, β) στα αντίστοιχα 153 δείγματα cfDNA, γ) σε 75 δείγματα ιστών από τους ίδιους ασθενείς
μονιμοποιημένων και εγκλεισμένων σε παραφίνη (FFPEs). . Όλα τα δείγματα ελέγχθηκαν ως προς
την έκφραση της CK-19 με RT-qPCR στην IVD πλατφόρμα LightCycler 2.0 (Roche, Diagnostics).
Αποτελέσματα:Σε ασθενείς με χειρουργήσιμο καρκίνο του μαστού βρέθηκε στατιστικά σημαντική
συσχέτιση ανάμεσα στην μεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου SOX17 στο cfDNA και στο
αντίστοιχο κλάσμα των CTC (P=0,001) και παράλληλα βρέθηκε υψηλή συσχέτιση με CK-19 mRNA
έκφραση (Ρ = 0,006). Δεν προέκυψε καμία συσχέτιση ως προς την μεθυλίωση του υποκινητή του
γονιδίου SOX17 μεταξύ FFPEs-CTC και FFPES-cfDNA. Σε ασθενείς με διαγνωσμένη μετάσταση
παρατηρήθηκε άμεση σχέση μεταξύ μεθυλίωσης του υποκινητή SOX17 στα CTC και cfDNA (P =
0,046), ενώ η μεθυλίωση του εν λόγω γονιδίου σε cfDNA συσχετίστηκε με την έκφραση της CK-19
mRNA (P = 0.04).
Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η μεθυλίωση του υποκινητή του
γονιδίου SOX17 σε cfDNA, σχετίζεται με δυσμενή πρόγνωση σε ασθενείς με διαγνωσμένη
μετάσταση (Ρ = 0,016), ενώ μεθυλίωση του γονιδίου σε CTC σχετίζεται με δυσμενή πρόγνωση σε
ασθενείς με χειρουργήσιμο καρκίνο του μαστού (Ρ = 0,044).
102
Π.Α. 07
ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΚΥΚΛΟΦΟΡΟΥΝΤΩΝ MIR-155 ΚΑΙ MIR-146A ΜΕ ΑΝΔΡΙΚΗ ΥΠΟΓΟΝΙΜΟΤΗΤΑ ΚΑΙ
ΠΑΧΥΣΑΡΚΙΑ
Ειρήνη Δερμιτζάκη1, Johannes Bobjer2,3, Μαριάννα Κατρινάκη2, Hamideh Rastkhani4, Κωνσταντίνα
Λυρώνη1, Ανδρέας Ν. Μαργιωρής1, Yvonne Lundberg Giwercman4, Aleksander Giwercman2,3 και
Χρήστος Τσατσάνης1
1Εργ. Κλινικής Χημείας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Κρήτης, Ηράκλειο, Κρήτη, Ελλάδα; 2Molecular
Reproductive Research Group, Dept. of Clinical Sciences Malmö, Lund University, Malmö, Sweden;
3Reproductive Medicine Centre, Skåne University Hospital Malmö, Malmö, Sweden; 4Molecular
Genetic Reproductive Medicine, Dept. of Clinical Sciences Malmö, Lund University, Malmö, Sweden
Εισαγωγή: Τα micro RNAs (miRNAs) είναι μη-κωδικά κομμάτια RNA μικρού μεγέθους, που
ρυθμίζουν την έκφραση και τη σταθερότητα του mRNA. Η μέτρηση των miRNAs είναι πλέον εφικτή
στον ορό του αίματος. Έπειτα από την ανακάλυψη αυτή, πολλές μελέτες έχουν συσχετίσει τα
επίπεδα των miRNAs στον ορό με την εμφάνιση διαφόρων ασθενειών συμπεριλαμβανομένων των
φλεγμονωδών νόσων και γίνεται μια μεγάλη προσπάθεια να χρησιμοποιηθούν τα διάφορα
miRNAs ως βιοδείκτες. Ανάμεσα στα miRNAs που έχουν ανακαλυφθεί, το miR-155 και το miR-146a
φαίνεται να είναι ρυθμιστές της φλεγμονώδους διαδικασίας. Τα ενεργοποιημένα μακροφάγα
έχουν αυξημένα επίπεδα του miR-155 και του miR-146a. Μελέτες στην ανδρική υπογονιμότητα
δείχνουν ότι η εμφάνισή της συνδέεται με ανεπάρκεια ανδρογόνων, αλλά και με εμφάνιση
παχυσαρκίας και χρόνιας χαμηλού βαθμού φλεγμονής ( Low Grade Systemic Inflammation-LGSI).
Σκοπός: Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να προσδιορίσουμε την πιθανή συσχέτιση των
επιπέδων των miR-155 και miR-146a στον ορό με χρόνια χαμηλού βαθμού φλεγμονής,
υπογοναδισμό και γονιμότητα σε ανθρώπους.
Υλικά και μέθοδοι: Για τον σκοπό αυτό, επιλέχθηκαν τυχαία 60 άτομα από μία μελέτη που
βρίσκεται σε εξέλιξη και αφορά άνδρες με υπογονιμότητα (υπογοναδισμός; n=20, ευγοναδισμός;
n=20 και ομάδα αναφοράς n=19). Τα επίπεδα των κυκλοφορούντων miRNAs, τα επίπεδα των
ορμονών αναπαραγωγής και τα επίπεδα των φλεγμονωδών κυττοκινών μετρήθηκαν στον ορό των
ασθενών.
Αποτελέσματα: Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα του miR-155 στον ορό του αίματος
συσχετίσθηκαν με τα επίπεδα του miR-146a των ασθενών. Επίσης, τα επίπεδα των φλεγμονωδών
δεικτών συσχετίσθηκαν με τα επίπεδα του miR-146a αλλά όχι με τα επίπεδα του miR-155. Τα
επίπεδα του miR-155 βρέθηκε να σχετίζονται με την εμφάνιση της υπογονιμότητας (p=0.001). Η
ανάλυση ROC έδειξε ότι τα επίπεδα του miR-155 με χαμηλότερη τιμή 1.77 είχαν ευαισθησία κατά
60% και ειδικότητα κατά 95% για τον εντοπισμό της υπογονιμότητας. Επίσης, τα επίπεδα του miR155 είχαν θετική και αρνητική προγνωστική αξία κατά ποσοστό 96% και 56%, αντίστοιχα. Όταν
χρησιμοποιήθηκαν σε συνδυασμό με τα επίπεδα της ορμόνης FSH, η ειδικότητα και η ευαισθησία
της μεθόδου ήταν 82% και 84%, αντίστοιχα, ενώ οι θετική και αρνητική προγνωστική αξία ήταν
91% και 70%, αντίστοιχα. Καμία συσχέτιση δεν παρατηρήθηκε ανάμεσα στα επίπεδα των miRNAs
και του δείκτη μάζας σώματος (body mass index- BMI), των επιπέδων της χοληστερόλης, της HDLχοληστερόλης ή της LDL-χοληστερόλης. Συμπέρασμα: Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα
κυκλοφορούντα επίπεδα των miRNAs στον ορό μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πιθανοί
βιοδείκτες της υπογονιμότητας.
Χρηματοδότηση: ‘‘Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση’’, πρόγραμμα THALIS-FAT-VESSEL (No 379527)
103
Π.Α. 08
ΕΠΙΔΡΑΣΗ Zn ΣΤΟ ΛΙΠΙΔΑΙΜΙΚΟ ΠΡΟΦΙΛ ΤΟΥ ΗΠΑΤΟΣ ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΩΝ ΠΟΝΤΙΚΩΝ ΠΟΥ
ΕΚΦΡΑΖΟΥΝ ΤΗΝ Ηsp70 ΠΡΩΤΕΙΝΗ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ 1H-NMR
Λέκκας Π(1), Κωσταρά Χ(2), Μπαϊρακτάρη Ε(2), Δεληγιάννης Ι(1), Ζερικιώτης Σ(1), Τζάλλας Χ (2),
Αγγελίδης Χ(3), Βεζυράκη Π(1), Καλφακάκου Β(1)
(1) Εργαστήριο Φυσιολογίας, (2)Εργαστήριο Κλινικής Χημείας και (3)Εργαστήριο Βιολογίας, Ιατρική
Σχολή, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, 451 10, Ιωάννινα, Ελλάδα
Εισαγωγή: Καταστάσεις stress προκαλούν επαγωγή της πρωτεΐνης Hsp70 που αλληλεπιδρά με τον
Zn στη ρύθμιση της ομοιόστασής του αλλά και στον μεταβολισμό των λιπιδίων.
Σκοπός: Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της επίδρασης του Zn στις επαγόμενες
λόγω δίαιτας, αλλαγές του λιπιδαιμικού προφίλ του ήπατος των διαγονιδιακών ποντικών που
εκφράζουν την πρωτεΐνη Hsp70 με φασματοσκοπία 1H NMR.
Υλικά και Μέθοδοι: Τριάντα διαγονιδιακά ποντίκια στελέχους CBA-C57BL/6J που εκφράζουν την
Hsp70 πρωτεΐνη, χωρίστηκαν σε 3 ομάδες δίαιτας με υψηλά λιπαρά (High Fat Diet-HFD): 10
ποντίκια HFD3, 8 ποντίκια HFD30 και 12 ποντίκια HFD300 (διατροφή εμπλουτισμένη σε Zn3, 30 και
300mgZn/kg, αντίστοιχα και 55% θερμίδες από λιπαρά συστατικά Mucedola Co). Τα συστατικά των
λιπιδίων του ήπατος εκχυλίστηκαν με την τροποποιημένη μέθοδο Blight και Dryer. Η καταγραφή
του λιπιδαιμικού προφίλ του ήπατος έγινε με λήψη φασμάτων 1Η NMR σε φασματογράφο Bruker
DRX-500. Για την διάκριση των υπό μελέτη ομάδων διαγονιδιακών ποντικών δημιουργήθηκαν
στατιστικά μοντέλα με εφαρμογή τεχνικών αναγνώρισης προτύπων.
Αποτελέσματα: Η λεπτομερής ανάλυση του λιπιδαιμικού προφίλ του ήπατος έδειξε ότι τα
ποντίκια που έλαβαν διατροφή εμπλουτισμένη με Zn 3mg/kg και 300mg/kg παρουσίασαν
διαφορετικό και περισσότερο αθηρογόνο προφίλ σε σχέση με την ομάδα ελέγχου HFD30, η οποία
είναι εμπλουτισμένη με την άριστη διατροφικά συγκέντρωση Zn 30mg/kg. Τα λιπιδαιμικά
συστατικά του ήπατος που κυρίως διαφοροποίησαν την HFD3 από την HFD30 ομάδα ήταν τα
υψηλότερα επίπεδα κορεσμένων λιπαρών οξέων και ο χαμηλότερος βαθμός ακορεστότητας, η
φωσφατιδυλοχολίνη, τα ακόρεστα και διαλλυλικά λιπαρά οξέα. Τα HFD300 ποντίκια
χαρακτηρίστηκαν από ηπατικό προφίλ πλούσιο σε αθηρογόνα συστατικά κυρίως υψηλότερα
επίπεδα κορεσμένων λιπαρών οξέων και χαμηλότερα επίπεδα βαθμού ακορεστότητας σε σχέση με
την ομάδα ελέγχου.
Συμπεράσματα: Η ανάλυση του λιπιδαιμικού προφίλ του ήπατος με φασματοσκοπία 1Η NMR
έδειξε ότι η ανεπάρκεια (3mg/kg) ή τα ενδεχόμενα τοξικά επίπεδα (300mg/kg) Zn μειορυθμίζουν
την έκφραση του γονιδίου της Hsp70 επάγοντας αθηρογόνες αλλαγές στο λιπιδαιμικό προφίλ του
ήπατος των διαγονιδιακών ποντικών.
104
Π.Α.09
ΜΕΛΕΤΗ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΜΕΤΑΜΟΣΧΕΥΣΗ ΜΥΕΛΟΥ ΤΩΝ ΟΣΤΩΝ ΠΟΥ ΛΑΜΒΑΝΟΥΝ
ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΗ ΑΓΩΓΗ ΚΑΙ ΠΑΡΟΥΣΙΑΖΟΥΝ ΛΟΙΜΩΞΗ ΑΠΟ CLOSTRIDIUM DIFFICILE.
Α. Γρηγοράτου1, Ε. Μπελεσιώτου2, Α. Μελπίδου 1, Μπάρκα Χ2, Ε. Περιβολιώτη2, Μ. Πρατικάκη1, Χ.
Πάντζιου1, Μ. Νέπκα2, Ζ. Ψαρουδάκη2, Σ. Ιωαννίδου1.
Βιοχημικό1 και Μικροβιολογικό2 Εργαστήριο, Π.Γ.Ν.Α. "Ο Ευαγγελισμός».
Σκοπός: Οι ασθενείς με μεταμόσχευση μυελού των οστών (ΜΜΟ) λαμβάνουν ανοσοσοκατασταλτικά
και στη συντρτιπτική πλειοψηφία τους αναστολείς της καλσινευρίνης. Οι αναστολείς αυτοί, η
κυκλοσπορίνη και το τακρόλιμους, παρά το γεγονός ότι δεν παρουσιάζουν δομικές αναλογίες, δρουν
με παρόμοιο τρόπο συνδεόμενoι με την κυκλοφιλίνη ή την ανοσοφιλίνη FKBP αντίστοιχα και εν
συνεχεία με την καλσινευρίνη, που ρυθμίζει τη μεταγραφή της ιντερλευκίνης-2 (IL-2) και άλλων
κυτταροκινών των ενεργοποιημένων Τ-λεμφοκυττάρων. Εξετάζεται η συσχέτιση της
ανοσοκατασταλτικής αγωγής των μεταμοσχευμένων αιματολογικών ασθενών με την εμφάνιση
λοίμωξης από Clostridium difficile (CDI).
Υλικό και μέθοδοι: Την περίοδο 2012 – 2013, σε διαρροϊκά δείγματα κοπράνων (τύπων 5–7,
σύμφωνα με την κλίμακα Bristol), των μεταμοσχευμένων αιματολογικών ασθενών με κλινική υποψία
CDI, έγινε καταρχήν αναζήτηση γλουταμικής δεϋδρογενάσης GDH, αντιγόνου που παράγεται από
τοξινογόνα και μη τοξινογόνα στελέχη CD και ακολούθησε ανοσοχημικός προσδιορισμός (C.DIFF QUIK
CHEK COMPLETE) των τοξινών Α και Β (CDT). Τα επίπεδα των ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων
προσδιορίστηκαν σε ολικό αίμα. Η κυκλοσπορίνη μετρήθηκε με τη μέθοδο του πολωμένου
ανοσοφθορισμού (FPIA), σε αναλυτή AxSYM και το τακρόλιμους με τη μέθοδο της χημειοφωταύγειας
(CMIA) σε αναλυτή Architect (Abbott Diagnostics).
Αποτελέσματα: Συνολικά από τους 126 μεταμοσχευμένους αιματολογικούς ασθενείς, μελετήθηκαν
101 (80.1%) ύποπτοι για CDI ασθενείς. Από αυτούς στους 14 ασθενείς (12.9%) ανιχνεύθηκε
γλουταμική δεϋδρογενάση GDH+. Από τους 14 GDH+ ασθενείς. οι 6 GDH+ ασθενείς (42.9%) λάμβαναν
ανοσοκατασταλτικά. Οι 4 GDH+ ασθενείς (28.8%) ελάμβαναν τακρόλιμους και 1 GDH+ ασθενής (
7.1%) ελάμβανε κυκλοσπορίνη. Στους 5 (35.7%) από τους 14 ασθενείς, που ελάμβαναν
ανοσοκατασταλτική αγωγή, ανιχνεύθηκαν και GDH+ και τοξίνες CDT. Οι 4 ασθενείς (80%) με θετικά
GDH+ και CDT+ λάμβαναν τακρόλιμους και 1 ασθενής ( 20%) με θετικά GDH+ και CDT+
κυκλοσπορίνη.
Συμπεράσματα: Η χορήγηση ανοσοκατασταλτικών, και ιδιαίτερα τακρόλιμους, σε ασθενείς με
μεταμόσχευση μυελού φαίνεται να σχετίζεται με τη λοίμωξη από Clostridium difficile. Στους ασθενείς
θεραπευτικά χορηγήθηκαν αντιβιοτικά (μετρονιδαζόλη, βανκομυκίνη, φινταξομυκίνη).
105
Π.Α.10
ΤΑ ΕΠΙΠΕΔΑ ΤΗΣ ΛΙΠΟΚΑΛΙΝΗΣ-2 (NGAL) ΕΙΝΑΙ ΣΗΜΑΝΤΙΚΑ ΑΥΞΗΜΕΝΑ ΣΤΟΝ ΟΡΟ ΑΣΘΕΝΩΝ
ΜΕ ΘΑΛΑΣΣΑΙΜΙΚΑ ΚΑΙ ΔΡΕΠΑΝΟΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΣΥΝΔΡΟΜΑ: ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΜΕ ΤΗ ΝΕΦΡΙΚΗ
ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ
Ι. Παπασωτηρίου1, Ε. Βοσκαρίδου2, Α. Μαργέλη1, Α. Κοτρώτσου2, Δ. Κυριακοπούλου4, T.
Nwagha1,3, Χ. Ποζιόπουλος1 και Α. Καττάμης4
1Βιοχημικό Τμήμα, ΓΝΠ Αθηνών «Η Αγία Σοφία», Αθήνα,
2Κέντρο Αναφοράς και Πρόληψης Θαλασσαιμίας και Δρεπανοκυτταρικής Νόσου, ΓΝΑ «Λαϊκό»,
Αθήνα,
3Department of Hematology and Immunology, University of Nigeria, Teaching Hospital Ituku Ozalla,
Enugu, Nigeria,
4Α’ Παιδιατρική Κλινική Πανεπιστημίου Αθηνών, ΓΝΠ Αθηνών «Η Αγία Σοφία», Αθήνα
Εισαγωγή: Οι ασθενείς με αιμοσφαιρινοπάθειες συχνά εμφανίζουν διαφόρου βαθμού νεφρικές
βλάβες κυρίως σωληναριακού τύπου. Η συνδεδεμένη με ζελατινάση λιποκαλίνη των
ουδετεροφίλων (NGAL) είναι μια πρωτεϊνη που ανήκει στην οικογένεια των λιποκαλινών και
αρχικά ανιχνεύτηκε σε ενεργοποιημένα ουδετερόφιλα, μια που θεωρείται ότι αποτελεί εγγενή
αντιβακτηριακό παράγοντα. Παράγεται και σε άλλα κύτταρα, όπως στα κύτταρα των νεφρικών
σωληναρίων σαν απάντηση σε διάφορες βλάβες. Η αύξηση του ρυθμού παραγωγής της NGAL και
η απελευθέρωση της από τα νεφρικά σωληνάρια, μετά από βλάβη, μπορεί να θεωρηθεί
αυτοάμυνα με την ενεργοποίηση συγκεκριμένων σιδηροεξαρτώμενων βιοχημικών οδών, που κατά
πάσα πιθανότητα αντικατοπτρίζουν τον μηχανισμό, μέσω του οποίου η NGAL προάγει την νεφρική
ανάπτυξη και διαφοροποίηση. Τα επίπεδα της NGAL συσχετίζονται με τον βαθμό της νεφρικής
βλάβης τόσο σε οξείες όσο και σε χρόνιες νεφρικές νόσους. Σε αυτά τα πλαίσια μελετήσαμε την
κλινική σημασία της μέτρησης των επιπέδων της NGAL και τη συσχέτιση τους με τη νεφρική
λειτουργία σε ασθενείς με αιμοσφαιρινοπάθειες.
Ασθενείς και Μέθοδοι: Στη μελέτη συμπεριλάβαμε 117 ενήλικες ασθενείς με
αιμοσφαιρινοπάθειες διαχωρισμένους σε τρεις διακριτές ομάδες. Ομάδα Α: 30 ασθενείς με
Μεταγγισιο-εξαρτώμενη Θαλασσαιμία, Ομάδα Β: 29 ασθενείς με Ενδιάμεση Θαλασσαιμία (TI), και
Ομάδα Γ: 58 ασθενείς με HbS/βthal, ενώ 20 υγιή άτομα αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου (Ομάδα Δ).
Στον ορό των ασθενών και των μαρτύρων μετρήθηκαν με ανοσοενζυματικές μεθόδους τα επίπεδα
των Cystatin C (Cys-C) και NGAL, ενώ η σπειραματική διήθηση υπολογίσθηκε από την εξίσωση:
eGFR (mL/min)=77.24(Cys-C)-1.2623.
Αποτελέσματα: Βρήκαμε ότι: α) τα επίπεδα της NGAL ήταν σημαντικά αυξημένα σε όλες τις
ομάδες των ασθενών σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, Ομάδα Α 95.0±45.0µg/L, Ομάδα Β
139.1±86.1µg/L, Ομάδα Γ 117.8±37.3µg/L έναντι 50.3±11.3µg/L της Ομάδας Δ (p<0.001), β) Τα
επίπεδα της Cys-C ήταν σημαντικά αυξημένα στις Ομάδες Α και Γ συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου
0.94±0.34mg/L και 1.04±0.50mg/L αντίστοιχα, έναντι 0.75±0.09mg/L (p<0.01), ενώ τα επίπεδα της
Cys-C των ασθενών της Ομάδας Β 0.72±0.13mg/L δεν διέφεραν από αυτά των υγιών ατόμων
(p>0.300), c) Τα επίπεδα της NGAL και οι αντίστοιχες τιμές της eGFR (Ομάδα Α: 96.9±39.8, Ομάδα
Β: 117.0±26.0, Ομάδα Γ: 86.2±27.8 και Ομάδα Δ: 109.6±15.0mL/min αντίστοιχα) παρουσίαζαν
σημαντική αρνητική συσχέτιση μόνο στους ασθενείς των Ομάδων Α και Γ (r=-0.739, p<0.001 και
r=-0.735, p<0.001 αντίστοιχα), ενώ τα αυξημένα επίπεδα της NGAL ήταν ανεξάρτητα από τις τιμές
της eGFR στους ασθενείς της Ομάδας B.
106
Συμπεράσματα: Τα παραπάνω ευρήματα δείχνουν τον μηχανισμό ανάδρασης της ενεργοποίησης
του άξονα σωληναρίου-σπειράματος. Αυτό αντικατοπτρίζεται στα επίπεδα της NGAL σε ασθενείς
με μεταγγισιο-εξαρτώμενη θαλασσαιμία και HbS/βthal νόσο που έχουν νεφρικές βλάβες και
προηγείται της μείωσης της GFR. Η αύξηση της NGAL σε ασθενείς με ενδιάμεση θαλασσαιμία
ανεξάρτητα από τις υπάρχουσες νεφρικές βλάβες πιθανόν να δείχνει ένα αντιρροπιστικόπροστατευτικό ρόλο της πρωτεϊνης σε απάντηση στη φλεγμονή και το οξειδωτικό stress.
Πρόσφατες μελέτες συνδέουν την αύξηση της παραγωγής της NGAL με την αναιμία. Επιπλέον σε
πειραματικά μοντέλα παρατηρήθηκε ότι στον μυελό των οστών η NGAL προκαλεί παρεμπόδιση
της ερυθροποίησης μέσω της επαγωγής της απόπτωσης και της διακοπής της διαφοροποίησης των
προγονικών κυττάρων της ερυθράς σειράς.
107
Π.Α. 11
Η ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΑ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΤΟΥ ΔΙΑΛΥΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΟΥ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΗ
ΠΛΑΣΜΙΝΟΓΟΝΟΥ ΤΥΠΟΥ ΟΥΡΟΚΙΝΑΣΗΣ (suPAR) ΣΕ ΤΕΛΕΙΟΜΗΝΑ ΝΕΟΓΝΑ ΜΕ ΛΟΙΜΩΞΗ Η
ΣΗΨΗ: ΜΙΑ ΠΡΟΟΠΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ
Τ. Σιαχανίδου1, Α. Μαργέλη2, Χ. Τσιρογιάννη1, Σ. Χαρώνη1, Μ. Γιαννάκη3, Ε. Βαβουράκης4, Α.
Χαρισιάδου3, Ι. Παπασωτηρίου2
1Μονάδα Νεογνών, Α’ Παιδιατρική Κλινική Πανεπιστημίου Αθηνών, ΓΝΠ Αθηνών «Η Αγία Σοφία»,
Αθήνα,
2Βιοχημικό Τμήμα, ΓΝΠ Αθηνών «Η Αγία Σοφία», Αθήνα,
3Μικροβιολογικό Εργαστήριο, ΓΝΠ Αθηνών «Η Αγία Σοφία», Αθήνα,
4Αιματολογικό Εργαστήριο, ΓΝΠ Αθηνών «Η Αγία Σοφία», Αθήνα
Εισαγωγή: O διαλυτός υποδοχέας του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης
(soluble form of the urokinase-type plasminogen activator receptor) είναι μια πρωτεϊνη που
συμμετέχει σε έναν μεγάλο αριθμό κυτταρικών λειτουργιών, όπως προσκόλληση κυττάρων,
μετανάστευση, χημειοταξία, πρωτεόλυση, ενεργοποίηση ανοσολογικής απάντησης, ιστικής
αναδιοργάνωσης, εισβολή και μεταγωγή σήματος. Σε πρόσφατες μελέτες τα αυξημένα επίπεδα
suPAR σε διάφορα βιολογικά υγρά συσχετίζονται θετικά με τη βαρύτητα της λοίμωξης, του SIRS ή
της σήψης, καθώς με το βαθμό ενεργοποίησης του ανοσοποιητικού συστήματος. Επειδή δεν
υπάρχουν αναφορές για προσδιορισμό των επιπέδων του suPAR σε νεογνά, μελετήσαμε την αξία
της μέτρησης των επιπέδων της πρωτεϊνης αυτής σε νεογνά με λοίμωξη ή/και σήψη και την
συσχέτισή του suPAR με κλινικές και εργαστηριακές παραμέτρους.
Ασθενείς και Μέθοδοι: Τα επίπεδα του suPAR μετρήθηκαν με ανοσοενζυματική μέθοδο
(suPARnostic® Standard kit; ViroGates A/S, Birkerød, Denmark)1 στο πλάσμα 47 νεογνών, μέσης
ηλικίας 18±5 ημέρες, με εμπύρετη λοίμωξη μικροβιακής (Ν=19) ή ιογενούς αιτιολογίας (Ν=28),
καθώς και 18 υγιών νεογνών που αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου. Στα νεογνά με λοίμωξη
πραγματοποιήθηκαν σειριακές μετρήσεις του suPAR: στην αρχική φάση της λοίμωξης, σε 12-24
ώρες, 48 ώρες, 3ο-5ο 24ωρο και 7ο-10ο 24ωρο.
Αποτελέσματα: Τα κυριότερα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι: α) τα επίπεδα suPAR ήταν
σημαντικά αυξημένα στην αρχική φάση της λοίμωξης (5.01±1.52 ng/mL) συγκριτικά με την ομάδα
ελέγχου (3.61±0.74 ng/mL, p<0.001), ενώ βρέθηκε σημαντική θετική συχέτιση των επιπέδων του
του suPAR με τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις της CRP (r=0.42, p=0.001), β) τα επίπεδα suPAR
βρέθηκαν αυξημένα, αλλά όχι σημαντικά, στα νεογνά με μικροβιακές λοιμώξεις (5.38±1.92 ng/mL)
συγκριτικά με τα νεογνά με ιογενείς λοιμώξεις (4.73±1.11 ng/mL), γ) κατά την αποδρομή της
λοίμωξης, τα επίπεδα του suPAR σταδιακά ελαττώθηκαν (p=0.001) και δ) με την εφαρμογή
καμπύλης ROC διαπιστώθηκε ότι τα επίπεδα suPAR έχουν υψηλή διαγνωστική αξία στη νεογνική
λοίμωξη (AUC 0.801, p<0.001), δεν διακρίνουν τη μικροβιακή από την ιογενή λοίμωξη, ενώ είναι
προγνωστικός δείκτης της βαρύτητας της λοίμωξης (AUC 0.788, p=0.001).
Συμπέρασματα: Τα επίπεδα suPAR αποτελούν νέο διαγνωστικό και προγνωστικό δείκτη με
ιδιαίτερη αξία στην εκτίμηση της βαρύτητας της λοίμωξης στα νεογνά. Δεν παρέχει δυνατότητα
διάκρισης μεταξύ βακτηριακών και ιογενών λοιμώξεων, ενώ η κλινική του αξία στην
παρακολούθηση της φαρμακευτικής αντιμετώπισης της λοίμωξης αποτελεί στόχο της περαιτέρω
έρευνάς μας.
1Clin Chem 59:1621-9, 2013.
108
Π.Α. 12
ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΗΠΑΤΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΕΞΩΤΕΡΙΚΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΥΠΟ ΑΝΤΙΕΠΙΛΗΠΤΙΚΗ ΑΓΩΓΗ.
Β. Μπρακούλια, Η. Αγγελίδης, Α. Γρηγοράτου, Α. Μελπίδου, Μ. Πρατικάκη, Δ Πολίτου, Σ.
Ιωαννίδου, Ε. Λιανίδου.
Βιοχημικό Εργαστήριο, Π.Γ.Ν.Α. "Ο Ευαγγελισμός» και Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας
Πανεπιστήμίου Αθηνών.
Σκοπός: Η καταγραφή και αξιολόγηση των αποτελεσμάτων εξωτερικών ασθενών υπό
αντιεπιληπτική (ΑΕ) αγωγή, οι οποίοι προσήλθαν στο βιοχημικό εργαστήριο του Π Γ Ν Α «Ο
Ευαγγελισμός» από το Σεπτέμβριο του 2012 έως τον Ιούνιο του 2013 για μέτρηση των επιπέδων
των αντιεπιληπτικών φαρμάκων που ελάμβαναν και έλέγχο της ηπατικής λειτουργίας τους.
Υλικό και μέθοδοι: Έγινε μελέτη 100 ασθενών (48 άνδρες και 52 γυναίκες), ηλικίας 18 – 90 ετών, η
οποία περιελάμβανε προσδιορισμό των λαμβανόμενων ΑΕ φαρμάκων, καθώς και έλεγχο της
ηπατικής λειτουργίας τους. Συγκεκριμένα μετρήθηκαν οι τρανσαμινάσες AST και ALT, η γγλουταμική τρανσφεράση γGT, η ολική χολερυθρίνη, τα ολικά λευκώματα ΤΡ, οι αλβουμίνες, οι
σφαιρίνες και ο λόγος A/G των εν λόγω ασθενών σε αναλυτή Modular (Roche). Η μέτρηση των
επιπέδων των ΑΕ φαρμάκων έγινε με τη μέθοδο του πολωμένου ανοσοφθορισμού (FPIA) σε
αναλυτή AxSYM. Τα φάρμακα που προσδιορίστηκαν ήταν βαλπροϊκό, φαινυτοΐνη, καρβαμαζεπίνη,
φαινοβαρβιτάλη και λίθιο. Ποσοστό 90% των ασθενών ελάμβανε μονοθεραπεία, ενώ το υπόλοιπο
10% ελάμβανε δύο φάρμακα.
Αποτελέσματα: Στο 72% των ασθενών τα επίπεδα των ΑΕ φαρμάκων προσδιορίσθηκαν εντός του
θεραπευτικού παραθύρου, στο 22% των ασθενών ήταν υποθεραπευτικά και στο 6% ήταν τοξικά.
Από τους 60 ασθενείς που λάμβαναν βαλπροϊκό οι 11 ασθενείς (18,3%) είχαν αυξημένη γGT, οι 5
ασθενείς (8,3%) αυξημένη ALT και 3 ασθενείς (5%) χαμηλή αλβουμίνη. Από τους 13 ασθενείς που
λάμβαναν φαινυτοΐνη οι 7 ασθενείς (53,8%) είχαν αυξημένη γGT, ο 1 ασθενής (7,7%) αυξημένη
ALT και ο 1 ασθενής (7,7%) χαμηλή αλβουμίνη. Από τους 30 ασθενείς που λάμβαναν
καρβαμαζεπίνη οι 9 (30%) είχαν αυξημένη γGT και οι 4 ασθενείς (8,3%) αυξημένη ALT (13,3%). Οι
5 (50%) από τους 10 ασθενείς που λάμβαναν δύο φάρμακα είχαν υψηλή γGT.
Συμπεράσματα: Η γGT φαίνεται να είναι ο πιο ευαίσθητος δείκτης ηπατικής λειτουργίας (αύξήση
σε 32 ασθενείς, 32%), ακολουθεί η ALT η οποία βρέθηκε αυξημένη σε 10 ασθενείς (10%) και η
αλβουμίνη που ήταν χαμηλή σε 4 ασθενείς (4%). Συνεπώς επιβάλλεται ο τακτικός έλεγχος της
συγκέντρωσης των αντιεπιληπτικών και η παρακολούθηση της ηπατικής λειτουργίας των ασθενών
υπό ΑΕ αγωγή. Επισημαίνεται ότι υποαλβουμιναιμία σημαίνει μείωση του ποσοστού του
συνδεδεμένου φαρμάκου και μπορεί να οδηγήσει σε τοξικότητα.
109
Π.Α. 13
ΈΛΕΓΧΟΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΕΞΩΤΕΡΙΚΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΠΟΥ ΛΑΜΒΑΝΟΥΝ ΑΝΤΙΕΠΙΛΗΠΤΙΚΑ.
Η. Αγγελίδης, Β. Μπρακούλια, Α. Γρηγοράτου, Α. Μελπίδου, Χ. Πάντζιου, Σ. Ιωαννίδου,
Ε. Λιανίδου.
Βιοχημικό Εργαστήριο, Π.Γ.Ν.Α. "Ο Ευαγγελισμός» και Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας
Πανεπιστήμίου Αθηνών.
Σκοπός: Η καταγραφή και αξιολόγηση των αποτελεσμάτων εξωτερικών ασθενών υπό
αντιεπιληπτική (ΑΕ) αγωγή, οι οποίοι προσήλθαν στο βιοχημικό εργαστήριο του Π Γ Ν Α «Ο
Ευαγγελισμός» από το Σεπτέμβριο του 2012 έως τον Ιούνιο του 2013 για μέτρηση των επιπέδων
των αντιεπιληπτικών φαρμάκων που ελάμβαναν και έλέγχο της νεφρικής λειτουργίας τους
Υλικό και μέθοδοι: Έγινε μελέτη 100 ασθενών (48 άνδρες και 52 γυναίκες), ηλικίας 18 – 90 ετών, η
οποία περιελάμβανε προσδιορισμό των λαμβανόμενων ΑΕ φαρμάκων, καθώς και έλεγχο της
νεφρικής λειτουργίας τους. Συγκεκριμένα μετρήθηκαν η ουρία, η κρεατινίνη, το ουρικό οξύ και οι
ηλεκτρολύτες Na+, K+ σε αναλυτή Modular (Roche). Η μέτρηση των επιπέδων των ΑΕ φαρμάκων
έγινε με τη μέθοδο του πολωμένου ανοσοφθορισμού (FPIA) σε αναλυτή AxSYM. Τα φάρμακα που
προσδιορίστηκαν ήταν βαλπροϊκό, φαινυτοΐνη, καρβαμαζεπίνη, φαινοβαρβιτάλη και λίθιο.
Ποσοστό 90% των ασθενών ελάμβανε μονοθεραπεία, ενώ το υπόλοιπο 10% ελάμβανε δύο
φάρμακα.
Αποτελέσματα: Από τους 60 ασθενείς που λάμβαναν βαλπροϊκό οι 9 ασθενείς (15%) είχαν
αυξημένο K+, οι 5 ασθενείς (8,3%) αυξημένο Na+ και 4 ασθενείς (6,7%) υψηλή ουρία και ουρικό
οξύ. Από τους 13 ασθενείς που λάμβαναν φαινυτοΐνη οι 3 ασθενείς (23%) είχαν χαμηλό Na+. Από
τους 30 ασθενείς που λάμβαναν καρβαμαζεπίνη οι 3 (10%) είχαν αυξημένο Na+ και ο 1 ασθενής
(3,3%) είχε αυξημένο K+. Σε ποσοστό 22% των ασθενών τα αντιεπιληπτικά ήταν σε
υποθεραπευτικά επίπεδα, στο 6% ήταν τοξικά και στο 72% των ασθενών προσδιορίσθηκαν εντός
του θεραπευτικού παραθύρου. Μόνον ένας από τους 10 ασθενείς που λάμβαναν δύο
αντιεπιληπτικά φάρμακα παρουσίασε ήπια αύξηση της κρεατινίνης.
Συμπεράσματα: Η συγκέντρωση του (K+) βρέθηκε να είναι ο πιο ευαίσθητος δείκτης νεφρικής
λειτουργίας, αυξήθηκε σε 10 ασθενείς (10%). Ακολουθεί συγκέντρωση του (Na+) που βρέθηκε
αυξημένη σε 8 ασθενείς (13,3%), ενώ σε 3 ασθενείς η συγκέντρωση του (Na+) ήταν χαμηλή. Μόνον
σε 4 ασθενείς (6,7%) παρατηρήθηκε μικρή αύξηση της ουρίας και του ουρικού οξέος, ενώ μικρή
επίσης αύξηση της κρεατινίνης βρέθηκε σε 1 μόνον ασθενή από όσους λάμβαναν δύο
αντιεπιληπτικά. Αναδεικνύεται η σημασία του τακτικού ελέγχου των αντιεπιληπτικών και αλλά
και της παρακολούθησης της νεφρικής λειτουργίας των ασθενών. Αυτό αφορά ιδιαίτερα όσους
λαμβάνουν παράλληλα δύο φάρμακα και κυρίως λίθιο, που είναι γνωστό για τη νεφροτοξικότητά
του.
110
Π.Α. 14
ΤΑ ΧΑΜΗΛΑ ΕΠΙΠΕΔΑ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ DICKKOPF-1 ΣΕ ΠΑΧΥΣΑΡΚΑ ΠΑΙΔΙΑ ΔΕΙΧΝΟΥΝ
ΔΙΑΤΑΡΑΧΗ ΤΗΣ ΚΑΤΑΣΤΟΛΗΣ ΤΗΣ ΚΑΝΟΝΙΚΗΣ Wnt ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗΣ
Ι. Παπασωτηρίου1, Ε. Τέρπος2, Α. Γαλάνη1, Χ. Κανακά-Gantenbein3, Γ. Χρούσος3
1Βιοχημικό Τμήμα, ΓΝΠ Αθηνών «Η Αγία Σοφία», Αθήνα,
2Θεραπευτική Κλινική Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, Αθήνα,
3Α’ Παιδιατρική Κλινική Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, Αθήνα
Εισαγωγή: Η έκκριση των Wnt πρωτεϊνών από τα λιπώδη κύτταρα διαδραματίζει σημαντικό ρόλο
στον έλεγχο της λιπογένεσης. Ο Wnt ανταγωνιστής, Dickkopf-1 (DKK-1), εκκρίνεται από τα
ανθρώπινα προλιποκύτταρα και επηρεάζει την ωρίμανση και την αύξηση των λιποκυττάρων. Τα
επίπεδα του DKK-1 mRNA αυξάνονται έξι ώρες μετά την έναρξη της λιπογένεσης στον άνθρωπο και
ακολουθεί αντίστοιχη αύξηση της DKK-1 πρωτεϊνης. Κατά την περαιτέρω διαφοροποίηση των
λιποκυττάρων, τα επίπεδα του DKK-1 mRNA και της πρωτεϊνης σταδιακά μειώνονται για να
φτάσουν σε μή ανιχνεύσιμα επίπεδα στο ώριμο λιποκύτταρο. Η παροδική επαγωγή του DKK-1
συσχετίζεται με την προς τα κάτω ρύθμιση των επιπέδων της β-κατενίνης στο κυτταρόπλασμα και
στον πυρήνα, αποτελώντας έναν αντιπροσωπευτικό δείκτη της κανονικής Wnt σηματοδότησης
καθώς και της μεταγραφικής δραστηριότητας του Wnt/β-κατενίνη. Αξιοσημείωτη είναι, επίσης, η
εμπλοκή της DKK-1 πρωτεϊνης στην διαδικασία ανακατασκευής του οστού.
Υλικό και Μεθοδολογία: Σε αυτήν την μελέτη μετρήθηκαν στο πλάσμα, με ανοσοενζυμικές
μεθόδους, τα επίπεδα του DKK-1 σε 16 νορμοβαρή και 25 παχύσαρκα κορίτσια. Διερευνήθηκαν
πιθανές συσχετίσεις των DKK-1 επιπέδων με ανθρωπομετρικές παραμέτρους, την αντίσταση στην
ινσουλίνη, παραγόμενα από τον λιπώδη ιστό μόρια [αδιπονεκτίνη, λεπτίνη, πρωτεϊνη σύνδεσης
της ρετινόλης-4 (RBP-4) και λιποκαλίνη-2], δείκτες ανακατασκευής των οστών [οστεοπροτεγερίνη
(OPG), ενεργοποιητής του υποδοχέα του πυρηνικού παράγοντα NF-κB (RANKL), οστεοκαλσίνη,
καρβοξυτελικό διασταυρούμενο τελοπεπτιδιο του κολλαγόνου τύπου-I (CTX), οστικό κλάσμα
αλκαλικής φωσφατάσης (bALP) και όξινη φωσφατάση ανθεκτική στα τρυγικά άλατα ισομορφή-5b
(bone TRACP-5b)] καθώς και με έναν δείκτη φλεγμονής (hs-CRP).
Αποτελέσματα: Οι μετρήσεις ανέδειξαν: α) επίπεδα DKK-1 σημαντικά υψηλότερα στα νορμοβαρή
σε σχέση με τα παχύσαρκα κορίτσια (37.5±18.0 vs. 18.6±2.4 pg/mL, p=0.009), β) αρνητική
συσχέτιση των τιμών των δεικτών BMI και HOMA με τα επίπεδα του DKK-1 (r=-0.508, p<0.001 και
r=-0.380, p<0.01, αντιστοίχως), γ) σημαντική συσχέτιση των logDKK-1 τιμών μόνο με τα επίπεδα
αδιπονεκτίνης (r=-0.404, p=0.008), δ) θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων DKK-1 και RANKL
(r=0.492, p<0.001) και ε) αρνητική συσχέτιση μεταξυ των επιπέδων των hs-CRP και DKK-1 (r=0.371, p=0.01).
Συμπεράσματα: Τα αρχικά μας ευρήματα υποδεικνύουν ότι δείκτες του μεταβολικού συνδρόμου
όπως η παχυσαρκία, η αντίσταση στην ινσουλίνη, τα χαμηλά επίπεδα αδιπονεκτίνης και ο χαμηλός
βαθμός φλεγμονής συσχετίζονται αρνητικά με τα επίπεδα της DKK-1 πρωτεϊνης πλάσματος στον
παιδικό πληθυσμό. Η παχυσαρκία χαρακτηρίζεται από μία απρόσφορη αύξηση του μεγέθους των
λιποκυττάρων (υπερτροφική παχυσαρκία) που προκαλείται από την αδυναμία του οργανισμού να
επιστρατεύσει και να διαφοροποιήσει νέα προγονικά κύτταρα. Η αδυναμία λιπογένεσης που
παρατηρείται στην παχυσαρκία φαίνεται να συσχετίζεται με την έλλειψη DKK-1, η οποία
διαταράσσει την κανονική οδό σηματοδότησης του Wnt.
111
Π.Α. 15
ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΑΚΡΑΙΟΥ ΦΥΣΙΚΟΥ STRESS ΣΤΑ ΚΥΚΛΟΦΟΡΟΥΝΤΑ ΒΛΑΣΤΙΚΑ/ΠΡΟΓΟΝΙΚΑ
ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΟΥ ΕΜΠΛΕΚΟΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΕΠΟΥΛΩΣΗ ΤΩΝ ΙΣΤΩΝ: ΠΙΘΑΝΕΣ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΠΡΟΕΚΤΑΣΕΙΣ
Ι. Παπασωτηρίου1, Κ. Σκενδέρη2, Μ. Τσιρώνη3, Α. Γαλάνη1, Γ. Χρούσος4, Ε. Γουσέτης5
1Βιοχημικό Τμήμα, ΓΝΠ Αθηνών «Η Αγία Σοφία», Αθήνα,
2Εργαστήριο Διατροφής και Διαιτολογίας, «Χαροκόπειο» Παν/μιο Αθηνών, Καλλιθέα,
3Τμήμα Παθολογίας Νοσηλευτικής Σχολής Παν/μίου Πελοποννήσου, Σπάρτη,
4Α’ Παιδιατρική Κλινική Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, Αθήνα,
5Μονάδα Μεταμόσχευσης Μυελού των Οστών, ΓΝΠ Αθηνών «Η Αγία Σοφία», Αθήνα
Εισαγωγή: Τα αυτόλογα προγονικά κύτταρα είναι μία πολλά υποσχόμενη επιλογή στο φάσμα των
αναγεννητικών κυτταρικών θεραπειών. Τα ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα (endothelial
progenitor cells, EPCs) φαίνεται να συμμετέχουν τόσο στην επούλωση των αγγείων όσο και στην
αγγειογένεση, ενώ οι εκ του μυελού των οστών ορμώμενοι ινοβλάστες είναι πολυδύναμα
κύτταρα που μεσολαβούν στην επούλωση και ανακατασκευή των τραυματισμένων ιστών. Έχει
αποδειχθεί η αρνητική επίδραση του γήρατος και διαφόρων καρδιαγγειακών παραγόντων
κινδύνου, όπως ο διαβήτης, στο θεραπευτικό δυναμικό και των δύο προαναφερόμενων
πολυδύναμων κυττάρων. To “Σπάρταθλον”, ο υπερμαραθώνιος αγώνας δρόμου (246Km
παρατεταμένης, αδιάκοπης και εξουθενωτικής άσκησης για διάστημα έως και 36 ωρών), αποτελεί,
λόγω της φύσης του, ιδανικό μοντέλο μελέτης του παρατεταμένου σοβαρού φυσικού stress. Οι
δρομείς υφίστανται δραματικές συστηματικές και φλεγμονώδεις αλλαγές, καθώς το ανοσολογικό
τους σύστημα εντείνει τη λειτουργία του για να ανταποκριθεί στις επακόλουθες της ακραίας
φυσικής κόποσης βλάβες της καρδιάς, των σκελετικών μυών και των υπολοίπων οργάνων.
Υποθέσαμε ότι ο συγκεκριμένος τύπος άσκησης ασκεί ιδιαίτερη επίδραση στα EPCs και σε άλλα εκ
του μυελού των οστών ορμώμενα κύτταρα.
Υλικό και Mεθοδολογία: Μελετήθηκε ο αριθμός των κυκλοφορούντων EPCs και ινοβλαστών σε
συνδιασμό με δείκτες ενδοθηλιακής δυσλειτουργίας και πρωτεϊνες παραγόμενες από τον λιπώδη
ιστό σε 20 αθλητές του “Σπάρταθλου”, πριν, στο τέλος και 24 ώρες μετά τον αγώνα. Τα EPCs
μελετήθηκαν σε καλλιέργειες μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος (PBMC) υπό συνθήκες
ενδοθηλιακών κυττάρων (EndoCult) και μετρήθηκαν οι σχηματιζόμενες αποικίες (CFUs). Οι
κυκλοφορούντες ινοβλάστες καλλιεργήθηκαν επίσης από PBMCs σε IMDM, εμπλουτιζόμενοι με IL3 και M-CSF και ταυτοποιούμενοι ως CD45+CD14+CD34lowCollagen-I+ ινοβλαστικά κύτταρα.
Μετρήθηκαν, επίσης, τα επίπεδα πλάσματος μορίων ενδοθηλιακής δυσλειτουργίας, όπως οι E-, Land P-σελεκτίνες, το διαλυτό μόριο διακυττάριας προσκόλλησης-1(sICAM-1), το διαλυτό μόριο
αγγειακής κυτταρικής προσκόλησης-1 (sVCAM-1) και η θρομβομοντουλίνη (TM) μαζί με πρωτεϊνες
προερχόμενες από τον λιπώδη ιστό όπως λεπτίνη, αντιπονεκτίνη (ADPN), λιποκαλίνη-2 (NGAL),
συνδετική πρωτεϊνη της ρετινόλης-4 (RBP-4), αναστολέας του ενεργοποιητή του πλασμινογονου-1
(PAI-1), ανασταλτικός παράγοντας μετανάστευσης των μακροφάγων (MIF), IL-8 και χημειοτακτική
πρωτεϊνη των μακροφάγων-1 (MCP-1) με ανοσοενζυμικές μεθόδους. Επιπλέον, μετρήθηκαν τα
επίπεδα του ελεύθερου DNA στο πλάσμα, ευαίσθητου δείκτη της σχετιζόμενης με την
υπερπροπόνηση φλεγμονής.
Αποτελέσματα: Ο αριθμός των κυκλοφορούντων EPCs στο περιφερικό αίμα αυξήθηκε σχεδόν στο
112
δεκαπλάσιο στο τέλος του αγώνα “Σπάρταθλον” (από 48±15 κύτταρα/ml σε 464±36 κύτταρα/ml)
και παρέμεινε αυξημένος (420±28 κύτταρα/ml) ακόμα και στις 48 ώρες μετά τον αγώνα (p<0.001).
Το ποσοστό των CD45+CD14+CD34lowCollagen-I+ ινοβλαστών πριν, στο τέλος και 48 ώρες μετά τον
αγώνα δεν παρουσίασε σημαντική διαφοροποίηση (64.5±6.2% vs 70.8±8.5% vs 68±4.8%,
αντίστοιχα, p>0.5). Τα επίπεδα στο πλάσμα των δεικτών δυσλειτουργίας του ενδοθηλίου
ακολούθησαν διαφορετικά μοντέλα ανταπόκρισης: E-σελεκτίνη, sICAM, sVCAM και
θρομβομοντουλίνη αυξήθηκαν σημαντικά στο τέλος του αγώνα και επέστρεψαν στα
προαγωνιστικά επίπεδα στις 48 ώρες μετα τον αγώνα (p<0.01), ενώ οι L- και P-σελεκτίνες
παρέμειναν ανεπηρέαστες πριν και κατά το τέλος του αγώνα ενώ παρουσίασαν παρόμοια μείωση
στις 48 ώρες μετά τον αγώνα (p>0.6). Ομοίως, οι δείκτες NGAL, IL-8 και MCP-1, παραγόμενοι από
τον λιπώδη ιστό, παρουσίασαν σημαντικές αυξήσεις στο τέλος του αγώνα για να επιστρέψουν στα
προαγωνιστικά επίπεδα 48 ώρες μετά (p<0.01). Λεπτίνη και RBP-4 σημείωσαν σημαντική μείωση
κατά το τέλος του αγώνα αλλά με διαφορετικό μοντέλο ανάκαμψης (p<0.001 και p<0.02,
αντιστοίχως), ενώ οι τιμές των ADPN, PAI-1 και MIF δεν παρουσίασαν στατιστικά σημαντικές
διαφορές (p>0.5).
Συμπεράσματα: Η οξεία φλεγμονώδης ιστική βλάβη, απότοκη εξουθενωτικής άσκησης, αυξάνει τα
EPCs αλλά όχι τους ινοβλάστες. Δεδομένης της ικανότητας των EPCs να προωθούν την ανάπλαση
των αγγείων και την αγγειογένεση και της σχέσης των ινοβλαστών με την ιστική ίνωση σε
περιβάλλον επίμονης φλεγμονής, συμπεραίνουμε ότι αυτό το είδος κινητοποίησης των
επουλωτικών κυττάρων ίσως να υπηρετεί έναν φυσιολογικό επουλωτικό μηχανισμό κατά την οξεία
φλεγμονώδη ιστική βλάβη και πιθανώς μία πηγή δυνητικών κυτταρικών θεραπειών στο μέλλον.
Επιπρόσθετα, η μελέτη αυτή ανέδειξε διαφορετικά πρότυπα ανταπόκρισης των λιποκινών στο
ερέθισμα της συστηματιικής φλεγμονής.
113
Π.Α. 16
ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΟΥ ΛΙΠΩΔΟΥΣ ΙΣΤΟΥ ΚΑΙ ΤΗΣ ΟΣΤΙΚΗΣ
ΑΝΑΚΑΤΑΣΚΕΥΗΣ ΣΕ ΝΟΡΜΟΒΑΡΗ ΚΑΙ ΠΑΧΥΣΑΡΚΑ ΚΟΡΙΤΣΙΑ
Ι. Παπασωτηρίου1, Χ. Κανακά-Gantenbein2, Α. Μαργέλη1, Α. Γαλάνη1, Γ. Χρούσος2, Ε. Τέρπος3
1Βιοχημικό
Τμήμα, ΓΝΠ Αθηνών «Η Αγία Σοφία», Αθήνα,
Παιδιατρική Κλινική Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, Αθήνα,
2Θεραπευτική
Κλινική Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών,
2Α’
Αθήνα
Εισαγωγή: Ο λιπώδης ιστός και τα οστά συνδέονται μεταξύ τους μέσω ενός πολύπλοκου δικτύου
αλληλεπιδράσεων σε μοριακό και πρωτεϊνικό επίπεδο. Η ινσουλίνη, η λεπτίνη, η αδιπονεκτίνη και
τα παραγόμενα από το λίπος οιστρογόνα είναι πιθανό να είναι μέρος αυτής της πολύπλοκης
αλληλεπίδρασης. Η λεπτίνη, μία ορμόνη που εκκρίνεται από τον λιπώδη ιστό, δρώντας μέσω του
υποδοχέα της, συνεισφέρει σημαντικά στην υγεία των οστών, αναστέλλοντας τον σχηματισμό
νέου οστού και προωθώντας την απορρόφηση του. Επιπλέον, αναστέλλει την έκκριση του
ενεργοποιητή του υποδοχέα του πυρηνικού παράγοντα NF-κB (RANKL) από τους οστεοβλάστες,
επάγοντας την παραγωγή της οστεοπροτεγερίνης (OPG) και επηρρεάζοντας έτσι θετικά την
ισσοροπία OPG/RANKL. Ο κύριος βιολογικός ρόλος της OPG είναι να εξουδετερώνει τον RANKL και
να ελέγχει τον σχηματισμό, την δραστηριότητα και την επιβίωση των οστεοκλαστών, έτσι ώστε να
αναστέλλεται η οστική απορρόφηση.
Σκοπός: Η διερεύνηση των σχέσεων των ορμονών του λιπώδους ιστού, όπως της λεπτίνης, της
αδιπονεκτίνης, της RBP-4 και της λιποκαλίνης-2, καθώς και του δείκτη χαμηλού βαθμού
φλεγμονής hs-CRP με δείκτες του οστικού μεταβολισμού όπως OPG, RANKL, οστεοκαλσίνη,
καρβοξυτελικό διασταυρούμενο τελοπεπτίδιο του κολλαγόνου τύπου-I (CTX), οστικό κλάσμα
αλκαλικής φωσφατάσης (bALP) και οστική όξινη φωσφατάση ανθεκτική στα τρυγικά άλατα
ισομορφή-5b (TRACP-5b) σε κορίτσια με ποικίλες τιμές BMI.
Μεθοδολογία: Ογδόντα κορίτσια (ηλικίας 9-15 ετών) συγκαταλέγησαν στη συγκεκριμένη μελέτη
και κατατάχθηκαν σε 4 ομάδες των 20 ατόμων, ανάλογα με τις τιμές των σταθερών αποκλίσεων
των BMI (BMI-SDs): υπέρβαρα 1.8±0.4, παχύσαρκα 2.2±0.4, νοσηρά παχύσαρκα 3.6±0.4 και
νορμοβαρή -0.11±0.4. Λιποκίνες, hs-CRP και οστικοί δείκτες μετρήθηκαν σε όλες τις ομάδες με
ανοσοενζυμικές και νεφελομετρικές μεθόδους καθώς και με χημειοφωταύγεια.
Αποτελέσματα: Τα κυριώτερα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν: α) τα επίπεδα των OPG, RANKL
και bALP μειώνονται σημαντικά με την αύξηση των BMI-SDSs (p=0.03, p=0.03 και p<0.01,
αντίστοιχα), ενώ δεν παρατηρήθηκε καμία συσχέτιση με τις τιμές των οστεοκαλσίνη, CTX και
οστικής TRACP-5b (p>0.60), β) η λεπτίνη συσχετίστηκε αρνητικά με bALP, οστική TRACP-5b,
οστεοκαλσίνη, OPG και RANKL (p=0.002, p<0.05, p=0.002, p=0.02, p=0.006 και p=0.006,
αντίστοιχα), η αδιπονεκτίνη συσχετίστηκε θετικά με CTX και OPG (p=0.004 και p=0.04, αντίστοιχα),
η RBP-4 παρουσίασε επίσης θετική συσχέτιση με OPG και bALP (p<0.01 και p=0.002, αντίστοιχα),
ενώ η λιποκαλίνη-2 παρουσίασε θετική συσχέτιση με την bALP (p<0.001), γ) η συστηματική,
σχετιζόμενη με την παχυσαρκία φλεγμονή, εκφραζόμενη μέσω της hs-CRP, συσχετίστηκε θετικά
μόνο με την OPG.
Συμπεράσματα: Τα ευρήματα μας υποστηρίζουν την ύπαρξη σημαντικών συνδετικών δικτύων
μεταξύ των πρωτεϊνικών προϊόντων του λιπώδους ιστού και των εμπλεκόμενων στην οστική
114
ανακατασκευή μορίων. Ο οστικός μεταβολισμός διαφοροποιείται στα παχύσαρκα κορίτσια,
κυρίως υπό την επίδραση των μειωμένων επιπέδων της OPG. Οι σημαντικές συσχετίσεις της OPG
με τη λεπτίνη, την αδιπονεκτίνη και την hs-CRP υποδεικνύουν τον πιθανό ρυθμιστικό ρόλο τόσο
των λιποκινών όσο και της χαμηλού βαθμού φλεγμονής στην οστική μάζα των παχύσαρκων
παιδιών.
115
Ενθέσεις
Δ.Α 01
ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΠΑΧΥΣΑΡΚΙΑΣ ΜΕ ΤΟ NPY
Παρρά Γεωργία1, Τράπαλη Μαρία2
1 Πτυχιούχος Τμήματος Ιατρικών Εργαστηρίων, ΤΕΙ ΑΘΗΝΑΣ, 2 Χημικός, PhD, MSc
Το NPY ανήκει στα κεντρικά ορεξιογόνα νευροπεπτίδια, αποτελεί ένα από τα πιο άφθονα πεπτίδια
στον εγκέφαλο. Η έκφρασή του γίνεται σε πολλές περιοχές όπως ο υποθάλαμος (κυρίως στους
πυρήνες ARC, PVN, VMH,DMH, LHA), οι αμυγδαλωτοί πυρήνες, ο ιππόκαμπος, ο NST και ο
νωτιαίος μυελός. Συγκεκριμένα εκφράζεται μαζί με το GAD2 στους ίδιους νευρώνες στον
υποθάλαμο και πιο συγκεκριμένα στον τοξοειδή πυρήνα. Οι νευρώνες αυτοί δρουν σε διάφορες
άλλες περιοχές του υποθαλάμου για να διεγείρουν την πρόσληψη τροφής. Το σήμα του NPY
μεταδίδεται μέσω μίας ετερογενούς οικογένειας υποδοχέων ένας από τους οποίους είναι και ο
NPY2R. Το NPY2R αποτελεί έναν ανασταλτικό υποδοχέα ο οποίος εκφράζεται σε αφθονία στον
τοξοειδή πυρήνα.
Το NPY εγχέεται κυρίως στον κοιλιακό έσω πυρήνα του υποθαλάμου, επάγει την παχυσαρκία και
με αναστολή της συμπαθητικής κίνησης, το NPY μπορεί να διεγείρει την απελευθέρωση της
ινσουλίνης και μπορεί να προκαλέσει παχυσαρκία.
Πραγματοποιήθηκαν έρευνες σε αρουραίους, οι οποίες έδειξαν την σχέση του NPY με την
παχυσαρκία: 1η έρευνα Η υπορύθμηση της έκφρασης του υποθαλάμου προοπιομελανοκορτίνης (POMC) μετά τον απογαλακτισμό σχετίζεται με υπερφαγία και προκαλείται
από την παχυσαρκία, (σε αρουραίους JCR) που υπερεκφράζουν το NPY. 2η έρευνα Τα
νευροπεπτίδια του υποθαλάμου που συνδέονται με την σίτιση εκφράζονται διαφορετικά σε
επιρρεπείς παχύσαρκους και στους αδύνατους αρουραίους. 3η έρευνα Αποδείχθηκε ότι με τον
υποσιτισμό κατά τα πρώτα στάδια της ζωής τροποποιείται η κατανομή του NPY κατά μήκος του
μονοπατιού τοξοειδή/παρακοιλιακού πυρήνα. Άλλη έρευνα, από καναδούς ερευνητές, έδειξε ότι
τα κύτταρα του λιπώδους ιστού της κοιλιάς παράγουν ποσότητες της ορμόνης NPY.
Τέλος δημιουργείται το ερώτημα αν το NPY σχετίζεται με την ανθρώπινη παχυσαρκία.
Σύμφωνα με τα διαθέσιμα μέχρι τώρα στοιχεία και με βάση τα συμπεράσματα από μελέτες
ερευνητών η παχυσαρκία σχετίζεται με το NPY διότι η κεντρική χορήγηση του έχει δείξει ότι επάγει
τη λήψη τροφής.
Οι ανακαλύψεις σχετικά με την ορμόνη NPY είναι πιθανό ότι θα οδηγήσει σε νέους και
αποτελεσματικούς τρόπους πρόληψης της παχυσαρκίας.
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
1. Pandit R, Luijendijk M, Vanderschuren L, Fleur S, Adan R. Limbic substrates of the effects of
neuropeptide Y on intake of and motivation for palatable food.Obesity (Silver Spring). 2014 Feb
6. doi: 10.1002/oby.20718.
2. Rocha M, Fernandes P, Lotufo B Manhães A, Barradas P, Tenorio F. Undernutrition during early
life alters neuropeptide Y distribution along the arcuate/paraventricular pathway.
Neuroscience. 2014 Jan 3; 256:379-91.
116
3. Diané A, Pierce W, Russell J, Heth C, Vine D, Richard D, Proctor S. Down-regulation of
hypothalamic pro-opiomelanocortin (POMC) expression after weaning is associated with
hyperphagia-induced obesity in JCR rats overexpressing neuropeptide Y.Br J Nutr. 2014 Mar;
111(5):924-32. doi: 10.1017/S0007114513003061. Epub 2013 Oct 7.
4. Renshaw D, Batterham R. Peptide YY: A potential therapy for obesity. Curr Drug Targets 2005;
6:171-179.
5. Dube MG, Karla SP. Karla PS. Low abundance of NPY in the hypothalamus can produce
hyperphagia and obesity. Peptides 2007; 2:475-479.
6. Russell J, Graham S, Richardson M. Cardiovascular disease in the JCR:LA-cp rat.Mol Cell
Biochem. 1998 Nov; 188(1-2):113-26.
7. Krashes M, Shah B, Koda S, Lowell B. Rapid versus delayed stimulation of feeding by the
endogenously released AgRP neuron mediators GABA, NPY, and AgRP.Cell Metab. 2013 Oct 1;
18(4):588-95. doi: 10.1016/j.cmet.2013.09.009.
8. Beck B. Neuropeptide Y in normal eating and in genetic and dietary-induced obesity. Philos
Trans R Soc Lond B Biol Sci 2006; 361:1159-1185.
9. Diané A, Pierce W, Russell J, Heth C, Vine D, Richard D, Proctor S. Down-regulation of
hypothalamic pro-opiomelanocortin (POMC) expression after weaning is associated with
hyperphagia-induced obesity in JCR rats overexpressing neuropeptide Y.Br J Nutr. 2014
Mar;111(5):924-32. doi: 10.1017/S0007114513003061. Epub 2013 Oct 7.
10. Hsieh Y, Chen P, Yu C, Liao J, Kuo D. The neuropeptide Y Y1 receptor knockdown modulates
activator protein 1-involved feeding behavior in amphetamine-treated rats.Mol Brain. 2013
Nov 13; 6:46. doi: 10.1186/1756-6606-6-46.
117
Δ.Α 02
ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΗΣ ΛΕΒΕΤΙΡΑΚΕΤΑΜΗΣ ΣΤΟΝ ΟΡΟ ΑΣΘΕΝΩΝ
ΜΕ ΕΠΙΛΗΨΙΑ
Η. Μπέγας1, Α. Τσακάλωφ2, Ε. Δαρδιώτης3 και Ε. Ασπροδίνη1
Εργαστήρια 1Φαρμακολογίας και 2Χημείας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας και
3Νευρολογική Κλινική Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου, Λάρισα.
ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Η Λεβετιρακετάμη αποτελεί νεώτερο αντιεπιληπτικό φάρμακο δρώντας ως αναστολέας της
πρωτεΐνης SV2A, η οποία εμπλέκεται στην εξωκύττωση των κυστιδίων των νευροδιαβιβαστών. Η
Λεβετιρακετάμη δεν συνδέεται με τις πρωτεΐνες του ορού, δεν μεταβολίζεται από το ήπαρ (με
συνέπεια να παρουσιάζει αλληλεπιδράσεις με άλλα φάρμακα σπανίως), ενώ αποβάλλεται σε
ποσοστό σχεδόν 100% από τα νεφρά. Το θεραπευτικό της εύρος είναι 12-46 μg/mL. Η
παρακολούθηση των επιπέδων της Λεβετιρακετάμης χρησιμεύει στην πρόληψη της τοξικότητας,
στον έλεγχο συμμόρφωσης του ασθενούς και στην προσαρμογή της δοσολογίας σε περιπτώσεις
νεφρικής ανεπάρκειας.
ΣΚΟΠΟΣ
Η ανάπτυξη μιας απλής, ευαίσθητης και αξιόπιστης μεθόδου για τον προσδιορισμό της
Λεβετιρακετάμης στον ορό ασθενών με επιληψία.
ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ
Σε 100μL ορό ασθενούς ή σε ορό βαθμονόμησης και ποιοτικού ελέγχου προστέθηκαν 250μL
διαλύματος του Εσωτερικού Προτύπου (Ε.Π.: 1-μεθυλοξανθίνη 4μg/mL σε Μεθανόλη). Τα
δείγματα ανακινήθηκαν ισχυρά για 1΄ και αφέθηκαν σε ηρεμία για 5΄. Κατόπιν φυγοκεντρήθηκαν
για 10΄ στις 13000rpm, στους 4° C. Από το υπερκείμενο, 150μL εξατμίστηκαν σε ρεύμα αζώτου
στους 45° C και το ξηρό υπόλειμμα επαναδιαλύθηκε σε 150μL κινητής φάσης. Στη συνέχεια, 20μL
εγχύθηκαν στο χρωματογραφικό σύστημα το οποίο ήταν εξοπλισμένο με στήλη Beckman
Ultrasphere (C18, 250x4.6mm I.D., 5μm διάμετρος σωματιδίων). Η κινητή φάση αποτελούνταν από
ρυθμιστικό διάλυμα 20mM ΝaΗ2PO4/H3PO4 (pH=4,0) και ακετονιτρίλιο (94/6 v/v) και διέτρεχε την
στήλη με ταχύτητα 1mL/min σε θερμοκρασία 30° C. Η ανίχνευση της Λεβετιρακετάμης έγινε στα
205nm.
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
H Λεβετιρακετάμη και το Ε.Π. εκλούσθηκαν στα 11,9±0,3 min και 6,2±0,1 min, αντίστοιχα. Η
καμπύλη βαθμονόμησης των συγκεντρώσεων της Λεβετιρακετάμης έναντι του κλάσματος των
εμβαδών των χρωματογραφικών κορυφών του φαρμάκου και του Ε.Π. ήταν γραμμική για εύρος
συγκεντρώσεων 2,5-100,0μg/mL με συντελεστή γραμμικότητας R2=0,9983. H διακύμανση εντός
σειράς και μεταξύ σειρών ήταν μικρότερη του 5,9 και 5,3%, αντίστοιχα (n=5). Η ακρίβεια
κυμάνθηκε από 100,3 έως 104,2%. Το όριο ποσοτικού προσδιορισμού ήταν 0,9μg/mL (S/N=10). Η
εξειδίκευση της μεθόδου διερευνήθηκε με την ανάλυση δειγμάτων ορού υγιών εθελοντών και
δείγματος ορού TDM Quality Control της εταιρείας ΒΙORAD το οποίο περιείχε 10 αντιεπιληπτικά
και 11 κοινώς συνταγογραφούμενα φάρμακα. Δεν παρατηρήθηκαν χρωματογραφικές παρεμβολές
στον χρόνο έκλουσης της Λεβετιρακετάμης και του Ε.Π.
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ
Αναπτύχθηκε μία απλή, αξιόπιστη και χαμηλού κόστους μέθοδος για τον προσδιορισμό της
Λεβετιρακετάμης στον ορό ασθενών με επιληψία. Η μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί στην
παρακολούθηση των επιπέδων του φαρμάκου με σκοπό την αποφυγή της τοξικότητας, την
διαπίστωση της συμμόρφωσης των ασθενών και την προσαρμογή της δοσολογίας σε επιληπτικούς
ασθενείς με νεφρική ανεπάρκεια.
118
Δ.Α 03
ΜΟΝΟ Η ΖΩΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΑΙΜΑΤΙΝΙΚΗ ΠΡΩΤΕΙΝΗ ΚΑΙ ΟΧΙ Η ΖΩΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΜΗ
ΑΙΜΑΤΙΝΙΚΗ ΠΡΩΤΕΙΝΗ, ΟΥΤΕ Η ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΠΡΩΤΕΙΝΗ, ΣΧΕΤΙΖΕΤΑΙ ΜΕ ΑΥΞΗΜΕΝΕΣ
ΤΙΜΕΣ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ ΚΑΙ ΑΙΜΑΤΟΚΡΙΤΗ
Άγγελος Ευαγγελόπουλος1, Ναταλία Βαλλιάνου1, Εκάβη Γεωργουσοπούλου2, Βασιλική
Μπουντζιούκα2, Μαρία Μπόνου1, Ευάγγελος Βογιατζάκης1, Ιωάννης Μπαρμπετσέας1, Πέτρος
Αυγερινός1, Δημοσθένης Παναγιωτάκος2
1ΓΝΑ
«Πολυκλινική», Αθήνα
Πανεπιστήμιο Αθηνών, Αθήνα
2Χαροκόπειο
Εισαγωγή: Η πρόσληψη διαφορετικών τύπων πρωτεΐνης μπορεί να σχετίζεται με διαφορές σε
βιοδείκτες μεταξύ διαφορετικών πληθυσμών.
Σκοπός: Σκοπός της εργασίας αυτής ήταν η μελέτη τυχόν διαφορών της επίδρασης της πρόσληψης
ζωικής προέλευσης πρωτεΐνης, αιματινικής και μη, καθώς και φυτικής προέλευσης πρωτεΐνης, σε
αιματολογικές και βιοχημικές παραμέτρους φλεγμονής, σε φαινομενικά υγιείς ενήλικες που
διαμένουν στην Αθήνα.
Υλικά και Μέθοδοι: Τετρακόσιοι ενενήντα φαινομενικά υγιείς ενήλικες (46±16 έτη, 40% άνδρες),
που επισκέφθηκαν το ΓΝΑ « Πολυκλινική» για εξετάσεις ρουτίνας, συμμετείχαν εθελοντικά στη
μελέτη (ποσοστό συμμετοχής 85%). Δημογραφικά, ανθρωπομετρικά και άλλα χαρακτηριστικά του
τρόπου ζωής των συμμετεχόντων καταγράφηκαν, ενώ οι συμμετέχοντες συμπλήρωσαν και ένα
ημιποσοτικό έγκυρο ερωτηματολόγιο, που αφορούσε τις διατροφικές τους συνήθειες. Η
πρόσληψη πρωτεΐνης κατατάχθηκε σε τρεις διαφορετικές κατηγορίες: ζωικής προέλευσης
αιματινική πρωτεΐνη, ζωικής προέλευσης μη αιματινική πρωτεΐνη και πρωτεΐνη φυτικής
προέλευσης. Σε όλους τους συμμετέχοντες μετρήθηκαν σάκχαρο νηστείας, κρεατινίνη, ουρικό οξύ,
ολική χοληστερόλη, LDL-χοληστερόλη, HDL-χοληστερόλη, τριγλυκερίδια, cystatin C, απτοσφαιρίνη,
αιμοσφαιρίνη, αιματοκρίτης, σίδηρος ορού, φερριτίνη, λευκά αιμοσφαίρια, μονοκύτταρα,
αιμοπετάλια και C-αντιδρώσα πρωτεΐνη.
Αποτελέσματα: Η πρόσληψη ζωικής πρωτεΐνης, αιματινικής προέλευσης σχετιζόταν με αυξημένες
τιμές αιμοσφαιρίνης και αιματοκρίτη (p<0.05), ενώ η πρόσληψη ζωικής προέλευσης, μη
αιματινικής πρωτεΐνης καθώς και η πρωτεΐνη φυτικής προέλευσης δε σχετιζόταν με τις
αιματολογικές παραμέτρους ούτε με τους βιοχημικούς δείκτες φλεγμονής που μελετήθηκαν,
λαμβανομένων υπόψιν των διαιτητικών παραμέτρων και των χαρακτηριστικών του τρόπου ζωής.
Συμπέρασμα: Η πρόσληψη ζωικής πρωτεΐνης, αιματινικής προέλευσης μόνο φαίνεται να
σχετίζεται θετικά με αιματολογικές παραμέτρους. Ο τυχόν συγχυτικός ρόλος που μπορεί να
διαδραματίζουν διαιτητικές συνήθειες και χαρακτηριστικά του τρόπου ζωής στις παραμέτρους
αυτές, χρήζει περαιτέρω διερεύνησης.
119
Δ.Α 04
ΚΑΤΑΝΟΜΗ ΤΩΝ ΚΛΑΣΜΑΤΩΝ ΤΗΣ HDL-ΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗΣ ΣΤΟΝ ΟΡΟ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΧΡΟΝΙΑ
ΝΕΦΡΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ
Σαμουηλίδη Ελισάβετ1,Κωστόπουλος Βασίλης1,Λιαούρη Αυγουστίνα1,Κιούση Εύα 2 ,
Παπαμανώλης Εμμανουήλ 2 , Μπούντου Ειρήνη 2, Γράψα Ειρήνη2
Τμήμα Γ.Ν.Α. ‘’ΑΛΕΞΑΝΔΡΑ’’, 2 Νεφρολογική Κλινική Πανεπιστημίου Αθηνών Γ.Ν.Α.
‘’ΑΡΕΤΑΙΕΙΟ’’, Αθήνα.
1Βιοχημικό
Εισαγωγή: Είναι γνωστό ότι η δυσλιποπρωτεїναιμία και οι μεταβολές στη δομή και στη
συγκέντρωση των κλασμάτων των λιποπρωτεїνών συμβάλουν στην εξέλιξη της αρτηριοσκλήρωσης
στους ασθενείς με χρόνια νεφρική ανεπάρκεια (ΧΝΑ). Η ελάττωση της HDL υποτάξης 2 (HDL2-C)
στον ορό, που έχει προστατευτική δράση ως προς την αθηρωμάτωση, καθώς και της υπόταξης 3
(HDL3-C), που έχει αντιοξειδωτικές ιδιότητες, αυξάνει τον κίνδυνο εμφάνισης καρδιαγγειακής
νόσου. Σκοπός της εργασίας ήταν να μελετήσουμε και να συγκρίνουμε τα επίπεδα των λιπιδίων
και των κλασμάτων της HDL-C σε ασθενείς με ΧΝΑ τελικού σταδίου σε αιμοκάθαρση (ΑΙΜΚ) με
εκείνα ασθενών με ΧΝΑ σταδίου 2 έως 5 (μη ΑΙΜΚ).
Μέθοδος: Μελετήθηκαν 31 ασθενείς μη ΑΙΜΚ (51±17 ετών,16 Α,15Γ), 34 ασθενείς σε ΑΙΜΚ για
73±16 μήνες (58±15 ετών, 19 Α,15Γ) και 21 φυσιολογικά άτομα (ΦΜ, 49±10 ετών, 11 Α,10Γ).Τα
HDL2-C και HDL3-C κλάσματα απομονώθηκαν από τον ορό με τη μέθοδο καταβύθισης ενός
σταδίου με διάλυμα ηπαρίνης/ MnCl2 / δεξτράνης. Κατόπιν μετρήθηκε στο προκύπτον
υπερκείμενο η συγκέντρωση της HDL3-C με την ομοιογενή μέθοδο προσδιορισμού HDL-C .
Αποτελέσματα: Η συγκέντρωση ολικής χοληστερόλης και LDL-C ήταν αυξημένη στους μη ΑΙΜΚ
ασθενείς σε σχέση με τους ασθενείς σε ΑΙΜΚ (p<0.01), ενώ των τριγλυκεριδίων ήταν σημαντικά
αυξημένη μόνο στους ΑΙΜΚ (138±52 mg/dl) έναντι των ΦΜ (82±32, p<0.001).H HDL-C ήταν
ελαττωμένη και στις δύο ομάδες ασθενών, αλλά η ελάττωση ήταν πιο έντονη στους ΑΙΜΚ (40±12
mg/dl) από ότι στους μη ΑΙΜΚ (53±16, p<0.01). Αναφορικά με τις υποτάξεις της HDL-C, βρέθηκε
ότι η HDL3-C ήταν δραματικά ελαττωμένη στους ΑΙΜΚ ασθενείς (11±3 mg/dl) συγκριτικά με τους
μη AIMK (28±8 mg/dl)) και ΦΜ (23±4 p<0.001).Η HDL2-C δεν διέφερε μεταξύ των ασθενών, αλλά
ήταν οριακά χαμηλότερη σε μη ΑΙΜΚ ασθενείς (24±13) σε σχέση με τους ΦΜ (33±9, p<0.05). O
λόγος HDL2 /HDL3 παρουσίαζε σημαντική αρνητική συσχέτιση με τα τριγλυκερίδια σε μη ΑΙΜΚ (r=0.364, p=0.044) και ΑΙΜΚ (r=-0.349, p=0.0461), ενώ η συσχέτιση του λόγου με την HDL-C ήταν
θετική (μη ΑΙΜΚ: r=0.510,p=0.0034, AIMK: r=0.568, p=0.0005).
Συμπέρασματα:1)Στους μη ΑΙΜΚ ασθενείς,παρατηρείται σταδιακή ελάττωση της ολικής
χοληστερόλης και της LDL-C ταυτόχρονα με την ελάττωση της HDL-C .2) Η ΑΙΜΚ δεν φαίνεται να
επηρεάζει τα επίπεδα της HDL2-C υποτάξης. Ωστόσο φαίνεται να προκαλεί σημαντική ελάττωση
της HDL3-C,η οποία μπορεί να σχετίζεται με την απώλεια της αντιοξειδωτικής ικανότητας της HDLC.3) Ο εύκολος εργαστηριακός προσδιορισμός των HDL2 και HDL3 κλασμάτων και η συσχέτιση του
λόγου HDL2/HDL3 με τη συγκέντρωση των τριγλυκεριδίων και HDL-C είναι δυνατόν να βοηθήσει
στην πρόγνωση και παρακολούθηση αρτηριοσκλήρωσης στους ασθενείς με ΧΝΑ.
120
Δ.Α 05
ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟ ΣΤΡΕΣ ΚΑΙ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΝΗΣΤΕΙΑ 40 ΗΜΕΡΩΝ
(ΠΡΟΔΡΟΜΗ ΕΡΓΑΣΙΑ)
Ε. Ποιμενίδου, Ε. Λυμπεράκη, Ε. Βαγδατλή, Ε. Παντζιαρέλα, Φ. Ελευθερίου, Β. Κωνσταντινίδου
Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων, Α.ΤΕΙ Θεσσαλονίκης
Εισαγωγή: Η ενίσχυση της αντιοξειδωτικής ικανότητας του οργανισμού μετά από διατροφή
πλούσια σε αντιοξειδωτικά είναι γνωστή. Η Ορθόδοξη νηστεία χαρακτηρίζεται από διατροφή
χαμηλής περιεκτικότητας σε κορεσμένα λιπαρά και υψηλή περιεκτικότητα σε φυτικές ίνες και
αντιοξειδωτικά.
Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να μελετηθεί η επίδραση της αυστηρής 40ήμερης νηστείας
στην αντιοξειδωτική ικανότητα του οργανισμού και στις παραμέτρους της γενικής αίματος.
Υλικό-Μέθοδος: Σε ομάδα 10 εθελοντών με παρόμοιο τρόπο διατροφής και μη καπνιστών, ηλικίας
45-60 ετών, μετρήθηκαν τα επίπεδα των ολικών αντιοξειδωτικών ΤΑC ορού και οι παράμετροι της
γενικής εξέτασης αίματος πριν και μετά από 40 ημέρες νηστεία από κρέας και γαλακτοκομικά
προϊόντα. Η μέτρηση των αντιοξειδωτικών έγινε με τη μέθοδο TEAC (Trolox equivalence
antioxidant capacity) που βασίζεται στην οξείδωση του 2,2’-azino-bis(3-ethylbenthiazoline)-6sulfonic (ΑΒΤS), ενώ οι παράμετροι της γενικής αίματος μετρήθηκαν σε αιματολογικό αναλυτή. Η
στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πριν και μετά τη νηστεία έγινε με το t-paired test ή το
Wilcoxon Signed Ranks Test, ανάλογα με την κανονικότητα των παραμέτρων, στο στατιστικό
πρόγραμμα SPSS 21.
Αποτελέσματα: Η μέση τιμή των ΤAC πριν και μετά τη νηστεία ήταν 1,098mM και 2,749mM
αντίστοιχα, με παρατηρούμενη αύξηση έως και 250%, στατιστικά πολύ σημαντική (p<0,001) Ως
προς τις αιματολογικές παραμέτρους παρατηρήθηκε μια στατιστικά σημαντική ελάττωση του
αιματοκρίτη ((p=0,037) και της μέσης περιεκτικότητας αιμοσφαιρίνης των ερυθροκυττάρων (MCH)
(p=0,007), ενώ αυξήθηκε στατιστικά σημαντικά το εύρος κατανομής των ερυθροκυττάρων (RDW)
(p=0,049), γεγονότα που αποδόθηκαν στη μειωμένη πρόσληψη σιδήρου και την ελάττωση της
ερυθροποιίας.
Συμπεράσματα: Σύμφωνα με την ανάλυση των δεδομένων της έρευνας, φαίνεται ότι η ορθόδοξη
νηστεία έχει θετική επίδραση στην αντιοξειδωτική ικανότητα του οργανισμού αλλά επηρεάζει
αρνητικά την ερυθροποιία. Η έρευνα θα συνεχιστεί με περισσότερο αριθμό δειγμάτων και
προσδιορισμό και άλλων βιοχημικών δεικτών.
121
Δ.Α 06
ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ ΜΕΤΑΜΟΣΧΕΥΜΕΝΩΝ ΝΕΦΡΟΥ, ΠΟΥ ΛΑΜΒΑΝΟΥΝ
ΑΝΟΣΤΟΛΕΙΣ ΤΗΣ ΚΑΛΣΙΝΕΥΡΙΝΗΣ.
Ε. Μπελεσιώτου2 , Α. Γρηγοράτου1, Α. Μελπίδου 1, Ε. Περιβολιώτη2, Μ. Πρατικάκη1, Ζ.
Ψαρουδάκη2, Χ. Πάντζιου1, Α. Αργυροπούλου2, Ζ. Παπαρρίζου2, Δ. Κόκκινου2, Σ. Ιωαννίδου1.
Βιοχημικό1 και Μικροβιολογικό2 Εργαστήριο, Π.Γ.Ν.Α. "Ο Ευαγγελισμός».
Σκοπός: Ο εντοπισμός και καταγραφή των μεταμοσχευμένων νεφρού, οι οποίοι λαμβάνουν
ανοσοκατασταλτικά – αναστολείς της καλσινευρίνης (Cyclosporine ή Tacrolimus)
ή / και
αναστολείς της m-TOR (Everolimus) και οι οποίοι κατά τη διάρκεια του πρώτου έτους μετά τη
λήψη του μοσχεύματος παρουσιάζουν μικροβιακές λοιμώξεις, που εγκυμονούν αυξημένο κίνδυνο
απόρριψης και θνητότητας. Η βελτιστοποίηση και εξατομίκευση της χορηγούμενης αγωγής
αποσκοπεί στη μακροχρόνια επιβίωση του μοσχεύματος.
Υλικό και μέθοδοι: Κατά την διάρκεια 2 ετών σε 18 μεταμοσχευμένους, που παρουσίασαν
πυρετό ελήφθησαν αιμοκαλλιέργειες και ουροκαλλιέργειες. Τα ανοσοκατασταλτικά
προσδιορίστηκαν σε ολικό αίμα. Η κυκλοσπορίνη μετρήθηκε με τη μέθοδο του πολωμένου
ανοσοφθορισμού (FPIA), σε αναλυτή AxSYM και
το τακρόλιμους με τη μέθοδο της
χημειοφωταύγειας (CMIA) σε αναλυτή Architect (Abbott). Επίσης μετρήθηκε η CRP, δείκτης
φλεγμονής των ασθενών, σε αναλυτή Modular (Roche). Η επώαση των αιμοκαλλιεργειών έγινε με
το σύστημα BACTEC NR 9240, ακολούθησε χρώση κατά Gram και έγινε άμεσος ενοφθαλμισμός
και καλλιέργεια σε ποικίλα, κοινά και ειδικά θρεπτικά υλικά κάτω από ειδικές συνθήκες (επώαση
στους 35-37° C για 48 ώρες, σε 5-7% CO2). Η βιοχημική ταυτοποίηση των απομονωθέντων
βακτηρίων έγινε με με το αυτόματο σύστημα Viteκ 2 (BioMerieux) και ο έλεγχος ευαισθησίας των
μικροοργανισμών στα αντιβιοτικά με το αυτόματο σύστημα Viteκ 2 και με E test (AB Biodisk).
Αποτελέσματα: Σε 6 ασθενείς (33,3%) ανιχνεύθηκε αυξημένη C-αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP). Σε
όλους τους ασθενείς μετρήθηκαν τα επίπεδα των ανοσοκατασταλτικών και ευρέθησαν εντός του
θεραπευτικού παραθύρου. 2 από τους 18 ασθενείς (11,1%) είχαν μόνο μικροβιαιμία (από κόκκους
θετικούς κατά Gram), ενώ σε 16 ασθενείς (18,9%) συνυπήρχε ουρολοίμωξη με τον ίδιο
μικροοργανισμό και οι 2 από τους 18 ασθενείς ( (11.1%) οδηγήθηκαν σε σηπτικό shock.
Συγκεκριμένα απομονώθηκαν: E.coli σε 5 ασθενείς (27,8%), K. pneumoniae σε 4 ασθενείς
(22,2%), A.baumanii σε 3 ασθενείς (16,7%), P.aeruginosa σε 2 ασθενείς (11,1%), S. Epidermidis
σε 2 ασθενείς (11,1%) και τέλος E. faecalis σε 1 ασθενή (5,6%). Τα περισσότερα επεισόδια
λοίμωξης σε 15 ασθενείς (83,3%) παρουσιάστηκαν κατά το πρώτο τρίμηνο μετά την
μεταμόσχευση. Κατά τη διάρκεια της λοίμωξης απεβίωσαν 2 ασθενείς (11,1%).
Συμπεράσματα: Αρχικά όλοι οι μεταμοσχευμένοι με μικροβιακές λοιμώξεις δεν παρουσίαζαν
σοβαρή κλινική εικόνα, επικρατούν τα αρνητικά κατά Gram βακτηρίδια, σε ένα μικρό ποσοστό
ασθενών υπήρχε μόνο μικροβιαιμία από κόκκους θετικούς κατά Gram ενώ πολύ μικρό ποσοστό
ασθενών απεβίωσε κατά την διάρκεια της λοίμωξης. Η συχνή μέτρηση των επιπέδων των
ανοσοκατασταλτικών, η προφύλαξη και η άμεση αντιμετώπιση των μικροβιακών λοιμώξεων με την
κατάλληλη θεραπευτική αγωγή εξασφαλίζει την επιτυχία της μεταμόσχευσης και την επιβίωση των
ληπτών.
122
Δ.Α 07
ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΟΛΙΚΩΝ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΦΕΡΡΙΤΙΝΗΣ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΘΑΛΑΣΣΑΙΜΙΑ, ΣΤΗΝ
ΣΑΡΔΗΝΙΑ ΣΤΗΝ ΚΕΝΤΡΙΚΗ ΜΑΚΕΔΟΝΙΑ ΚΑΙ ΣΤΗΝ ΤΕΧΕΡΑΝΗ
Ι. Τσαμεσίδης1, Ε. Λυμπεράκη1, Ε. Βαγδατλή1, Α. Καλπάκα2, E. Γιαρτζά2, C. Fozza3, A. Pantaleo3,
S. Shams4
1Τμήμα
Ιατρικών Εργαστηρίων, ΑΤΕΙΘ 2 Νοσοκομείο Άγιος Παύλος, Θεσσαλονίκη 3Πανεπιστημιακό
Νοσοκομείο Σάσσαρι, Σαρδηνία, 4Παιδιατρικό Κέντρο, Τεχεράνη, Ιράν
Εισαγωγή: Είναι γνωστό ότι στους ασθενείς με θαλασσαιμία, λόγω της χρόνιας αιμόλυσης, των
συχνών μεταγγίσεων αίματος και της αυξημένης εντερικής απορρόφησης του σιδήρου,
παρατηρείται υπερφόρτωση σιδήρου. Η υπερφόρτωση αυτή σχετίζεται με την παραγωγή
ελευθέρων ριζών (ROS), που προκαλούν βλάβη διάφορων ενδοκυτταρικών παραγόντων με
παράλληλη εξασθένιση του αντιοξειδωτικού συστήματος του οργανισμού. Αντίθετα, η φερριτίνη
θεωρείται ενδογενής αντιοξειδωτική ουσία, καθώς προστατεύει τον οργανισμό από την τοξική
δράση του ελεύθερου σιδήρου. Παράλληλα είναι ήδη γνωστό ότι ενδογενές αντιοξειδωτικό
αποτελεί και η χολερυθρίνη, που είναι γενικά αυξημένη στους θαλασσαιμικούς, λόγω της χρόνιας
αιμόλυσης και της ηπατοτοξικότητας της υπερφόρτωσης σιδήρου.
Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση της σχέσης της ολικής αντιοξειδωτικής
ικανότητας με την φερριτίνη, ασθενών με θαλασσαιμία τριών διαφορετικών περιοχών, δυο
μεσογειακών χωρών όπως η Κεντρική Μακεδονία (Ελλάδα) και η Σαρδηνία (Ιταλία) καθώς και μιας
μουσουλμανικής, της Τεχεράνης (Ιράν).
Υλικά και μέθοδος: Σε 122 εθελοντές με θαλασσαιμία, 30 από την Κ.Μακεδονία, 30 από την
Σαρδηνία και 62 από την Τεχεράνη, ηλικίας 25-60 ετών μετρήθηκε η αντιοξειδωτική ικανότητα
(TAC) του πλάσματος, με τη μέθοδο TEAC (Trolox equivalence antioxidant capacity) που βασίζεται
στην οξείδωση του 2,2’-azino-bis(3-ethylbenthiazoline)-6-sulfonic (ΑΒΤS), ενώ τα επίπεδα
φερριτίνης είχαν προηγουμένως μετρηθεί με ραδιοανοσομέτρηση (RIA). Επιπρόσθετα μετρήθηκε
και η χολερυθρίνη, η αντιοξειδωτική δράση της οποίας περιλαμβάνεται στη μέτρηση της TAC. Στο
SPSS21 υπολογίσθηκε ο συντελεστής συσχέτισης μεταξύ της TAC και της φερριτίνης και στους τρεις
πληθυσμούς και αναζητήθηκε ύπαρξη τυχόν γραμμικής σχέσης (regression) μεταξύ των μέσων
τιμών της TAC και της φερριτίνης των τριών πληθυσμών.
Αποτελέσματα: Οι τιμές των αντιοξειδωτικών, της φερριτίνης και της χολερυθρίνης φαίνονται
στον πίνακα 1. Υπήρξε μια αρνητική γραμμική σχέση μεταξύ των μέσων τιμών της TAC και της
φερριτίνης των τριών πληθυσμών (R2:0,992), όμως μόνον στους Έλληνες οι τιμές της φερριτίνης
είχαν ισχυρή αρνητική συσχέτιση με αυτήν της TAC (r:-0,79). H μέση τιμή χολερυθρίνης στους
Σαρδήνιους ήταν υψηλή, αυξάνοντας πιθανόν την τιμή της TAC.
ΠΕΡΙΟΧΗ
ΘΑΛΑΣΣΑΙΜΙΚΩΝ
Κ.Μακεδονία
Σαρδηνία
Τεχεράνη
ΚΑΤΑΓΩΓΗΣ TAC
(mM)
2,4
1,8
1,5
ΦΕΡΡΙΤΙΝΗ
(ng/ml)
1084,7
1794,2
2291
ΧΟΛΕΡΥΘΡΙΝΗ (mg/dl)
1,23
2,9
1,25
Συμπεράσματα:1.Στους θαλασσαιμικούς η φερριτίνη, αντανακλώντας την υπερφόρτωση σιδήρου,
δεν μπορεί να θεωρηθεί ως ενδογενές αντιοξειδωτικό αλλά αντίθετα η τιμή της είναι ανάλογη με
123
το οξειδωτικό στρες. 2.Η μη ανεύρεση συσχέτισης TAC/φερριτίνης στους Σαρδήνιους με την υψηλή
χολερυθρίνη και στους Ιρανούς με τη μη μεσογειακή διατροφή, οδηγούν στο συμπέρασμα ότι για
την εξαγωγή καλύτερων συμπερασμάτων θα πρέπει να συνυπολογισθούν οι τιμές και άλλων
ενδογενών αντιοξειδωτικών, όπως του ουρικού οξέος καθώς και της κορτιζόλης (δείκτης του
στρες).
124
Δ.Α 08
ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΟΛΙΚΩΝ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΩΝ ΥΓΙΩΝ ΑΤΟΜΩΝ ΚΑΙ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΘΑΛΑΣΣΑΙΜΙΑ, ΣΤΗΝ
ΣΑΡΔΗΝΙΑ ΣΤΗΝ ΚΕΝΤΡΙΚΗ ΜΑΚΕΔΟΝΙΑ ΚΑΙ ΣΤΗΝ ΤΕΧΕΡΑΝΗ
Ι. Τσαμεσίδης1, Ε. Λυμπεράκη1, Ε. Βαγδατλή1, C. Fozza2, A. Pantaleo2, Α. Καλπάκα3, Ε. Γιαρτζά3,
S.Shams4
1Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων, ΑΤΕΙΘ 2Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Σάσσαρι, Σαρδηνία
3Νοσοκομείο Άγιος Παύλος, Θεσσαλονίκη 4Παιδιατρικό Κέντρο, Τεχεράνη, Ιράν
Εισαγωγή: Αντιφατικά δεδομένα υπάρχουν στη διεθνή βιβλιογραφία σχετικά με την ολική
αντιοξειδωτική κατάσταση των ατόμων με μεσογειακή αναιμία. Σε αρκετές μελέτες η ολική
αντιοξειδωτική ικανότητα των θαλασσαιμικών εμφανίζεται μικρότερη από αυτήν των υγιών
ατόμων, ενώ σε άλλες μεγαλύτερη. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η σύγκριση της ολικής
αντιοξειδωτικής ικανότητας ασθενών με θαλασσαιμία με αυτές των υγιών, σε τρείς περιοχές με
διαφορετικές διατροφικές συνήθειες, τρόπο ζωής και φυλετικές διαφορές: σε δυο μεσογειακές
περιοχές, την Κεντρική Μακεδονία (Ελλάδα) και τη Σαρδηνία (Ιταλία), επίσης της μουσουλμανικής
Τεχεράνης (Ιράν) καθώς και μεταξύ των τριών πληθυσμών. Υλικό και Μέθοδος: Σε σύνολο 220
εθελοντών, 122 με θαλασσαιμία εκ των οποίων, 30 από την Κ.Μακεδονία, 30 από την Σαρδηνία,
62 από την Τεχεράνη και 98 υγιών, 24 από την Κ.Μακεδονία, 12 από την Σαρδηνία και 62 από το
Ιράν, ηλικίας 25-60 ετών, μετρήθηκε η αντιοξειδωτική ικανότητα (TAC) του πλάσματος, με τη
μέθοδο TEAC (Trolox equivalence antioxidant capacity) που βασίζεται στην οξείδωση του 2,2’azino-bis(3-ethylbenthiazoline)-6-sulfonic (ΑΒΤS). Στο SPSS21 έγινε σύγκριση των τιμών των έξι
ομάδων με το t-student test.
Αποτελέσματα: Ο μέσος όρος και η σταθερά απόκλιση των τιμών των αντιοξειδωτικών υγιών και
θαλασσαιμικών φαίνονται στον πίνακα 1. Οι Έλληνες, τόσο οι υγιείς όσο και οι θαλασσαιμικοί,
είχαν στατιστικά υψηλότερες τιμές TAC από αυτές των Σαρδηνίων και των Ιρανών (p<0,001). Οι
τιμές της TAC των θαλασσαιμικών, ήταν στατιστικά σημαντικά υψηλότερες αυτών των υγιών
ατόμων και στις τρεις περιοχές (πιν.1).
TAC ± SD (mM)
p
Θαλασσαιμικοί
Υγιείς
Θαλασ./υγιών
Κ.Μακεδονία
2,4 ± 0,11
2,05 ± 0,15
0,0011
Σαρδηνία
1,8 ± 0,12
1,49 ± 0,13
0,00017
Τεχεράνη
1,5 ± 0,18
1,4 ± 0,20
0,001
Συμπεράσματα: Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων μας προκύπτει ότι 1. Οι υψηλότερες τιμές
ολικών αντιοξειδωτικών στους Έλληνες (υγιών και θαλασσαιμικών), οδηγούν στο συμπέρασμα ότι
οι διατροφικές συνήθειες, ο τρόπος ζωής και οι φυλετικές διαφορές είναι καθοριστικές για την
οξειδωτική ικανότητα των ατόμων. 2. Οι θαλασσαιμικοί, παρόλο το οξειδωτικό στρες που
εμφανίζουν λόγω της συσσώρευσης του σιδήρου, παρουσιάζουν μεγαλύτερη αντιοξειδωτική
ικανότητα από αυτήν των υγιών, πιθανόν λόγω της μεγαλύτερης προσοχής που αποδίδεται στη
διατροφή και τον τρόπο ζωής τους. Η μέτρηση της φερριτίνης και της χολερυθρίνης (ενδογενή
αντιοξειδωτικά) και της κορτιζόλης (δείκτης του στρες), θα βοηθήσει στον σχηματισμό πλήρους
εικόνας για το οξειδωτικό στρες που αναπτύσσουν τα άτομα αυτά.
125
Δ.Α 09
ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΦΥΤΟΥ ΣΙΔΕΡΙΤΗΣ (ΤΣΑΪ ΤΟΥ ΒΟΥΝΟΥ) ΚΑΙ ΤΟΥ
ΧΑΜΟΜΗΛΙΟΥ ΣΤΗΝ ΟΞΕΙΔΩΣΗ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΟΡΟΥ
Κλοτσουθύμιου Μ, Μακέδου Κ, Ηλιάδης Σ, Παπαγεωργίου Γ.
Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας, Ιατρικό Τμήμα, Σχολή Επιστημών Υγείας, Αριστοτέλειο
Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης
Εισαγωγή: Το τσάι του βουνού ή σιδερίτης (Sideritis syriaca, της οικογένειας Labiatea) θεωρείται
ότι έχει αντιφλεγμονώδεις, αντιμικροβιακές και αντιοξειδωτικές ιδιότητες, που οφείλονται στα
διτερπενοειδή, τα φλαβονοειδή και τα στοιχειώδη έλαια που περιέχει. Το χαμομήλι (Matricaria
chamomilla, της οικογένειας Chamomilla) θεωρείται ότι έχει αντιφλεγμονώδεις, αγχολυτικές,
αντισπασμωδικές, ήπιες αντιβακτηριδιακές και αντιαιμοπεταλιακές ιδιότητες.
Σκοπός: Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση του υδατικού εκχυλίσματος του φυτού
σιδερίτης και του χαμομηλιού στην ex vivo οξείδωση των ολικών λιποπρωτεϊνών του ορού
αίματος.
Υλικά και μέθοδοι: Η λήψη αίματος έγινε από υγιείς δότες έπειτα από νηστεία 12 ωρών. Για την
οξείδωση των λιποπρωτεϊνών αραιωμένου ορού (1/100 σε PBS) χρησιμοποιήθηκε υδατικό
διάλυμα 50μΜ θειικού χαλκού. Η εκχύλιση των αντιοξειδωτικών ουσιών του τσαγιού έγινε σε
βρασμένο απεσταγμένο νερό (10g φυτού σε 200ml νερό) και χρησιμοποιήθηκαν αραιώσεις 1/100,
1/200 και 1/1000 του εκχυλίσματος σε νερό, ενώ για το εκχύλισμα του χαμομηλιού
χρησιμοποιήθηκαν αραιώσεις 1/200, 1/500, 1/1000 και 1/2000, ώστε να καλυφθεί όλο το εύρος
των συγκεντρώσεων έως εκείνες στις οποίες δεν οξειδώνονται οι λιποπρωτεΐνες. Η οξείδωση
πραγματοποιήθηκε σε φασματοφωτόμετρο θερμοστατημένο στους 37oC, σε μήκος κύματος
245nm, συνεχώς για 6 ώρες. Ο χρόνος καθυστέρησης (lag time) στην οξείδωση, τόσο των
δειγμάτων, όσο και του μάρτυρα (χωρίς αντιοξειδωτικό), υπολογίσθηκε από την καμπύλη
οξείδωσης.
Αποτελέσματα: Μετά την προσθήκη εκχυλίσματος τσαγιού με αραιώσεις 1/1000 και 1/200
παρατηρήθηκε αύξηση του lag time κατά 192% και 285,5% αντίστοιχα. Δεν σημειώθηκε οξείδωση
των λιποπρωτεϊνών του ορού παρουσία εκχυλίσματος με αραίωση 1/100. Μετά την προσθήκη
εκχυλίσματος χαμομηλιού με αραιώσεις 1/1000 και 1/2000 παρατηρήθηκε αύξηση του lag time
κατά 164% και 107%, αντίστοιχα. Δεν σημειώθηκε οξείδωση των λιποπρωτεϊνών του ορού
παρουσία εκχυλίσματος με αραίωση 1/500 και 1/200 στις 6 ώρες του πειράματος (αύξηση lag time
> 275%).
Συμπεράσματα: Στην αραίωση 1/1000 και τα δύο φυτά παρουσίασαν μεγάλη αναστολή της
οξείδωσης, χωρίς σημαντική διαφορά μεταξύ τους (τσάι 192% και χαμομήλι 164%). Σε
μεγαλύτερες συγκεντρώσεις, το χαμομήλι δείχνει ισχυρότερη αντιοξειδωτική δράση σε σχέση με
το τσάι του βουνού, αφού αναστολή >275% της οξείδωσης των λιποπρωτεϊνών επιτυγχάνεται με
αραιότερο διάλυμα χαμομηλιού (1/500) σε σχέση με το τσάι του βουνού (1/200). Από τα
πειράματα καταδεικνύεται ότι και τα δύο φυτά είναι ισχυρά αντιοξειδωτικά παρέχοντας πιθανόν
προστασία από την αθηροσκλήρωση, με το χαμομήλι να έχει μεγαλύτερη αντιοξειδωτική δράση
από το τσάι του βουνού.
126
Δ.Α 10
ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΜΕΤΡΗΣΗΣ ΤΗΣ β2-ΜΙΚΡΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ
Χ.Ψαχούλια1,Λ.Κυρίου1,Α.Παπαγεωργίου2, I.Κάκας2,Μ.Πρατικάκη1,
Α.Τζανάτου1,Ι.Τζιώνα1,Α.Τσιρογιάννη2,Σ.Ιωαννίδου1
1. Βιοχημικό τμήμα Γ.Ν.Α. ΕΥΑΓΓΕΛΙΣΜΟΣ
2. Ανοσολογικό τμήμα Γ.Ν.Α. ΕΥΑΓΓΕΛΙΣΜΟΣ
ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Η β2-μικροσφαιρίνη είναι μία πρωτεΐνη 11,8KD που συμμετέχει στον σχηματισμό της βαλυσίδας των ανθρώπινων λευκοκυτταρικών αντιγόνων (HLA) του μείζoνος συμπλέγματος
ιστοσυμβατότητας (MHC). Είναι παρούσα σε ιδιαίτερα μεγάλες συγκεντρώσεις στην επιφάνεια
των λεμφοκυττάρων. Σε καλοήθεις καταστάσεις αξιολογείται κυρίως στη διαφορική διάγνωση
σπειραματικής δυσλειτουργίας από σωληναριακή βλάβη των νεφρών, νεφρική ανεπάρκεια,
φλεγμονώδη νοσήματα, τοξική επίδραση φαρμάκων (π.χ. κυκλοσπορίνης), αυτοάνοσα νοσήματα.
Επιπλέον αξιολογείται σε κακοήθεις καταστάσεις κυρίως σε αιματολογικά νοσήματα όπως
πολλαπλούν μυέλωμα, λεμφώματα, λεμφοκυτταρική λευχαιμία κ.λ.π..
ΣΚΟΠΟΣ: Η σύγκριση και αξιολόγηση των σειριακών μετρήσεων ασθενών, με τρεις διαφορετικές
μεθόδους ώστε να είναι εφικτή η εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων από τους κλινικούς ιατρούς
για την πορεία της εξέλιξης της νόσου στα πλαίσια αλλαγής μεθόδου.
ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Μετρήθηκε η β2-μικροσφαιρίνη σε ορούς 65 ασθενών μεγάλου εύρους
συγκεντρώσεων με τρείς διαφορετικές μεθόδους:α) τον Ανοσοφθoρισμό στον ανοσοχημικό
αναλητή Axsym της Abbott, με τιμές αναφοράς : <1900 μg/L, β) την Θολωσιμετρία σε αναλυτή
Modular της Roche με τιμές αναφοράς : (0.8 – 2.2) mg/L και τα 35 δείγματα μετρήθηκαν και με γ)
την Νεφελομετρία σε νεφελόμετρο Dade Behring, με τιμές αναφοράς (0,07- 0,18) mg/dl .
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Οι σχέσεις, που συνδέουν τις τιμές είναι y=ax+b :
β2-Mod=1.224β2-Axsym+1.22 με δa=0,017 και δb=0.127, β2-Nef=1.28
β2-Axsym+0.139 με δa=0,0164 και δb=0.139 και
δb=0.106 όλες οι τιμές σε mg/L .
β2-Mod=0,978β2-Nef -0,21 με δa=0,009 και
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Οι τιμές της β2-μικροσφαιρίνης μετρούμενες με θολωσιμετρία σχετίζονται
στατιστικώς σημαντικά με τις τιμές της β2- μικροσφαιρίνης μετρούμενες με νεφελομετρία και η
κλίση της ευθείας είναι α=0,978 με δa=0,009 σχεδόν (1). Μεγαλύτερες αποκλίσεις παρατηρούνται
στις τιμές της β2-μικροσφαιρίνης μετρούμενες με ανοσοφθορισμό, όπου οι τιμές είναι
χαμηλότερες σε σχέση με τις δύο άλλες μεθόδους και με την μεγαλύτερη απόκλιση στις πολύ
υψηλές συγκεντρώσεις.
127
Δ.Α 11
ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΠΑΡΑΤΕΤΑΜΕΝΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ, ΧΑΜΗΛΗΣ ΕΝΤΑΣΗΣ ΣΤΟ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟ ΤΟΥ
ΣΙΔΗΡΟΥ ΚΑΙ ΣΤΑ ΕΠΙΠΕΔΑ ΤΗΣ ΕΨΙΔΙΝΗΣ.
Κατερίνα Σκενδέρη1, Γιώργος Παπανοκολάου1, Αυγή Μαμαλάκη2, Δημοσθένης Παναγιωτάκος1,
Ελένη Κυρατζοπούλου2, Πέτρος Ηλιάδης2, Μαρία Τσιρώνη3
1Τμήμα
Επιστήμης Διαιτολογίας-Διατροφής, Χαροκόπειο Πανεπιστήμιο, Αθήνα
2Εργαστήριο
3Τμήμα
Μοριακής Βιολογίας και Ανοσοβιοτεχνολογίας, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ, Αθήνα
Νοσηλευτικής, Πανεπιστήμιο Πελοποννήσου, Σπάρτη
Η άσκηση ως στρεσογόνος παράγοντας είναι γνωστό ότι μπορεί να επάγει μια φλεγμονώδη
κατάσταση. Ο σίδηρος είναι ρυθμιστικός παράγοντας συμβάλλοντας στη μεταφορά του οξυγόνου,
απαραίτητου στοιχείου της αερόβιας άσκησης. Η φλεγμονή επάγει τη συγκέντρωση του σιδήρου
στα μακροφάγα, η οποία ρυθμίζεται από την έκκριση της εψιδίνης.
Σκοπός: Μελέτη της επίδρασης της παρατεταμένης άσκησης, μέτριας έντασης στο μεταβολισμό
του σιδήρου, μέσω των αλλαγών που υφίστανται οι δείκτες της φερριτίνης και του σιδήρου καθώς
και στα επίπεδα εψιδίνης στον ορό αμέσως μετά την άσκηση και 48 ώρες μετά το τέλος της
άσκησης σε υπερμαραθώνιους δρομείς.
Μέθοδος: Δείγματα αίματος ελήφθησαν πριν (φάση Ι) και αμέσως μετά τον αγώνα (φάση ΙΙ)
καθώς και 48 ώρες μετά τη λήξη του αγώνα (φάση ΙΙΙ) από 19 άνδρες δρομείς που συμμετείχαν
στον υπερμαραθώνιο αγώνα «Σπάρταθλον» (246 Km συνεχούς προσπάθειας από Αθήνα-Σπάρτη),
και τερμάτισαν σε λιγότερο από 36 ώρες. Οι συγκεντρώσεις του σιδήρου στον ορό
προσδιορίστηκαν με φωτομετρική μέθοδο (ALFA WASSERMANN, Schiapparelli biosystems, Inc.,
New Jersey), ενώ οι συγκεντρώσεις της φερριτίνης στον ορό προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο της
ανοσοενζυμικής φθορισμομετρίας (ST AIA-PACK FER, ΑΙΑ 600ΙΙ, Tosoh Corporation). Τα επίπεδα
εψιδίνης μετρήθηκαν στον ορό με ανταγωνιστική Elisa.
Αποτελέσματα: Τα επίπεδα φερριτίνης αυξήθηκαν σε όλους τους δρομείς στη φάση ΙΙ (p=0,17) και
παρέμειναν αυξημένα στη φάση ΙΙΙ (p<0,01). Οι μέσοι όροι των επιπέδων του σιδήρου ήταν
73,58±23,75 μg/dl (φάση Ι), 95,74±48,85 (φάση II) και 54,56±18,42 (φάση ΙΙΙ) και τα επίπεδα
εψιδίνης ήταν 155,51±104,12, 157,9±126,06, and 124,38±67,55 ng/ml, στις φάσεις Ι, ΙΙ και ΙΙΙ,
αντίστοιχα. Μετά από ανάλυση διακύμανσης για επαναλαμβανόμενες μετρήσεις προκύπτει μια
αρνητική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων σιδήρου και εψιδίνης (b±SE: -1,429±0,577, p=0,026).
Συμπέρασμα: Όσον αφορά στα επίπεδα σιδήρου και εψιδίνης, σημειώθηκαν δύο διαφορετικές
αποκρίσεις στα επίπεδα της εψιδίνης που σχετίζονται με την παρατεταμένη άσκηση, χαμηλής
έντασης. Οι περισσότεροι δρομείς σημείωσαν μια μείωση στα επίπεδα εψιδίνης στη φάση ΙΙ, ενώ
άλλοι αύξησαν τις συγκεντρώσεις εψιδίνης. Παρά ταύτα, υπάρχει στατιστικά σημαντική αρνητική
συσχέτιση μεταξύ επιπέδων σιδήρου και εψιδίνης σε όλους τους δρομείς.
128
Δ.Α 12
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΑΝΤΙΨΥΧΩΣΙΚΟΥ ΦΑΡΜΑΚΟΥ ΚΛΟΖΑΠΙΝΗ ΣΤΟΝ ΟΡΟ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΥΓΡΗ
ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ ΚΑΙ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΣΤΟ ΥΠΕΡΙΩΔΕΣ
Η. Μπέγας1, Κ. Φάκα3, Α. Τσακάλωφ2, Ε. Κουβαράς1 και Ε. Ασπροδίνη1
Εργαστήρια 1Φαρμακολογίας και 2Χημείας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας και
3Ψυχιατρική Κλινική Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου, Λάρισα.
ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Η κλοζαπίνη (διβενζοδιαζεπίνη) αποτελεί «άτυπο» αντιψυχωσικό με μειωμένες, συγκρινόμενη με
τα τυπικά αντιψυχωσικά, εξωπυραμιδικές ενέργειες και όψιμη δυσκινησία. Θεωρείται φάρμακο
εκλογής για τις ανθεκτικές μορφές της σχιζοφρένειας λόγω της αποτελεσματικής μείωσης των
θετικών (ψευδαισθήσεις, παραληρητικές ιδέες) και των αρνητικών (άγχος, απάθεια, απόσυρση)
συμπτωμάτων της νόσου. Η μεγάλη διακύμανση της συγκέντρωσής της στον ορό ασθενών λόγω
διαφορετικής δραστηριότητας των ηπατικών ενζύμων, η αλληλεπίδραση με άλλα φάρμακα, η
υψηλή πιθανότητα για την μη συμμόρφωση του ασθενούς καθώς και ο αυξημένος κίνδυνος για
επιληπτικές κρίσεις και ακοκκιοκυττάρωση, σε περίπτωση υψηλών επιπέδων του φαρμάκου στον
ορό, καθιστούν απαραίτητη την παρακολούθηση των επιπέδων της. Η κλινική απόκριση
συσχετίζεται θετικά με συγκεντρώσεις 350-420ng/mL, με ανώτατο όριο απόκρισης τα 600838ng/mL.
ΣΚΟΠΟΣ
Η ανάπτυξη μιας απλής, ευαίσθητης και αξιόπιστης μεθόδου για τον προσδιορισμό της κλοζαπίνης
στον ορό ασθενών με σχιζοφρένεια.
ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ
Πρότυπα δείγματα παρασκευάστηκαν με εμβολιασμό δειγμάτων λευκού ορού σε συγκεντρώσεις
0,50, 100, 200, 500, 1000ng/mL και δείγματα ποιοτικού ελέγχου συγκεντρώσεων 75, 400 και
750ng/mL. Σε 800μL ορό ασθενούς ή σε πρότυπα δείγματα και δείγματα ποιοτικού ελέγχου
προστέθηκαν 160μL διαλύματος του Εσωτερικού Προτύπου (Ε.Π.: δεξτρομεθορφάνη 10μg/mL) και
160μL διαλύματος ΝaOH 1M. Στην συνέχεια προστέθηκαν 1,6mL διαιθυλαιθέρας, τα δείγματα
ανακινήθηκαν ισχυρά για 1΄, φυγοκεντρήθηκαν για 6’-2500g και τοποθετήθηκαν στους -20° C για
12-13’. Η οργανική φάση απομονώθηκε και εξατμίστηκε σε ρεύμα αζώτου στους 45° C και το ξηρό
υπόλειμμα επαναδιαλύθηκε σε 160μL κινητής φάσης, ενώ 20μL εγχύθηκαν σε χρωματογραφικό
σύστημα εξοπλισμένο με στήλη Κromasil (C18, 250x4.6mm I.D., 5μm) και κινητή φάση (50mM
ΝaΗ2PO4/H3PO4, pH=4,0/Ακετονιτρίλιο, 715/285 v/v) σε ταχύτητα 1mL/min και θερμοκρασία 50° C.
Η ανίχνευση έγινε στα 215nm.
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
H κλοζαπίνη και το Ε.Π. εκλούσθηκαν σε 17,45±0,49 και 13,68±0,32min, αντίστοιχα. Η καμπύλη
βαθμονόμησης των συγκεντρώσεων της κλοζαπίνης έναντι του κλάσματος των εμβαδών των
χρωματογραφικών κορυφών του φαρμάκου και του Ε.Π. ήταν γραμμική για εύρος 50-1000ng/mL
με συντελεστή γραμμικότητας R2=0,9988. H επαναληψιμότητητα των μετρήσεων ήταν μικρότερη
του 5%, (n=9) και η ακρίβεια κυμάνθηκε από 100,4 έως 104,5%. Η εξειδίκευση της μεθόδου
διερευνήθηκε με παράλληλη ανάλυση 34 φαρμάκων (όπως αντιεπιληπτικά, αντιψυχωσικά,
βενζοδιαζεπίνες, αντικαταθλιπτικά, ανοσοκατασταλτικά, αντιβιοτικά) και μετά από ανάλυση
129
δειγμάτων ορού υγιών εθελοντών και τριών ασθενών. Δεν παρατηρήθηκαν χρωματογραφικές
παρεμβολές στον χρόνο έκλουσης της κλοζαπίνης και του Ε.Π.
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ
Αναπτύχθηκε απλή, αξιόπιστη και χαμηλού κόστους μέθοδος για τον προσδιορισμό της κλοζαπίνης
στον ορό ασθενών με σχιζοφρένεια. Η μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί στην παρακολούθηση των
επιπέδων του φαρμάκου με σκοπό την βελτιστοποίηση της θεραπείας, την αποφυγή της
τοξικότητας και την διαπίστωση της συμμόρφωσης των ασθενών.
130
Δ.Α 13
ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΣΕ ΑΝΑΛΥΤΕΣ SIEMENS ADVIA 1800
ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΩΝΤΑΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ MEDICON HELLAS
Αθανάσιος Τζωρτζόπουλος1, Ειρήνη Ντάσκαρη-Γερασιμίδη1 & Μιχαήλ Τάλιας2
E-mail: [email protected]
1Εργαστήριο Βιοχημείας,Νοσηλευτική Μονάδα Αγρινίου, Γενικό Νοσοκομείο Αιτωλοακαρνανίας
2Σχολή Οικονομικών Επιστημών και Διοίκησης, Ανοικτό Πανεπιστήμιο Κύπρου
Εισαγωγή: Η διασφάλιση της αξιοπιστίας των εργαστηριακών αποτελεσμάτων συνδέεται άμεσα
με τη βελτίωση της συνολικής ποιότητας των παρεχόμενων υπηρεσιών υγείας των εργαστηριακών
τμημάτων των νοσηλευτικών μονάδων - νοσοκομείων. Η επαλήθευση των μεθόδων στα βιοχημικά
εργαστήρια που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό των βιοχημικών παραμέτρων καθώς και
ο προσδιορισμός της αβεβαιότητας αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα στάδια επιβεβαίωσης της
αξιοπιστίας των αποτελεσμάτων στο εργαστήριο. Οι κλασσικές βιοχημικές παράμετροι
αναφέρονται στη Γλυκόζη (GLU), Ουρία (UREA), Κρεατινίνη (CREAT), Κάλιο (K), Νάτριο (Na),
Ασβέστιο (Ca), Φώσφορος (P), Μαγνήσιο (Mg), Ολική Χολερυθρίνη (T-BIL), Άμεση Χολερυθρίνη
(DBIL), Ασπαρτική Αμινοτρανσαμινάση (AST/SGOT), Αλανίνης αμινοτρανσαμινάση (ALT/SGPT),
Γλουταμινική τρανσπεπτιδάση (GGT), Αλκαλική φωσφατάση (ALP), Γαλακτική Αφυδρογονάση
(LDH), Κρεατινο-κινάση (CKNAC), Αμυλάση (AMYL), Τριγλυκερίδια (TRIG), Χοληστερόλη (CHOL),
HDL-Cholesterol (HDL), Ουρικό οξύ (URIC), Ολικά λευκώματα (TP), Αλβουμίνη (ALB), Σίδηρος
(IRON).
Η επαλήθευση μεθόδων περιλαμβάνει την ορθότητα, ακρίβεια μεθόδων, επαναληψιμότητα,
αναπαραγωγιμότητα μετρήσεων, όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης, καθώς και εκτίμηση
συνδυαστικής και διευρυμένης αβεβαιότητας μετρήσεων του εργαστηρίου.
Σκοπός: Σκοπός της παρούσας έρευνας είναι η επαλήθευση μεθόδων και ο προσδιορισμός της
αβεβαιότητας των μετρούμενων κλασσικών βιοχημικών παραμέτρων στο κλινικό βιοχημικό
εργαστήριο της νοσηλευτικής μονάδος Αγρινίου του Γενικού Νοσοκομείου Αιτωλοακαρνανίας με
απώτερο στόχο τη βελτίωση της ποιότητας των παρεχόμενων διαγνωστικών υπηρεσιών του
εργαστηρίου προς τον πολίτη - ασθενή.
Υλικά και Μέθοδος: Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε δυο αναλυτές SIEMENS ADVIA 1800
χρησιμοποιώντας υλικά SIEMENS αλλά κυρίως αντιδραστήρια και συμπληρωματικά υλικά της
εταιρείας MEDICON HELLAS SA. Η επαλήθευση των μεθόδων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση
ορών-δειγμάτων ελέγχου (control samples) ή μειγμάτων ορών ασθενών, σε δυο τουλάχιστο
επίπεδα συγκέντρωσης, εντός και εκτός ορίων αναφοράς. Η αποθήκευση και επεξεργασία των
δεδομένων σε πρώτο επίπεδο έγιναν με τη χρήση ειδικού πληροφοριακού - λογισμικού
συστήματος με την επωνυμία Ασκληπιός LIS της εταιρείας Computer Solutions SA το οποίο είναι
εγκατεστημένο στο εργαστήριο.
Αποτελέσματα:
- Τα αποτελέσματα των μετρήσεων ορθότητας που εκφράζεται με το % Bias είναι <20% για όλες τις
βιοχημικές παραμέτρους.
- Τα αποτελέσματα των μετρήσεων ανάκτησης που εκφράζουν την ακρίβεια των μεθόδων των
κλασσικών βιοχημικών παραμέτρων στο Βιοχημικό εργαστήριο της νοσηλευτικής μονάδος
Αγρινίου είναι εντός των επιτρεπτών ορίων (90-110%).
131
- Τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης διαφέρουν από αναλυτή σε αναλυτή και παρουσιάζουν
σημαντικές διαφορές με τις αντίστοιχες του κατασκευαστή.
- Η αναλυτική αβεβαιότητα έχει προσδιοριστεί για κάθε βιοχημική παράμετρο και για κάθε
αναλυτή με αξιοσημείωτες διαφορές.
Συμπεράσματα:
Τα αποτελέσματα των μετρήσεων των κλασσικών βιοχημικών παραμέτρων στο εργαστήριο
βιοχημείας της νοσηλευτικής μονάδος Αγρινίου είναι επαληθεύσιμα και αξιόπιστα όπως
προκύπτει από τις τιμές εντός των επιτρεπτών ορίων όσον αφορά στην ορθότητα, την ακρίβεια και
την πιστότητα των μετρήσεων καθώς και από την εκτίμηση της αβεβαιότητας.
Οι διαφορές που παρατηρήθηκαν ανάμεσα στους αναλυτές του εργαστηρίου μπορεί να
οφείλονται στην κατασκευαστική φύση του κάθε αναλυτή αλλά και στις ειδικές συνθήκες
περιβάλλοντος του εργαστηρίου (Θερμοκρασία, υγρασία).
Υπό τις συνθήκες του εργαστηρίου, τα αντιδραστήρια της εταιρείας MEDICON μπορούν να
χρησιμοποιούνται για την παραγωγή αξιόπιστων εργαστηριακών αποτελεσμάτων σε αναλυτές
SIEMENS ADVIA 1800.
132
Δ.Α 14
Η ΣΥΜΜΕΤΟΧΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΙΝΗΣ ΙRAK-M ΣΤΗΝ ΑΘΗΡΩΜΑΤΩΣΗ: ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΚΑΙ Ο
ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΣΑΝ ΒΙΟΔΕΙΚΤΗΣ
Ε. Δερμιτζάκη, Κ. Λυρώνη, Π. Αυγουστινάκη, Ν. Μαλλιαράκη, Α. Πάτσαλος, Μ. Βενυχάκη, Α.
Μαργιωρής, Χ. Τσατσάνης
Εργαστήριο Κλινικής Χημείας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Κρήτης και Βιοχημικό Εργαστήριο
ΠΑΓΝΗ, Ηράκλειο, Κρήτη
Εισαγωγή: Η πρωτείνη IRAK-M είναι μια πρωτεΐνη που ρυθμίζει την ενεργοποίηση των
μακροφάγων δρώντας σαν αρνητικός ρυθμιστής της σηματοδότησης προφλεγμωνοδών
ερεθισμάτων. Κατα την παχυσαρκία τέτοια σήματα είναι διαρκή οδηγώντας σε χαμηλού βαθμού
συστηματική φλεγμονή στην οποία κεντρικό ρόλο παίζουν τα μακροφάγα. Συνεχής διέγερση των
μακρφάγων έχει σαν αποτέλεσμα την δημιουργία αφρωδών κυττάρων και την αθηρωμάτωση.
Μελέτες της ομάδας μας έδειξαν οτι η αδιπονεκτίνη επάγει την έκφραση της IRAK-M οδηγώντας
σε αθηροπροστατευτική δράση.
Σκοπός: Στόχος της παρούσας μελέτης είναι η ανάλυση του μηχανισμού επαγωγής της IRAKM στα
μακροφάγα καθώς και η πιθανή χρήση της σαν βιοδείκτης μεταβολικής φλεγμονής.
Υλικά και μέθοδοι: α) Έγινε ανάλυση του υποκινητή του γονιδίου IRAK-M, επιμόλυνση
μακροφάγων με siRNA για μεταγραφικούς παράγοντας καθως και πειράματα κατακρήμνησης
χρωματίνης για την ανίχνευση πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων. β) Απομονώθηκε ορρός και
RNA απο περιφερικό αίμα απο 50 δότες με φυσιολογικό σωματικό βάρος και παχύσαρκους και
έγινε ποσοτικοποίηση του mRNA της IRAKM με real time RT-PCR και μέτρηση δεικτών
αθηρωμάτωσης.
Αποτελέσματα: Τα αποτελέσματα έδειξαν οτι το γονίδιο IRAK-M ρυθμίζεται απο τους
μεταγραφικούς παράγοντες NFkB και C/EBPβ καθως και επιγενετικά απο τους παράγοντες EZH2
και UTX1. Στον περιφερικό αίμα τα επίπεδα του mRNA της IRAK-M βρέθηκε να σχετίζονται με τον
δείκτη μάζας σώματος (ΒΜΙ), και με τους δείκτες φλεγμονής και αθηρωμάτωσης ESR, CRP, SAA,
ICAM-1, VCAM-1, τριγλυκερίδια, ολική χοληστερόλη και LDL. Επίσης βρέθηκε αρνητική συσχέτιση
με τα επίπεδα αδιπονεκτίνης. Δεν βρέθηκε καμία συσχέτιση με τα επίπεδα γλυκόζης, ινσουλίνης,
HDL, plasminogen και IL-8.
Συμπεράσματα: Η IRAK-M ρυθμίζεται σε μεταγραφικό επίπεδο αλλά και επιγενετικά που συνάδει
με σίγησή της κατά τη χρόνια μεταβολική φλεγμονή. Μέτρησή της στο περιφερικό αίμα μπορεί να
αποτελέσει βιοδείκτη που θα διακρίνει την χρόνια συστηματική φλεγμονή όπως αυτή που
παρουσιάζεται κατά την παχυσαρκία, με την οξεία φλεγμονή.
Η εργασία χρηματοδοτήθηκε στα πλαίσια του προγράμματος ΕΠΔΒΜ- ΘΑΛΗΣ FatVessel No 379527.
133
Δ.Α 15
ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗΣ ΤΟΥ RASSF1A ΜΕ PYROSEQUENCING ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΣΠΟΡΑΔΙΚΟ
ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟΥ
Πουμπουρίδου Ν.1, Acha-Sagredo A.2, Γούτας Ν.3, Βλαχοδημητρόπουλος Δ.3, Λάγιου Μ.1,
Βασίλαρος Σ.4, Λιανίδου Ε.5, Λιλόγλου Τ.2, Κρούπης Χ.1
1 Εργαστήριο Κλινικής Βιοχημείας, ΑΤΤΙΚΟΝ Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή
ΕΚΠΑ, Αθήνα
2 Molecular and Clinical Cancer Medicine Dept., Πανεπιστήμιο Liverpool, Liverpool, Αγγλία
3 Παθολογοανατομικό εργαστήριο, Ευγενίδειο Θεραπευτήριο, Ιατρική Σχολή ΕΚΠΑ, Αθήνα
4 «Πρόληψις» Κλινική Καρκίνου του Μαστού, Αθήνα
5 Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ, Αθήνα
Σκοπός: Το προϊόν του γονιδίου RASSF1A (RAS association domain family protein 1A) ανήκει στην
οικογένεια των ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών και αλληλεπιδρά με την XPA DNA επιδιορθωτική
πρωτεΐνη. Η απενεργοποίησή του μέσω μεθυλίωσης του υποκινητή του έχει ανιχνευθεί σε
ποικιλία καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού. Ο σκοπός αυτής της
εργασίας ήταν να αναπτυχθεί αξιόπιστη μεθοδολογία για να εκτιμηθεί η επιγενετική τροποποίηση
του RASSF1A και στη συνέχεια να αξιολογηθεί σε ασθενείς με σποραδικό καρκίνο του μαστού.
Ασθενείς και Μέθοδοι: DNA απομονώθηκε με στήλες από 96 παγωμένους ιστούς μαστού, όπου οι
92 προήλθαν από ασθενείς με σποραδικό καρκίνο υπό παρακολούθηση με γνωστά
ιστοπαθολογικά δεδομένα (τύπος και grade μέσω ιστολογικής έκθεσης, ορμονικοί υποδοχείς με
IHC, HER2 ογκογονίδιο με IHC/CISH) ενώ 4 ήταν ιστοί ελέγχου. Εκτελέσθηκε DNA μετατροπή με
θειώδες νάτριο (ZymoResearch) και η μεθυλίωση του DNA μελετήθηκε με μεθοδολογία
Pyrosequencing στον αναλυτή Q96 Pyromark (Qiagen) με τη βοήθεια του λογισμικού PyroMark
Assay Design. Οι RASSF1Α εκκινητές που σχεδιάστηκαν για τη PCR αντίδραση καλύπτουν μια
περιοχή μεταξύ nt -85 και -201 (συσχετιζόμενα με το εναρκτήριο ATG) η οποία περιείχε 9 CpG
δινουκλεοτίδια. Ανά δινουκλεοτίδιο, μετρείται το ποσοστό μεθυλίωσης και το αποτέλεσμα
λαμβάνεται ως μέσος όρος της μεθυλίωσης των 9 CpGs. Μεθυλιωμένα θεωρήθηκαν όσα δείγματα
έφεραν τιμή μεγαλύτερη του 50% και υπερμεθυλιωμένα του 75% των τιμών των καρκινικών
δειγμάτων. Τα ληφθέντα αποτελέσματα επεξεργάστηκαν στατιστικώς με χρήση του ΙΒΜ SPSS
Statistics Version 21.
Αποτελέσματα: Ο μέσος όρος μεθυλίωσης των ιστών ελέγχου ήταν 31,2 ενώ η διάμεσος των
καρκινικών δειγμάτων ήταν 45,4 (και το όριο των 75% ήταν 59,2). Από την στατιστική ανάλυση των
αποτελεσμάτων βρέθηκε μόνο ότι υπάρχει σημαντική συσχέτιση μεταξύ της μεθυλίωσης του
RASSF1Α (τόσο σε ποσοστό 50% όσο και σε ποσοστό 75%) με την έκφραση των ορμονικών
υποδοχέων ER (p=0,027 και p=0,019 αντίστοιχα, χ2 test).
Συμπεράσματα: Τα στατιστικώς ληφθέντα αποτελέσματα έρχονται σε αντίθεση με τα όσα
αναφέρονται στη βιβλιογραφία διεθνώς, καθώς δεν απεδείχθη στατιστικώς σημαντική συσχέτιση
μεταξύ του ποσοστού μεθυλίωσης του RASSF1Α και δυσμενών προγνωστικών παραγόντων,
ωστόσο οι μεθοδολογίες που έχουν χρησιμοποιηθεί δεν παρέχουν τόσο λεπτομερή ποσοτική
ανάλυση σε μεγάλο αριθμό δινουκλεοτιδίων όσο η μέθοδος που αναπτύχθηκε.
134
Δ.Α 16
Μέτρηση και αξιολόγηση των δεικτών οστικού μεταβολισμού β-CrossLaps, P1NP, 25(OH)Βιταμίνη
D, Παραθορμόνη (PTH), (N-mid)Οστεοκαλσίνη, Ασβέστιο (Ca), Φωσφόρος (P) και Αλκαλική
Φωσφατάση (ALP) σε ανδρικό πληθυσμό ηλικίας >50 ετών.
Μελπίδου Α., Γρηγοράτου Α., Λασηθιωτάκης Γ., Μελπίδης Κ., Γιαννακάκης Α., Μπότουλα Ε.,
Ιωαννίδου Σ.
Βιοχημικό Εργαστήριο, Ορμονολογικό Εργαστήριο Π.Γ.Ν.Α. "Ο Ευαγγελισμός»
Σκοπός: Η καταγραφή και αξιολόγηση των αποτελεσμάτων ανδρών οι οποίοι προσήλθαν στο
εξωτερικό ιατρείο του Γ.Ν.Α. "Ο Ευαγγελισμός» καθ΄ όλον το έτος 2013 για μέτρηση των δεικτών
οστικού μεταβολισμού β-CrossLaps, P1NP, 25(OH)Βιταμίνης D, Παραθορμόνης (PTH), (Nmid)Οστεοκαλσίνης (OSTEOC), Ασβεστίου (Ca), Φωσφόρου (P) και Αλκαλικής Φωσφατάσης (ALP).
Υλικό και μέθοδοι: Μελετήθησαν 188 άρρενες ηλικίας >50 ετών (50-89 έτη) με φυσιολογική
νεφρική λειτουργία οι οποίοι διαιρέθησαν σε δύο ομάδες: Ομάδα Α (82 άτομα τα οποία
προσήλθαν από Οκτώβριο έως Απρίλιο) και Ομάδα Β (106 άτομα τα οποία προσήλθαν από Μάϊο
έως Σεπτέμβριο). Το Ca, ο P, η ALP και η OSTEOC μετρήθηκαν σε αναλυτή Modular (Roche), η PTH
στον αναλυτή Centauros (Siemens). Η 25(OH)Βιταμίνη D, τα β-CrossLaps και P1NP μετρήθηκαν
στον αναλυτή Elecsys (Roche).
Αποτελέσματα: Από τις ζητούμενες εξετάσεις το Ca, ο P, η ALP και η 25(OH)Βιταμίνη D μετρήθηκαν
στο σύνολο των 188 ανδρών. Τα β-CrossLaps και P1NP ζητήθηκαν και μετρήθηκαν μόνο σε 16 από
τους 188, η PTH σε 68 και η (N-mid)Οστεοκαλσίνη σε 8. Οι τιμές Ca, P και ALP ήσαν εντός του
φυσιολογικού εύρους στο σύνολο των 188 ανδρών. Τα 6 από τα 16 άτομα (37.5%) στα οποία
μετρήθηκαν β-CrossLaps και P1NP είχαν αυξημένες τιμές (β-CrossLaps >0.450 ng/mL και P1NP
>73.87μg/L). Από τα 68 άτομα στα οποία μετρήθηκε η PTH τα 16 (23.5%) είχαν αυξημένες τιμές
(>93 pg/mL). Τα 8 άτομα στα οποία μετρήθηκε η OSTEOC είχαν φυσιολογικές τιμές. Στην ομάδα Α
η 25(OH)Βιταμίνη D ήταν σε έλλειψη (<10mg/dL) σε ποσοστό 15,8% ενώ σε επάρκεια (<30mg/dL)
ήταν μόλις στο 6%. Η ομάδα Β είχε έλλειψη 25(OH)Βιταμίνης D σε ποσοστό 9.4% και επάρκεια
29.2%.
Συμπεράσματα: Επιβεβαιώνεται η εποχική διακύμανση της 25(OH)Βιταμίνης D με την
επάρκεια της 25(OH)Βιταμίνης D στην ομάδα Β να είναι 4.9 φορές μεγαλύτερη από ότι στην ομάδα
Α. Ωστόσο και στις δύο ομάδες η ανεπάρκεια σε 25(OH)Βιταμίνη D παραμένει υψηλή (Ομάδα Α:
78.2%, Ομάδα B: 61.4%). Καταδεικνύεται επίσης ο ελλιπής έλεγχος του οστικού μεταβολισμού
όπως φαίνεται από τον πολύ μειωμένο αριθμό των ζητούμενων εξετάσεων για β-CrossLaps, P1NP,
PTH και Οστεοκαλσίνης. Με τα τόσο υψηλά ποσοστά ανεπάρκειας σε 25(OH)Βιταμίνη D παραμένει
ο κίνδυνος για εμφάνιση οστεοπόρωσης και στον ανδρικό πληθυσμό, συνεπώς θα ήταν σκόπιμο ο
έλεγχος του οστικού μεταβολισμού να συνοδεύεται από την μέτρηση των β-CrossLaps, P1NP, PTH
και Οστεοκαλσίνης.
135
Δ.Α 17
ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑΣ ΓΙΑ ΤΗ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗΣ ΤΩΝ ΥΠΟΚΙΝΗΤΩΝ
ΟΓΚΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΜΕ ΥΓΡΗ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΑ ΣΦΑΙΡΙΔΙΩΝ ΣΕ ΣΥΝΔΥΑΣΜΟ ΜΕ
ΠΟΛΛΑΠΛΗ ΕΙΔΙΚΗ ΓΙΑ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗ PCR
Κλειώ Παρίση, Αθηνά Μάρκου, Μαρία Χειμωνίδου και Εύη Λιανίδου
Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Αθηνών, 15771, Αθήνα.
Εισαγωγή: Η ερευνητική μας ομάδα έδειξε προσφάτως την προγνωστική σημασία της μεθυλίωσης
των υποκινητών των SOX17, BRMS1 και CST6 σε πρωτοπαθείς όγκους, κυκλοφορούντα καρκινικά
κύτταρα (circulating tumour cells, CTCs) και στο ελεύθερο κυττάρων DNA (cell-free DNA, cfDNA).
Σκοπός: Η ανάπτυξη και η αναλυτική αξιολόγηση μεθοδολογίας για την ταυτόχρονη μελέτη
μεθυλίωσης των υποκινητών των γονιδίων SOX17, BRMS1 και CST6 σε κλινικά δείγματα. H
αναπτυχθείσα μέθοδος βασίζεται στον συνδυασμό της υγρής μικροσυστοιχίας σφαιριδίων (liquid
bead array) με την πολλαπλή ειδική για μεθυλίωση PCR (liquid bead array - multiplex MSP).
Υλικά και μέθοδοι: Σχεδιάστηκαν in silico εκκινητές και ανιχνευτές για τους υποκινητές των
γονιδίων CST6, SOX17 και BRMS1. Στη μεθοδολογία περιλαμβάνεται επίσης η β-actin (ACTB) ως
γονίδιο-στόχος προς έλεγχο της ποιότητας του DNA. Σε όλα τα δείγματα έγινε απομόνωση DNA,
κατεργασία με SB (sodium bisulfite), πολλαπλή PCR για τα 4 γονίδια-στόχους, βιοτινυλίωση των
PCR προϊόντων, υβριδισμός των βιοτινυλιωμένων προϊόντων της πολλαπλής MSP στα
μικροσφαιρίδια xMAP®, προσθήκη στρεπταβιδίνης – φυκοερυθρίνης και μέτρηση σήματος στο
Luminex® 200. Κάθε στάδιο της πειραματικής πορείας βελτιστοποιήθηκε από άποψη αναλυτικής
ειδικότητας, ευαισθησίας, επαναληψιμότητας και αναπαραγωγιμότητας. Πλακουντιακό DNA
χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικό δείγμα ελέγχου για τη μεθυλίωση, ενώ ως θετικό δείγμα ελέγχου
χρησιμοποιήθηκε ένα εμπορικώς διαθέσιμο 100% μεθυλιωμένο DNA. Για την αναλυτική
αξιολόγηση της μεθοδολογίας χρησιμοποιήθηκαν 3 καρκινικές κυτταρικές σειρές: MCF-7, MDAMB-231 και SK-BR-3.
Αποτελέσματα: Η μέθοδος χαρακτηρίζεται από υψηλή ειδικότητα για κάθε γονίδιο-στόχο καθώς
παρά την πολυπλοκότητα κάθε στόχος ανιχνεύεται ειδικώς παρουσία των άλλων. Η μέθοδος έχει
επίσης υψηλή ευαισθησία καθώς ανιχνεύει μεθυλιωμένες αλληλουχίες DNA για κάθε στόχο με
ποσοστό μεθυλίωσης 0,2% παρουσία 99,8% μη μεθυλιωμένου DNA. Οι συντελεστές
μεταβλητότητας της ίδιας μέτρησης (intra-assay CV, n=3) για τους υποκινητές των γονιδίων ήταν:
BRMS1: 5.9%, SOX17: 17.3% και CST6: 11.1% ενώ μεταξύ διαφορετικών μετρήσεων (inter-assay CV,
n=3) βρέθηκαν: BRMS1: 5.0%, SOX17: 12.7% και CST6: 11.7%. Η αναπτυχθείσα μεθοδολογία
εφαρμόστηκε επιτυχώς για τη μελέτη μεθυλίωσης των υποκινητών του εξεταζόμενου γονιδιακού
πάνελ στις κυτταρικές σειρές MCF-7, MDA-MB-231 και SK-BR-3. Η μέθοδος απαιτεί ελάχιστη
ποσότητα converted DNA ενώ η συνολική διάρκεια της πειραματικής πορείας ανέρχεται σε 5h
περίπου.
Συμπεράσματα: Η αναπτυχθείσα μεθοδολογία θα μπορούσε να εφαρμοστεί για την αξιολόγηση
της κατάστασης μεθυλίωσης των CTCs, αφού ανιχνεύεται η μεθυλίωση των 4 στόχων ταυτοχρόνως
και αξιόπιστα σε ελάχιστη ποσότητα δείγματος, ούτως ώστε να εξοικονομείται πολύτιμη ποσότητα
δείγματος με παράλληλη μείωση κόστους και διάρκειας της ανάλυσης. Η μέθοδος μπορεί να
επεκταθεί περαιτέρω με την προσθήκη νέων γονιδίων – στόχων.
136
Δ.Α 18
ΜΕΛΕΤΗ ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗΣ DNA ΤΟΥ ΥΠΟΚΙΝΗΤΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ
SOX17 ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟΥ ΜΕ ΥΨΗΛΗΣ ΔΙΑΚΡΙΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΑΝΑΛΥΣΗ
ΚΑΜΠΥΛΩΝ ΤΗΞΗΣ (MS-HRMA)
Σοφία Μαστοράκη1a, Μαρία Χειμωνίδου1a, Λάμπρος Δημητρακόπουλος1b, Σοφία Κουνέλη2,
Νίκος Μαλάμος2, Βασίλης Γεωργούλιας3 και Εύη Λιανίδου 1
1Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Αθηνών, 15771, Αθήνα.
2 Μονάδα Ιατρική Ογκολογίας, Νοσοκομείο Έλενα Βενιζέλου, Αθήνα.
3Τμήμα
Ιατρικής Ογκολογίας, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Ηρακλείου, Ιατρική σχολή
Πανεπιστημίου Κρήτης, 71110, Ηράκλειο
a.
ίση συνεισφορά
b.
παρούσα διεύθυνση: ACDC Lab, Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of
Toronto, Toronto, Ontario, Canada
Εισαγωγή: Tο SOX17 δρα ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο και η υπερμεθυλίωση στον υποκινητή του
σχετίζεται με την αποσιώπησή του. Η ανίχνευση μεθυλίωσης στον υποκινητή του SOX17 παρέχει
σημαντικές προγνωστικές πληροφορίες σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού.
Σκοπός: Στόχος της παρούσας μελέτης είναι η ανάπτυξη μίας ημιποσοτικής, υψηλής διακριτικής
ικανότητας μεθόδου για την διερεύνηση της μεθυλίωσης του γονιδίου SOX17 σε κλινικά δείγματα.
Η μέθοδος βασίζεται στην υψηλής διακριτικής ικανότητας ανάλυση καμπυλών τήξης (MS-HRMA).
Υλικά και μέθοδοι: Σχεδιάσαμε εκκινητές που ενισχύουν εξίσου μεθυλιωμένες και μη
μεθυλιωμένες αλληλουχίες κατόπιν χημικής τροποιποίησης του DNA με όξινο θειώδες νάτριο.
Βελτιστοποιήσαμε και επαληθεύσαμε την αναπτυχθείσα μέθοδο MS-HRMA, χρησιμοποιώντας
εμπορικά διαθέσιμα συνθετικά πρότυπα μη μεθυλιωμένου (0%) και 100% μεθυλιωμένου, χημικά
τροποποιημένου DNA (0-100% μεθυλιωμένο DNA). Αρχικά, έγινε κλινική αξιολόγηση της μεθόδου,
αναλύοντας 65 ιστούς εγκλεισμένους σε παραφίνη ασθενών με πρώιμο καρκίνο μαστού και
ασθενών με διαγνωσμένη μετάσταση, καθώς και 31 υγιών ατόμων (πιλοτική ομάδα). Στη συνέχεια,
αναλύσαμε 69 δείγματα ασθενών με χειρουργήσιμο καρκίνο μαστού (ανεξάρτητη ομάδα). Τα
αποτελέσματα με την τεχνική MS-HRMA για τα παραπάνω 165 δείγματα, συγκρίθηκαν με τα
αποτελέσματα που είχαν ληφθεί από την Real-Time Methylation-Specific PCR (Real-Time MSP).
Αποτελέσματα: Η αναπτυχθείσα μέθοδος χαρακτηρίζεται από υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία,
αφού είναι δυνατή η ανίχνευση 1% μεθυλιωμένης αλληλουχίας έναντι 99% μη μεθυλιωμένων, ενώ
παράλληλα παρέχει την δυνατότητα ημιποσοτικής εκτίμησης των επιπέδων μεθυλίωσης του
υποκινητή του γονιδίου SOX17. Στην πιλοτική ομάδα ασθενών, μεθυλίωση στον υποκινητή του
SOX17 βρέθηκε σε 42/65 δείγματα (64,6%), στην ανεξάρτητη ομάδα σε 55/69 δείγματα (79,7%),
ενώ κανένα από τα 31 δείγματα υγιών ατόμων δε βρέθηκε θετικό (0% μεθυλιωμένα). Τα ποσοστά
μεθυλίωσης των δειγμάτων παρουσίασαν σημαντική διαφοροποίηση μεταξύ των διαφορετικών
ομάδων ασθενών. Η MS-HRMA και η Real-Time MSP έδωσαν σημαντικά συγκρίσιμα αποτελέσματα
όταν τα ίδια 165 δείγματα αναλύθηκαν και με τις δύο μεθόδους, με συμφωνία 146/165 δείγματα
(88,5%).
Συμπεράσματα: Η αναπτυχθείσα μέθοδος MS-HRMA για τη μελέτη μεθυλίωσης του υποκινητή του
γονιδίου SOX17 είναι κλειστού τύπου, ευαίσθητη, απλή και χαμηλού κόστους. Δεν απαιτεί
ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR ενώ παρέχει άμεσα συγκρίσιμα αποτελέσματα με την
Real-Time MSP σε λιγότερο χρόνο ανάλυσης. Επιπρόσθετα παρέχει το πλεονέκτημα της
ημιποσοτικής εκτίμησης των επιπέδων μεθυλίωσης.
137
Δ.Α 19
ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΩΝ ΣΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ ΤΟΥ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ C
ΣΤΗΝ ΠΡΟΩΡΗ ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΘΡΟΜΒΩΣΗΣ
Γιαλεράκη Αργυρή1, Αναστασίου Γεωργία1, Πολίτου Μαριάννα2, Καρακίτσος Πέτρος3 , Κρούπης
Χρήστος4, Τραυλού Ανθή1
1
Αιματολογικό Εργαστήριο-Μονάδα Αιμοδοσίας, Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο «ΑΤΤΙΚΟΝ»
2
Μονάδα Αιμοδοσίας, Αρεταίειο Νοσοκομείο Αθηνών
3 Εργαστήριο
4
Διαγνωστικής Κυτταρολογίας, Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο «ΑΤΤΙΚΟΝ»
Εργαστήριο Κλινικής Βιοχημείας, Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο «ΑΤΤΙΚΟΝ»
ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Ο ενδοθηλιακός υποδοχέας της πρωτεΐνης C (EPCR) είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη
που εκφράζεται στο ενδοθήλιο των μεγάλων αγγείων, δεσμεύει την πρωτεΐνη C (PC) και ενισχύει
την ενεργοποίηση της. Φαίνεται ότι αυξημένα επίπεδα sEPCR σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο
θρόμβωσης, καθώς ο διαλυτός sEPCR συνδέεται με την PC και ανταγωνίζεται τον EPCR,
αναστέλλοντας έτσι την ενεργοποίηση της PC και την δραστικότητα της APC. Η εμπλοκή του EPCR
στον μηχανισμό της αιμόστασης υποδηλώνει έναν πιθανό ρόλο στην παθογένεση της θρόμβωσης.
ΣΚΟΠΟΣ: Η μελέτη σχεδιάστηκε με σκοπό να διερευνηθεί η επίπτωση του πολυμορφισμού
4600A/G, στο εξόνιο 4 που οδηγεί σε υποκατάσταση Ser219Gly στην διαμεμβρανική περιοχή του
EPCR, και του πολυμορφισμού 4678G/C, στην 3'-UT περιοχή του EPCR, στον κινδύνου εμφάνισης
θρόμβωσης, αξιολογώντας επίσης τη συμβολή τους στα επίπεδα sEPCR, σε ασθενείς με ήδη
γνωστές μεταλλάξεις ή/ και άλλους παράγοντες κινδύνου, με τελικό στόχο τη διερεύνηση της
μοριακής βάσης θρομβοφιλικής διάθεσης άγνωστης μέχρι στιγμής αιτιολογίας και την αξιολόγηση
του επιπρόσθετου κινδύνου θρόμβωσης σε γενικό πληθυσμό και ασθενείς.
ΑΣΘΕΝΕΙΣ-ΜΕΘΟΔΟΙ: Συλλέχθηκαν δείγματα αίματος από 84 ασθενείς με θρόμβωση και
συγγενείς ή επίκτητους παράγοντες κινδύνου, τα δημογραφικά στοιχεία των οποίων φαίνονται
στον παρακάτω πίνακα και 100 υγιή άτομα που χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα ελέγχου. Οι
ασθενείς και οι μάρτυρες ήταν Ελληνικής καταγωγής και συμβατής ηλικίας και φύλου. Η
ανίχνευση των πολυμορφισμών πραγματοποιήθηκε με Real-Time PCR ενώ τα επίπεδα sEPCR
μετρήθηκαν με ELISA σε 58 ασθενείς, που δεν βρίσκονταν υπό αντιπηκτική αγωγή.
ΔΗΜΟΓΡΑΦΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ
Φύλο
Κλινική εκδήλωση
Ηλικία 1ου επεισοδίου
Αριθμός θρομβωτικών επεισοδίων
138
Θήλυ
Άρρεν
Εν τω βάθει φλεβική θρομβωση (DVT)
Αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο (ΑΕΕ)
Πνευμονική Εμβολή
Έμφραγμα του μυοκαρδίου
Άλλο θρομβωτικό επεισόδιο
Πρώτο θρομβωτικό επεισόδιο ≤35
Πρώτο θρομβωτικό επεισόδιο >35
1
2
≥3
ΟΜΑΔΑ ΑΣΘΕΝΩΝ %
55
45
27
18
21
13
20
45
55
50
29
21
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Η συχνότητα των αλληλίων EPCR4600G και EPCR 4678C ήταν συγκρίσιμη
ανάμεσα στους ασθενείς και στην ομάδα ελέγχου (p=0.7 και p=0.5 αντίστοιχα). Όπως φαίνεται
στον παρακάτω πίνακα, το αλλήλιο EPCR4600G βρέθηκε πιο συχνό σε ασθενείς που εμφάνισαν
θρόμβωση σε νεαρή ηλικία σε σύγκριση με αυτούς που εμφάνισαν σε μεγαλύτερη (p=0.08), ενώ η
εμφάνιση του προστατευτικού EPCR4678C ήταν σημαντικά πιο χαμηλή σε ασθενείς νεαρότερης
ηλικίας (p=0.06). Κανένας από τους δυο πολυμορφισμούς του EPCR δεν φάνηκε να σχετίζεται με
υποτροπές. Ασθενείς που έφεραν το αλλήλιο EPCR4600G παρουσίασαν στατιστικά σημαντικά
αυξημένα επίπεδα sEPCR σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (304 ± 72 ng/ml vs 235± 51 ng/ml, p=
0.001), ενώ ασθενείς με γονότυπο EPCR4678C/C παρουσίασαν χαμηλότερα επίπεδα sEPCR σε
σχέση με φορείς τουλάχιστον ενός αλληλίου EPCR4600G (p=0.0003).
Πολυμορφισμοί
4600A/G
4678G/C
AA
AG
G
CC
GC
GG
C
Ασθενείς
<35
Συχνότητα
αλληλίου
29
9
P
Ασθενείς Συχνότητα
>35
αλληλίου
42
4
0.11
7
16
15
0.04
0.08
13
24
9
0.39
0.54
0.06
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η απουσία του προστατευτικού αλληλίου
EPCR4678C ή η παρουσία του αλληλίου EPCR4600G μπορεί να σχετίζονται με πρόωρη εμφάνιση
θρομβωτικού επεισοδίου. Παρόλ’ αυτά χρειάζονται μελέτες που να αφορούν μεγαλύτερο αριθμό
ασθενών, προκειμένου να διαλευκανθεί η παθοφυσιολογική βάση της σχέσης μεταξύ
πολυμορφισμών σε γονίδια παραγόντων αιμοστατικής ισορροπίας και κλινικής έκβασης.
139
Δ.Α 20
ΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣ ΣΤΑ ΓΟΝΙΔΙΑ KRAS, NRAS ΚΑΙ BRAF ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΑΧΕΟΣ
ΕΝΤΕΡΟΥ
Ειρήνη Παπαδοπούλου, Αγγελική Απέσσου, Βασιλική Μεταξά-Μαριάτου, Αγγελική Τσιριγώτη,
Κωνσταντίνος Αγιαννιτόπουλος, Γεώργιος Νασιούλας.
GENEKOR I.A.E. Λεωφόρος Σπάτων 52, Γέρακας, Αθήνα
Εισαγωγή
Τα πρωτοογκογονίδια RAS (HRAS, KRAS and NRAS) κωδικοποιούν μια οικογένεια υψηλά ομόλογων
πρωτεϊνών, ο οποίες συμμετέχουν στο μεταγωγικό μονοπάτι RAS/RAF/MEK/ERK που ρυθμίζει την
κυτταρική ανάπτυξη και επιβίωση. Ελέγχονται εξωκυτταρiκά μέσω σημάτων που μεταβιβάζονται
από τον διαμεμβρανικό υποδοχέα τυροσινικής κινάσης, EGFR (Epidermal Grouth Factor Receptor).
Μεταλλαγές στα γονίδια που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες KRAS και NRAS, απομονώνουν το
RAS/RAF/MEK/ERK μονοπάτι από τον υποδοχέα του και καθιστούν τους αναστολείς του EGFR
αναποτελεσματικούς. Οι μεταλλαγές στα γονίδια ΚRAS, και NRAS παρατηρούνται σε περίπου 55%
των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου. Είναι γνωστό ότι ασθενείς με αυτές τις μεταλλαγές
δεν ανταποκρίνονται στη θεραπεία με τα αντι-EGFR αντισώματα
Σκοπός
Σκοπός της μελέτης ήταν η ανάπτυξη μεθοδολογίας για την ανάλυση μεταλλαγών στα γονίδια
KRAS, NRAS και BRAF και ο καθορισμός της συχνότητας μεταλλαγών στα παραπάνω γονίδια σε
ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου.
Υλικά και Μεθόδοι
2071 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου (1699 Έλληνες και 372 Ρουμάνοι) αναλύθηκαν για
μεταλλαγές στο εξώνιο 2 του KRAS. Επιπλέον, 354 όγκοι υποβλήθηκαν σε πλήρη ανάλυση για τα
γονίδια KRAS (εξώνια 2, 3, 4), NRAS (εξώνια 2, 3, 4) και BRAF (εξώνιο 15). Για την ανάλυση
απομονώθηκε DNA από καρκινικούς ιστούς εγκλεισμένους σε παραφίνη. Η ανίχνευση μεταλλαγών
έγινε με τη μέθοδο HRM (High Resolution Melting (HRM) και ακολούθησε προσδιορισμός της
αλληλουχίας κατά Sanger.
Αποτελέσματα
Μεταλλαγές στο εξώνιο 2 του KRAS (κωδικόνια 12/13) ανιχνεύθηκαν στο 41,3% (702/1699) των
Ελλήνων ασθενών και στο 39.2% (146/372) των Ρουμάνων.
Από τους 354 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε πλήρη ανάλυση για τα γονίδια KRAS, NRAS και BRAF,
40.96% έφεραν σωματικές μεταλλαγές στο εξώνιο 2 του KRAS. Μεταξύ των φυσιολογικών για το
KRAS εξώνιο 2 όγκων, μεταλλαγές στα υπόλοιπα εξώνια του KRAS και NRAS ανιχνεύθηκαν σε
ποσοστό 15.31% ενώ μεταλλαγές στο BRAF βρέθηκαν σε ποσοστό 12.44%. Η ευαισθησία της
μεθόδου HRM που χρησιμοποιήθηκε ήταν μεγαλύτερη σε σχέση με τον προσδιορισμό
αλληλουχίας κατά Sanger.
Συμπεράσματα
Η μέθοδος HRM μπορεί να χρησιμοποιηθεί για αξιόπιστη και ευαίσθητη ανίχνευση μεταλλαγών
στα γονίδια KRAS, NRAS και BRAF. Περισσότερο από το ¼ των ασθενών που είναι φυσιολογικοί
στο εξώνιο 2 του KRAS παρουσιάζουν μεταλλαγές σε άλλες γενετικές θέσεις που εμπλέκονται στη
ανθεκτικότητα στη στοχευμένη θεραπεία με anti-EGFR αντισώματα .
140
Δ.Α 21
ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΣΤΑ ΓΛΥΚΟΚΟΡΤΙΚΟΕΙΔΗ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΣΚΛΗΡΥΝΣΗ ΚΑΤΑ
ΠΛΑΚΑΣ (ΣΚΠ) ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΥΠΟΤΡΟΠΗ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ
Narjes Nasiri Ansari1, Μαρία Ελευθερία Ευαγγελοπούλου2, Ελιάνα Σπηλιώτη1, Ευανθία Κασσή1,
Παρασκευή Μουτσάτσου1
1Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας, Ιατρική Σχολή, Εθνικό&Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
21η
Νευρολογική Κλινική Εθνικού &Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, Αιγινήτειο
Νοσοκομείο, Αθήνα
Εισαγωγή
Η μεθυλπρεδνιζολόνη (ΜΠΔ) χρησιμοποιείται ευρέως στη θεραπεία των ασθενών με σκλήρυνση
κατά πλάκας (ΣΚΠ) με στόχο αφ’ενός τη μείωση της έκκρισης των φλεγμονωδών μορίων από τα Τλεμφοκύτταρα και αφ’ετέρου την απόπτωση των Τ-λεμφοκυττάρων. Εν τούτοις, διαφορές στην
ευαισθησία στη ΜΠΔ μεταξύ των ασθενών επηρεάζουν την ανταπόκριση στη θεραπεία. Oι
ασθενείς με μειωμένη ευαισθησία στη ΜΠΔ εμφανίζουν μειωμένη ικανότητα καταστολής των
φλεγμονωδών μορίων, αντίσταση στην απόπτωση των Τ-λεμφοκυττάρων καθώς και μειωμένη
κλινική βελτίωση μετά από υποτροπή της νόσου.
Σκοπός της μελέτης
1) Η διερεύνηση της ευαισθησίας στη ΜΠΔ σε ασθενείς με ΣΚΠ σε τρεις διαφορετικές μορφές της
νόσου με τη χρήση των γλυκοκορτικοειδο-εξαρτώμενων γονιδίων GILZ και MCL-1 ως δείκτες της
ευαισθησίας στα γλυκοκορτικοειδή και 2) Η διερεύνηση του ρόλου των γονιδίων GILZ και MCL-1
στην πρόβλεψη ανταπόκρισης στη θεραπεία.
Υλικά-Μέθoδοι
Τρεις ομάδες ασθενών με ΣΚΠ (ασθενείς με κλινικά μεμονωμένο σύνδρομο, διαλείπουσα μορφή,
προϊούσα μορφή) οι οποίοι εμφάνισαν υποτροπή της νόσου και έλαβαν ενδοφλέβια MΠΔ για
πέντε ημέρες συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη.
Η έκφραση των γονιδίων GILZ και MCL-1 προσδιορίστηκε σε ολικό αίμα με ποσοτική real-time PCR
την πρώτη καθώς και την πέμπτη ημέρα θεραπείας, πριν και μετά από ενδοφλέβια χορήγηση ΜΠΔ
(1000mg/ημέρα). Για την αξιολόγηση της κλινικής εικόνας και της ανταπόκρισης στην κορτιζόνη
πριν και μετά από την πέμπτη ημέρα της ενδοφλέβιας θεραπείας χρησιμοποιήθηκε η κλίμακα
αναπηρίας Expanded Disability Status (EDSS).
Αποτελέσματα
Η αύξηση της έκφρασης των γονιδίων GILZ και MCL-1 μετά τη χορήγηση της ΜΠΔ την πρώτη
ημέρα της θεραπείας ήταν σημαντικά μεγαλύτερη στους ασθενείς που ανταποκρίθηκαν, σε σχέση
με τους ασθενείς χωρίς ανταπόκριση στην ΜΠΔ (p<0.05 και p<0.01 για τα γονίδια GILZ και MCL-1
αντιστοίχως). Αξίζει να σημειωθεί ότι στους ασθενείς με ανταπόκριση στη ΜΠΔ, τα επίπεδα
έκφρασης των GILZ και MCL-1 την πέμπτη ημέρα της θεραπείας ήταν σημαντικά μειωμένα σε
σχέση με τα επίπεδα έκφρασης της πρώτης ημέρας της θεραπείας (p<0.05). Οι ασθενείς με
έλλειψη ανταπόκρισης στη θεραπεία δεν εμφάνισαν σημαντικές διαφορές στην έκφραση των
παραπάνω γονιδίων την πρώτη και την πέμπτη ημέρα χορήγησης ΜΠΔ.
Συμπεράσματα
Η διαφοροποίηση της έκφρασης των γονιδίων GILZ και MCL-1 μεταξύ των ασθενών που
ανταποκρίθηκαν σε σχέση με τους ασθενείς χωρίς ανταπόκριση στη θεραπεία, επισημαίνει τον
πιθανό τους ρόλο ως δείκτες ευαισθησίας στη ΜΠΔ και ανταπόκρισης στη θεραπεία ασθενών με
ΣΚΠ.
141
Δ.Α 22
ΑΝΑΖΗΤΗΣΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΔΙΑΤΑΡΑΧΩΝ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΩΝ
ΓΛΥΚΟΚΟΡΤΙΚΟΕΙΔΩΝ NR3C1 ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΣΚΛΗΡΥΝΣΗ ΚΑΤΑ ΠΛΑΚΑΣ (ΣΚΠ)
Aμαλία Σερτεδάκη1, Μαρία- Ελευθερία Ευαγγελοπούλου2, Άννα Σεμανιάκου3, Ευανθία Κασσή3,
Ευαγγελία Χαρμανδάρη1, Γεώργιος Χρούσος1, Παρασκευή Μουτσάτσου3
1
Εργαστήριο Μοριακής Ενδοκρινολογίας, Α' Παιδιατρικής Κλινικής Ιατρικής Σχολής Εθνικού &
Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, Nοσοκομείο Παίδων «Αγ.Σοφία»
2
Νευρολογική Κλινική Εθνικού & Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, Αιγινήτειο Νοσοκομείο,
3
Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας, Ιατρική Σχολή, Εθνικό & Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Εισαγωγή-Σκοπός
Πολλές μελέτες υποστηρίζουν ότι οι ασθενείς με Σκλήρυνση κατά Πλάκας (ΣΚΠ) εμφανίζουν
έλλειψη ευαισθησίας στα γλυκοκορτικοειδή τόσο στο κεντρικό νευρικό σύστημα όσο και στην
περιφέρεια. Η ευαισθησία δε στα γλυκοκορτικοειδή έχει δειχθεί ότι σχετίζεται με την ανταπόκριση
στη θεραπεία με γλυκοκορτικοειδή και την κλινική βελτίωση των ασθενών αυτών. Επειδή, ο κύριος
μεσολαβητής της δράσης των γλυκοκορτικοειδών είναι ο υποδοχέας των γλυκοκορτικοειδών (GR) ,
στην παρούσα εργασία διερευνήσαμε την ύπαρξη πιθανών πολυμορφισμών/μεταλλάξεων του
γονιδίου NR3C1 που κωδικοποιεί την α ισομορφή του GR σε ασθενείς με ΣΚΠ, καθώς και την
συσχέτιση τους με την πρόβλεψη ανταπόκρισης στην θεραπεία.
Ασθενείς και μέθοδοι
Μελετήθηκαν 36 ασθενείς με ΣΚΠ με διαφορετικές μορφές της νόσου (ασθενείς με κλινικά
μεμονωμένο σύνδρομο, διαλείπουσα μορφή, προϊούσα μορφή), 26 εκ των οποίων είχαν
ανταποκριθεί στη χορηγούμενη θεραπεία με μεθυλπρεδνιζολόνη και 10 οι οποίοι δεν είχαν
ανταποκριθεί.
Απομονώθηκε γενωμικό DNA από λεμφοκύταρα περιφερικού αίματος των ασθενών. Τα εξώνια 2
έως 9 και οι παρακείμενες περιοχές συμπεριλαμβανομένων των θέσεων ματίσματος του γονιδίου
NR3C1 πολλαπλασιάστηκαν με PCR και υποβλήθηκαν σε απ’ ευθείας αλληλούχιση του DNA με
χρήση του Big Dye Terminator cycle sequencing kit v3.1 (Applied Biosystems) σε γενετικό αναλυτή
ABI 3500 (Applied Biosystems).
Έγινε στατιστική ανάλυση χ2 και Fisher’s exact test.
Αποτελέσματα
Δεν ανιχνεύθηκε παθολογική μετάλλαξη του γονιδίου στους ασθενείς με ΣΚΠ ενώ ανιχνεύθηκαν
τρεις πολυμορφισμοί: Ν363S (rs6195), N766N (rs6196) και c.1469-16 G>T (rs6188). Η στατιστική
ανάλυση δεν ανέδειξε στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των γονοτύπων των 3
πολυμορφισμών και της απόκρισης των ασθενών στα γλυκοκορτικοειδή. Επίσης δεν αναδείχθηκε
στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των πολυμορφισμών και της φάσης της νόσου.
Η σύγκριση της συχνότητας των αλληλομόρφων των πολυμορφισμών των ασθενών με ΣΚΠ με τις
αντίστοιχες συχνότητες του Ευρωπαϊκού πληθυσμού στο 1000 Genome Project ανέδειξαν
στατιστικά σημαντικές διαφορές. Συγκεκριμένα οι γονότυποι AA (rs6195), TT (rs6196) και GG
(rs6188) καθώς και η συχνότητα του αλλήλιου A (rs6195) παρουσίασαν στατιστικά σημαντικές
διαφορές μεταξύ των 2 πληθυσμών.
Συμπεράσματα
Αναλύθηκε η κωδικοποιούσα περιοχή του γονιδίου NR3C1 σε ασθενείς με ΣΚΠ και ανιχνεύθηκαν
τρεις γνωστοί πολυμορφισμοί. Η συχνότητα των γονοτύπων των πολυμορφισμών δεν εμφάνισε
στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις ομάδες των ασθενών. Η σύγκριση της συχνότητας
των αλληλομόρφων των πολυμορφισμών μεταξύ των ασθενών με ΣΚΠ και αυτή των Ευρωπαίων
στο 1000 Genome Project ανέδειξε στατιστικά σημαντικές διαφορές.
142
Δ.Α 23
ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΧΡΗΣΗΣ ΤΩΝ ΚΑΡΔΙΑΚΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΠΡΟΚΑΡΔΙΟ ΑΛΓΟΣ ΤΟΥ
ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟΥ ΚΟΖΑΝΗΣ.
Γρηγοροπούλου Γ.,1 ‘Ωττας-Λαγός,1 Γκουντιός Δ.,1 Παστόρε Φ.1
1 Εργαστήριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας, Γ. Ν. Κοζάνης Μαμάτσειο, Κοζάνη.
Εισαγωγή: Η καρδιακή τροπονίνη Τ είναι μια δομική πρωτεΪνη των μυών η οποία
απελευθερώνεται σε περίπτωση κυτταρικής βλάβης (νέκρωση) του μυοκαρδίου. Σύμφωνα με τις
κατευθυντήριες οδηγίες της Ευρωπαϊκής Καρδιολογικής Εταιρείας, η καρδιακή τροπονίνη αποτελεί
τον πλέον ενδεικνυόμενο βιοχημικό δείκτη μυοκαρδιακής νέκρωσης, με υψηλή ειδικότητα και
ευαισθησία. Επιπλέον, συστήνεται και η μέτρηση του μυοκαρδιακού ισοενζύμου ΜΒ κλάσματος
της κρεατινοκινάσης CK, ως εναλλακτικό δείκτη μυοκαρδιακής νέκρωσης.
Σκοπός: Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση και η συσχέτιση των επιπέδων των
καρδιακών δεικτών καρδιακής τροπονίνης Τ και μυοκαρδιακού ισοενζύμου της κρεατινοκινάσης
(CK-MB) σε ασθενείς που προσήλθαν στο τμήμα επειγόντων περιστατικών (ΤΕΠ) του νοσοκομείου
Κοζάνης.
Υλικό και μέθοδοι: Το υλικό της μελέτης αποτέλεσαν 685 οροί ασθενών οι οποίοι προσήλθαν στα
ΤΕΠ του Γενικού Νοσοκομείου Κοζάνης κατά τη χρονική περίοδο από 25/01/2012 έως 26/07/12. Η
ποιοτική μέτρηση της τροπονίνης Τ έγινε με την ποιοτική ανοσολογική μέθοδο Troponin T sensitive
της Roche Cardiac. Θετικό αποτέλεσμα του τεστ σημαίνει ότι η συγκέντρωση της τροπονίνης Τ στο
δείγμα είναι μεγαλύτερη από 0.1 ng/mL. Ο προσδιορισμός του ισοενζύμου MB της CK (μέτρηση
της καταλυτικής δραστικότητας της CK-MB) και ο προσδιορισμός της κρεατινοκινάσης (CK) έγινε
στον αναλυτή Cobas 6000 c501 της Roche.
Αποτελέσματα: Απο τα 685 δείγματα που εξετάστηκαν, τα 28 δείγματα (ποσοστό 4%) έδωσαν
θετικό αποτέλεσμα στο τεστ τροπονίνης και μόνο για ένα από αυτά παρατηρήθηκε αύξηση της
δραστικότητας της CK-MB(16% της CK).Τα υπόλοιπα 657 δείγματα (ποσοστό 96%) έδωσαν
αρνητικό αποτέλεσμα στο τεστ τροπονίνης. Από αυτά τα 21 δείγματα είχαν αυξημένη
δραστικότητα της CK-MB (6-13% της CK) ενώ τα υπόλοιπα είχαν φυσιολογική CK. Έτσι, όπως
φαίνεται από τον Πίνακα 1, τα ποσοστά των δειγμάτων για τα οποία παρατητηρήθηκε αύξηση της
δραστικότητας της CKMB είναι ίδια ανεξάρτητα από το αποτέλεσμα του τεστ τροπονίνης
Πίνακας 1: Συσχέτιση των επιπέδων της δραστικότητας της CKMB με τα αποτελέσματα της
τροπονίνης Τ, σε ασθενείς με προκάρδιο άλγος.
Αποτέλεσμα
τεστ Αυξημένη δραστικότητα
Φυσιολογική
τροπονίνης
CKMB
δραστικότητα CKMB
ΘΕΤΙΚΟ
3.6 %
96.4%
ΑΡΝΗΤΙΚΟ
3.2%
96.8%
Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματα της παρούσης μελέτης δείχνουν η αύξηση των επιπέδων της
CKMB δεν συσχετίζεται με το αποτέλεσμα του τεστ τροπονίνης σε ασθενείς με προκάρδιο άλγος.
Έτσι ο ταυτόχρονος προσδιορισμός και των δύο καρδιακών δεικτών συμβάλλει σημαντικά τόσο
στην πρόληψη όσο και στη γρήγορη διάγνωση των καρδιακών βλαβών.
143
Δ.Α 24
ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΒΑΛΣΑΡΤΑΝΗΣ ΜΕ ΑΜΛΟΔΙΠΙΝΗ Η΄ ΥΔΡΟΧΛΩΡΟΘΕΙΑΖΙΔΗ ΣΤΗ
ΝΕΦΡΙΚΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΚΑΙ ΠΡΩΤΕΪΝΟΥΡΙΑ ΣΕ ΥΠΕΡΤΑΣΙΚΟΥΣ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΟ
ΣΥΝΔΡΟΜΟ
Κωσταρά Χα, Χριστογιάννης Λβ, Κωσταπάνος Μβ, Κοντοδήμου Κα, Ελισάφ Μβ, Μπαϊρακτάρη Εα
αΕργαστήριο Κλινικής Χημείας, βΤομέας Παθολογίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων,
45110, Ιωάννινα
Εισαγωγή: Η αλβουμινουρία αποτελεί ανεξάρτητο παράγοντα κινδύνου για την εμφάνιση
αγγειακών συμβαμάτων. Η μικροαλβουμινουρία παρατηρείται συχνά σε ασθενείς με μεταβολικό
σύνδρομο. Η υπερτασική νεφροσκλήρυνση είναι μία από τις επιπλοκές της υπέρτασης που
συσχετίζεται με την εμφάνιση χρόνια νεφρικής νόσου. Είναι λίγα τα δεδομένα όσον αφορά την
επίδραση των συνδυασμών αντιυπερτασικών φαρμάκων στην πρωτεϊνουρία σε υπερτασικούς
ασθενείς με μεταβολικό σύνδρομο.
Σκοπός: Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η εκτίμηση της επίδρασης των συνδυασμών
βαλσαρτάνης με αμλοδιπίνη ή υδροχλωροθειαζίδη στη νεφρική λειτουργία και πρωτεϊνουρία σε
υπερτασικούς ασθενείς με μεταβολικό σύνδρομο.
Υλικά και Μέθοδοι: Σε 50 ασθενείς με υπέρταση σταδίου ΙΙ/ΙΙΙ και μεταβολικό σύνδρομο
χορηγήθηκε συνδυασμός βαλσαρτάνης με αμλοδιπίνη (160/5 mg/ημέρα, V-A, n=25) ή με
υδροχλωροθειαζίδη (160/12.5 mg/ημέρα, V-H, n=25). Πριν την έναρξη της αγωγής, καθώς και 16
εβδομάδες αργότερα προσδιορίσθηκαν τα επίπεδα της κρεατινίνης του ορού με βάση τα οποία
υπολογίσθηκε ο ρυθμός σπειραματικής διήθησης. Παράλληλα, προσδιορίσθηκε η νεφρική
απέκκριση της αλβουμίνης και α1-μικροσφαιρίνης, ως ένδειξη σπειραματικής και σωληναριακής
πρωτεϊνουρίας αντίστοιχα.
Αποτελέσματα: Οι 2 συνδυασμοί φαρμάκων είχαν σαν αποτέλεσμα μία σημαντική και παρόμοια
μείωση της αρτηριακής πίεσης. Δεν διέφερε σημαντικά η πρωτεϊνουρία και η νεφρική λειτουργία
των 2 ομάδων πριν τη χορήγηση της φαρμακευτικής αγωγής. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές
μεταβολές των επιπέδων της κρεατινίνης του ορού και του ρυθμού σπειραματικής διήθησης στις 2
ομάδες ασθενών. Πριν την έναρξης της αγωγής η νεφρική απέκκριση της αλβουμίνης ήταν
αυξημένη και στις δυο ομάδες των ασθενών: μέση τιμή 74 mg/g κρεατινίνης στην V-H ομάδα και
81 mg/g κρεατινίνης στην V-A ομάδα αντίστοιχα (μεταξύ των 2 ομάδων δεν παρατηρήθηκε
στατιστικά σημαντική διαφορά). Παρατηρήθηκε μία σημαντική μείωση της νεφρικής απέκκρισης
αλβουμίνης στην ομάδα V-A κατά 25,1% (p < 0,05). Εντούτοις, η νεφρική απέκκριση αλβουμίνης
δεν μεταβλήθηκε σημαντικά στην ομάδα V-H (p < 0,05 για την μεταξύ των ομάδων σύγκριση). Δεν
παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στη νεφρική απέκκριση αλβουμίνης πριν και
μετά τη χορήγηση της αγωγής και στις δυο ομάδες ασθενών.
Συμπεράσματα: Παρά την παρόμοια αντιυπερτασική δράση των 2 συνδυασμών, ο συνδυασμός VA ενδέχεται να είναι αποτελεσματικότερος από τον συνδυασμό V-H όσον αφορά τη μείωση της
αλβουμινουρίας. Τα αποτελέσματα αυτά πιθανά αναδεικνύουν τις προστατευτικές δράσεις της
συνδυασμένης αγωγής V-A στο νεφρικό σπείραμα.
144
Δ.Α 25
ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ SLC2A1 ΚΑΙ ΠΡΟΣΑΡΜΟΓΗ ΚΕΤΟΓΟΝΙΚΗΣ ΔΙΑΙΤΑΣ ΣΕ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΜΕ
ΑΤΥΠΗ ΜΟΡΦΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑΣ GLUT1
Σπανού Μαρία, Βάνα Κολοβού, Βλιώρα Χριστιάννα, Ζουγανέλη Σοφία, Κουτσοδόντης Γιώργος,
Παπαδοπούλου Άννα, Τσιρούδα Μαρία, Αγγουριδάκης Ιωάννης, Ντινόπουλος Αργύρης.
Γ’ ΠΑΙΔΙΑΤΡΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ, ΓΕΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟ
«ΑΤΤΙΚΟΝ» & «DNAGENETIX» Ιατρικό Διαγνωστικό Εργαστήριο Μοριακών και Γενετικών
Αναλύσεων
ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Η ανεπάρκεια GLUT1 είναι μια σπάνια νόσος με ποικίλη κλινική εικόνα, που
κληρονομείται με αυτοσωμικό επικρατή χαρακτήρα και παρουσιάζει ποικίλη κλινική εικόνα που
χαρακτηρίζεται κυρίως από φαρμακοανθεκτική επιληψία, σφαιρική αναπτυξιακή διαταραχή και
διαταραχές κινητικότητας. Έχουν περιγραφεί επίσης και άτυπες εκδηλώσεις του συνδρόμου με
χαρακτηριστικά την άτυπη αφαιρετική επιληψία, παροξυσμικά γεγονότα μετά από άσκηση ή
νηστεία καθώς και διαταραχές κινητικότητας που περιλαμβάνουν χοριοαθετωσικές κινήσεις. Η
κετογονική δίαιτα αποτελεί τη θεραπεία εκλογής, αλλά η εφαρμογή της δεν είναι πάντα εύκολη.
ΣΚΟΠΟΣ: Περιγράφονται οι περιπτώσεις δύο κοριτσιών, αδελφών ηλικίας 5 και 15 ετών καθώς και
του πατέρα τους. Αναλύεται η εφαρμογή τροποποιημένων μορφών κετογονικής δίαιτας ανά
περίπτωση μετά από κλινική και μοριακή διάγνωση ανεπάρκειας GLUT1.
ΜΕΘΟΔΟΣ/ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Περίπτωση Α: Κορίτσι 5 ετών με έναρξη αφαιρετικών επεισοδίων με
πτώσεις από 2,5 ετών και κινησιακή διαταραχή με αταξία και χοριοαθετωσικές κινήσεις. Ελάμβανε
τριπλή αντιεπιληπτική αγωγή χωρίς έλεγχο των επεισοδίων.
Περίπτωση Β: Κορίτσι 15 ετών με επεισόδια αφαίρεσης από την ηλικία των 2,5 ετών χωρίς
ανταπόκριση παρά την αντιεπιληπτική αγωγή με χοριοαθετωσικές κινήσεις άκρων και κλονικές
κινήσεις κάτω άκρων μετά από κόπωση
Ο πατέρας τους 39 ετών με επιληψία από την παιδική ηλικία υπό μερικό έλεγχο με αγωγή.
Έγινε έλεγχος με γλυκόζη ΕΝΥ 37mg/dl και γλυκαιμικό δείκτη 0.36, καθώς και ΗΕΓ καταγραφή
νηστείας και σίτισης με τυπικά ευρήματα για GLUT1. Το γαλακτικό οξύ ΕΝΥ ήταν εντός
φυσιολογικών ορίων. Άμεση αλληλούχιση του γονιδίου SLC2A1 ανέδειξε τη μετάλλαξη c.277C>T
που εδράζεται στο εξόνιο 4 του γονιδίου. Η συγκεκριμένη μετάλλαξη οδηγεί² σε αντικατάσταση του
αμινοξέος Arg από² Trp στη θέση 93 της πρωτεΐνης SLC2A1 και σχετίζεται με το σύνδρομο
ανεπάρκειας GLUT1. Στη συνέχεια έγινε έλεγχος στους γονείς και η ίδια μετάλλαξη ανευρέθη στον
πατέρα.
Τα παιδιά ξεκίνησαν κετογονική δίαιτα, αρχικά τροποποιημένη δίαιτα Atkins με σημαντική
βελτίωση της κλινικής εικόνας στην περίπτωση Β, όπου και παρέμεινε η δίαιτα ως ανωτέρω. Στην
περίπτωση Α λόγω μη καλής κλινικής ανταπόκρισης η δίαιτα τροποποιήθηκε σε κετογονική 4:1 με
αποτέλεσμα σημαντική βελτίωση των επεισοδίων και βελτίωση της κινητικής διαταραχής.
Σημειώνεται ότι η εφαρμογή² της δίαιτας ήταν δύσκολη με πλημμελή² συμμόρφωση και ότι η μικρή²
παρέκκλιση από² τη δίαιτα οδηγεί² σε άμεση υποτροπή² των επιληπτικών φαινομένων. Ακολούθησε
σταδιακή μείωση και διακοπή της αντιεπιληπτικής αγωγής.
145
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Η ανεπάρκεια GLUT1 είναι μια σπάνια νόσος για την οποία η κετογονική δίαιτα
είναι η θεραπεία εκλογής, με έλεγχο των επεισοδίων σπασμών αλλά και βελτίωση των κινητικών
διαταραχών και της γνωστικής λειτουργίας των ασθενών. Είναι ουσιώδης η όσο το δυνατόν
πρώιμη διάγνωση της οντότητας αυτής και η έναρξη κετογονικής δίαιτας, η οποία πρέπει να
προσαρμόζεται ατομικά σύμφωνα με τη συμμόρφωση και την κλινική ανταπόκριση.
146
Δ.Α 26
ΣΠΛΗΝΕΚΤΟΜΗ ΚΑΙ ΕΠΙΠΕΔΑ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΜΕΣΟΓΕΙΑΚΗ ΑΝΑΙΜΙΑ
Ι. Χατζηλάου1, Α. Καραβάς2
1Αιμοδοσία ΓΝΑ «Η Ελπίς», 2Μονάδα Μεσογειακής Αναιμίας ΓΝΑ «Γ. Γεννηματάς»
Εισαγωγή-Σκοπός: Τα επίπεδα των λιπιδίων στους ασθενείς με μεσογειακή αναιμία (ΜΑ) είναι
ελαττωμένα σε σχέση με τον υγιή πληθυσμό. Αυτό αποδίδεται σε πολλούς παράγοντες μεταξύ των
οποίων περιλαμβάνονται οι ηπατοπάθειες που είναι απότοκες των μεταγγίσεων (ηπατίτιδες C, B
και σιδήρωση του ήπατος) και η υπερπλασία - υπερλειτουργία του δικτυοενδοθηλιακού
συστήματος (ΔΕΣ). Στην εργασία αυτή εξετάζεται η επίπτωση της σπληνεκτομής στα επίπεδα των
λιπιδίων των ασθενών.
Υλικό και μέθοδος: Το υλικό αποτέλεσαν 77 ενήλικες ασθενείς με ΜΑ, 50 από αυτούς με
σπληνεκτομή και 27 χωρίς σπληνεκτομή. Μετρήθηκαν η χοληστερόλη, η LDL, η HDL και τα
τριγλυκερίδια. Τα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν με το πρόγραμμα στατιστικής SPSS.
Αποτελέσματα: (α).Τα επίπεδα της χοληστερόλης βρέθηκαν σημαντικά υψηλότερα στους ασθενείς
με σπληνεκτομή σε σύγκριση με τα επίπεδα των ασθενών χωρίς σπληνεκτομή (125.10±31.65 mg/dl
και 106.00±28.94 mg/dl αντίστοιχα, t=2.60, df=75, p<0.05). (β).Τα επίπεδα της LDL βρέθηκαν
επίσης σημαντικά υψηλότερα στους ασθενείς με σπληνεκτομή (62.86±27.88 mg/dl και
49.70±22.39 mg/dl αντίστοιχα, t=2.11, df=75, p<0.05). (γ).Η HDL και τα τριγλυκερίδια δεν διέφεραν
σημαντικά στις δύο ομάδες ασθενών.
Συμπεράσματα: Με βάση τα αποτελέσματα, τα επίπεδα χοληστερόλης και LDL στους ασθενείς με
σπληνεκτομή είναι σημαντικά υψηλότερα από τα αντίστοιχα επίπεδα των ασθενών χωρίς
σπληνεκτομή. Μια πιθανή εξήγηση είναι αυτό να οφείλεται στην ελάττωση, λόγω της
σπληνεκτομής, της συνολικής μάζας του υπερλειτουργούντος ΔΕΣ.
147
Δ.Α 27
ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΕΠΑΝΑΛΗΨΙΜΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΜΕΤΡΗΣΕΩΝ ΣΕ ΕΝΑ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΔΟΚΙΜΩΝ
ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ (PT) ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΥΛΙΚΩΝ ΕΛΕΓΧΟΥ.
Οθων Παναγιωτάκης1, Δημήτριος Ρίζος2, Κωνσταντίνος Μακρής3 και Αλέξανδρος Χαλιάσος1
1. ΕΣΕΑΠ Διεργαστηριακό Σχήμα Δοκιμών Ικανότητας Διαγνωστικών Εργαστηρίων, Αθήνα, Ελλάδα.
2. Ορμόνολογικό Εργαστήριο, Αρεταίειο Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Αθηνών,
Αθήνα, Ελλάδα.
3. Τμήμα Κλινικής Βιοχημείας, Γενικό Νοσοκομείο ΚΑΤ, Κηφισιά, Αθήνα, Ελλάδα.
Η αξιολόγηση της επαναληψιμότητας των μετρήσεων, στα διεργαστηριακά προγράμματα δοκιμών
ικανότητας, βασίζεται στην ανάλυση του ίδιου δείγματος πολλές φορές κατά τη διάρκεια ενός
κύκλου. Αυτό μπορεί να βάλει σε πειρασμό κάποιους από τους συμμετέχοντες να προσπαθήσουν
να εντοπίσουν τα δείγματα αυτά ώστε να καταχωρήσουν, τις ήδη γνωστές από τις προηγούμενες
αποστολές, τιμές-στόχους και να επιτύχουν μ’ αυτό τον τρόπο υψηλή βαθμολογία
επαναληψιμότητας. Για να αποτρέψει αυτή τη δυνατότητα, το ΕΣΕΑΠ, το Ελληνικό
Διεργαστηριακό Σχήμα Δοκιμών Ικανότητας Διαγνωστικών Εργαστηρίων, κατά τη διάρκεια του
κύκλου του έτους 2013 σχεδίασε στο σχήμα της κλινικής χημείας, χωρίς να ενημερώσει τους
συμμετέχοντες, μια μελέτη που περιλάμβανε την ανάλυση δύο φορές του ίδιου δείγματος και
άλλων δύο δειγμάτων, που προήρχοντο από το αρχικό δείγμα το οποίο είχε υποστεί μία αραίωση
κατά 10% όπως επίσης και μία συμπύκνωση κατά το ίδιο ποσοστό με αντίστοιχη τροποποίηση του
όγκου που λυοφιλοποιήθηκε ανά φιαλίδιο διατηρώντας σταθερό τον όγκο της ανασύστασης, στο
επίπεδο του όγκου των υπολοίπων δειγμάτων του κύκλου.
Ο σκοπός της μελέτης μας ήταν να διερευνηθεί η παρεμβολή της τροποποίησης των δειγμάτων
στην εκτίμηση της επαναληψιμότητας.
Διακόσια ενενήντα (290) εργαστήρια του ΕΣΕΑΠ από την Ελλάδα και την Κύπρο συμμετείχαν σε
αυτή την τυφλή μελέτη, από τη οποία αποκλείστηκαν: (α) τα εργαστήρια που δεν είχαν αναλύσει
και τα τέσσερα δείγματα στη διάρκεια του κύκλου, (β) τα αποτελέσματα των εργαστηρίων που
ήταν μεγαλύτερα ή μικρότερα των τριών τυπικών αποκλίσεων από την consensus μέση τιμή και (γ)
τα εργαστήρια που ανέφεραν αλλαγή μεθόδου κατά τη διάρκεια αυτού του κύκλου. Τελικά,
αξιολογήθηκαν τα 4 αποτελέσματα για κάθε μία από τις 21 διαφορετικές παραμέτρους κλινικής
χημείας από 209 συνολικά εργαστήρια. Δύο από τα δείγματα (δείγματα 1 & 2) αξιολογήθηκαν
όπως καταχωρήθηκαν και τα άλλα δύο μετά τη διόρθωση με τον κατάλληλο συντελεστή για την
αραίωση (δείγμα 3) ή την συμπύκνωση (δείγμα 4). Υπολογίστηκε, με αυτό τον τρόπο, η μέση τιμή
για κάθε δείγμα για κάθε μία από τις 21 παραμέτρους για όλα τα εργαστήρια και συγκρίθηκαν
αυτές οι μέσες τιμές, χρησιμοποιώντας το t-test. Αξιολογήθηκαν και τα 6 πιθανά ζεύγη που
προκύπτουν για κάθε παράμετρο. Τα αποτελέσματα μας παρουσιάζονται στον ακόλουθο πίνακα:
148
Δείγματα
1&3
1&4
1&2
3&4
2&4
2&3
GLU
URE
CRE
Να+
Κ+
PR
OT
A
L
B
CH
OL
H
DL
T
RI
UR
IC
TB
IL
C
a
PH
OS
M
G
F
e
SG
OT
(AS
T)
SG
PT
(AL
T)
γGT
CK
AMYL
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
Παρατηρήθηκε ότι, για την πλειοψηφία των εξετάσεων, που είναι γραμμοσκιασμένες στον
παραπάνω πίνακα, τρία ζεύγη δειγμάτων και συγκεκριμένα: (α) το πρώτο μη τροποποιημένο και το
αραιωμένο (1 & 3), (β) τα δύο ίδια, μη τροποποιημένα (1 & 2) και (γ) το δεύτερο μη
τροποποιημένοτο και το συμπυκνωμένο (2 & 4), έδειξαν στατιστικά μη σημαντική διαφορά (-), σε
αντίθεση με τους υπόλοιπους τρεις συνδυασμούς όπου ανιχνεύθηκαν στατιστικώς σημαντικές
διαφορές (+).
Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης μας δείχνουν ότι η πιθανή παρεμβολή που οφείλεται στην
τροποποίηση των δειγμάτων είναι μικρότερη από την αβεβαιότητα των μετρήσεων η οποία είναι
υπεύθυνη για τις παραπάνω στατιστικά σημαντικές ή μη διαφορές και κατά συνέπεια η τεχνική
μας μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση της επαναληψιμότητας στα σχήματα δοκιμών
ικανότητας διαγνωστικών εργαστηρίων του ΕΣΕΑΠ.
149
Δ.Α 28
ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΠΑΝΑΛΗΨΙΜΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΜΕΤΡΗΣΕΩΝ ΤΩΝ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ
ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΑΠΟ ΕΝΑ ΔΙΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟ ΣΧΗΜΑ ΔΟΚΙΜΩΝ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ (PT) ΚΑΙ
ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΤΗΣ ΜΕ ΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΜΕΤΑΒΛΗΤΟΤΗΤΑ.
Δημήτριος Ρίζος1, Οθων Παναγιωτάκης2, Κωνσταντίνος Μακρής3 και Αλέξανδρος Χαλίασος2
1. Ορμόνολογικό Εργαστήριο, Αρεταίειο Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Αθηνών, Αθήνα,
Ελλάδα.
2. ΕΣΕΑΠ Διεργαστηριακό Σχήμα Δοκιμών Ικανότητας Διαγνωστικών Εργαστηρίων, Αθήνα, Ελλάδα.
3. Τμήμα Κλινικής Βιοχημείας, Γενικό Νοσοκομείο ΚΑΤ, Κηφισιά, Αθήνα, Ελλάδα.
Τα ποιοτικά κριτήρια για Διεργαστηριακά Σχήματα Δοκιμών Ικανότητας στην Εργαστηριακή
Ιατρική περιλαμβάνουν την αξιολόγηση της ακρίβειας των μετρήσεων των συμμετεχόντων
εργαστηρίων, τη χρήση εναλλάξιμων με κανονικά δείγματα υλικών ελέγχου ανθρώπινης
προέλευσης που ελαχιστοποιούν τις επιδράσεις του υποστρώματος (matrix effect), την
αξιολόγηση της γραμμικότητας των μετρήσεων με τη χρήση τουλάχιστον δύο δειγμάτων ανά
διανομή και εξέταση και τέλος την εκτίμηση της επαναληψιμότητας των μετρήσεων.
Προκειμένου να εκπληρώσει αυτά τα κριτήρια, το ΕΣΕΑΠ (το Ελληνικό Διεργαστηριακό Σχήμα
Δοκιμών Ικανότητας Διαγνωστικών Εργαστηρίων) εισήγαγε τη μέτρηση της επαναληψιμότητας
χρησιμοποιώντας την ανάλυση του ίδιου δείγματος τέσσερις φορές κατά τη διάρκεια ενός ετήσιου
κύκλου. Ο ιδανικός στόχος ποιότητας για τα εργαστήρια που συμμετέχουν είναι η
επαναληψιμότητα να είναι τουλάχιστον 50% μικρότερη από τη βιολογική μεταβλητότητα για κάθε
εξέταση, όπως αυτή περιγράφεται στην ακόλουθη βιβλιογραφική αναφορά: Ricos et al. Current
databases on biologic variation: pros, cons and progress. Scand J Clin Lab Invest 1999;59:491-500,
revision 2014.
Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν τα αποτελέσματα από τα 290 εργαστήρια του ΕΣΕΑΠ στην
Ελλάδα και στη Κύπρο και αξιολογήθηκαν σε σχέση με τα προτεινόμενα όρια που προέρχονται
από τη βιολογική μεταβλητότητα για κάθε μια από τις εξετάσεις που περιλαμβάνονται στο
πρόγραμμα της κλινικής χημείας του ΕΣΕΑΠ. Από τη μελέτη αποκλείστηκαν (α) τα εργαστήρια που
δεν είχαν αναλύσει και τα τέσσερα δείγματα στη διάρκεια του κύκλου, (β) τα αποτελέσματα των
εργαστηρίων που ήταν μεγαλύτερα ή μικρότερα των τριών τυπικών αποκλίσεων από την
consensus μέση τιμή και (γ) τα εργαστήρια που ανέφεραν αλλαγή μεθόδου κατά τη διάρκεια
αυτού του κύκλου. Τελικά, αξιολογήθηκαν τα 4 αποτελέσματα για κάθε μία από τις 21
διαφορετικές παραμέτρους κλινικής χημείας από 209 συνολικά εργαστήρια και υπολογίσθηκε η
μέση τιμή επαναληψιμότητας για κάθε παράμετρο.
150
Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον ακόλουθο πίνακα:
Εξέταση:
Βιολογική
Μεταβλητότητα (%)
Προτεινόμενα όρια
(%)
Γλυκόζη
5,60
2,80
Μεση τιμή
επαναληψιμότητας
(%)
2,31
Ουρία
12,10
6,05
3,36
Κρεατινίνη
5,95
2,98
4,16
+
0,60
0,30
1,42
Κάλιο K+
4,60
2,30
1,78
Ολικά Λευκώματα
2,75
1,38
2,55
Αλβουμίνη
3,20
1,60
2,85
Χοληστερόλη
5,95
2,98
2,68
HDL-χοληστερόλη
7,30
3,65
3,57
Τριγλυκερίδια
19,90
9,95
2,89
Ουρικό Οξύ
8,60
4,30
2,82
Ολική χολερυθρίνη
21,80
10,90
4,14
Ασβέστιο
2,10
1,05
2,55
Φωσφορος
8,15
4,08
2,63
Μαγνήσιο
3,60
1,80
3,60
Σίδηρος
26,50
13,30
4,49
SGOT (AST)
12,30
6,15
3,13
SGPT (ALT)
19,40
9,70
5,30
γ- GT
13,40
6,70
4,59
CK
22,80
11,40
8,90
Αμυλάση
8,70
4,40
3,08
Νάτριο Na
Τα αποτελέσματά δείχνουν ότι όλες οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται σήμερα ξεπερνούν τους
προτεινόμενους στόχους ποιότητας, εκτός από τις περιπτώσεις του Νατρίου και του Ασβεστίου,
καθώς επίσης και της Κρεατινίνης, των Ολικών Λευκωμάτων, της Αλβουμίνης και του Μαγνησίου,
όπου τα αποτελέσματα είναι μικρότερα από τη βιολογική μεταβλητότητα, αλλά όχι κάτω από το
στόχο ποιότητας του 50% της βιολογικής μεταβλητότητας.
151
Στοιχεία Ομιλητών και Προέδρων στρογγυλών τραπεζιών:
Ferrari Maurizio, President-Elect IFCC, Professor of Clinical Pathology, University Vita-Salute San
Raffaele, Director of Clinical Molecular Biology and Cytogenetics Laboratory and Head of Unit of
Genomics for Diagnosis of Human Pathologies, IRCCS San Raffaele, Milan, Italy
Gouget Bernard, Treasurer IFCC, Asst. Professor, University Hospital , Paris Descartes, Conseiller
Santé Publique, Fédération Hospitalière de France, France
Lennartz Lieselotte, PhD, Scientific Affairs Manager, Abbott Diagnostics Europe
Morris Howard, Vice President IFCC, Endocrine Bone Research Laboratory, Professor of Medical
Science, School of Pharmacy and Medical Sciences, University of South Australia and Chief Medical
Scientist, Chemical Pathology. SA Pathology, Adelaide, Australia
Murray Sam, Dr. Biologist, BioMarkers Solutions Ltd, England
Panteghini Mauro, President EFLM, Department
University of Milano Medical School, Milan, Italy
of
Clinical
Sciences
“Luigi
Sacco”
Απέσσου Αγγελική, Δρ. Βιολόγος, Εργαστήριο Μοριακής Γενετικής, Genekor Medical S.A.
Βαμβουκάκης Ιωάννης, Βιολόγος, Leriva
Βογιατζάκης Ευάγγελος, Δρ. Ιατρός Βιοπαθολόγος -Κλινικός Μικροβιολόγος, Δν/τής
Μικροβιολογικού Εργαστηρίου και Εθνικού Κέντρου Αναφοράς Μυκοβακτηριδίων, Νοσοκομείο
"Σωτηρία"
Γρηγοράτου Ανδριανή, Δρ. Βιοχημικός, Βιοχημικό εργαστήριο ΓΝΑ Ευαγγελισμός
Δήμα Κλεάνθη, Επίκ. Καθηγήτρια Κλινικής Βιοχημείας, Αττικό Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο,
Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών
Ζευγώλης Βασίλειος, Δρ. Βιοχημικός, Εθνικό Κέντρο Αιμοδοσίας
Ιωαννίδης Παναγιώτης, Δρ. Μοριακός Βιολόγος, Εθνικό Κέντρο Αναφοράς Μυκοβακτηριδίων,
Νοσοκομείο "Σωτηρία"
Καράμπαμπα Φωτεινή, Δρ. Βιολόγος, Συνεργάτης TUI HELLAS
152
Καράμπελα Σιμόνα, Βιοπαθολόγος, Δντ/ρια ΕΣΥ, Μικροβιολογικό εργαστήριο, Νοσοκομείο
"Σωτηρία"
Καρίκας Γεώργιος, Καθηγητής Βιοχημείας-Κλινικής Χημείας, Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων,
Τεχνολογικό Εκπαιδευτικό Ίδρυμα Αθηνών
Καψιμάλη Βιολέττα, Επίκ. Καθηγήτρια Ιατρικής Μικροβιολογίας-Ανοσολογίας, Ιατρική Σχολή
Πανεπιστημίου Αθηνών
Κολιοπάνος Ανδρέας, Βιολόγος, Επιστημονικός Δ/ντής Leriva
Κορφιάς Στέφανος, Λέκτορας
Πανεπιστημίου Αθηνών
Νευροχειρουργικής,
ΓΝΑ
Ευαγγελισμός,
Ιατρική
Σχολή
Κρούπης Χρήστος, Επίκ. Καθηγητής Κλινικής Βιοχημείας-Μοριακής Διαγνωστικής, Αττικό
Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών
Κώνστα Ευγενία, Δρ. Χημικός, Επιστημονικός Συνεργάτης, Β’ Παθολογική Προπαιδευτική Κλινική,
Αιματολογική Μονάδα, Αττικό Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο
Λεϊμονή Ειρήνη, Δρ. Βιολόγος, Υπεύθυνη Διασφάλισης Ποιότητας, ΕΥΡΩΙΑΤΡΙΚΗ
Λιανίδου Ευρύκλεια, Καθηγήτρια Κλινικής Χημείας, Τμήμα Χημείας Πανεπιστημίου Αθηνών
Λόη Βασιλική, Χημικός, Ενδοκρινολογικό εργαστήριο Ερυθρός Σταυρός
Μακρής Κωνσταντίνος, Δρ. Βιολόγος, Βιοχημικό εργαστήριο, Νοσοκομείο ΚΑΤ
Μητρόπουλος Χρύσανθος, Βιολόγος, Γ.Γ. ΣΕΙΒ
Μπαϊρακτάρη Ελένη, Αναπλ. Καθηγήτρια Κλινικής Χημείας, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο
Ιωαννίνων, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Ιωαννίνων
Μπότουλα Εφη, Χημικός, Ενδοκρινολογικό εργαστήριο, ΓΝΑ Ευαγγελισμός
Νασιούλας Γεώργιος, Δρ. Βιοχημικός-Μοριακός Βιολόγος, Επιστημ. Δ/ντής Genekor Medical S.A.
Παπαδημητρίου Αγγελική, Μαιευτήρας Γυναικολόγος, Δρ Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Αθηνών
Παπαδημητρόπουλος Βασίλης, Χημικός MBA, Marketing Segment Manager, Europe Region East,
ABBOTT HELLAS
153
Παπασωτηρίου Ιωάννης, Δρ. Χημικός, Δν/τής Βιοχημικού Εργαστηρίου, Νοσοκομείο Παίδων «Αγία
Σοφία»
Ρίζος Δημήτριος , Αναπλ. Καθηγητής Κλινικής Χημείας, Αρεταίειο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο,
Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών
Σπυρόπουλος Βασίλειος, Καθηγητής Βιοϊατρικής Τεχνολογίας, Τμήμα Τεχνολογίας Ιατρικών
Οργάνων ΤΕΙ Αθηνών
Σπυροπούλου Παναγιώτα, Δρ. Βιολόγος, Τζάνειο Γενικό Νοσοκομείο
Τουρνής Συμεών, Δρ. Ενδοκρινολόγος, Εργαστήριο Έρευνας Παθήσεων
Μυοσκελετικού Συστήματος, Νοσοκομείο ΚΑΤ, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών
Τσατσάνης Χρήστος, Αναπλ. Καθηγητής Κλινικής Χημείας, Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο
Ηρακλείου, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Κρήτης
Τσόπλου Φένια, Δρ Βιολόγος, Gene Diagnosis
Τσιόδρας Σωτήριος, Αναπλ. Καθηγητής Παθολογίας-Λοιμωξιολογίας, Αττικό Παν/κό Γενικό
Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών και Λοιμωξιολόγος ΚΕΕΛΠΝΟ
Ψαρρά Κατερίνα, Δρ. Βιοχημικός, Τμήμα Ανοσολογίας - Ιστοσυμβατότητας, ΓΝΑ Ευαγγελισμός
Ψαχούλια Χριστίνα, Δρ. Χημικός, Βιοχημικό εργαστήριο, ΓΝΑ Ευαγγελισμός
Χαλιάσος Αλέξανδρος, Δρ. Ιατρός-Κλινικός Χημικός, ΕΣΕΑΠ
154
Χορηγοί
Ευχαριστούμε θερμά για την υποστήριξη:
Ε.Σ.Ε.Α.Π.
Abbott Ελλάς
P. Zafeiropoulos S.A. Διαγνωστικά Είδη
Leriva Διαγνωστικά
Medicon Hellas
Roche Hellas
Siemens Διαγνωστικά
155
156
157

PDF - Life Positive

2014 Οκτώβριος- Newsletter 13 - Ελληνική Εταιρία Κλινικής Χημείας

Βιβλίο Περιλήψεων - Ελληνική Εταιρία Κλινικής Χημείας

Τελικό Πρόγραμμα

ΧΑΙΡΕΤΙΣΜΟΣ ΠΡΟΕδΡΟυ 10ου ΠΣΚΧ - Ελληνική Εταιρία Κλινικής

Π Ρ Ο Κ Α Τ Α Ρ Κ Τ Ι Κ Ο Π Ρ Ο Γ Ρ Α Μ Μ Α 13&14/03/2014 www

αν. γραμματεας