ΕΦΑ­ΡΜ­Ο­ΣΜ­Ε­ΝΗ ΚΛ­Ι­Ν­ΙΚΗ ΜΙΚΡ­Ο­ΒΙ­ΟΛ­Ο­ΓΙΑ ΚΑΙ ΕΡΓΑ­ΣΤΗ­ΡΙ­ΑΚΗ ΔΙ­ΑΓ­Ν­Ω­ΣΤ­ΙΚΗ
(Εφαρ Κλ­ιν Μικρ­ο­βι­ολ Εργ Δι­αγν)
ΚΩΔΙΚΟΣ: 4315
Τρίμη­νη Έκδ­οση της Ετ­αιρ­είας Κλ­ι­ν­ικής Μικρ­ο­βι­ολ­ο­γίας και Εργα­στη­ρι­ακής Δι­αγ­ν­ω­στ­ικής
Έτος Ίδ­ρυσης 1986
Ιδρύτρια: Α. Αρ­σέ­νη
Δι­ο­ικ­ητι­κό Συ­μβ
­ ο­ύ­λιο
Πρό­εδ­ρος: Χρύ­σα Κο­ύ­τσ­ια-Καρ­ο­ύζ­ου
Αντ­ιπρό­εδ­ρος: Μαρία Γιαννάκη-Ψινάκη
Γε­ν­ική Γραμ­μα­τέ­ας: Μαρία Κανελλοπούλου
Τα­μίας: Αθ­ηνά Χαρι­σι­ά­δ­ου
Ει­δι­κή Γραμ­μα­τέ­ας: Ελένη Αλεξάνδρου-Αθανασούλη
Τακ­τι­κά Μέλη: Δ
ημήτρης Παπαβέντσης, Λουκία Ζέρβα
Αν­απληρωματικά Μέλη: Ελένη Πρίφτη-Παπαγιαννάκου, Μαρία Παπαδημητρίου, Σοφία Τσιπλάκου
Εξ­ελ­εγ­κ­τι­κή Επι­τρ­οπή
Κατερίνα Χρυσάκη, Ευαγγελία Πετρίδου
Συ­ν­τ­ακ­τι­κή Επι­τρ­οπή
Διευθυντές Σύ­ντ­αξ­ης: Μ. Γιαννάκη-Ψινάκη, Μ. Κανελλοπούλου
Συ­ντ­άκ­τες: Μ. Φουστούκου, Ε. Αλεξάνδρου, Δ. Παπαβέντσης
Μέλη:
Αργυροπούλου Α.
Κουππάρη Γ.
Αρσένης Γ.
Κούτσια-Καρούζου Χ.
Βαγιάκου Ε.
Λεγάκης Ν.
Βακάλης Ν.
Λεμπέση Ε.
Βατόπουλος Α.
Μαλάμου-Λαδά Ε.
Βελεγράκη Τ.
Μανιάτης Α.
Βελονάκης Ε.
Μαρόπουλος Γ.
Βογιατζάκης Ε.
Μεντής Α.
Βογιατζή-Ηλιάδου A.
Μυριαγκού Β.
Δαΐκος Γ.
Νικολάου Χ.
Δίζα-Ματαυτσή Ε.
Ορφανίδου Μ.
Δρογγάρη-Απειρανθίτου Μ.
Πάγκαλη Α.
Ζέρβα Λ.
Παλέρμος Ι.
Θέμελη-Διγαλάκη Κ.
Παπαδογιωργάκη Ε.
Θεοδωρίδης Θ.
Παπαπαρασκευάς Ι.
Κανακούδη-Κανσουζίδου Α.
Παπαστεριάδη-Παχούλα Χ.
Καραμπογιά Π.
Παππά Α.
Κατσάνης Γ.
Παρασκάκη Ε.
Πετεινάκη Ε.
Πετροχείλου-Πάσχου Β.
Πεφάνης Α.
Πλατσούκα Ε.
Πρίφτη Ε.
Σιαφάκας Ν.
Σπηλιοπούλου Ι.
Στάθη Α.
Σταμουλακάτου Α.
Στεφάνου Ι.
Τάσσιος Π.
Τζανακάκη Τ.
Τζουβελέκης Λ.
Τσιφτσάκης Ε.
Τρίκκα-Γραφάκου Ε.
Φωτιάδου-Παππά Ε.
Χαρισιάδου Α.
Χατζηπαναγιώτου Ε.
Ηλεκτρονική επεξεργασία εντύπου: Αικ. Κολυμπίρη, Τηλ. 6939551579
Πληροφορίες: Χ. Κούτσια-Καρούζου, Τηλ.: 210 8923622
ΕΠΙ­ΣΤ­ΗΜ­ΟΝ
­ ­ΙΚΗ ΑΛ­Λ­ΗΛΟ­ΓΡ­ΑΦ­ΙΑ
Δι­εύ­θυ­νση Ετ­αιρ­είας: Μαι­άν­δ­ρου 23, 115 28 Αθήνα
[email protected]
[email protected]
Οι αναγνώστες του περιοδικού μας μπορούν να
απευθύνονται στην ακόλουθη ηλεκτρονική
διεύθυνση: www.ekmed.gr – www.scmld.gr
Ιδι­ο­κ­τήτ­ης: Ετ­αιρ­εία Κλ­ι­ν­ικής Μικρ­οβ
­ ι­ολ­ο­γίας και Εργαστηριακής Διαγνωστικής
AP­PLIED CLIN­I­CAL MI­CRO­BI­OL­O­GY AND LAB­O­RA­TO­RY DI­AG­NO­SIS
(Ap­plied Clin Mi­cro­bi­ol)
Pub­lished Quar­ter­ly by the Greek So­ci­e­ty for Clin­i­cal Mi­cro­bi­ol­o­gy and Lab­o­ra­to­ry Di­ag­no­sis
Of­fi­cers of the So­ci­e­ty
Pres­i­dent: Ch. Kout­sia-Kar­ou­zou
Vice Pres­i­dent: M. Gi­an­naki-Psinaki
Sec­re­tary Gen­er­al: M. Kanellopoulou
Treas­ur­er: A. Char­is­si­ad­ou
Sec­re­tary: H. Alexandrou-Athanasouli
Mem­bers: D. Papaventsis, L. Zerva, H. Prifti-Papayannakou, M. Papadimitriou, S. Tsiplakou
Audit Committee
Κ. Chrysaki, E. Petridou
Ed­i­to­ri­al Board
Ed­i­tors-in-Chief: M
. Giannaki-Psinaki, M. Kanellopoulou
As­sist­ant Ed­i­tors: M
. Foustoukou, H. Alexandrou, D. Papaventsis
Mem­bers:
Argyropoulou A.
Mentis A.
Arsenis G.
Myriagou V.
Charisiadou A.
Nikolaou C.
Chatzipanagiotou E.
Orfanidou M.
Daikos G.
Palermos J.
Diza-Mataftsi E.
Pangalis A.
Drogari-Apeiranthitou M.
Papadogiorgaki E.
Fotiadou-Pappa E.
Papaparaskevas J.
Kanakoudi-Kansouzidou A.
Papasteriadi-Pachoula C.
Karaboyia P.
Pappa A.
Katsanis G.
Paraskaki E.
Kouppari G.
Pefanis A.
Koutsia-Carouzou C.
Petinaki E.
Lebessi H.
Petrocheilou-Paschou V.
Legakis N.
Platsouka E.
Malamou-Ladas H.
Prifti E.
Maniatis A.
Siafakas N.
Maropoulos G.
Spiliopoulou I.
Ad­dress
So­ci­et­ y for Clin­i­cal Mi­cro­bi­ol­o­gy and Laboratory Diagnosis
23, Me­an­drou Str.
115 28 Athens, Greece
http://www.scmld.gr
Stamoulakatou A.
Stathi A.
Stefanou I.
Tassios P.
Themeli-Digalaki K.
Theodoridis T.
Trikka-Graphakos E.
Tsiftsakis E.
Tzanakaki T.
Tzouvelekis L.
Vagiakou E.
Vakalis N.
Vatopoulos A.
Velegraki T.
Velonakis E.
Vogiatzakis E.
Vogiatzi-Iliadou A.
Zerva L.
Εφαρμοσμένη
Κλινική Μικροβιολογία
και Εργαστηριακή Διαγνωστική
Περίο­δ­ος Β’, Τό­μ­ος 17, Τεύχος 1
Ιανουάριος - Μάρτιος 2012
ΠΕ­ΡΙΕΧΟΜΕ­ΝΑ
Σελίδα
ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΕΙΣ
Φυματιώδης μηνιγγίτιδα
Μ. Κεχαγιά, Αικ. Βελέντζα
9-17
Φυματιώδης μέση ωτίτιδα: μια σπάνια νόσος
Αικατερίνη Μιχελάκη, Αικ. Βελέντζα, Μ. Κανελλοπούλου
18-23
ΜΕΛΕΤΗ
Συνδυαστική θεραπεία ποσακοναζόλης και αμφοτερικίνης Β σε πειραματικό
μοντέλο διάσπαρτης καντιντίασης. Συσχέτιση με in vitro αποτελέσματα
Αντ. Ελεφάντη, Π. Αλεξάκος, J. Mouton, Λ. Ζέρβα, Ιωσήφ Μελετιάδης
ΕΝΔΙΑΦΕΡΟΥΣΑ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ
Ισχαιμικό εγκεφαλικό έμφρακτο σε βρέφος από HSV
M. Γιαννάκη, Γ. Γεωργούλης, Κ. Τσαπρούνη, Ευαγγ. Πετρίδου, Β. Συριοπούλου
Α. Πάγκαλη
ΤΕΧΝΙΚΗ
Η χρώση «Ziehl - Neelsen»
Αικ. Βελέντζα, Ευστ. Λιάκου
24-34
35-40
41-43
ΣΥΝΕΔΡΙΑ - ΣΕΜΙΝΑΡΙΑ
46
Τρίμη­νη Έκδ­οση της Ετ­αιρ­είας Κλ­ι­ν­ικής Μικρ­ο­βι­ολ­ο­γίας και Εργα­στη­ρι­ακής Δι­αγ­ν­ω­στ­ικής
GR - ISSN 1105 - 4719
Applied Clinical Microbiology
and Laboratory Diagnosis
Pe­ri­od B’, Vol­ume 17, No 1
REVIEWS
Tuberculous meningitis
M. Kechagia, Aik. Velentza
January - March 2012
CON­TENTS
Tuberculosis otitis media: a rare disease
A. Michelaki, Aik. Velentza, M. Kanellopoulou
PAPER
Combination therapy of posaconazole with amphotericin B in a murine model of
experimental disseminated candidiasis. Correlation with in vitro results
Ant. Elefanti, Pav. Alexakos, J. Mouton, L. Zerva, Jos. Meletiadis
Page
9-17
18-23
24-34
CASE REPORT
HSV-2 and ischemic stroke in an infant
M. Giannaki, G. Georgoulis, K. Tsaprouni, E. Petridou, V. Syriopoulou, A. Pangalis
35-40
TECHNIQUE
The Ziehl-Neelsen stain
Aik. Velentza, Eust. Liakou
41-43
CONGRESSES - SEMINARS
AP­PLIED CLIN­I­CAL MI­CRO­BI­OL­O­GY AND LAB­O­RA­TO­RY DI­AG­NO­SIS
Pub­lished Quar­ter­ly by the So­ci­e­ty of Clin­ic­ al Mi­cro­bi­ol­o­gy - Athens
46
ΟΔΗΓΙΕΣ ΠΡΟΣ ΤΟΥΣ ΣΥΓΓΡΑΦΕΙΣ
Το περιοδικό αυτό εκδίδεται από την Εταιρεία Κλινικής Μικροβιολογίας και Εργαστηριακής Διαγνωστικής και έχει στόχο
την ενημέρωση και συνεχή εκπαίδευση των Ελλήνων Βιοπαθολόγων σε θέματα Κλινικής Μικροβιολογίας και Εργαστηριακής
Διαγνωστικής γενικότερα. Γι' αυτό το σκοπό δημοσιεύονται σε αυτό τα ακόλουθα:
1. Ανασκοπήσεις
Αναλυτικές παρουσιάσεις με σύγχρονη βιβλιογραφία σε ενδιαφέροντα θέματα της Κλινικής Μικροβιολογίας,
Εργαστηριακής Αιματολογίας, Κλινικής Χημείας και Εργαστηριακής Ανοσολογίας. Τις ανασκοπήσεις υπογράφει ένας ή το
πολύ δύο συγγραφείς. Η έκταση του άρθρου συμπεριλαμβανομένης της βιβλιογραφίας δεν πρέπει να υπερβαίνει τις 20 δακτυλογραφημένες σελίδες και οι βιβλιογραφικές παραπομπές τις 50.
2. Ερευνητικές εργασίες
Μελέτες πρωτότυπες και πρωτοδημοσιευμένες καθαρά εργαστηριακές, μικτές κλινικο-εργαστηριακές ή επιδημιολογικές,
προοπτικές ή αναδρομικές πρέπει να βασίζονται σε ερευνητικό πρωτόκολλο και να περιγράφεται αναλυτικά η μεθοδολογία τους.
Η έκταση των ερευνητικών εργασιών να μην υπερβαίνει τις 9 δακτυλογραφημένες σελίδες. Η βιβλιογραφία να συμπεριλαμβάνεται στις 8 σελίδες και το σύνολο των αναφορών να μην υπερβαίνει τις 20.
3. Άρθρα σύνταξης
Βραχείες ανασκοπήσεις ή απόψεις σε επίκαιρα θέματα από τα μέλη του Δ.Σ. ή τα μέλη της Συντακτικής Επιτροπής, επώνυμα ή ανώνυμα. Η έκταση του άρθρου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τις 5 δακτυλογραφημένες σελίδες συμπεριλαμβανομένης
και της βιβλιογραφίας, η οποία θα πρέπει να έχει έως 10 βιβλιογραφικές παραπομπές.
4. Ενδιαφέρουσες περιπτώσεις
Περιπτώσεις σπάνιες ή με ενδιαφέρουσα εργαστηριακή διάγνωση. Γράφονται από βιοπαθολόγους με συμμετοχή κλινικών ιατρών (μέχρι 6 συγγραφείς). Αφορούν περιπτώσεις που η διάγνωσή τους έγινε κυρίως από το Εργαστήριο. Η έκτασή τους
να είναι έως 5 δακτυλογραφημένες σελίδες συμπεριλαμβανομένης της βιβλιογραφίας, η οποία να περιέχει ως 10 αναφορές.
5. Τεχνικές - Μεθοδολογία
Ενημερωτικά άρθρα στη διαγνωστική αξία νέων μεθόδων, περιγραφή νέων εφαρμόσιμων τεχνικών και μεθόδων ποιοτικού ελέγχου. Η έκταση του άρθρου να μην υπερβαίνει τις 5 δακτυλογραφημένες σελίδες συμπεριλαμβανομένης της βιβλιογραφίας, η οποία να περιέχει ως 10 αναφορές.
6. Σεμινάρια, στρογγυλά τραπέζια
Ολόκληρο το θέμα ενός Σεμιναρίου ή Στρογγυλού Τραπεζιού εφ' όσον έχει ζητηθεί γραπτό κείμενο σύμφωνα με τις οδηγίες του περιοδικού και ειδική βιβλιογραφία.
7. Επιστημονικές ειδήσεις
Βιβλιοκρισίες ή βιβλιοπαρουσιάσεις, παρουσίαση αποτελεσμάτων, εργασιών, συνεδρίων, συνοπτικά ή πρακτικά συνεδρίων υπό μορφή περιλήψεων, ανακοινώσεις επιστημονικών συναντήσεων ή συνεδρίων.
8. Επικοινωνία με τους αναγνώστες
Εδώ μπορούν να δημοσιεύονται, α) επιστολές προς τη σύνταξη για διάφορα θέματα που αφορούν τους αναγνώστες και το
περιοδικό, β) ερωτήσεις - θέματα ιατρικού περιεχομένου, τα οποία μας βοηθούν στον έλεγχο και την αξιολόγηση των γνώσεών μας.
ΤΡΟΠΟΣ ΥΠΟΒΟΛΗΣ ΕΡΓΑΣΙΩΝ
Γίνονται δεκτές εργασίες μόνον στην ελληνική γλώσσα. Η γλώσσα πρέπει να είναι ομοιογενής, δημοτική, μονοτονική. Η
εργασία θα πρέπει να συνοδεύεται από επιστολή ενυπόγραφη από τον υπεύθυνο για την αλληλογραφία συγγραφέα. Στην επιστολή θα πρέπει να δηλώνεται ότι όλοι οι συγγραφείς συμφωνούν για τη δημοσίευση και ότι η εργασία δεν έχει ξαναδημοσιευτεί.
Το κείμενο της εργασίας υποβάλλεται δακτυλογραφημένο με διπλό διάστημα σε Α4 210Χ297, περιθώριο 2,5 cm, σε 3 αντίγραφα (ένα για το αρχείο του περιοδικού και δύο για τους κριτάς) και συνοδεύεται από δισκέτα προγράμματος Word 97 ή νεότερο.
Πρέπει να χρησιμοποιούνται χωριστές σελίδες για κάθε ένα κεφάλαιο. 1) Σελίδα τίτλου, 2) Περίληψη - λέξεις ευρετηρίου,
3) Κυρίως κείμενο της εργασίας, 4) Πίνακες, 5) Εικόνες, 6) Λεζάντες εικόνων, 7) Ευχαριστίες, 8) Βιβλιογραφία, 9) Περίληψη
στην Αγγλική.
Γράφονται τα εξής:
Τίτλος της μελέτης. Να είναι σύντομος (όχι πάνω από 10 λέξεις). Μπορεί να υπάρχει και υπότιτλος. Πλήρες ονοματεπώνυμο κάθε συγγραφέα (μικρό όνομα και επίθετο στην ονομαστική), Ίδρυμα, Εργαστήριο ή Κλινική όπου έγινε η μελέτη.
Όνομα, διεύθυνση και τηλέφωνο του υπεύθυνου συγγραφέα για αλληλογραφία. Ημερομηνία (ταχυδρομική) υποβολής της
μελέτης.
Το κείμενο
Οι ερευνητικές εργασίες αποτελούνται συνήθως από τα κεφάλαια: Εισαγωγή, Υλικό και μέθοδος, Αποτελέσματα,
Συζήτηση. Η εισαγωγή περιλαμβάνει τις απαραίτητες βιβλιογραφικές παραπομπές και αναφέρει το λόγο για τον οποίο πραγματοποιήθηκε η εργασία.
Στη μεθοδολογία περιγράφεται το πρωτόκολλο, με βάση το οποίο εξελίχθηκε η έρευνα. Αναφέρονται λεπτομερώς ο τρόπος επιλογής ασθενών ή οποιουδήποτε υλικού, καθώς και η μέθοδος η οποία εφαρμόστηκε, ώστε η ίδια έρευνα να μπορεί να
αναπαραχθεί από μελλοντικούς ερευνητές. Στην περίπτωση ερευνών που αφορούν σε ανθρώπους, πρέπει να τονίζεται ότι η
έρευνα πραγματοποιήθηκε με βάση τη Διακήρυξη του Ελσίνκι (1975). Οι φαρμακευτικές ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν στη
μελέτη πρέπει να αναφέρονται με τη χημική ονομασία τους. Περιγράφεται το υλικό που αξιολογήθηκε κατά τη διάρκεια της
μελέτης και το κεφάλαιο ολοκληρώνεται με τα στατιστικά κριτήρια που χρησιμοποιήθηκαν.
Στο επόμενο κεφάλαιο παρουσιάζονται τα αποτελέσματα ολοκληρωμένα, αλλά σύντομα. Όσα αναφέρονται σε πίνακες,
δεν επαναλαμβάνονται στο κείμενο.
Στη συζήτηση περιγράφονται οι προοπτικές που διανοίγονται με τα αποτελέσματα της μελέτης, καθώς και τα τελικά συμπεράσματα. Δεν επαναλαμβάνονται όσα έχουν αναφερθεί στα αποτελέσματα. Επίσης, μπορεί να γίνει σύγκριση με τα αποτελέσματα άλλων ομοιειδών εργασιών. Συνδέονται τα αποτελέσματα με τους στόχους της μελέτης, αποφεύγονται όμως αυθαίρετα
συμπεράσματα, τα οποία δεν προκύπτουν από τα αποτελέσματα της εργασίας.
Οι πίνακες
Γράφονται ο καθένας σε χωριστή σελίδα αριθμούμενοι με αραβικούς αριθμούς. Η λεζάντα (τίτλος) πρέπει να είναι σαφής
ώστε να μη χρειάζεται να ανατρέχει κανείς στο κείμενο για να καταλάβει το περιεχόμενό του. Οι στήλες να έχουν κάθε μία μια
σύντομη επικεφαλίδα. Στο κάτω μέρος του πίνακα γράφονται επεξηγήσεις των συντομογραφιών και σημείων που σημειώθηκαν
στο κείμενο του πίνακα. Αποφεύγονται οι κάθετες γραμμές.
Οι εικόνες
Εικόνες λέγονται όλα τα σχήματα, διαγράμματα, φωτογραφίες κ.λπ. Αριθμούνται με αραβικούς αριθμούς. Οι λεζάντες
όλων των εικόνων (τίτλοι) γράφονται μαζί σε μια ξεχωριστή σελίδα. Προκειμένου για σχήματα πρέπει να είναι σχεδιασμένα
με σινική μελάνη από γραφίστα χωρίς γράμματα ή αριθμούς από γραφομηχανή, και οι φωτογραφίες σε γυαλιστερό χαρτί στο
πρωτότυπο (όχι φωτοαντίγραφα).
Όλες οι εικόνες καθώς και οι πίνακες πρέπει να αναφέρονται στο κείμενο με τους αριθμούς των.
Ελληνική περίληψη
Περιλαμβάνει το σκοπό εν συντομία (τα κεφάλαια): υλικό, μέθοδοι, τεχνική, αποτελέσματα και συμπεράσματα (200-300 λέξεις).
Μετά την περίληψη παρατίθενται 5-10 λέξεις ευρετηρίου.
Αγγλική περίληψη
Αγγλική περίληψη αναγράφεται σε όλες τις μελέτες (ανασκοπήσεις, ερευνητικές εργασίες, περιπτώσεις κ.λπ.) με 200-400
λέξεις. Γράφεται στα αγγλικά το/τα ονόματα του συγγραφέα, ο τίτλος του άρθρου και το ίδρυμα και το τμήμα προέλευσης.
Ευχαριστίες
Προς τα άτομα που βοήθησαν με οποιονδήποτε τρόπο.
Βιβλιογραφία
Στο κείμενο αριθμούνται με αραβικούς αριθμούς σε παρένθεση με τη σειρά που εμφανίζονται. Σε περίπτωση που αναφέρονται ονομαστικά συγγραφείς γράφονται το επίθετο του 1ου συγγραφέα και ακολουθεί το «et al» για τις ξένες και το «και συν»
για τις ελληνικές μελέτες. Αν είναι δύο οι συγγραφείς αναφέρονται και οι δύο.
Στον κατάλογο βιβλιογραφίας γράφονται με τη σειρά που εμφανίσθηκαν στο κείμενο με τους ίδιους αριθμούς. Πρώτα γράφεται
το επώνυμο, ακολουθούν τα αρχικά του μικρού ονόματος (χωρίς τελείες), κόμμα, τα ονόματα των άλλων, μέχρι έξι συγγραφέων. Οι
πέραν των έξι δεν γράφονται αλλά σημειώνονται με το «et al». Ακολουθεί ο τίτλος της μελέτης, το περιοδικό με την αποδεκτή συντομογραφία του κατά το Index Medicus χωρίς τελείες, το έτος, ο τόμος, η πρώτη και η τελευταία σελίδα της δημοσίευσης. Οι βιβλιογραφικές παραπομπές που αναφέρονται σε άρθρα που δημοσιεύθηκαν σε ελληνικά περιοδικά γράφονται με ελληνικούς χαρακτήρες.
Σε περίπτωση που δεν αναφέρεται όνομα συγγραφέως (π.χ. άρθρα συντάξεως περιοδικών) μπαίνει η λέξη Anonymous και
για ελληνικές μελέτες «Ανώνυμος», ακολουθεί ο τίτλος της μελέτης, το περιοδικό, το έτος, ο τόμος και οι σελίδες.
Εργασίες που έγιναν δεκτές για δημοσίευση σε κάποιο περιοδικό αλλά δεν δημοσιεύθηκαν ακόμη μπορούν να αναφερθούν στη βιβλιογραφία με τη σημείωση «υπό δημοσίευση».
Περιλήψεις μελετών από το Πρόγραμμα Συνεδρίου δεν περιλαμβάνονται στον κατάλογο βιβλιογραφίας ούτε και προφορικές ανακοινώσεις και ομιλίες μπορεί να αναφερθούν στο κείμενο. Περιλαμβάνονται μελέτες που δημοσιεύονται στα Πρακτικά
Συνεδρίου υπό την πλήρη μορφή των, μπορεί και σαν περίληψη. Πίνακες και Εικόνες από βιβλία ή από δημοσιευμένές μελέτες πρέπει να συνοδεύονται από έγγραφη χορήγηση άδειας αναδημοσιεύσεως από το συγγραφέα ή τον εκδότη. Μελέτη δημοσιευθείσα σε ένα ξενόγλωσσο περιοδικό μπορεί να γίνει δεκτή προς αναδημοσίευση στο περιοδικό αυτό σε ελληνική μετάφραση συνοδευόμενο με τα σχετικά έγγραφα.
ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ τρόπου γραφής τριών βιβλιογραφικών παραπομπών στον κατάλογο της βιβλιογραφίας. (Για τις
άλλες περιπτώσεις βλέπε τους Ενιαίους Κανόνες Γραφής κατά το σύστημα Vancouver που δημοσιεύονται στο 1ο τεύχος 1995
Ιανουαρίου-Φεβρουαρίου του περιοδικού αυτού).
Άρθρο από περιοδικό: Gray J, Marsh PJ, Stewart D, Pedler SJ. Enterococcal bacteraemia: a prospective study of 125
episodes. J Hosp Infect 1994, 27: 179-186.
Άρθρο από βιβλίο: Kenny G. Mycoplasmas. Ιn ΜanuaΙ of Clinical Microbiology, 5th Edition, American Society for
Microbiology 1991, p. 478-487.
Άρθρο από Πρακτικά Συνεδρίου: Lee LA, Pugr ΝΒ, Bean ΝΗ, Tauxe RV. Antimicrobial resistance οf Salmonella isolated
from patient 1989-1990 (abstract 523) Ιn: Program and Abstracts of the 31st Interscience Conference in Antimicrobial Agents and
Chemotherapy (Chicago) Washington DC: American Society for Microbiology 1991: 186.
Οι Οδηγίες αυτές γράφθηκαν με βάση τους Ενιαίους Κανόνες γραφής όπως αναφέρονται στην ιστοστελίδα του Ιατροτέκ.
Διορθώσεις - Ανάτυπα
Διόρθωση από τους συγγραφείς πραγματοποιείται μια φορά μετά τη διαδικασία της κρίσης από δύο κριτές και την αποδοχή προς δημοσίευση από τη Συντακτική Επιτροπή. Η διόρθωση πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τις υποδείξεις της Συντακτικής
Επιτροπής και αποκλείονται αυθαίρετες τροποποιήσεις.
Η παραγγελία ανατύπων βαρύνει τους συγγραφείς και γίνεται κατ' ευθείαν στην Εκδοτική Εταιρεία.
Της Σύ­ν­τ­αξ­ης
Έπειτα από μακρά, 16 ετή και γόνιμη θητεία στη διεύθυνση του περιοδικού της εταιρείας
μας η κυρία Βασιλική Πετροχείλου-Πάσχου αποχωρεί από τη θέση αυτή.
Αισθανόμαστε την ανάγκη και την υποχρέωση να εκφράσουμε τη βαθιά μας ευγνωμοσύνη για τη σημαντική συμβολή της στην εδραίωση του περιοδικού ανάμεσα στα ιατρικά
έντυπα που όχι μόνο διαβάζονται, αλλά και χρησιμοποιούνται ως βοήθημα στην καθημερινή
πρακτική των Εργαστηρίων. Η κυρία Β. Π-Π όχι μόνο συντόνιζε την έκδοση, συνεχίζοντας
το έργο της δασκάλας όλων μας Αντιγόνης Αρσένη, αλλά μας δίδαξε και τον τρόπο σωστής
συγγραφής, βελτιώνοντας τα κείμενα που της παραδίδαμε και δίνοντάς μας κάθε φορά πολύτιμες συμβουλές.
Ελπίζουμε ότι, με τη βοήθεια των συναδέλφων-συγγραφέων και με τις εποικοδομητικές
προτάσεις των αναγνωστών, το περιοδικό μας θα συνεχίσει την εκπαιδευτική του δραστηριότητα, δημοσιεύοντας ανασκοπήσεις, νέες εργαστηριακές μεθόδους, ενδιαφέρουσες περιπτώσεις και μελέτες από όλους τους τομείς της ειδικότητάς μας.
•••
Η πρώτη ανασκόπηση προέρχεται από το Μικροβιολογικό Τμήμα του «Σισμανόγλειου»
Γ.Ν.Α. από δύο νέους επιστήμονες, την ειδικευομένη στη Βιοπαθολογία Κεχαγιά Μ. και τη
βιολόγο Βελέντζα Αικ. Τίτλος της ανασκόπησης είναι «Φυματιώδης μηνιγγίτιδα». Είναι ένα
ενδιαφέρον θέμα, διότι αν και παγκοσμίως η φυματιώδης μηνιγγίτιδα αποτελεί το 6% των
εξωπνευμονικών εστιών φυματίωσης, στην πατρίδα μας φτάνει το 13% (ECDC 2007). Το
γεγονός της αύξησης των HIV κρουσμάτων στην Ελλάδα, ιδιαίτερα σε χρήστες ναρκωτικών
ουσιών, προσδίδει μεγαλύτερο ενδιαφέρον και καλεί σε επαγρύπνηση τις υγειονομικές υπηρεσίες για έλεγχο της νόσου στην ομάδα αυτή των ασθενών. Στο κείμενο αναφέρεται λεπτομερώς, πλην της επιδημιολογίας, η παθογένεια της νόσου, η κλινική εικόνα και η εργαστηριακή προσέγγιση από μικροβιολογικής πλευράς κυρίως, αλλά και απεικονιστικής. Σημαντική
είναι η επισήμανση των συγγραφέων ότι οι μοριακές τεχνικές έχουν στη συγκεκριμένη νόσο
χαμηλή ευαισθησία (~50%).
Στη δεύτερη ανασκόπηση η οποία προέρχεται από το ίδιο νοσοκομείο αναλύεται εμπεριστατωμένα μια σπάνια κλινική οντότητα, η «Φυματιώδης μέση ωτίτιδα». Η νόσος συνήθως
είναι ετερόπλευρη, αφορά νεαρά άτομα και οφείλεται κυρίως στο M. tuberculosis. Η παράλυση του προσωπικού νεύρου και η κώφωση είναι σοβαρές επιπλοκές, οι οποίες είναι δυνατόν να αποφευχθούν, όταν η διάγνωση γίνει έγκαιρα. Η ανώδυνη ωτόρροια, η μη ανταπόκριση στα κοινά αντιβιοτικά και αντιμυκητιακά φάρμακα, παράλληλα με τα ωτοσκοπικά ευρήματα, οδηγούν στην κλινική υποψία της νόσου.
Η ερευνητική εργασία αυτού του τεύχους, η οποία είναι αποτέλεσμα συνεργασίας τριών
ερευνητικών ομάδων, είχε σκοπό την ανάπτυξη εργαστηριακής μεθόδου διερεύνησης της
συνέργειας μεταξύ ποσακοναζόλης και αμφοτερικίνης Β και ελέγχου του αποτελέσματος σε
πειραματόζωα με πειραματική καντιντίαση μετά από κατάλληλη ανάλυση. Η μελέτη είναι
αρκετά αξιόλογη και λεπτομερειακή και με δεοντολογικούς περιορισμούς. Παρόμοιες μελέτες πιθανώς να βοηθήσουν στο μέλλον στη θεραπευτική αντιμετώπιση ασθενών με σοβαρές
μυκητιακές λοιμώξεις.
Από το Νοσοκομείο Παίδων «Η Αγία Σοφία» παρουσιάζεται περίπτωση ισχαιμικού εγκεφαλικού εμφράκτου σε βρέφος πέντε μηνών που συνδέεται με λοίμωξη του ΚΝΣ από HSV
τύπου 2. Από όσο γνωρίζουμε είναι η πρώτη αναφορά ισχαιμικού εγκεφαλικού εμφράκτου
ερπητικής αιτιολογίας, σε παιδί.
Τέλος δίδονται λεπτομερείς οδηγίες ετοιμασίας και συντήρησης των χρωστικών, που
είναι απαραίτητες για την εκτέλεση της Ziel-Neelsen χρώσης, πιστεύοντας ότι όλα τα μικροβιολογικά εργαστήρια πρέπει να είναι σε θέση να δίνουν άμεσα στον κλινικό ιατρό την πληροφορία της ύπαρξης οξεάντοχων βακτηριδίων στα κλινικά δείγματα, προκειμένου να γίνεται έγκαιρα η έναρξη της αντιφυματικής αγωγής.
Μ.Γ. και Μ.Κ.
Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία
και Εργαστηριακή Διαγνωστική
Περίοδος Β’, Τόμος 17, Τεύχος 1, σελ. 9-17
2012
ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΕΙΣ
ΦΥΜΑΤΙΩΔΗΣ ΜΗΝΙΓΓΙΤΙΔΑ
ΜΑΡΙΑ ΚΕΧΑΓΙΑ, ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ ΒΕΛΕΝΤΖΑ
Η αναζωπύρωση της φυματίωσης τις τελευταίες δεκαετίες, σε συνδυασμό με την εμφάνιση πολυανθεκτικών και εξαιρετικά ανθεκτικών στελεχών μυκοβακτηριδίων, έχουν επαναφέρει τη νόσο στο προσκήνιο ως ένα ιδιαίτερα σημαντικό πρόβλημα δημόσιας υγείας. Η έξαρση αυτή έχει αποδοθεί κυρίως
στην επιδημία του AIDS, (Acquired Immune Deficiency Syndrome), η οποία ταυτόχρονα έχει επηρεάσει και το πρότυπο της νόσου, με αποτέλεσμα την αύξηση των εξωπνευμονικών εντοπίσεων. Η φυματιώδης μηνιγγίτιδα αποτελεί τη σοβαρότερη κλινικά μορφή εξωπνευμονικής φυματίωσης με υψηλά ποσοστά θνησιμότητας. Σ’ αυτό συντελεί η μη ειδική κλινική εικόνα και η δυσχερής εργαστηριακή διάγνωση, καθώς το στάδιο της νόσου κατά την έναρξη θεραπείας αποτελεί τον κυριότερο προγνωστικό παράγοντα. Στην παρούσα ανασκόπηση δίνεται έμφαση στην επιδημιολογία, στους παθογενετικούς μηχανισμούς, στην κλινική εικόνα της φυματιώδους μηνιγγίτιδας και στις μεθόδους εργαστηριακής διάγνωσης, καθώς η κλινική υποψία σε συνδυασμό με την κατάλληλη εργαστηριακή προσέγγιση αποτελούν απαραίτητο συνδυασμό για την επίτευξη της καλύτερης δυνατής θεραπευτικής έκβασης.
(Λέξεις ευρετηρίου: φυματιώδης μηνιγγίτιδα, επιδημιολογία φυματιώδους μηνιγγίτιδας, παθογένεια
φυματιώδους μηνιγγίτιδας, εργαστηριακή διάγνωση φυματιώδους μηνιγγίτιδας, θεραπεία φυματιώδους
μηνιγγίτιδας).
Εισαγωγή
Η πρώτη επίσημη περιγραφή της φυματιώδους μηνιγγίτιδας έχει αποδοθεί στον Robert
Whytt to 1768, ο οποίος στη μονογραφία του
Μorbus Cerebralis Whyttii περιέγραψε το κλινικό
σύνδρομο, αλλά και την παθολογοανατομική εικόνα της νόσου, ενώ ο αιτιολογικός παράγοντας
Mycobacterium tuberculosis απομονώθηκε αρκετά
αργότερα, το 1882 από τον Robert Koch1,2. ΈκτοΜικροβιολογικό Τμήμα, «Σισμανόγλειο» Γ.Ν.Α.
τε, αν και έχει σημειωθεί σημαντική πρόοδος στη
διαγνωστική και θεραπευτική προσέγγιση της φυματίωσης, εντούτοις η νόσος εξακολουθεί να αποτελεί σημαντικό πρόβλημα δημόσιας υγείας. Σύμφωνα με τα δεδομένα της Παγκόσμιας Οργάνωσης Υγείας (ΠΟΥ), το 2009 σημειώθηκαν 9,4 εκατομμύρια νέα κρούσματα, που αφορούσαν στην
πλειονότητά τους την Ασία και την Αφρική και σε
μικρότερο βαθμό την Ευρώπη και την Αμερική.
Παράλληλα, η συχνότητα των πολυανθεκτικών
στελεχών, τα οποία ορίζονται ως στελέχη ταυτόχρονα ανθεκτικά στην ισονιαζίδη και ριφαμπικί-
10 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία­
νη (Multidrug Resistant, MDR) και των εξαιρετικά ανθεκτικών (ανθεκτικά σε ισονιαζίδη, ριφαμπικίνη, κινολόνες και σε ένα από τα εξής: αμικασίνη, καναμυκίνη ή/και καπρεομυκίνη), αυξάνεται
διαρκώς3. Η επίπτωση των εξωπνευμονικών μορφών της νόσου αντανακλά την επιδημιολογία της
στον εκάστοτε πληθυσμό. Η μηνιγγίτιδα αποτελεί
τη σοβαρότερη εξωπνευμονική μορφή της φυματίωσης με υψηλά ποσοστά θνητότητας, τα οποία
είναι ακόμη υψηλότερα σε ανοσοκατεσταλμένους
ασθενείς, όπως πάσχοντες από AIDS, στους οποίους απομονώνονται ως αιτιολογικοί παράγοντες
εκτός του M. tuberculosis και «μη φυματιώδη μυκοβακτηρίδια» (Non Tuberculus Mycobacteria,
NTM). Δεδομένης της μη ειδικής κλινικής εικόνας και της απουσίας προτυποποιημένων διαγνωστικών κριτηρίων, η φυματιώδης μηνιγγίτιδα διαγιγνώσκεται δυσχερώς, γεγονός που προϋποθέτει
υψηλό δείκτη υποψίας για την έγκαιρη έναρξη θεραπείας, η οποία αποτελεί και το σημαντικότερο
προγνωστικό παράγοντα ευνοϊκής έκβασης της
λοίμωξης.
Επιδημιολογία
Η φυματίωση του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ) αποτελεί τη σοβαρότερη μορφή φυματίωσης και αντιπροσωπεύει το 1% όλων των νεοδιαγνωσθεισών περιπτώσεων ετησίως και το 6% των εξωπνευμονικών εντοπίσεων,
ποσοστό το οποίο ενδέχεται να είναι υψηλότερο,
αν λάβει κανείς υπόψη τα μη μικροβιολογικώς επιβεβαιωμένα κρούσματα. Η μηνιγγίτιδα αποτελεί τη συχνότερη εκδήλωσή της4,5. Μετά την εμφάνιση της πανδημίας της HIV λοίμωξης η επιδημιολογία της φυματίωσης άλλαξε, με τη συχνότητά της να κορυφώνεται το 2004 και έκτοτε να σημειώνει ήπια, αλλά σταθερή πτώση. Ανάλογα επηρεάστηκε και το πρότυπο της νόσου,
με αποτέλεσμα την αύξηση των εξωπνευμονικών
και διάσπαρτων μορφών της, με τις πρώτες να αποτελούν το 15-20% των συνολικών περιπτώσεων φυματίωσης στους ανοσοεπαρκείς και να
προσεγγίζουν το 50% στους ασθενείς με HIV. Όπως είναι αναμενόμενο η φυματιώδης μηνιγγίτι-
δα ακολουθεί την τάση αυτή, καθώς η HIV λοίμωξη αποτελεί τον καθοριστικότερο παράγοντα εμφάνισής της, με αμέσως επόμενο την ηλικία που με τη σειρά της επηρεάζεται από την
οικονομική και κοινωνική κατάσταση του εκάστοτε πληθυσμού. Σε πληθυσμούς με υψηλό υγειονομικό επίπεδο η συχνότητα της νόσου είναι υψηλότερη στους ενήλικες από ό,τι στα παιδιά, γεγονός το οποίο αντιστρέφεται στους πληθυσμούς με χαμηλότερο υγειονομικό επίπεδο,
στους οποίους συχνότερα προσβάλλονται άτομα κάτω των 5 ετών. Όσον αφορά στα ποσοστά
θνησιμότητας, ποικίλλουν και αυτά από χώρα σε
χώρα ανάλογα με τα εκάστοτε ιδιαίτερα οικονομικά και υγειονομικά χαρακτηριστικά και κυμαίνονται από 7-40% στις αναπτυγμένες και έως
69% στις αναπτυσσόμενες χώρες3,6.
Η Ελλάδα παρουσιάζει πρόβλημα υποδήλωσης της φυματίωσης, δυσχεραίνοντας την πρόσβαση σε απολύτως ακριβή στοιχεία. Την τελευταία δεκαπενταετία, κατόπιν κορύφωσης των
κρουσμάτων, που σημειώθηκε το έτος 2000 στη
χώρα μας και πιθανώς εκφράζει την κορύφωση
του μεταναστευτικού κύματος, σε συνδυασμό με
την ορθότερη επιδημιολογική επιτήρηση της νόσου, σημειώνεται ήπια αλλά σταθερή ελάττωση
των συνολικών κρουσμάτων και παράλληλη αύξηση του ποσοστού στους μετανάστες7. Σύμφωνα με επίσημα στοιχεία του Ευρωπαϊκού Κέντρου
Πρόληψης και Ελέγχου Νόσων (ECDC) για τη
χώρα μας, το 2007 το ποσοστό των εξωπνευμονικών κρουσμάτων ήταν 13% του συνόλου, ενώ καταγράφηκαν 6 κρούσματα φυματιώδους μηνιγγίτιδας, 2 εκ των οποίων ήταν παιδιατρικά8.
Παθογένεια
Από το 1933, έτος συσχετισμού της φυματιώδους μηνιγγίτιδας με εστιακές αλλοιώσεις στις
μήνιγγες και το φλοιό του εγκεφάλου από τους
Rich και MacCordock, έχει σημειωθεί αδιαμφισβήτητη πρόοδος στην κατανόηση της παθογένειας της νόσου. Είναι πλέον ξεκάθαρο πως η
νόσος, είτε αναπτύσσεται επί εδάφους πρωτοπαθούς φυματίωσης είτε επί αναζωπύρωσης λαν-
Περίοδος B’, Τόμος 17, Τεύχος 1, 2012
θάνουσας φυματικής μόλυνσης, πρόκειται για
δευτεροπαθή προσβολή του ΚΝΣ κατόπιν διασποράς από κάποια πρωτοπαθή εξωμηνιγγική εστία9. Εντούτοις, ο ακριβής μηχανισμός εγκατάστασης της τόσο σοβαρής εξωπνευμονικής αυτής εκδήλωσης της φυματίωσης δεν έχει εξακριβωθεί στο σύνολό του, με τη σχετική ερευνητική δραστηριότητα να παραμένει έντονη. Οι μηχανισμοί οι οποίοι εμπλέκονται στην παθογένειά της διαχωρίζονται σε δύο επίπεδα, κυτταρικό και μακροσκοπικό, με το πρώτο να αποτελεί
ακόμη αντικείμενο μελέτης. Σύμφωνα με νεότερα δεδομένα, η τριάδα «μακροφάγα - Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα - ξενιστής» διαδραματίζει τον
κεντρικό ρόλο στη διαμόρφωση και εξέλιξη της
νόσου με τις παραγόμενες κυτταροκίνες [ιντερφερόνη-γ (IFN-γ), ιντερλευκίνη 1-β (IL1-β) και
παράγοντες νέκρωσης όγκων (ΤΝFs)] να επάγουν τη δημιουργία κοκκιωμάτων με μηχανισμό
παρόμοιο με εκείνον της πνευμονικής φυματίωσης. Σε μακροσκοπικό επίπεδο, πιστεύεται πλέον πως η παθογένεια της φυματιώδους μηνιγγίτιδας διατρέχει σε δύο στάδια, με αφετηρία την
προσβολή του πνευμονικού ιστού και των σύστοιχων επιχώριων λεμφαδένων από τα μυκοβακτηρίδια και τη δημιουργία του πρωτοπαθούς
συμπλέγματος. Στη συνέχεια και επί διασποράς
των μυκοβακτηριδίων στο ΚΝΣ δημιουργούνται
τα χαρακτηριστικά τυροειδοποιημένα κοκκιώματα, γνωστά και ως εστίες του Rich, τα οποία
μπορεί να εντοπίζονται στις μήνιγγες, στο εγκεφαλικό παρέγχυμα ή και στο νωτιαίο μυελό10,11.
Παρόλο που δεν έχει ακόμη διευκρινισθεί εάν
τα μυκοβακτηρίδια διαπερνούν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό εξωκυτταρίως ή εντός μολυσμένων φαγοκυττάρων, η ανωτέρω διασπορά λαμβάνει χώρα αιματογενώς12. Οι βάκιλλοι διασπείρονται είτε κατά το σύντομο διάστημα βακτηριαιμίας που συνοδεύει το σχηματισμό του πρωτοπαθούς συμπλέγματος, είτε κατά τη διάρκεια παρατεταμένης βακτηριαιμίας, εφόσον η πρωτοπαθής εστία δεν περιοριστεί, με αποτέλεσμα την εξέλιξη της πρωτολοίμωξης. Οι συνέπειες της διασποράς αυτής ποικίλλουν ανάλογα με την ανοσιακή απάντηση του ξενιστή, αλλά και τη λοι-
11­
μογόνο δύναμη του μυκοβακτηριδίου. Πράγματι, συγκεκριμένα στελέχη φαίνεται να διαθέτουν
μεγαλύτερο τροπισμό προς το ΚΝΣ, ενώ πρόσφατες μελέτες έχουν καταδείξει τον πιθανό ρόλο που ενδέχεται να διαδραματίζει ο γονότυπος
του Μ. tuberculosis σε συνδυασμό με τη γενετική
πολυμορφία του ξενιστή στην εκδήλωση της νόσου, καθώς διαφορετικοί μυκοβακτηριδιακοί γονότυποι επάγουν ξεχωριστά πρότυπα ανοσιακής
απόκρισης13,14. Σ’ αυτήν την κατεύθυνση υπάρχουν πρόσφατες ενδείξεις πως στελέχη του Μ.
tuberculosis απαντώμενα κυρίως σε Ευρώπη και
Αμερική έχουν μικρότερες πιθανότητες πρόκλησης φυματιώδους μηνιγγίτιδας σε σχέση με αντίστοιχα που απαντώνται στην Ασία15. Στις περιπτώσεις που η αρχική λοίμωξη από μυκοβακτηρίδιο εξελιχθεί σε κεγχροειδή φυματίωση, ο κίνδυνος διασποράς στο ΚΝΣ είναι υψηλότερος
και πιθανώς εμπλέκεται ιδιαίτερα στην παθογένεια της παιδικής φυματιώδους μηνιγγίτιδας, ενώ λιγότερο συχνή οδός διασποράς είναι η κατά συνέχεια ιστών, από προϋπάρχουσα εστία φυματιώδους ωτίτιδας ή κρανιακής οστεΐτιδας10,16.
Το δεύτερο στάδιο του παθογενετικού μηχανισμού της φυματιώδους μηνιγγίτιδας περιλαμβάνει τη ρήξη των εστιών του Rich και την απελευθέρωση των βακίλλων στον υπαραχνοειδή χώρο, με συνέπεια την ανάπτυξη μίας κοκκιωματώδους φλεγμονώδους αντίδρασης, η οποία οδηγεί
στην εκδήλωση μηνιγγίτιδας. Η ανωτέρω φλεγμονώδης αντίδραση χαρακτηρίζεται από πλούσιο σε ινική εξίδρωμα, που εντοπίζεται κυρίως
στη βάση του εγκεφάλου και μπορεί να προκαλέσει τη δημιουργία συμφύσεων με επακόλουθη πρόκληση αγγειίτιδας συνηθέστερα στην έσω
καρωτίδα αρτηρία, στους κλάδους της μέσης εγκεφαλικής αρτηρίας και στα αγγεία που τροφοδοτούν τα βασικά γάγγλια, ή να επεκταθεί στο εγκεφαλικό παρέγχυμα προκαλώντας έμφρακτα,
διαταραχές αιμάτωσης ή εγκεφαλίτιδα αντίστοιχα. Σε πιθανή επέκταση του εξιδρώματος στο μεσοσκελιαίο βόθρο, οι εγκεφαλικές συζυγίες με
κυριότερες τις II, IV και VI, είναι δυνατό να υποστούν βλάβη. Σε περίπτωση παρεμπόδισης
της παροχέτευσης του Εγκεφαλονωτιαίου Υγρού
12 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία­
(ΕΝΥ) υπάρχει κίνδυνος υδροκεφάλου, η εμφάνιση του οποίου έχει συσχετιστεί με δυσμενή
πρόγνωση και μειωμένη ανταπόκριση στις θεραπευτικές παρεμβάσεις17-19. H ρήξη μίας εστίας του Rich και η απελευθέρωση μυκοβακτηριδίων εντός του νωτιαίου αραχνοειδούς χώρου έχει
ως συνέπεια τη φυματιώδη προσβολή των μηνίγγων του νωτιαίου μυελού. Στην ίδια κατάληξη είναι δυνατό να οδηγήσει η κατά συνέχεια επέκταση παρασπονδυλικού αποστήματος, γνωστού
και ως αποστήματος του Pott, ενώ σαφώς σπανιότερα και η πρωτογενής εντόπιση στο νωτιαίο
μυελό φυματωμάτων του Rich20,21.
Κλινική εικόνα
Αν και η κλινική εικόνα χρόνιου εμπυρέτου
με σημεία μηνιγγισμού θεωρείται ως τυπική της
φυματιώδους μηνιγγίτιδας, στην πραγματικότητα
τo φάσμα των εκδηλώσεών της είναι ιδιαίτερα ευρύ και μη ειδικό, με άτυπες μορφές στις οποίες επικρατεί εικόνα εγκεφαλίτιδας να περιγράφονται
όλο και πιο συχνά22,4. Η έναρξη της νόσου είναι
συνήθως υποξεία με βαθμιαία εξέλιξη της κλινικής εικόνας. Τα πρόδρομα συμπτώματα, όπως κεφαλαλγία, πυρετική κίνηση, καταβολή, είναι αβληχρά και η διάρκειά τους κυμαίνεται από δύο έως οκτώ εβδομάδες23,24. Κατά συνέπεια, οι ασθενείς συνήθως προσκομίζονται καθυστερημένα
στο νοσοκομείο με εστιακά νευρολογικά σημεία,
έκπτωση του επιπέδου συνείδησης και σημεία αυξημένης ενδοκρανιακής πίεσης, όπως έντονη κεφαλαλγία, οίδημα θηλών και σπασμούς. Τα εστιακά νευρολογικά σημεία περιλαμβάνουν εκτός από πάρεση των εγκεφαλικών συζυγιών (κυρίως
των II, IV και VI) και σοβαρότερες βλάβες, όπως
ημιπληγία και αφασία22,4. Ο πυρετός ενδέχεται
να απουσιάζει (περίπου στο 25% των περιπτώσεων) ιδίως σε ηλικιωμένους ασθενείς και η αυχενική δυσκαμψία περιγράφεται μόνο στο ένα τρίτο
των περιπτώσεων24. Επί συνύπαρξης φυματωμάτων ή αποστημάτων η συμπτωματολογία ποικίλλει ανάλογα με την εντόπιση και τις διαστάσεις
τους με βραδύτερη εξέλιξη στην περίπτωση των
πρώτων. Οι παιδιατρικοί ασθενείς εμφανίζουν συνήθως σημεία μηνιγγισμού, ενώ κατά τη βρεφική
ηλικία οι συνηθέστερες εκδηλώσεις αφορούν ευερεθιστότητα, κοιλιακά άλγη, λήθαργο, αυχενική
δυσκαμψία και διόγκωση των κρανιακών πηγών
επί αυξημένης ενδοκρανιακής πίεσης17. Η σταδιοποίηση της φυματιώδους μηνιγγίτιδας γίνεται
με βάση την κλινική βαρύτητα των ασθενών κατά την έναρξη της θεραπείας, καθώς αποτελεί τον
κυριότερο προγνωστικό παράγοντα. Για το σκοπό αυτό υιοθετούνται κυρίως τροποποιήσεις του
συστήματος αξιολόγησης του Medical Research
Council που πρωτοεφαρμόστηκε το 1943, το οποίο κατατάσσει τα περιστατικά σε τρία στάδια
αύξουσας βαρύτητας, αλλά και η Κλίμακα της
Γλασκόβης η οποία εκτιμά το επίπεδο συνείδησης
του ασθενούς19,25.
Μικροβιολογική Διάγνωση
Α) Γενική εξέταση ΕΝΥ
Στη φυματιώδη μηνιγγίτιδα ο αριθμός των
κυττάρων κυμαίνεται από 10-500/mm3 με λεμφοκυτταρικό τύπο. Στα αρχικά στάδια της νόσου
είναι δυνατό να επικρατούν τα πολυμορφοπύρηνα με τον τύπο να μεταπίπτει σε λεμφοκυτταρικό μέσα σε ένα χρονικό διάστημα 7 ημερών, δυσκολεύοντας κατ’ αυτό τον τρόπο τη διάγνωση.
Σε ασθενείς με λοίμωξη από τον HIV ο λευκοκυτταρικός τύπος ενδέχεται να παραμείνει πολυμορφοπυρηνικός, εύρημα το οποίο έχει συσχετισθεί με καλύτερη πρόγνωση26. Όσον αφορά στις
βιοχημικές παραμέτρους, το λεύκωμα είναι συνήθως αυξημένο και μπορεί να κυμαίνεται από
45-400 mg/dl (συνήθως 100-200 mg/dl), ενώ τα
επίπεδα γλυκόζης ελαττωμένα, κάτω των 45 mg/
dl στο 70% των περιπτώσεων24,26. Ο προσδιορισμός της ενεργότητας του ενζύμου απαμινάσης
της αδενοσίνης (adenosine deaminase, ADA) αποτελεί ένα αμφιλεγόμενο διαγνωστικό εργαλείο27,28. Τα επίπεδα χλωρίου αναμένονται μειωμένα, αλλά δεν αποτελούν χρήσιμο δείκτη για τη
διάγνωση της φυματιώδους μηνιγγίτιδας29.
Β) Μικροσκόπηση-Καλλιέργεια
Η αιτιολογική διάγνωση της φυματιώδους
μηνιγγίτιδας τίθεται επί ανεύρεσης οξεάντοχων
βακτηριδίων κατά τη μικροσκόπηση άμεσου ξη-
Περίοδος B’, Τόμος 17, Τεύχος 1, 2012
ρού παρασκευάσματος χρωματισμένου κατά
Ziehl-Neelsen (ZN) και απομόνωσης του βακίλλου σε καλλιέργεια. Όμως και οι δύο αυτές μέθοδοι παρουσιάζουν χαμηλή ευαισθησία, η οποία υπολογίζεται γύρω στο 20% και σε 20-88%
αντίστοιχα18,30-32. Στη χαμηλή ευαισθησία συμβάλλει η πτωχή σε μυκοβακτηρίδια περιεκτικότητα του ΕΝΥ και η συνήθης αδυναμία αποστολής επαρκούς ποσότητας στο εργαστήριο. Για το
λόγο αυτό και δεδομένης της ανάγκης έγκαιρης
έναρξης θεραπείας, κριτήρια όπως ενεργός φυματίωση ή ιστορικό της νόσου σε άλλο όργανο ή σύστημα, διάρκεια κλινικών ευρημάτων άνω των 5 ημερών και συμβατές με την πάθηση
παράμετροι από τη γενική εξέταση του ΕΝΥ θα
πρέπει να κατευθύνουν την κλινική υποψία. Η άμεση μικροσκοπική εξέταση του ΕΝΥ για την αναζήτηση μυκοβακτηριδίων είναι οικονομική και
απλή στην εκτέλεσή της, διαθέτει όμως χαμηλή ευαισθησία λόγω πτωχού μυκοβακτηριδιακού
φορτίου, ιδίως σε πάσχοντες από ΑIDS. Επιπλέον, δεν αναγνωρίζει το είδος παρά μόνο το γένος
των μυκοβακτηριδίων και αδυνατεί να διακρίνει
μεταξύ βιώσιμων και μη μικροoργανισμών. Καθώς ο όγκος του δείγματος αποτελεί σημαντικό
κριτήριο της ευαισθησίας της μεθόδου, προτείνεται φυγοκέντρηση (3.000 × g για 15 λεπτά σε
ψυχόμενη φυγόκεντρο) δείγματος με ελάχιστο
συνιστώμενο όγκο 6 ml και παράταση του χρόνου μικροσκόπησης στα 30 min33. Τα δύο είδη
χρώσεων που χρησιμοποιούνται ευρέως για την
αναζήτηση οξεάντοχων μικροοργανισμών είναι η χρώση ΖΝ με βασική φουξίνη και οι φθορίζουσες χρωστικές auramine-O, rhodamine B. H
χρώση Kinyoun αποτελεί παραλλαγή της ΖΝ με
χαμηλότερη όμως ευαισθησία34.
Η πιθανότητα απομόνωσης του μυκοβακτηριδίου σε καλλιέργεια εξαρτάται επίσης από τον
όγκο του δείγματος με ελάχιστο συνιστώμενο τα
2 ml. Το ΕΝΥ λόγω του μικρού αριθμού βακίλλων
που περιέχει πρέπει να μεταφερθεί στο εργαστήριο εντός μίας ώρας από τη λήψη και, εφόσον αυτό δεν είναι δυνατό, να φυλαχθεί στους 4°C, καθώς οι πιθανότητες θετικής καλλιέργειας ελαττώνονται αντιστρόφως ανάλογα με το χρονικό
13­
διάστημα που μεσολαβεί μεταξύ λήψης και ενοφθαλμισμού στα θρεπτικά υλικά. Το ΕΝΥ είναι άσηπτο υλικό, επομένως όλη η ποσότητα του δείγματος είναι σκόπιμο να ενοφθαλμίζεται μετά από
φυγοκέντρηση στα κατάλληλα στερεά και υγρά
θρεπτικά υλικά. Τα δεύτερα θεωρούνται προτιμότερα λόγω της ταχύτερης ανάπτυξης των μυκοβακτηριδίων σε αυτά. Τα ευρέως χρησιμοποιούμενα θρεπτικά υλικά είναι τα στερεά LöwensteinJensen (LJ), Ogawa, Middlebrook 7H10 και 7H11
και το υγρό Middlebrook 7H934-36. Τα αυτοματοποιημένα συστήματα καλλιέργειας χρησιμοποιούν υγρά θρεπτικά υλικά. Το πλέον διαδεδομένο στην ελληνική αγορά είναι το BACTEC MGIT
960 (BD [Becton, Dickinson and Company]
Diagnostic Systems), το οποίο χρησιμοποιεί τροποποιημένο Middlebrook 7H9 υγρό θρεπτικό υλικό, μείγμα αντιμικροβιακών παραγόντων (πολυμυξίνη Β, αμφοτερικίνη Β, ναλιδιξικό οξύ, τριμεθοπρίμη και αζλοκιλλίνη) για την αναστολή ανάπτυξης κοινών μικροοργανισμών και μυκήτων και
μείγμα ολεϊκού οξέος, αλβουμίνης και δεξτρόζης
ως εμπλουτιστικούς παράγοντες ανάπτυξης μυκοβακτηριδίων. Άλλα ευρέως διαδεδομένα αυτοματοποιημένα καλλιεργητικά συστήματα είναι το
ESP Culture System II (Trek Diagnostic Systems)
και το σύστημα MB/BacT (bioMérieux)34. Τα δύο
πρώτα ανιχνεύουν την ανάπτυξη του μυκοβακτηριδίου με βάση τη μέτρηση του βαθμού κατανάλωσης οξυγόνου, ενώ το τελευταίο ανιχνεύει χρωματομετρικά την παραγωγή διοξειδίου του
άνθρακα36,37. Η επώαση των καλλιεργειών γίνεται, όπως σε όλα τα δείγματα στα οποία αναζητούνται μυκοβακτηρίδια (35-37°C, 5-10% CO2),
με μέγιστη χρονική διάρκεια επώασης τις 8-12 εβδομάδες στην περίπτωση των στερεών και τις 6
εβδομάδες στην περίπτωση των υγρών καλλιεργητικών υλικών. Οι καλλιέργειες επισκοπούνται
συστηματικά. Από τις ύποπτες αποικίες ετοιμάζονται και μικροσκοπούνται παρασκευάσματα χρωματισμένα κατά ZN. Επί επιβεβαίωσης της ύπαρξης οξεάντοχων βακτηριδίων ακολουθεί ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους είτε κλασικά (συνδυασμός καλλιεργητικών, βιοχημικών και μορφολογικών χαρακτηριστικών) είτε μοριακά34-37.
14 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία­
Μολονότι στη συντριπτική πλειοψηφία των
περιπτώσεων ο αιτιολογικός παράγοντας που απομονώνεται ανήκει στο σύμπλεγμα του μυκοβακτηριδίου της φυματίωσης (Μ. tuberculosis
complex), εντούτοις μηνιγγίτιδα μπορεί να προκληθεί και από NTM. Αν και έχουν περιγραφεί
περιπτώσεις στις οποίες υπεύθυνα ήταν NTM όλων των κατά Runyon ομάδων, ο συχνότερα απομονούμενος εκπρόσωπος αποτελεί το Μ. avium
complex, ακολουθούμενο από το M. fortuitum
και M. kansasii. Tα NTM ενοχοποιούνται κυρίως σε ασθενείς με HIV λοίμωξη, αλλά και άλλους
παράγοντες ανοσοκαταστολής, καθώς και σε περιπτώσεις υποκείμενων καταστάσεων, όπως κρανιοεγκεφαλικά τραύματα, νευροχειρουργικές επεμβάσεις και χρόνιες λοιμώξεις. Δεδομένου όμως ότι το ΕΝΥ είναι ένα στείρο βιολογικό υλικό,
είναι σκόπιμο σε όλες τις περιπτώσεις μηνιγγίτιδας η απομόνωσή τους να αξιολογείται με συμβατά για φυματίωση ευρήματα και από τις παραμέτρους της γενικής εξέτασης του ΕΝΥ38.
Γ) Μοριακή διάγνωση
Για τη διάγνωση της φυματιώδους μηνιγγίτιδας είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν μοριακές
τεχνικές ανίχνευσης του μυκοβακτηριδίου απευθείας από το ΕΝΥ, οι οποίες επιταχύνουν δραματικά το χρόνο διάγνωσης. Η αποτελεσματικότητά τους παραμένει αμφιλεγόμενη39. Οι τεχνικές αυτές βασίζονται στον πολλαπλασιασμό
των νουκλεϊκών οξέων DNA ή RNA (Nucleic
Acid Amplification, NAA) και περιλαμβάνουν
τόσο εμπορικές όσο και in-house μεθόδους άμεσης ανίχνευσης. Γνωστές εμπορικές εφαρμογές
είναι η τεχνική NASBA (Nucleic Acid Sequenced
Based Amplification) και η ΤΜΑ (Transcription
Mediated Amplification). Οι in-house τεχνικές
βασίζονται στην PCR για τον πολλαπλασιασμό
ειδικών περιοχών του DNA και διαφέρουν από εργαστήριο σε εργαστήριο με ευρύτερα χρησιμοποιούμενα τα στοιχεία IS6110 (Insertion
Sequence 6110) και devR40,41. Τα αποτελέσματα
των μεθόδων αυτών παρουσιάζουν διακυμάνσεις
στις διάφορες μελέτες που έχουν εκπονηθεί. Μία
μελέτη που διενεργήθηκε σε νοσοκομείο τριτοβάθμιας περίθαλψης στη Βραζιλία, έδειξε ότι η
ευαισθησία της μεθόδου για τη διάγνωση φυματίωσης σε ΕΝΥ ήταν της τάξης του 50% και η ειδικότητα 98,6%39. Σε μία άλλη έρευνα που πραγματοποιήθηκε in-house μοριακή τεχνική σε διηθημένο με φίλτρο ΕΝΥ, η ευαισθησία αντιστοιχούσε σε 87,6%, και η ειδικότητα σε 92%41. Η
μειωμένη ευαισθησία των μεθόδων που χρησιμοποιούν PCR ενδεχομένως οφείλεται στη μικρή
ποσότητα του κλινικού δείγματος και επομένως
στο μικρό μικροβιακό φορτίο που περιέχεται σε
αυτό. Γι’ αυτό η ελάχιστη συνιστώμενη ποσότητα EΝΥ προτείνεται να είναι 2 ml40. Σε παρόμοια
συμπεράσματα κατέληξε και μία μετα-αναλυτική
μελέτη που αφορούσε στις ΝΑΑ εμπορικές μεθόδους, σύμφωνα με την οποία η ευαισθησία
ήταν της τάξης του 56% και η ειδικότητα του
98%42. Παρ’ ότι λοιπόν οι ΝΑΑ μέθοδοι, εμπορικές και μη, λόγω της χαμηλής τους ευαισθησίας δεν μπορούν να αποκλείσουν με βεβαιότητα
την ύπαρξη μηνιγγίτιδας μυκοβακτηριδιακής αιτιολογίας, είναι απαραίτητες για την ταχεία αιτιολογική διάγνωση, η οποία πάντοτε πρέπει να επιβεβαιώνεται με απομόνωση σε καλλιέργειες.
Απεικονιστική διάγνωση
Δεδομένης της απουσίας παθογνωμονικών
ευρημάτων, οι απεικονιστικές μέθοδοι αδυνατούν
να θέσουν τη διάγνωση, διαδραματίζουν όμως
σημαντικό ρόλο στην παρακολούθηση της νόσου και είναι απαραίτητες για την έγκαιρη εντόπιση αντενδείξεων οσφυονωτιαίας παρακέντησης (π.χ. ο υδροκέφαλος). Τα κυριότερα ευρήματα πλην του τελευταίου είναι επίταση των μηνίγγων στη βάση του εγκεφάλου και έμφρακτα, ενώ η μαγνητική τομογραφία έχει μεγαλύτερη ευαισθησία από την αξονική στον εντοπισμό των ακτινολογικών ευρημάτων στον εγκέφαλο21.
Θεραπεία
Η θεραπευτική προσέγγιση της φυματιώδους μηνιγγίτιδας είναι κατεξοχήν φαρμακευτι-
Περίοδος B’, Τόμος 17, Τεύχος 1, 2012
κή, καθώς οι χειρουργικές παρεμβάσεις έχουν περιορισμένη θέση στην αντιμετώπιση των επιπλοκών της νόσου. Σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες τόσο της ΠΟΥ όσο και του Κέντρου
Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων των ΗΠΑ
(Centers for Disease Control, CDC), για τη θεραπεία της εξωπνευμονικής φυματίωσης είναι σκόπιμο να εφαρμόζονται τα ίδια πρωτόκολλα με
την πνευμονική μορφή της, τα οποία στην πλειοψηφία τους ακολουθούν το πρότυπο μίας αγωγής
εφόδου τετραπλού σχήματος, την οποία διαδέχεται μία παρατεταμένη αγωγή συνέχισης διπλού
σχήματος. Τα πρωτόκολλα αυτά λαμβάνουν υπόψη το ιστορικό φυματίωσης (ελεύθερο ή προηγηθείσα λήψη αντιφυματικής αγωγής διάρκειας άνω του ενός μηνός), τους παράγοντες κινδύνου
πιθανής μόλυνσης από πολυανθεκτικό στέλεχος
και την ανοσολογική κατάσταση του ασθενούς
και περιλαμβάνουν τα αντιφυματικά χημειοθεραπευτικά πρώτης γραμμής, δηλαδή ισονιαζίδη (H),
ριφαμπικίνη (R), πυραζιναμίδη (Z), εθαμβουτόλη (E), στρεπτομυκίνη (S), σε δοσολογίες ανάλογες με το σωματικό βάρος43,44. Η ουσιαστική
διαφορά στο θεραπευτικό πρωτόκολλο της φυματιώδους μηνιγγίτιδας σε σχέση με εκείνο της
πνευμονικής μορφής έγκειται στη διάρκεια της
αγωγής, η οποία συνιστάται να παρατείνεται από τους 6 στους 9-12 μήνες, αν και έχουν προταθεί σχήματα τόσο βραχύτερης διάρκειας, επί χαμηλής πιθανότητας ανάπτυξης πολυαντοχής, όσο
και μεγαλύτερης17. Το συνιστώμενο σχήμα για τις
περιπτώσεις της νόσου οι οποίες έχουν προκληθεί από ευαίσθητα στελέχη αποτελείται από συνδυασμό εφόδου με Η-R-Z-E διάρκειας δύο μηνών, ακολουθούμενο από επτά με εννέα μήνες αγωγής με H και R. Εάν δεν υπάρχει υποψία πολυαντοχής συνιστάται προσθήκη κορτικοστεροειδών στο σχήμα και συγκεκριμένα δεξαμεθαζόνης,
καθώς φαίνεται να μειώνει τη θνητότητα των ασθενών ανεξάρτητα από τη συνύπαρξη ή μη HIV
λοίμωξης, πιθανότατα περιορίζοντας τη συχνότητα εμφάνισης παρενεργειών από τη θεραπεία21.
Αυτό που πρέπει να ληφθεί υπόψη επί HIV λοίμωξης όμως είναι η αλληλεπίδραση της R με τα επίπεδα των αντιρετροϊκών, οπότε χορηγείται ρι-
15­
φαμπουτίνη. Οι περιπτώσεις φυματιώδους μηνιγγίτιδας από MDR στελέχη αποτελούν θεραπευτική πρόκληση και συνδέονται με δυσμενή πρόγνωση, καθώς οι θεραπευτικές επιλογές στηρίζονται σε σχήματα αντιφυματικών δεύτερης γραμμής με μειωμένη αποτελεσματικότητα. Σ’ αυτές
τις περιπτώσεις συνιστώνται συνδυασμοί με εθιοναμίδη και κυκλοσερίνη λόγω της σχετικά καλής
διείσδυσής τους στο ΕΝΥ32,43,44.
Συμπερασματικά
Η φυματιώδης μηνιγγίτιδα αποτελεί τη σοβαρότερη μορφή φυματίωσης του ΚΝΣ. Η διάγνωσή της είναι δυσχερής λόγω της μη ειδικής
κλινικής εικόνας και της χαμηλής ευαισθησίας
των εργαστηριακών μεθόδων. Η άρτια εφαρμογή κλινικών και εργαστηριακών κριτηρίων κρίνεται απαραίτητη για την έγκαιρη έναρξη της
θεραπευτικής αγωγής, η οποία αποτελεί και το
βασικότερο προγνωστικό παράγοντα της νόσου.
Ευχαριστίες
Οι συγγραφείς θα ήθελαν να εκφράσουν τις
ευχαριστίες τους προς την κ. Κανελλοπούλου
Μαρία, Διευθύντρια του Μικροβιολογικού Τμήματος του «Σισμανογλείου» Γ.Ν.Α., για τις πολύτιμες υποδείξεις της κατά τη συγγραφή της ανασκόπησης.
Διεύθυνση Επικοινωνίας:
Μαρία Κεχαγιά
Δωδεκανήσου 52Α Βριλήσσια, 15235
Τηλ: 6972176916
Ε-mail: [email protected]
Summary
Tuberculous meningitis
M. KECHAGIA, AIK. VELENTZA
“Sismanoglion” General Hospital of Athens,
Microbiology Department
Applied Clinical Microbiology
16 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία­
Despite recent advances tuberculosis remains
a significant global public health issue due to its
still considerable prevalence as well as the emergence of multidrug and extensively multidrug
resistant mycobacterial strains. This burden has
been mainly attributed to the HIV epidemic which
has also influenced the disease’s epidemiological
pattern with the extrapulmonary forms being on
the rise. Tuberculous meningitis (TBM) constitutes the most severe form of the latter, displaying
high mortality rates as a result of its non specific
clinical features and its challenging laboratory diagnosis. The present review besides TBM’s epidemiology, pathogenesis and clinical picture, also
emphasizes on its laboratory diagnostics underlining the impact of a timely clinical suspicion paired
to the optimal laboratory approach to the disease’s
prognosis.
(Key words: Tuberculous meningitis, ΤΒΜ epidemiology, ΤΒΜ pathogenesis, ΤΒΜ laboratory
diagnosis, ΤΒΜ treatment).
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
1.Gupta S, Chopra K. Tuberculous meningitis in
children. Ind J Tub 1981, 28: 3.
2.Thwaites G, Chau ΤΤΗ, Mai ΝΤΗ, Drobniewski F, McAdam K, Farrar J. Tuberculous meningitis. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2000, 68:
289-299.
3.WHO 2011, 2010/2011 Tuberculosis Global Facts
[web page]. Available at http://www.who.int/tb/
publications/global_report/2010/en/index.html.
4.Golden MP, Vikram HR. Extrapulmonary Tuberculosis: An Overview. Am Fam Physician
2005, 72: 1761-1768.
5.Sharma SK, Mohan A. Exrapulmonary tuberculosis. Indian J Med Res 2004, 120: 316-353.
6.WHO 2011. Global Tuberculosis Control
2011[web page]. Available at http://www.who.int/
tb/publications/global_report/2010/en/index.html.
7.Papaventsis D, Nikolaou S, Karabela S, Ioannidis P, Konstantinidou E, Marinou I, et al. Tuberculosis in Greece: bacteriologically confirmed
cases and antituberculosis drug resistance 19952009. Euro Surveill. 2010, 15: 15.
8.European Centre for Disease Prevention and
Control/WHO Regional Office for Europe. Tuberculosis surveillance in Europe 2009. Stockholm: European Centre for Disease Prevention
and Control, 2011.
9.Donald PR, Schaaf HS, Schoeman JF. Tuberculous meningitis and military tuberculosis: the
Rich focus revisited. J Infect 2005, 50: 193-195.
10.Be NA, Kim KS, Bishai WR, Jain SK, SK. Pathogenesis of central nervous system tuberculosis.
Curr Mol Med 2009, 9: 94-99.
11.Drevets DA, Leenen PJM, Greenfield RA. Invasion of the Central Nervous System by Intracellular
Bacteria. Clin Microbiol Rev 2004, 17: 323-347.
12.Chackerian AA, Alt JM, Perera TV, Dascher
CC, Behar SM. Dissemination of Mycobacterium
tuberculosis Is Influenced by Host Factors and
Precedes the Initiation of T-Cell Immunity. Infect
Immun 2002, 70: 4501-4509.
13.Dormans J, Burger M, Aguilar D, HenrandezPando R, Kremer K, Roholl P, et al. Correlation
of virulence, lung pathology, bacterial load and
delayed type hypersensitivity responses after infection with different Mycobacterium tuberculosis
genotypes in a BALV/c mouse model. Clin Exp
Immunol 2004, 137: 460-468.
14.Manca C, Reed MB, Freeman S, Mathema
B, Kreiswirth B, Barry CE, et al. Differential
monocyte activation underlies strain-specific Mycobacterium tuberculosis pathogenesis. Infect Immun 2004, 72: 5511–5514.
15.Caws M, Thwaites G, Dunstan S, Hawn TR, Lan
NT, Thuong NT, et al. The influence of host and
bacterial genotype on the development of disseminated disease with Mycobacterium tuberculosis.
PLoS Pathogens 2008, 4: e1000034.
16.Garg RK. Tuberculosis of the central nervous system. Postgrad Med J 1999, 75: 133-140.
17.Rock BR, Olin M, Baker CA, Molitor TW, Peterson PK. Central Nervous System Tuberculosis:
Pathogenesis and Clinical Aspects. Clin Microbiol Rev 2008, 21: 243-261.
18.Burns DK. The nervous system. In Basic Pathology, Kumar V, Cotran RS S, Robbins S, 6th Edition, WB Saunders Company 1997, p. 713-744.
19.Lu CH, Chang WN, Chang HW. The prognostic
factors of adult tuberculous meningitis. Infection
2001, 29: 299-304.
20.Dass B, Puet TA, Watanaknakorn C. Tuberculosis of the spine (Pott’s disease) presenting as
Περίοδος B’, Τόμος 17, Τεύχος 1, 2012
“compression fractures’”. Spinal Cord 2002, 40:
604-608.
21.Harsha CKS, Shetty AP, Rajasekaran S. Intradural spinal tuberculosis in the absence of vertebral
or meningeal tuberculosis: a case report. J Orthop
Surg 2006, 14: 71-75.
22.Christie LJ, Loefler AM, Honarmand S, Flood
JM, Baxter R, Jacobson S, et al. Diagnostic Challenges of Central Nervous System Tuberculosis.
Emerg Infect Dis 2008, 14: 1473-1475.
23.Komolafe MA, Sunmonu TA, Esan OA. Tuberculous meningitis presenting with unusual clinical features in Nigerians: Two case reports. Cases
J 2008, 1: 180.
24.Christensen ASH, Andersen AB, Thomsen VO,
Andersen PH, Johansen IS. Tuberculous meningitis in Denmark: a review of 50 cases. BMC
Infect Dis 2011, 11: 47.
25.Thwaites G, Fisher M, Hemingway C, Scott G,
Solomon T, Innes J. British Infection Society
guidelines for the diagnosis and treatment of tuberculosis of the central nervous system in adults
and children. J Infect 2009, 59: 167-187.
26.Puccioni-Sohler M, Brandão CO. Factors associated to the positive cerebrospinal fluid culture in the tuberculous meningitis. Arq Neuropsiquiatr 2007, 65: 48-53.
27.Baheti R, Laddha P, Gehlot RS. CSF - Adenosine
Deaminase (ADA) Activity in Various Types of
Meningitis. J Indian Acad of Clin Med 2001, 2:
285-287.
28.Tuon FF, Higashino HR, Lopes MI, Litvoc MN,
Atomiva AN, Antonangelo, L, et al. Adenosine
deaminase and tuberculous meningitis—A systematic review with meta-analysis. Scand J Infect
Dis 2010, 42: 198-207.
29.Wallach JB. Central and peripheral nervous system disorders. In Interpretation of Diagnostic
Tests, 8th Edition, Lippincott Williams & Wilkins,
a Wolters Kluver business 2007, p. 305-336.
30.Radhakrishnan VV, Sehgal S, Mathai A. Correlation between culture of Mycobacterium tuberculosis and detection of mycobacterial antigens in
cerebrospinal fluid of patients with tuberculous
meningitis. J Med Microbiol 1990, 33: 223-226.
31.Ψαρουδάκη Ζ. Xρόνιες μηνιγγίτιδες. Ε.Κ.Μ.Ε.Δ
2008, 13 (3): 172-181.
32.Murthy JMK. Tuberculous meningitis: The challenges. Neurol India 2010, 58: 716-22.
33.Thakur R, Goyal R, Sarma S. Laboratory diagnosis of tuberculous meningitis - Is there a scope
17­
for further improvement? J Lab Physicians 2010,
2: 21.
34.European Centre for Disease Prevention and
Control. Mastering the basics of TB control: Development of a handbook on TB diagnostic methods. Stockholm: ECDC; 2011.
35.Μαρίνης Ε, Βογιατζάκης Ε, Βρυώνη Γ. Εργαστηριακή Μυκοβακτηριολογία. Αθήνα 2006, σελ.
73-114.
36.Φακίρη ΕΜ. Κλασικές μέθοδοι εργαστηριακής διάγνωσης μυκοβακτηριδιακών λοιμώξεων
(ανίχνευση-ταυτοποίηση- έλεγχος αντοχής) Μυκοβακτηρίδια: το παρόν και το μέλλον, Ημέρες
κλινικής μικροβιολογίας, Ελληνική Μικροβιολογική Εταιρεία 2007.
37.Della-Latta P, Weitzman I. Mycobacteriology. In
Essential Procedures for Clinical Microbiology,
American Society for Microbiology 1998, p. 169-203.
38.Flor A, Capdevila JA, Martin N, Gavaldà J, Pahissa A. Nontuberculous mycobacterial meningitis: report of two cases and review. Clin Infect Dis
1996, 25: 1266-1273.
39.Dora JM, Geib G, Chakr R, Paris F, Mombach
AB, Lutz L, et al. Polymerase Chain Reaction as a
Useful and Simple Tool for Rapid Diagnosis of Tuberculous Meningitis in a Brazilian Tertiary Care
Hospital. Braz J Infect Dis 2008, 12: 245-247.
40.Michael JS, Lalitha MK, Cherian T, Thomas K,
Mathai D, Abraham OC, et al. Evaluation of Polymerase Chain Reaction for rapid diagnosis of Tuberculous Meningitis. Ind J Tub 2002, 49: 133-137.
41.Haldar S, Sharma N, Gupta VK, Tyagi JS. Efficient diagnosis of tuberculous meningitis by
detection of Mycobacterium tuberculosis DNA
in cerebrospinal fluid filtrates using PCR. J Med
Microbiol 2009, 58: 616–624.
42.Pai M, Flores LL, Pai N, Hubbard A, Riley LW,
Colford JM Jr. Diagnostic accuracy of nucleic
acid amplification tests for tuberculous meningitis: a systematic review and meta-analysis. Lancet
Infect Dis 2003, 3: 663-643.
43.World Health Organization. Treatment of tuberculosis: guidelines-4th edition. (publication no.
WHO/HTM/TB/2009.420).
44.American Thoracic Society, CDC, and Infectious
Diseases Society of America. Treatment of tuberculosis. Morbidity and Mortality Weekly Report: Recommendations and Reports, 2003, 52 (RR-11): 1–77.
Υποβλήθηκε: 15/11/2011
Εγκρίθηκε: 8/2/2012
Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία
και Εργαστηριακή Διαγνωστική
Περίοδος Β’, Τόμος 17, Τεύχος 1, σελ. 18-23
2012
ΦΥΜΑΤΙΩΔΗΣ ΜΕΣΗ ΩΤΙΤΙΔΑ: ΜΙΑ ΣΠΑΝΙΑ ΝΟΣΟΣ
ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ ΜΙΧΕΛΑΚΗ, ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ ΒΕΛΕΝΤΖΑ, ΜΑΡΙΑ ΚΑΝΕΛΛΟΠΟΥΛΟΥ
Η φυματιώδης ωτίτιδα αποτελεί σπάνια κλινική εκδήλωση της φυματίωσης. Συνήθως ενέχεται το
M. tuberculosis ή το M. bovis, σπανιότερα τα Non Tuberculus Mycobacteria (NTB). Εκδηλώνεται με ανώδυνη ωτόρροια, που δεν ανταποκρίνεται στα ευρέος φάσματος αντιβιοτικά και αντιμυκητιακά φάρμακα, σχηματισμό κοκκιώδους ιστού, τυροειδοποιήσεις και πολλαπλές διατρήσεις του τυμπανικού υμένα, καταστροφή των οσταρίων του μέσου ωτός και της μαστοειδούς απόφυσης και περιφερική παράλυση του προσωπικού νεύρου. Η διάγνωση, η οποία βασίζεται σε μικροβιολογικές εξετάσεις (χρώση
Ziehl-Neelsen καλλιέργεια στα ειδικά θρεπτικά υλικά και μοριακές τεχνικές), και σε ιστολογικές (κοκκιώματα, κύτταρα Langans και τυροειδοποίηση ιστών), συνήθως καθυστερεί λόγω της μη εξοικείωσης
των κλινικών ιατρών με τη συγκεκριμένη κλινική οντότητα, με αποτέλεσμα την εμφάνιση σοβαρών επιπλοκών, όπως κώφωση, σχηματισμός συριγγίων, ενδοκράνια διασπορά μυκοβακτηριδίων και δημιουργία αποστημάτων. Η αντιφυματική θεραπεία με τα τέσσερα κλασικά αντιφυματικά φάρμακα διαρκεί
τουλάχιστον έξι μήνες, εξαρτάται όμως από το είδος του μυκοβακτηριδίου που προκάλεσε τη λοίμωξη,
τη συμμετοχή των παρακείμενων μαλακών μορίων και οστών στη φλεγμονή.
(Λέξεις ευρετηρίου: φυματίωση, ωτίτιδα, χρόνια μέση ωτίτιδα, Tb ωτίτιδα).
Eισαγωγή
Η φυματίωση αποτελεί έντονο υγειονομικό
πρόβλημα σε ορισμένες χώρες, ενώ η συνεχώς
αυξανόμενη πολυανθεκτική μορφή της παγκόσμιο πρόβλημα δημόσιας υγείας1. Το 2010 η Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας κατέγραψε 8.8 εκατομμύρια νέα κρούσματα, 1,1 εκατομμύρια θανάτους σε HIV αρνητικούς και 350.000 σε HIV
Μικροβιολογικό Τμήμα, «Σισμανόγλειο» Γ.Ν.Α.
θετικούς ασθενείς2. Αφορά κυρίως πνευμονικό ιστό και λεμφαδένες πρωτοπαθώς ή δευτεροπαθώς, σπανιότερα άλλα όργανα κυρίως σε ανοσοκατασταλμένα άτομα3. Η εντόπιση της νόσου
στο μέσον ους ευτυχώς είναι σπανιότατη4. Θεωρείται νόσος των παιδιών και γενικά των νεαρών ηλικιών, καθόσον το 84% των περιπτώσεων
αφορά ηλικίες μικρότερες των 15 ετών5. Η επίπτωση της νόσου έχει μειωθεί σημαντικά τα τελευταία 60 χρόνια στις αναπτυγμένες χώρες, λόγω της μείωσης της επίπτωσης γενικά της φυματίωσης στις χώρες αυτές και συγκεκριμένα α-
Περίοδος B’, Τόμος 17, Τεύχος 1, 2012
πό 5,5 κρούσματα/100.000 κατοίκους σε 2,3. Αντιθέτως αυξάνεται στις αναπτυσσόμενες χώρες,
καθόσον σε αυτές καταγράφονται 2000-3000
νέα κρούσματα ετησίως6. Η νόσος συνήθως είναι δευτεροπαθής και ακολουθεί τη λοίμωξη των
πνευμόνων. Η συγγενής φυματιώδης μέση ωτίτιδα παρατηρείται κυρίως στις αναπτυσσόμενες χώρες, όπου καταγράφονται υψηλά ποσοστά
φυματίωσης 7. Συνολικά σήμερα το 0,04-0,9%
των περιπτώσεων της χρόνιας μέσης ωτίτιδας οφείλεται στο M. tuberculosis ενώ σε ποσοστό 4%
ασθενών με φυματίωση κεφαλής και τραχήλου
υπάρχει εντόπιση στο μέσον ους8,9.
Παθογένεια- Κλινική Εικόνα
Η φυματιώδης ωτίτιδα (Tb ωτίτιδα) συνήθως είναι ετερόπλευρη και οφείλεται κυρίως στο
M. tuberculosis10. Το M. bovis ενέχεται σπανιότερα, ιδιαίτερα σε παιδιά στις αναπτυσσόμενες
χώρες, τα οποία καταναλώνουν μη παστεριωμένο γάλα αγελάδας11. Mycobacteria Other Than
Tuberculosis (MOTTs) προκαλούν ωτίτιδα κυρίως σε ανοσοκατασταλμένα άτομα, ή σε ασθενείς με προϋπάρχοντα νοσήματα των ώτων και
μετά από χειρουργικές ωτορινολαρυγγολογικές
επεμβάσεις 12. Η χρήση μολυσμένων υδατικών
διαλυμάτων και ακατάλληλα αποστειρωμένων
χειρουργικών υλικών με MOTTs έχει αποτελέσει αίτιο αυτών των λοιμώξεων13. Επίσης έχουν
αναφερθεί περιστατικά μέσης ωτίτιδας από Μ.
chelonae σε 17 ασθενείς μετά από χρήση μολυσμένου χειρουργικού εξοπλισμού καθώς και μαστοειδίτιδα από Μ. fortuitum μετά από μυριγγοτομή και τυμπανοπλαστική14, 15. Η εντόπιση του
βακτηρίου στο μέσον ους είναι δευτεροπαθής,
και γίνεται συνήθως μέσω της ευσταχιανής σάλπιγγας κατά τη διάρκεια της αιμόπτυσης και του
μολυσμένου αίματος με μυκοβακτηρίδια, ή αιματογενώς στο πλαίσιο κεχροειδούς φυματίωσης16.
Σπάνια είναι δυνατόν να μολυνθεί ο τυμπανικός
υμένας πρωτοπαθώς με αερολύματα, ιδιαίτερα όταν υπάρχει διάτρηση, ή έχει προηγηθεί μυριγγοτομή. Σπανιότερα ακόμη έχει αναφερθεί Tb ωτίτιδα σε νεογνά των οποίων η μητέρα έπασχε από
19­
φυματίωση γεννητικού συστήματος και μολύνθηκαν μέσω του πλακούντα ή μέσω του αμνιακού υγρού ή κατά τον τοκετό16,17.
Η κλινική εικόνα της Tb ωτίτιδας ποικίλλει. Το συχνό εύρημα της νόσου είναι η απότομη εκροή ορώδους υγρού από τον ακουστικό πόρο. Πυώδης εκροή είναι ένδειξη επιμόλυνσης από κοινά βακτήρια18. Πολλοί ασθενείς αναφέρουν απότομη απώλεια ακοής δυσανάλογη με
την έκταση της νόσου. Η απώλεια της ακοής δυνατόν να αφορά αγωγιμότητα (90% των ασθενών), ή νευροαισθητήρια οδό (~8%), ή αγωγιμότητα και νευροαισθητήρια οδό μαζί (~2%)17. Η
έλλειψη πόνου είναι χαρακτηριστικό της νόσου.
Εάν υπάρχει ωταλγία, οφείλεται στην πίεση που
προκαλείται από τη δημιουργία του κοκκιώδους
ιστού μέσα στη μαστοειδή απόφυση19,20. Η μαστοειδής απόφυση είναι τμήμα του μέσου ωτός
και αποτελεί οστέινη αεροφόρο δομή του κροταφικού οστού. Η κλινική εξέταση του πάσχοντος
ωτός αποκαλύπτει σχηματισμό κιτρινωπού κοκκιώδους ιστού πάνω σε λεπτό και υπεραιμικό τυμπανικό υμένα, μεμονωμένες ή πολλαπλές διατρήσεις του τυμπανικού υμένα, αποτέλεσμα των
συνενώσεων των κοκκιωμάτων8,10. Είναι δυνατόν να φανεί μέσω των διατρήσεων η προσβολή
των οσταρίων του μέσου ωτός (σφύρας, άκμονος και αναβολέα), το έκκριμα (λεπτό και υδαρές ή παχύ και βλεννώδες), ανάλογα με την επιμόλυνση από άλλα βακτήρια ή μύκητες16. Η κλινική εικόνα δεν είναι εντελώς χαρακτηριστική
και η υποψία για φυματιώδη μέση ωτίτιδα θα τεθεί, όταν ο ασθενής δεν ανταποκρίνεται στα συνήθη αντιβιοτικά. Εάν δεν χορηγηθεί έγκαιρα αντιφυματική αγωγή, η νόσος επεκτείνεται προκαλώντας φυματιώδη μαστοειδίτιδα, φυματιώδη
οστεομυελίτιδα του κροταφικού οστού, λαβυρινθίτιδα, φυματιώδη μηνιγγίτιδα, ενδοκράνια διασπορά του μυκοβακτηριδίου και σχηματισμό αποστημάτων5,8,20-22. Η χαρακτηριστική τριάδα
των συμπτωμάτων στη φυματιώδη ωτίτιδα είναι
ωτόρροια χωρίς πόνο, πολλαπλές μικρές διατρήσεις τυμπανικού υμένα και περιφερική παράλυση του προσωπικού νεύρου19. Η περιφερική παράλυση του προσωπικού νεύρου, η οποία αποτε-
20 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία­
λεί σημαντική επιπλοκή, είναι αποτέλεσμα της
ανατομικής θέσης του19,23. Το προσωπικό νεύρο διαθέτει ενδοκρανιακή, ενδοκροταφική και εξωκροταφική μοίρα, με την κροταφική μοίρα μήκους 3 cm να αποτελεί τη μεγαλύτερη ενδοστική πορεία νεύρου στο ανθρώπινο σώμα. Η προσβολή του κροταφικού οστού εύκολα σηματοδοτεί και την προσβολή του προσωπικού νεύρου23. Παρατηρείται συχνότερα στον παιδιατρικό πληθυσμό (35%) και λιγότερο στους ενήλικες (16%)17,20,22,24. Η παρουσία προωτιαίας λεμφαδενοπάθειας είναι συχνή, ενώ πολλαπλά φυματιώδη συρίγγια γύρω από τον ακουστικό πόρο παρατηρούνται σε ασθενείς, όπου η επίπτωση
της φυματίωσης είναι υψηλή5-7. Η διαφορική διάγνωση θα γίνει από το χολοστεάτωμα, την κοκκιωμάτωση Wegener, την ιστιοκύττωση X- ηωσινοφιλικό κοκκίωμα, τη σαρκοείδωση, τη νεκρωτική εξωτερική ωτίτιδα, το λέμφωμα, τη σύφιλη
και τέλος τη μυκητιακή μέση ωτίτιδα17,24,25.
Διάγνωση
Η επιμονή της φλεγμονής και τα ευρήματα της ωτοσκόπησης όπως αναφέρθηκαν παραπάνω, κατευθύνουν τον κλινικό ιατρό στη σωστή λήψη δείγματος και αναζήτηση του μυκοβακτηριδίου. Αποφεύγεται η χρήση βαμβακοφόρου στυλεού, διότι το βαμβάκι εγκλωβίζει τα μυκοβακτηρίδια και δεν επιτρέπει την απελευθέρωσή τους κατά τη διαδικασία της ετοιμασίας του
παρασκευάσματος για τις κατάλληλες χρώσεις,
ή προετοιμασίας του δείγματος για καλλιέργεια.
Προτιμάται η χρήση στυλεού από αλγινικό ασβέστιο ή πολυεστέρα26. Τα παρασκευάσματα ελέγχονται για την παρουσία οξεάντοχων βακτηρίων
με τη χρώση Ziehl-Neelsen ή Kinyoun. Η εξέταση αποβαίνει θετική σε ποσοστό 20-30% των περιπτώσεων27,28. Ο εμβολιασμός για απομόνωση
μυκοβακτηριδίων γίνεται ταυτόχρονα σε στερεά
(π.χ. Lowenstein-Jensen) και υγρά θρεπτικά υλικά (π.χ. Middlebrook 7H10/11)3. Η προηγηθείσα
χρήση ωτικών σταγόνων αντιβιοτικών δυνατόν
να επηρεάσει το αποτέλεσμα της καλλιέργειας. Ο παράλληλος έλεγχος άμεσου παρασκευά-
σματος και καλλιέργειας πτυέλων για απομόνωση μυκοβακτηριδίων επιβάλλεται, δεδομένου ότι
η πρωτοπαθής εστία ευρίσκεται σχεδόν πάντοτε
στους πνεύμονες. Επί έντονης κλινικής υποψίας της νόσου δυνατόν να εφαρμοστεί οποιαδήποτε μοριακή τεχνική αναζήτησης γενετικού υλικού M. tuberculosis complex ή MOTTs (PCR,
real-time PCR, TMA-Transcription Mediated
Amplification, NASBA-Nucleic Acid SequenceBased Amplification κ.λπ.) ανάλογα και με την
ενδημικότητα της περιοχής. Επιπλέον, χρήσιμες
για την έγκαιρη αντιμετώπιση της νόσου μπορούν να αποβούν μοριακές τεχνικές ανίχνευσης
γονιδίων αντοχής του M. tuberculosis complex
σε ορισμένα πρωτεύοντα αντιβιοτικά (Isoniazid,
Rifampin, Ethambutol), καθώς και σε δευτερεύοντα, όπως Aminoglycosides / Cyclic peptides και
Fluoroquinolones3.
Η δερμοαντίδραση mantoux αποτελεί τον
παλαιότερο διαγνωστικό τρόπο ελέγχου επαφής του ανθρώπου με το μυκοβακτηρίδιο. Ως αντιγόνο χρησιμοποιείται κεκαθαρμένη πρωτεΐνη
(Purified Protein Derivative, PPD) που βρίσκεται στο M. tuberculosis, M. bovis και άλλα Non
Tuberculous Mycobacteria, (NTM). Η αξιολόγηση της εξέτασης είναι δύσκολη στην περίπτωση
προηγηθέντος εμβολιασμού με το BCG εμβόλιο,
ή επαφής με NTB. Δεν είναι δυνατόν να διακριθεί η λανθάνουσα λοίμωξη από την ενεργό νόσο στην περίπτωση θετικού αποτελέσματος, καθώς επίσης και το αρνητικό αποτέλεσμα σε περίπτωση ανοσοανεπάρκειας. Εναλλακτικά χρησιμοποιείται ο ποιοτικός προσδιορισμός της ιντερφερόνης–γ, όπου ουσιαστικά ανιχνεύεται
η ύπαρξη Τ-λεμφοκυττάρων ειδικών για το M.
tuberculosis29.
Ιστολογικά ο τυμπανικός υμένας εμφανίζει έντονη φλεγμονή, περιέχει γιγαντοκύτταρα, μυκοβακτηρίδια με κύτταρα Langhans, νεκρώσεις,
τυροειδοποιήσεις, εξελκώσεις, και ασβεστοποιήσεις30. Η επέκταση της φλεγμονής δημιουργεί όμοιες ιστολογικές εικόνες στο μέσον ους με διάβρωση των οστών, σχηματισμό φυματιωδών κοκκιωμάτων στους επιχώριους λεμφαδένες και δημιουργία περιωτικών μονίμων συριγγίων8,17,30.
Περίοδος B’, Τόμος 17, Τεύχος 1, 2012
Η απλή ακτινογραφία στην περιοχή της μαστοειδούς αποφύσεως δεν δίνει χαρακτηριστικά
ευρήματα. Ομοίως μια φυσιολογική ακτινογραφία θώρακος δεν αποκλείει τη νόσο. Ο κλινικός
ιατρός πρέπει να είναι έντονα υποψιασμένος, ώστε να οδηγήσει την εργαστηριακή διαγνωστική προσέγγιση του ασθενούς προς τη σωστή κατεύθυνση. Η δημιουργία αέρα ή μαλακού ιστού
μέσα στη μαστοειδή απόφυση, ή η παρουσία καταστροφικών βλαβών της μαστοειδούς δεν είναι
χαρακτηριστικές της νόσου, καθόσον παρατηρούνται και σε άλλες χρόνιες φλεγμονές, υπάρχει όμως έντονη πιθανότητα να πρόκειται για
Tb ωτίτιδα31. Διάβρωση και αφαλάτωση των οσταρίων είναι δυνατόν να συμβεί, εξαρτάται βέβαια πάντα από το χρόνο έναρξης της αντιφυματικής θεραπείας σε σχέση με τη διάγνωση της
νόσου30-32. Πιστεύεται ότι η αξονική τομογραφία
δίνει περισσότερες λεπτομέρειες των βλαβών
της περιοχής33.
Η εκτίμηση της ακοής καταδεικνύει άλλοτε
άλλου βαθμού βαρηκοΐα. Στο μεγαλύτερο ποσοστό των περιπτώσεων (90%) η βλάβη εντοπίζεται στον τυμπανικό υμένα και στο μέσο ους, είναι δηλαδή τύπου αγωγιμότητας, σε μικρότερο
ποσοστό (8%) στο έσω ους και στο VIII εγκεφαλικό νεύρο και ακόμη λιγότερο (2%) είναι μικτού
τύπου24.
Η επιλογή και η διάρκεια της θεραπείας εξαρτώνται από την ενδημικότητα της περιοχής
καθώς και από το είδος του μυκοβακτηριδίου.
Στην περίπτωση της M. tuberculosis complex ωτίτιδας χορηγείται τετραπλό σχήμα με Isoniazid,
Rifampin, Pyrazinamide και Ethambutol για δύο
μήνες και ακολουθεί διπλό σχήμα με Isoniazid
και Rifampin για άλλους τέσσερις μήνες.
Άλλες θεραπευτικές προτάσεις συνίστανται αρχικά σε εξάμηνη θεραπεία με Isoniazid,
Rifampin, Pyrazinamide και σε περίπτωση αποτυχίας σε 18 ή 24μηνη θεραπεία με συνδυασμούς
Isoniazid, Rifampin, Pyrazinamide, Ethambutol
και Streptomycin. Δυσκολίες προκύπτουν όταν
απομονώνονται ανθεκτικά στα αντιφυματικά
στελέχη, ή MOTTs τα οποία είναι ανθεκτικά ενδογενώς στα κλασικά αντιφυματικά φάρμακα7.
21­
Χειρουργική παρέμβαση απαιτείται σε περίπτωση παράλυσης του προσωπικού νεύρου, υποπεριοστικού αποστήματος, συριγγίων, καταστροφής της μαστοειδούς απόφυσης34. Ο συνδυασμός χειρουργικής και φαρμακευτικής αγωγής οδηγεί στη θεραπεία σε συντομότερο χρονικό διάστημα35,36.
Συμπερασματικά, η Tb ωτίτιδα είναι σπάνια
νοσολογική κατάσταση, η οποία χωρίς θεραπεία
οδηγεί σε σοβαρές επιπλοκές, με σημαντικότερη
την παράλυση του προσωπικού νεύρου. Ο κλινικός γιατρός θα πρέπει να υποψιαστεί τη νόσο από τη σωστή λήψη ιστορικού, την κλινική εικόνα, τη μη ανταπόκριση στα κοινά αντιβιοτικά
και αντιμυκητιακά φάρμακα και είναι αυτός που
θα καθοδηγήσει στα σωστά διαγνωστικά βήματα
για την έγκαιρη διάγνωση της νόσου.
Διεύθυνση Επικοινωνίας:
Κανελλοπούλου Μαρία
Μικροβιολογικό Τμήμα «Σισμανόγλειο» Γ.Ν.Α
Αγγ. Σικελιανού 15, Νέα Ερυθραία 14671
Τηλ. 2108074067
Summary
Tuberculosis otitis media: a rare disease
A. MICHELAKI, A. VELENTZA,
M. KANELLOPOULOU
Dept. of Microbiology “Sismanoglion”
General Hospital Athens
Applied Clinical Microbiology
Tuberculosis otitis media (TOM) is a rare
clinical entity that is usually seen in association
with pulmonary tuberculosis. The characteristic
clinical features of TOM accounting for 0,05%0,9% of chronic infections of the middle ear are:
painless otorrhea, multiple tympanic perforations
and facial palsy. Diagnosis of TOM is established
by histological findings such as granulomas, Langhans’ giant cells and caseation necrosis, by mi-
22 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία­
crobiological aspects such as Ziehl Neelsen stain,
culture to solid and liquid media for Mycobacteria
sp. isolation and sensitivity, molecular techniques
and radical methods. Delay suspicion of this entity
leads to delay treatment and irreversible complications including labyrynthitis, postauricular fistula,
tuberculus osteomyelitis of the petrous pyramid,
acute mastoiditis, permanent hearing loss and
spread of the infection to the central nervous system. The treatment of choice for TOM is antituberculosis chemotherapy for at least six months
using currently available combinations. Surgery
may be required in some cases, especially for treating complications.
(Key words: tuberculosis, otitis, chronic otitis).
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
1.WHO. Tuberculosis prevalence surveys: a handbook. The lime book. WHO/HTM/TB/2010.17.
2.WHO. Global Tuberculosis Control: WHO report 2011 Switzerland 2011. http://www.who.int/
tb/publications/global_report/2011/gtbr 11.
3.Pfyffer GE, Brown-Elliott BA, Wallace RJ.
Mycobacterium:General Characteristics, Isolation, and Staining Procedures In: Murray PR,
Baron EJO, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH.
Manual of Clinical Microbiology 8th Edition,
ASM Washington, DC 2003, 532-584.
4.Nishiike S,Irifune M, Doi K. Tuberculosis otitis
media: clinical aspects of 12 cases. Ann Otol Rhinol Laryngol 2003, 12: 935-938.
5.Greenfield BJ, Selesnick SH, Fisher L, Ward RF,
Kimmelman CP, Harrison WG. Aural tuberculosis. Am J Otol 1995, 16(2): 175-182.
6.Plester D, Pusalkar A, Steinbach E. Middle ear
tuberculosis. J Laryngol Otol 1980, 94: 14151421.
7.Sens PM, Almeida C, O do Valle L, Costa L,
Angeli M. Tuberculosis of the ear, a professional
disease? Rev Bras Otol 2008, 74(4): 621-627.
8.Vaamonde P, Castro C, Garcia-Soto N, Labella
T, Lozano A. Tuberculosis otitis media: A significant diagnosis challenge. Head Neck Surg 2004,
130(6): 759-766.
9.Kiminyo K, Levi C, Krishnan J, Lucey D. Tuberculosis otitis media and mastoiditis (instructive
cases). Inf Dis Prac 2001, 10: 491-492.
10.Vital V, Printza A, Zaraboukas T. Tuberculous
otitis media: a difficult diagnosis and report of
four cases. Pathol Res Pract 2002, 198: 31-35.
11.Grewal DS, Baser B, Shahani RN, Khanna S.
Tuberculoma of the mastoid. J Laryngol Oto J
1995, 109: 264-265.
12.Hoca NT, Ogretensory M, Dayioglu D, Akbas
N. Tuberculous otitis media- a case report. Turk
Resp J 2008, 9(1): 48-50.
13.Phillips MS, Fordham von Reyn C. Nosocomial
infections due to nontuberculus mycobacteria.
Clin Infect Dis 2001, 33: 1363-1374.
14.Lowry PW, Jarvis WR, Oberle AD, et al. Mycobacterium chelonae causing otitis media in an earnose and throat practice. N Engl J Med 1988, 319:
978-982.
15.Neitch SM, Sydnor JB, Schleupner CJ. Mycobacterium fortuitum as a cause of mastoiditis and wound
infection. Arch Otolaryngol 1982, 108: 11-14.
16.Windle-Taylor PC, Bailey CM. Tuberculous otitis media: a series of 22 patients. Laryngoscope
1980, 90: 1039-1044.
17.Adhikari P. Tuberculous Otitis Media: A Review
of Literature. The Internet Journal of OtorhinolaryngologyTM ISSN: 1528-8420, 2009, (9): 1-6.
18.Midholm A, Pedersen B. Primary tuberculosis
otitis media. J Laryngol Otol 1971, 85(1): 11952000.
19.Quaranta N, Petrone P, Michailidou A, Miragliotta L, Santantonio M, Del Prete R, et al.
Tuberculous otitis media with facial paralysis: a
clinical and microbiological Diagnosis-A case
Report. Case Reports In Infec Dis 2011, Article
ID 932608.
20.Giner AR, Fortuny JC, Iranzo C, Sarroca E,
Palomar V. Otitis media tuberculosa. An ORL
Iber-Amer 1990, 5: 553-560.
21.Emmett JR, Fischer ND, Biggers WP. Tuberculous mastoiditis. Laryngoscope 1977, 87: 11571163.
22.Kirsch CM, Wehner JH, Jensen WA, Kagawa FT,
Ampagna A. Tuberculous otitis media. Southern
Med J 1995, 88(3): 363-366.
23.Μάλλης Α, Παπαδάς Θ. Περιφερική παράλυση
προσωπικού νεύρου. Αιτιολογία, διάγνωση και
αντιμετώπιση. Αρχεία Ελληνικής Ιατρικής 2010,
27(4): 607-613.
Περίοδος B’, Τόμος 17, Τεύχος 1, 2012
24.Awan M S, Salahuddin I. Tuberculous otitis media: two case reports and literature review. Ear
Nose Throat J 2002, 81: 792-794.
25.Arya M, Dixit R, Paramez AR, Sharma S, Rathore D. Tuberculosis of the middle ear with post
auricular abscess. Indian J Tuberc 2009, 56: 160163.
26.Simms V, Musher DM. Psoas muscle abscess due
to Mycobacterium kansasii in an apparently immunocompetent adult. Clin Infect Dis 1998, 27:
893-894.
27.Skolnik PR, Nadol JB, Baker AS. Tuberculosis
of the middle ear: Review of the literature with
an instructive case report. Rev Infect Dis 1986, 8:
403-410.
28.Lee PY, Drysdale AJ. Tuberculous otitis media:
a difficult diagnosis. J Laryngol Otol 1993, 107:
339-341.
29.Ζέρβα Λ. Φυματινοαντίδραση Mantoux–Προσδιορισμός Ιντερφερόνης. Κλινικό Φροντιστήριο
Μυκοβακτηρίδια: Το παρόν και το μέλλον. Ελληνική Μικροβιολογική Εταιρεία 2007, σελ. 56-61.
30.Makhdoom NK. Unilateral tuberculous otitis
media . JMMS 2010, 1(6): 192-195.
23­
31.Cho YS, Lee HS, Kim SW, et al. Tuberculous otitis media: a clinical and radiological analysis of 52
patients. Laryngoscope 2006, 116(6): 921-927.
32.Dunlap N.E, Bass J, Fujiwara P, Hopewell C,
Horsburgh R, Salfinger M. Diagnostic standards
and classification of tuberculosis in adults and
children. American Journal of Respiratory and
Critical Care Medicine 2000, 161(4): 1376-1395.
33.Hoshino T, Miyashita H, Asai Y. Computed tomography of the temporal bone in tuberculous
otitis media. J Laryngol Otol 1994, 108: 702-705.
34.Singh B. Role of surgery in tuberculosis mastoiditis. J Laryngo Otol 1991, 105: 907-915.
35.Kwon M, Choi SH, Chung JW. Roles of an antituberculosis medication and surgery in patients
with tuberculous otitis media. Acta Otolaryngol
2010, 130(6): 679-686.
36.Abes GT, Abes FL, Jamir JC. The variable clinical presentation of tuberculosis otitis media and
the importance of early detection. Otol Neurotol
2011, 32(4): 539-543.
Υποβλήθηκε: 15/09/2011
Εγκρίθηκε: 12/02/2012
Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία
και Εργαστηριακή Διαγνωστική
Περίοδος Β’, Τόμος 17, Τεύχος 1, σελ. 24-34
2012
ΜΕΛΕΤΗ
ΣΥΝΔΥΑΣΤΙΚΉ ΘΕΡΑΠΕΊΑ ΠΟΣΑΚΟΝΑΖΌΛΗΣ ΚΑΙ ΑΜΦΟΤΕΡΙΚΊΝΗΣ Β ΣΕ
ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΌ ΜΟΝΤΈΛΟ ΔΙΆΣΠΑΡΤΗΣ ΚΑΝΤΙΝΤΊΑΣΗΣ. ΣΥΣΧΈΤΙΣΗ ΜΕ
IN VITRO ΑΠΟΤΕΛΈΣΜΑΤΑ
ΑΝΤΙΓΌΝΗ ΕΛΕΦΆΝΤΗ, M.SC.1, ΠΑΎΛΟΣ ΑΛΕΞΆΚΟΣ M.SC.2, JOHAN MOUTON M.D. PH.D.3,
ΛΟΥΚΊΑ ΖΈΡΒΑ M.D. PH.D.1, ΙΩΣΉΦ ΜΕΛΕΤΙΆΔΗΣ PH.D.1
Η αυξανόμενη συχνότητα σοβαρών καντιντιακών λοιμώξεων σε ανοσοκατασταλμένους καθιστά αναγκαία τη διεύρυνση νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων, όπως η συνδυαστική χορήγηση αντιμυκητιακών. Σε αυτό το πλαίσιο, η αλληλεπίδραση μεταξύ πολυενίων και αζολών δεν είναι ακόμα πλήρως κατανοητή. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση αρχικώς της δραστικότητας του συνδυασμού αμφοτερικίνης Β και ποσακοναζόλης in vitro έναντι κλινικού στελέχους Candida albicans και η
συσχέτιση των εργαστηριακών αποτελεσμάτων με την in vivo δραστικότητα του συνδυασμού σε κατάλληλο μοντέλο διάσπαρτης καντιντίασης σε ποντικούς. Η φαρμακοδυναμική ανάλυση των αλληλεπιδράσεων πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το κριτήριο ανεξαρτησίας κατά Bliss, όπου το ποσοστό
δραστικότητας ενός συνδυασμού συγκρίνεται στατιστικά με το θεωρητικό ποσοστό αν τα δύο φάρμακα δρούσαν ανεξάρτητα. In vitro ανταγωνισμός κατά Bliss σε ποσοστό –23% (–23% - –22%) βρέθηκε για τους συνδυασμούς συγκεντρώσεων 0,03 έως 0,125 μg/mL αμφοτερικίνης Β και 0,004-0,015 μg/
mL ποσακοναζόλης, ενώ συνέργεια κατά Bliss 27% (14%-58%) βρέθηκε σε συνδυασμούς συγκεντρώσεων 0.008-0,0625 μg/mL αμφοτερικίνης Β και 1,5×10-5-0,001 μg/mL ποσακοναζόλης. Παρατηρήθηκε in
vivo συνέργεια κατά Bliss για τους συνδυασμούς 1 mg/kg αμφοτερικίνης Β με 0,2-0,9 mg/kg (13±4%)
ποσακοναζόλης, και ανταγωνισμός για τους συνδυασμούς 2-3,2 mg/kg αμφοτερικίνης B και 0,9 mg/kg
ποσακοναζόλης (35-83%). Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν in vitro και in vivo δοσοεξαρτώμενη αλληλεπίδραση για το συνδυασμό ποσακοναζόλης και αμφοτερικίνης Β, με συνέργεια στις χαμηλότερες δόσεις αμφοτερικίνης Β και ανταγωνισμό στις υψηλότερες δόσεις. Επομένως, ο εργαστηριακός έλεγχος
συνδυασμών αντιμυκητιακών θα μπορούσε να εφαρμοσθεί για την ανίχνευση συνεργικών συνδυασμών
που ενδεχομένως να βελτίωναν το κλινικό αποτέλεσμα και την αποφυγή ανταγωνιστικών συνδυασμών
που θα μείωναν τις πιθανότητες θεραπευτικής επιτυχίας.
(Λέξεις ευρετηρίου: καντιντίαση, συνδυαστική θεραπεία, συνέργεια, ανταγωνισμός, ανεξαρτησία κατά
Bliss).
1. Εργαστήριο Κλινικής Μικροβιολογίας, ΠΓΝ «Αττικόν», Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Αθηνών.
2. Κέντρο Πειραματικής Χειρουργικής, Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών, Ακαδημία Αθηνών.
3. Τμήμα Μικροβιολογίας, Πανεπιστημιακό Ιατρικό Κέντρο Νιμέγης, Ολλανδία.
Περίοδος B’, Τόμος 17, Τεύχος 1, 2012
Εισαγωγή
Τις τελευταίες δεκαετίες, η αύξηση του αριθμού των ανοσοκατασταλμένων ασθενών, όπως
αυτών που λαμβάνουν αντικαρκινική αγωγή, υποβάλλονται σε μεταμοσχεύσεις ή πάσχουν από AIDS, έχει οδηγήσει στην αύξηση του αριθμού των ασθενών που είναι ευάλωτοι σε μυκητιακές λοιμώξεις1. Το φαινόμενο αυτό σε συνδυασμό με την ανάπτυξη ανθεκτικών στελεχών και
το γεγονός ότι συχνά οι διαθέσιμες θεραπευτικές προσεγγίσεις χαρακτηρίζονται από υψηλή
τοξικότητα και χαμηλή αποτελεσματικότητα υποδεικνύει την αναγκαιότητα ανεύρεσης νέων
θεραπευτικών προσεγγίσεων 2. Η συνδυαστική
θεραπεία αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση η οποία θα μπορούσε να βελτιώσει την
αποτελεσματικότητα, να περιορίσει την τοξικότητα, να μειώσει το χρονικό διάστημα χορήγησης της αντιμυκητιακής αγωγής και να διευρύνει
το φάσμα της δραστικότητάς της σε περίπτωση
συνεργικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των φαρμάκων3. Ωστόσο, θα μπορούσε να οδηγήσει και
σε ανταγωνιστικές αλληλεπιδράσεις με ολέθριες
συνέπειες στην έκβαση της λοίμωξης.
H εργαστηριακή μελέτη της δραστικότητας
συνδυασμών αντιμυκητιακών φαρμάκων είναι απαραίτητη για την επιλογή συνδυασμών με συνεργικές αλληλεπιδράσεις, τη βελτιστοποίηση
της δοσολογίας, καθώς και την αναγνώριση ανταγωνιστικών αλληλεπιδράσεων. Ωστόσο, τα
in vitro αποτελέσματα σπάνια συσχετίζονται με
τη κλινική ανταπόκριση σε ανθρώπους ή πειραματόζωα4. Οι διαφορές μεταξύ των in vivo και in
vitro ευρημάτων μπορεί να οφείλονται σε παράγοντες που σχετίζονται με την πειραματική μεθοδολογία, αλλά και ανάλυσης των αποτελεσμάτων5.
Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η ανάπτυξη μιας εργαστηριακής μεθόδου τα αποτελέσματα της οποίας μετά από κατάλληλη ανάλυση
θα συσχετίζονται με την έκβαση συνδυαστικής
αντιμυκητιακής θεραπείας σε πειραματόζωα. Για
το σκοπό αυτό μελετήθηκε ο συνδυασμός ποσακοναζόλης και αμφοτερικίνη Β in vitro και in vivo
25­
σε μυϊκό μοντέλο πειραματικής καντιντίασης. Η
θεραπευτική χρήση των συνδυασμών αζολών με
την αμφοτερικίνη Β είναι υπό αμφισβήτηση λόγω του ενδεχομένου ανταγωνισμού μεταξύ αυτών των δύο τάξεων αντιμυκητιακών φαρμάκων6. Το ενδεχόμενο αυτό πηγάζει κυρίως από
το μηχανισμό δράσης που εμφανίζουν αυτές οι
τάξεις φαρμάκων, μια και οι αζόλες αναστέλλουν
το βιοσυνθετικό μονοπάτι της κυριότερης στερόλης της κυτταρικής μεμβράνης των μυκήτων,
της εργοστερόλης, με την οποία συνδέεται η αμφοτερικίνη Β και προκαλεί βλάβες στην κυτταρική μεμβράνη. Ωστόσο, οι περισσότερες in vitro
μελέτες εμφανίζουν το συνδυασμό αζόλης και
αμφοτερικίνης B αδιάφορο με βάση τον κλασματικό δείκτη ανασταλτικών συγκεντρώσεων (δείκτης FICi)7. Ποικίλα πειραματικά μοντέλα μυκητιακών λοιμώξεων έχουν χρησιμοποιηθεί στο
παρελθόν προκειμένου να μελετήσουν την αλληλεπίδραση μεταξύ αζολών και αμφοτερικίνης
Β κατά τη συνδυαστική θεραπεία, αλλά τα αποτελέσματα ποικίλλουν και είναι πολλές φορές αντικρουόμενα7. Ειδικότερα η αλληλεπίδραση μεταξύ ποσακοναζόλης και αμφοτερικίνης Β δεν έχει διερευνηθεί εκτενώς.
Η παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε με
σκοπό την εκτενέστερη διερεύνηση της in vitro
αλληλεπίδρασης του συνδυασμού ποσακοναζόλης και αμφοτερικίνης Β και της θεραπευτικής
του δράσης έναντι διάσπαρτης πειραματικής καντιντίασης και τον ακόλουθο συσχετισμό των αποτελεσμάτων αυτών με βάση το κριτήριο ανεξαρτησίας Bliss, που χρησιμοποιείται για την ανάλυση φαρμακοδυναμικών μοντέλων.
Υλικά και Μέθοδοι
Στέλεχος και θρεπτικό υλικό
Xρησιμοποιήθηκε κλινικό στέλεχος Candida
albicans με ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση
(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) αμφοτερικίνης Α 0,125 μg/mL και ποσακοναζόλης
0,01 μg/mL, το οποίο απομονώθηκε από ασθενή με διάσπαρτη καντιντίαση. Το στέλεχος ανα-
26 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία­
καλλιεργήθηκε από τους -70°C που ήταν αποθηκευμένο σε τρυβλία άγαρ Sabouraud Dextrose
(SDA) και επωάστηκε στους 30°C για 24h. Για
την παρασκευή του εναιωρήματος ενοφθαλμίσθηκαν τρεις έως πέντε αποικίες σε 10 mL αποστειρωμένου φυσιολογικού ορού. Εν συνεχεία
προσδιορίστηκε ο αριθμός κυττάρων ανά mL σε
πλάκα Neubauer και παρασκευάστηκε το τελικό εναιώρημα. Για τα in vitro πειράματα η τελική συγκέντρωση του εναιωρήματος ήταν 2,5 ×
103 CFU/mL σε θρεπτικό υλικό RPMI 1640 ρυθμισμένο σε pH 7,0 με 0,165 Μ 3-(N-μορφολινο)προπανοσουλφονικό οξύ (MOPS), ενώ για τα in
vivo πειράματα 106 CFU/mL σε αποστειρωμένο
φυσιολογικό ορό. Σε κάθε περίπτωση η συγκέντρωση του εναιωρήματος επιβεβαιώθηκε με επίστρωση του εναιωρήματος σε τρυβλία SDA και
μέτρηση εν συνεχεία των αποικιών.
Αντιμυκητιακοί παράγοντες
Για τα in vitro πειράματα χρησιμοποιήθηκαν οι καθαρές ουσίες ποσακοναζόλης (Merck
Ελλάδας, Αθήνα) και αμφοτερικίνης Β (SigmaAldrich, Αθήνα), οι οποίες διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO). Διαλύματα συγκέντρωσης 10 × 103 μg/mL ποσακοναζόλης και 5
×103 μg/mL αμφοτερικίνης Β φυλάχθηκαν στους
-70°C.
Στα in vivo πειράματα χρησιμοποιήθηκε
σκεύασμα ποσακοναζόλης (Noxafil, Merck Ελλάδας, Αθήνα) συγκέντρωσης 40 mg/ml, από το
οποίο παρασκευάστηκαν διαλύματα κατάλληλης
συγκέντρωσης σε αποστειρωμένο ύδωρ, καθώς
και αμφοτερικίνης Β (Fungizone, Apothecon,
Bristol-Myers Squibb, Princeton, N.J.), το οποίο
ανασυστάθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.
In vitro δοκιμασία συνδυασμού ποσακοναζόλης και αμφοτερικίνης Β. Χρησιμοποιήθηκε
η τεχνική της σκακιέρας 8 × 12 (checkerboard
technique) με βάση την πρότυπη μέθοδο μικροαραιώσεων σε ζωμό της CLSΙ M27-A38. Περιληπτικά, 50 μL υποδιπλάσιων συγκεντρώσεων ποσακοναζόλης συνδυάστηκαν με 50 μL υποδιπλά-
σιων συγκεντρώσεων αμφοτερικίνης Β συμπεριλαμβανομένης και της ομάδας ελέγχου χωρίς φάρμακο σε πλάκα μικροτιτλοποίησης 96 βοθρίων. Οι τελικές συγκεντρώσεις της ποσακοναζόλης κυμαίνονταν από 1,5 × 10-5 έως 0,015 μg/
mL και της αμφοτερικίνης Β από 0,008 έως 0,5
μg/mL. Η τελευταία στήλη βοθρίων (στήλη 12)
περιείχε μόνον αμφοτερικίνη Β, ενώ η τελευταία
σειρά βοθρίων (σειρά Η) μόνον ποσακοναζόλη.
Το βοθρίο Η12 (βοθρίο ελέγχου) περιείχε μόνο
θρεπτικό ζωμό.
Μετά τον ενοφθαλμισμό 0,1 mL εναιωρήματος C. albicans σε θρεπτικό υλικό, οι πλάκες επωάστηκαν στους 35°C για 48 h και ακολούθησε
προσδιορισμός της ανάπτυξης του μύκητα ανά
βοθρίο, με μέτρηση της απορρόφησης (Α) στα
405 nm. Τα αποτελέσματα υπέστησαν επεξεργασία με βάση την εξίσωση % μυκητιακής ανάπτυξης=(Αβοθρίου-Αυποβάθρου)/(Αβοθρίου ελέγχουΑυποβάθρου) × 100, όπου Αβοθρίου η απορρόφηση
του εξεταζόμενου βοθρίου, Αυποβάθρου η απορρόφηση βοθρίου ενοφθαλμισμένου μόνο με διάλυμα των φαρμακευτικών παραγόντων και Αβοθρίου ελέγχου η απορρόφηση βοθρίου ενοφθαλμισμένου μόνο με διάλυμα μύκητα. Για την αμφοτερικίνη Β η MIC προσδιορίστηκε οπτικά ως η ελαχίστη συγκέντρωση, η οποία αναστέλλει πλήρως την ανάπτυξη του μύκητα (0% ανάπτυξη) ενώ για την ποσακοναζόλη ως η ελαχίστη συγκέντρωση, η οποία αναστέλλει μερικώς την ανάπτυξη του μύκητα (50% ανάπτυξη).
Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές σε διαφορετικές ημέρες.
Πειραματόζωα
Η παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε με έγκριση της Γενικής Διεύθυνσης Αγροτικής Οικονομίας & Κτηνιατρικής (αριθμός πρωτοκόλλου
Κ/7391/2010) για πραγματοποίηση πειραμάτων
σε ζώα. Χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 60 CD1
θηλυκοί ποντικοί (μύες, Mus musculus), ηλικίας
4-6 εβδομάδων και σωματικού βάρους 23-27 g.
Τα πειραματόζωα είχαν πρόσβαση σε τροφή και
Περίοδος B’, Τόμος 17, Τεύχος 1, 2012
νερό κατά βούληση. Κατά τη διάρκεια της μελέτης τηρήθηκαν όλα τα προβλεπόμενα κριτήρια για τη διαβίωση και χειρισμό των πειραματόζωων9. Στους ποντικούς χορηγήθηκε υποδορίως διάλυμα κυκλοφωσφαμίδης (ENDOXAN,
Mead Johnson Pharmaceuticals, Evansville, Ind.)
σε δοσολογίες των 150 mg/kg (τέσσερις ημέρες
πριν τη λοίμωξη, ημέρα -4) και 100 mg/kg (μία
ημέρα πριν τη λοίμωξη, ημέρα -1), προκειμένου
να καταστούν ουδετεροπενικοί με αριθμό ουδετερόφιλων μικρότερο από 100 κύτταρα/mm3
καθ’ όλη τη διάρκεια του πειράματος. Η κυκλοφωσφαμίδη ανασυστάθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.
Μοντέλο διάσπαρτης καντιντίασης σε ποντικούς. Η διάσπαρτη καντιντίαση προκλήθηκε με την ενδοφλέβια χορήγηση 0,1 mL εναιωρήματος C. albicans (106 CFU/mL), 2h πριν την
έναρξη της θεραπείας (ημέρα 0). Στο τέλος των
πειραμάτων τα πειραματόζωα θυσιάστηκαν και
οι νεφροί τους τοποθετήθηκαν ξεχωριστά σε 2
mL φυσιολογικού ορού στους 4°C. Αμέσως μετά ακολούθησε μηχανική ομογενοποίηση των
νεφρών και το ομογενοποίημα που προέκυψε αραιώθηκε διαδοχικά κατά 1/10 και 1/100. Ακολούθησε επίστρωση 50 μL κάθε ομογενοποιήματος σε τρυβλία SDA, τα οποία επωάστηκαν
για 24h στους 30°C, ώστε να προσδιοριστεί ο αριθμός αποικιών Candida. Το μικρότερο όριο ανίχνευσης ήταν 40 CFU/νεφρό και τα αποτελέσματα εκφράσθηκαν ως ο μέσος όρος CFU/νεφρό από δύο πειραματόζωα (τέσσερις νεφροί).
Η χορήγηση των φαρμακευτικών παραγόντων, είτε ως μονοθεραπεία είτε ως συνδυαστική θεραπεία, ξεκίνησε 2h μετά τη μόλυνση (ημέρα 0) και επαναλήφθηκε μετά από 24h (ημέρα 1),
ενώ τα πειραματόζωα θανατώθηκαν κατά την ημέρα 2. Σε προκαταρκτικά πειράματα χορηγήθηκε μονοθεραπεία ποσακοναζόλης από το στόμα
σε 24 πειραματόζωα συνολικά και σε υποδιπλάσιες δόσεις που κυμαίνονταν από 0,03 έως 32
mg/kg. Επιπλέον χορηγήθηκε μονοθεραπεία αμφοτερικίνης Β ενδοπεριτοναϊκώς σε 12 πειραματόζωα συνολικά και σε υποδιπλάσιες δόσεις που
κυμαίνονταν από 0,31 έως 5 mg/kg. Η κάθε ο-
27­
μάδα αποτελούνταν από 2 πειραματόζωα και σε
κάθε περίπτωση χρησιμοποιήθηκε και μία ομάδα
μαρτύρων (2 ποντικών) στην οποία χορηγήθηκε placebo, είτε από το στόμα είτε ενδοπεριτοναϊκώς. Ακολούθως, τα αποτελέσματα δόσης/απόκρισης αναλύθηκαν με τη μέθοδο της μη γραμμικής παλινδρόμησης (σιγμοειδές μοντέλο Εmax)
το οποίο περιγράφεται με την εξίσωση E = Emax
× (D/ED50)m/[1 + (D/ED50)m], όπου Ε ο αριθμός αποικιών/νεφρό (CFU/νεφρό) σε μια δόση
D, Εmax η τιμή CFU/νεφρό στην ομάδα ελέγχου,
ED50 η δόση που αντιστοιχεί σε 50% του Εmax
και m η κλίση της καμπύλης δόσης-απόκρισης
(συντελεστής Hill) (Prism 5.0, GraphPad Inc,
San Diego, CA). Κατόπιν υπολογίστηκαν οι χαμηλές (Χ), ενδιάμεσες (Ε) και υψηλές (Υ) αποτελεσματικές δοσολογίες (ΑΔ), που αντιστοιχούσαν στο 20%, 50% και 80% του ολικού μυκητιακού φορτίου/νεφρό, αντίστοιχα, όπως αυτό καθορίζεται από την ομάδα μαρτύρων, στην οποία
χορηγήθηκε placebo (αποστειρωμένο ύδωρ). Τέλος μετά τον προσδιορισμό των τριών αποτελεσματικών δόσεων Χ, Ε, Υ για κάθε ένα φαρμακευτικό παράγοντα, μελετήθηκε η θεραπευτική
επίδραση όλων των δυνατών συνδυασμών ποσακοναζόλης και αμφοτερικίνης Β (3×3) με τον ίδιο
τρόπο που περιγράφηκε παραπάνω, χορηγώντας
τα διαλύματα ποσακοναζόλης από το στόμα και
αμέσως μετά τα διαλύματα αμφοτερικίνης Β ενδοπεριτοναϊκώς.
Ανάλυση φαρμακοδυναμικών αλληλεπιδράσεων
Οι in vitro και in vivo φαρμακοδυναμικές αλληλεπιδράσεις αναλύθηκαν με το μοντέλο Bliss
το οποίο περιγράφεται από την εξίσωση IIND =
IAMB + IΠΟΣ – IAMB × IΠΟΣ (1), για κάθε συνδυασμό, όπου IAMB και ΙΠΟΣ το ποσοστό αναστολής
της ανάπτυξης από την αμφοτερικίνη Β και την
ποσακοναζόλη, αντίστοιχα, και IIND το θεωρητικό ποσοστό αναστολής του συνδυασμού αν τα
φάρμακα δρούσαν ανεξάρτητα. Η εξίσωση (1) είναι ισοδύναμη με την EIND = EAMB × EΠΟΣ (δεδομένου ότι E=1−I), όπου EΑΜΒ, EΠΟΣ τα πειραματικώς προσδιοριζόμενα ποσοστά μυκητιακής α-
28 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία­
νάπτυξης (υπολογισμένα με βάση την απορρόφηση για τα in vitro πειράματα και τα CFU/νεφρό για τα in vivo πειράματα) σε χορήγηση αμφοτερικίνης Β και ποσακοναζόλης, αντίστοιχα,
και EΙΝD το θεωρητικό ποσοστό της μυκητιακής ανάπτυξης αν η αμφοτερικίνη Β και η ποσακοναζόλη δρούσαν ανεξάρτητα. Προκειμένου να
προσδιορισθεί το είδος των φαρμακοδυναμικών
αλληλεπιδράσεων για κάθε in vitro και in vivo
συνδυασμό υπολογίστηκε η διαφορά ΔΕ μεταξύ του θεωρητικού ποσοστού ανάπτυξης EIND και
του πειραματικώς προσδιοριζόμενου EΠΕΙΡ. Όταν
η τιμή ΔΕ ήταν >0, τότε η αλληλεπίδραση χαρακτηριζόταν ως συνεργική, ενώ όταν ΔΕ ήταν στατιστικώς σημαντικά <0 με βάση τη δοκιμασία t,
η αλληλεπίδραση χαρακτηριζόταν ως ανταγωνιστική για ένα δεδομένο συνδυασμό. Τέλος όταν
η τιμή ΔΕ δεν διέφερε στατιστικά από το μηδέν, η
αλληλεπίδραση χαρακτηριζόταν ως ανεξάρτητη.
Όταν προσδιορίστηκαν οι τιμές ΔΕ για όλους τους συνδυασμούς που μελετήθηκαν in
vitro κατασκευάστηκε ένα τρισδιάστατο διάγραμμα, το οποίο περιγράφει το είδος της αλληλεπίδρασης των φαρμακευτικών παραγόντων σε
όλους τους συνδυασμούς. Συγκεκριμένα οι κορυφές ή οι κοιλότητες που εμφανίζονται στο διάγραμμα, χαρακτηρίζονται από τιμές μεγαλύτερες
ή μικρότερες από το μηδενικό επίπεδο και υποδηλώνουν αντιστοίχως την ύπαρξη συνέργειας ή
ανταγωνισμού.
Αποτελέσματα
In vitro έλεγχος συνδυασμού
Τα αποτελέσματα του in vitro συνδυασμού
φαίνονται στην Εικόνα 1 όπου παρουσιάζονται
τα % ποσοστά μυκητιακής ανάπτυξης σε κάθε
συγκέντρωση των φαρμάκων μόνων τους και σε
συνδυασμό, καθώς και τα ποσοστά συνέργειας
ή ανταγωνισμού με βάση το κριτήριο Bliss (Πίνακας 1). Βρέθηκε ανταγωνισμός κατά Bliss σε
ποσοστό –23% (–23% - –22%) για τους συνδυασμούς συγκεντρώσεων 0,03 έως 0,125 μg/mL
αμφοτερικίνης Β και 0,004-0,015 μg/mL ποσακοναζόλης. Επίσης, συνέργεια 27% (14%-58%)
βρέθηκε σε συνδυασμούς συγκεντρώσεων από
0,008-0,0625 μg/mL αμφοτερικίνης Β και 1,5 ×
10-5-0,001 μg/mL ποσακοναζόλης. Στο τρισδιάστατο διάγραμμα (Εικόνα 1) φαίνεται ότι η συνέργεια εμφανίστηκε σε συνδυασμούς με χαμηλές συγκεντρώσεις αμφοτερικίνης Β και ποσακοναζόλης, ενώ ο ανταγωνισμός εμφανίστηκε σε
συνδυασμούς υψηλότερων συγκεντρώσεων αμφοτερικίνης Β και ποσακοναζόλης.
In vivo συνδυαστική θεραπεία
Οι σιγμοειδείς καμπύλες δόσης-απόκρισης
κατά τη μελέτη των μονοθεραπειών, αλλά και
των θεραπευτικών συνδυασμών, παρουσιάζονται
στην Εικόνα 2. Από τη σύγκριση των καμπυλών
Συνέργεια
Ανταγωνισμός
Εικόνα 1. Τρισδιάστατη απεικόνιση της
in vitro αλληλεπίδρασης ποσακοναζόλης+αμφοτερικίνης Β με βάση το φαρμακοδυναμικό μοντέλο Bliss. Οι κορυφές πάνω από το επίπεδο 0 αντιστοιχούν σε στατιστικά σημαντικές συνεργικές αλληλεπιδράσεις ενώ οι κοιλότητες κάτω από το επίπεδο 0 σε ανταγωνιστικές αλληλεπιδράσεις.
Περίοδος B’, Τόμος 17, Τεύχος 1, 2012
29­
Πίνακας 1. In vitro αλληλεπίδραση ποσακοναζόλης+αμφοτερικίνης Β με βάση το φαρμακοδυναμικό μοντέλο
Bliss. Στον Πίνακα 1α φαίνονται τα ποσοστά μυκητιακής ανάπτυξης ενώ στον Πίνακα 1β φαίνονται τα ποσοστά
συνέργειας (πράσινο χρώμα) και ανταγωνισμού (κόκκινο χρώμα) σε κάθε συγκέντρωση των φαρμάκων, μόνων
τους και σε συνδυασμό.
Πίνακας 1α.
Πίνακας 1β.
που αντιστοιχούν στις μονοθεραπείες παρατηρήθηκε ότι αποτελεσματική δοσολογία της ποσακοναζόλης που αντιστοιχεί στο 50% του ολικού μυκητιακού φορτίου (0,42 mg/kg) ήταν μικρότερη σε σχέση με την αντίστοιχη της αμφοτερικίνης Β (2 mg/kg), ωστόσο μόνο η αμφοτερικίνη Β επέφερε πλήρη κάθαρση των νεφρών όταν
χορηγήθηκε σε υψηλότερες δοσολογίες. Για τη
συνδυαστική θεραπεία υπολογίστηκαν οι δοσολογίες που αντιστοιχούσαν σε 20%, 50% και 80%
μυκητιακού φορτίου οι οποίες ήταν 1,2 και 3,6
mg/kg αμφοτερικίνης Β και 0,2, 0,45 και 0,9 mg/
kg ποσακοναζόλης, αντιστοίχως. Στο διάγραμμα παρουσιάζονται επίσης και οι καμπύλες που
προέκυψαν από το συνδυασμό των τριών δοσολογιών της αμφοτερικίνης Β με τις αντίστοιχες
τρεις της ποσακοναζόλης. Αξιολογώντας ποιοτικά τις καμπύλες των συνδυασμών παρατηρούνται δύο διαφορετικά φαινόμενα.
Στην περιοχή των χαμηλότερων δοσολογιών
αμφοτερικίνης Β σε συνδυασμό με την ποσακο-
ναζόλη οι καμπύλες αυτές βρίσκονται μετατοπισμένες στο χαμηλότερο αριθμό CFU/νεφρό, συγκρινόμενες με τις αντίστοιχες μονοθεραπείες
γεγονός που υποδηλώνει την ύπαρξη συνέργειας. Από την άλλη πλευρά, στην περιοχή του διαγράμματος όπου συγκεντρώνονται οι υψηλότερες δοσολογίες αμφοτερικίνης Β, σε συνδυασμό
με την ποσακοναζόλη, οι προκύπτουσες καμπύλες βρίσκονται μετατοπισμένες στον υψηλότερο
αριθμό CFU/νεφρό, συγκρινόμενες με την καμπύλη μονοθεραπείας αμφοτερικίνης Β. Αυτό το
φαινόμενο συσχετίζεται με την ύπαρξη ανταγωνισμού στη συγκεκριμένη περιοχή του διαγράμματος όπου συγκεντρώνονται οι δοσολογίες αμφοτερικίνης Β.
Τα αποτελέσματα αυτά αναλύθηκαν περαιτέρω με βάση το κριτήριο ανεξαρτησίας κατά
Bliss, προκειμένου να αξιολογηθεί και στατιστικώς η αλληλεπίδραση της ποσακοναζόλης και
της αμφοτερικίνης Β στους θεραπευτικούς συνδυασμούς που μελετήθηκαν. Στον Πίνακα 2 πα-
30 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία­
Β (ΕΠΕΙΡ), τα θεωρητικά ποσοστά μυκητιακού
φορτίου αν τα δύο φάρμακα δρούσαν ανεξάρτητα (EIND), όπως αυτά προσδιορίζονται από την
εξίσωση Bliss, καθώς και η διαφορά ΕΠΕΙΡ-EIND.
Στατιστικά σημαντική συνέργεια κατά Bliss παρατηρήθηκε για τους συνδυασμούς Χ AMB και
ΧPOS (13±4%) και ΧAMB και ΥPOS (10±4%), ενώ ανταγωνισμός κατά Bliss προσδιορίστηκε για
τους συνδυασμούς ΥAMB και ΕAMB με ΥPOS και
ΕPOS (35-83%).
Εικόνα 2. Καμπύλες δόσης-απόκρισης για την
αμφοτερικίνη Β (ΑΜΒ) και την ποσακοναζόλη
(POS) κατά τις μονοθεραπείες και τη συνδυαστική
θεραπεία. Παρατηρείται η ύπαρξη συνέργειας στην
περιοχή χαμηλότερων δοσολογιών αμφοτερικίνης Β
και ανταγωνισμού στην περιοχή των υψηλότερων,
αντιστοίχως.
ρουσιάζονται τα % ποσοστά του μυκητιακού
φορτίου όπως προσδιορίστηκαν για κάθε δοσολογία των φαρμάκων μόνων τους και σε συνδυασμό. Σχετικά με τις μονοθεραπείες τα αποτελέσματα της ανάλυσης έδειξαν ότι το μυκητιακό φορτίο βρέθηκε μειωμένο σε σχέση με την ομάδα μαρτύρων κατά 16±3 % και 100%, όταν χορηγήθηκαν οι υψηλότερες δοσολογίες ποσακοναζόλης (0,9 mg/kg) και αμφοτερικίνης Β (3,6
mg/kg), αντιστοίχως. Στον ίδιο Πίνακα παρουσιάζονται επίσης τα ποσοστά μυκητιακού φορτίου που προσδιορίστηκαν πειραματικώς για κάθε συνδυασμό ποσακοναζόλης+αμφοτερικίνης
Συμπεράσματα
Οι in vitro φαρμακοδυναμικές μελέτες συνδυασμών φαρμάκων είναι ένα πολύτιμο εργαλείο
για την κατανόηση της σχέσης μεταξύ της έκθεσης στο φάρμακο και της δραστικότητάς του έναντι τόσο ευαίσθητων όσο και ανθεκτικών στελεχών3. Ωστόσο η συσχέτιση των αποτελεσμάτων μεταξύ in vitro πειραμάτων και in vivo ευρημάτων είναι δύσκολη λόγω μεθοδολογικής και αναλυτικής ετερογένειας των αντίστοιχων μελετών. Στην παρούσα εργασία επετεύχθη ο συσχετισμός των in vitro αποτελεσμάτων συνδυασμού
ποσακοναζόλης και αμφοτερικίνης Β με αυτά
των in vivo πειραμάτων συνδυαστικής θεραπείας σε μοντέλο διάσπαρτης καντιντίασης. Συγκεκριμένα, η ανάλυση κατά Bliss αποκάλυψε την ύπαρξη μιας in vitro και in vivo δοσοεξαρτώμενης
αλληλεπίδρασης για το φαρμακευτικό συνδυασμό ποσακοναζόλης και αμφοτερικίνης Β, με συ-
Πίνακας 2. Στατιστική ανάλυση με χρήση του μοντέλου Bliss για τη μελέτη της αλληλεπίδρασης του συνδυασμού ποσακοναζόλη+αμφοτερικίνη
Β. Παρουσιάζονται τα % ποσοστά του μυκητιακού φορτίου, όπως αυτό προσδιορίστηκε πειραματικώς για κάθε δοσολογία κατά τη
μονοθεραπεία ή συνδυαστική θεραπεία (EΠΕΙΡ), καθώς και το θεωρητικό % ποσοστό (EIND), όπως αυτό προσδιορίστηκε από την
εξίσωση Bliss. Από τη μεταξύ τους διαφορά συμπεραίνεται το είδος της στατιστικά σημαντικής (p<0,05 με t δοκιμασία) αλληλεπίδρασης
(ΣΥΝ: συνέργεια, ΑΝΕΞ: ανεξάρτητη δράση, ΑΝΤ: ανταγωνισμός).
AMB
0,2 mg/kg POS
Δόση (μονοθεραπεία) EΠΕΙΡ ΕIND
% Διαφορά
(mg/kg)
EΠΕΙΡ (%)
(%)
(%) (αλληλεπίδραση)
0,45 mg/kg POS
EΠΕΙΡ ΕIND
% Διαφορά
(%)
(%) (αλληλεπίδραση)
0,9 mg/kg POS
EΠΕΙΡ
ΕIND
% Διαφορά
(%)
(%) (αλληλεπίδραση)
0
1
2
3,6
89±0
99±0 87±2
– 11 (ΑΝΕΞ)
94±6 48±11
– 45 (ANT)
75±18 0±0
– 75 (ANT)
84±2
73±2
83±4
10 (ΣΥΝ)
80±5 45±12
– 35 (ANT)
83±4
0±0
– 83 (ANT)
101±0
99±3
54±15
0±0
102±1
87±1 101±3
13 (ΣΥΝ)
58±5 55±13
– 2 (ΑΝΕΞ)
13±27 0±0
– 13 (ΑΝΕΞ)
Περίοδος B’, Τόμος 17, Τεύχος 1, 2012
νέργεια στις χαμηλότερες δοσολογίες αμφοτερικίνης Β και ανταγωνισμό στις υψηλότερες.
Οι περισσότερες in vitro μελέτες συνδυασμών αζόλης και αμφοτερικίνης Β έχουν καταδείξει αδιάφορη αλληλεπίδραση και σπάνια ανταγωνισμό 7,10. Στις περισσότερες από αυτές,
οι φαρμακοδυναμικές αλληλεπιδράσεις εκτιμήθηκαν με βάση το δείκτη κλασματικής ανασταλτικής συγκέντρωσης (Fractional Inhibitory
Concentration) FICi. Με βάση το δείκτη αυτό, ο
ανταγωνισμός και η συνέργεια αντιστοιχούν σε
αύξηση και μείωση των τιμών MIC των δύο φαρμάκων που εξετάζονται σε συνδυασμό κατά δύο
υποδιπλάσιες συγκεντρώσεις, γεγονός που σπάνια παρατηρείται in vitro7. Επομένως, ο δείκτης
FICi δεν είναι αρκούντως ευαίσθητος για την ανίχνευση αλληλεπιδράσεων χαμηλότερης κλίμακας, καθώς και αλληλεπιδράσεων που εμφανίζονται σε συγκεντρώσεις μικρότερες της τιμής
MIC5. Η ανάλυση κατά Bliss, ανιχνεύει φαρμακοδυναμικές αλληλεπιδράσεις που εμφανίζονται
σε όλο το φάσμα των συγκεντρώσεων ανεξάρτητα από το μέγεθός τους. Η συγκεκριμένη ανάλυση χρησιμοποιήθηκε σε προηγούμενες μελέτες
ασπεργίλλωσης και ανίχνευσε φαρμακοδυναμικές αλληλεπιδράσεις οι οποίες ήταν αδιάφορες
σύμφωνα με το δείκτη FIC11.
Η in vivo αλληλεπίδραση μεταξύ αζολών
και αμφοτερικίνης Β έναντι Candida spp. έχει ήδη μελετηθεί από διάφορες ερευνητικές ομάδες. Σε μοντέλα συστηματικής καντιντίασης από
Candida albicans, οι Louie και συν. παρατήρησαν
ανταγωνισμό μεταξύ της τριαζόλης φλουκοναζόλης και της αμφοτερικίνης Β12, ενώ οι Sugar και
Liu23 ανταγωνισμό μεταξύ της ιτρακοναζόλης
και της αμφοτερικίνης Β 13. Επιπλέον, οι Louie
και συν. ανέφεραν ότι o συνδυασμός φλουκοναζόλης και αμφοτερικίνης Β εμφάνιζε επίσης ανταγωνισμό σε πειραματικά μοντέλα ενδοκαρδίτιδας και πυελονεφρίτιδας από C. albicans σε
κουνέλια14. Ωστόσο, οι Sanati και συν. δεν παρατήρησαν ανταγωνισμό μεταξύ φλουκοναζόλης και αμφοτερικίνης Β σε πειραματικά μοντέλα
διάσπαρτης λοίμωξης από C. albicans σε ουδετεροπενικούς ποντικούς15 και ενδοκαρδίτιδας σε
31­
κουνέλια. Οι Sugar και συν. επιπλέον δεν κατέγραψαν την ύπαρξη ανταγωνισμού σε πειραματικά μοντέλα διηθητικής καντιντίασης σε ανοσοεπαρκείς ή ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς16. Η
ετερογένεια αυτή των αποτελεσμάτων ενδεχομένως να οφείλεται στις δοσολογίες της αμφοτερικίνης Β που χρησιμοποιήθηκαν, οι οποίες δεν
κάλυπταν μεγάλο φάσμα, αλλά μόνο υψηλές δοσολογίες που συσχετίζονται με ανταγωνισμό, όπως βρέθηκε και στην παρούσα μελέτη. Ενδείξεις για συνέργεια μεταξύ αζολών και αμφοτερικίνης Β υπάρχουν σε παλαιότερες μελέτες όπου
χρησιμοποιήθηκαν χαμηλές δόσεις αμφοτερικίνης Β17 καθώς και σε μια πρόσφατη μελέτη όπου
χρησιμοποιήθηκε ευρύ φάσμα δόσεων αμφοτερικίνης Β και ποσακοναζόλης18 επιβεβαιώνοντας
τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης όπου
βρήκαμε μια δοσοεξαρτώμενη συνέργεια και ανταγωνισμό μεταξύ ποσακοναζόλης και αμφοτερικίνης Β.
Παρόλο που ο μοριακός μηχανισμός της δοσοεξαρτώμενης αλληλεπίδρασης μεταξύ αμφοτερικίνης Β και ποσακοναζόλης δεν είναι γνωστός, τα αποτελέσματα της εργασίας αυτής θα
μπορούσαν να συσχετιστούν με το μοντέλο δράσης της αμφοτερικίνης Β όπως έχει προταθεί αρχικά από τους Cohen και συν.19 Σύμφωνα με αυτό, η αμφοτερικίνη Β σε χαμηλές συγκεντρώσεις
(0,2–0,8 μM) σχηματίζει μη υδρόφιλες πρόδρομες δομές πόρων στην επιφάνεια της μεμβράνης, οι οποίες ομοιάζουν με ιοντικά κανάλια, χωρίς την άμεση συμμετοχή μορίων εργοστερόλης.
Οι δομές αυτές έχουν ως αποτέλεσμα την αύξηση της διαπερατότητας της μεμβράνης στα μόρια της ουρίας και της γλυκόζης 20. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (>1,2 μM) οι μεμβρανικές
δομές αλληλεπιδρούν με τα μόρια της εργοστερόλης και δημιουργούνται υδρόφιλοι πόροι μεγάλης διαμέτρου21. Η συνεργική αλληλεπίδραση μεταξύ αμφοτερικίνης Β και ποσακοναζόλης
στην περιοχή των χαμηλότερων συγκεντρώσεων
αμφοτερικίνης Β θα μπορούσε να εξηγηθεί μέσω
των μεταβολών της διαπερατότητας που επάγει
η αμφοτερικίνη Β στην κυτταρική μεμβράνη και
έχουν ως επακόλουθο την αυξημένη εισροή ή τη
32 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία­
μη αποτελεσματική εκροή μορίων ποσακοναζόλης από το κύτταρο. Συνεπώς, δεδομένου ότι η
εργοστερόλη δεν ενέχεται στο σχηματισμό των
πρόδρομων δομών που επάγει η χαμηλή συγκέντρωση αμφοτερικίνης Β στην κυτταρική μεμβράνη, εικάζουμε ότι η αναστολή της βιοσύνθεσης της εργοστερόλης από την ποσακοναζόλη
δεν θα ανταγωνίζεται τη δράση της αμφοτερικίνης Β, αλλά θα παρουσιάζει συνεργική δράση22.
Από την άλλη, σε υψηλές συγκεντρώσεις, η αμφοτερικίνη Β σχηματίζει υδρόφιλους πόρους με
τη συμμετοχή μορίων εργοστερόλης και, επομένως, η αναστολή της βιοσύνθεσής της από την
ποσακοναζόλη θα μπορούσε να ανταγωνίζεται
τη δράση της αμφοτερικίνης Β.
Συμπερασματικά, στην παρούσα μελέτη βρέθηκε in vitro-in vivo συσχέτιση δοσοεξαρτώμενης συνέργειας και ανταγωνισμού μεταξύ ποσακοναζόλης και αμφοτερικίνης Β χρησιμοποιώντας το μαθηματικό μοντέλο Bliss. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν την εγκυρότητα της
in vitro μεθοδολογίας που εφαρμόσθηκε και υποδεικνύουν ότι μία τέτοιου είδους ανάλυση
μπορεί να ανιχνεύσει εργαστηριακά συνεργικούς
συνδυασμούς αντιμυκητιακών που ενδεχομένως
να βελτιώσουν το κλινικό αποτέλεσμα, αποφεύγοντας ταυτόχρονα ανταγωνιστικούς συνδυασμούς που θα μείωναν τις πιθανότητες θεραπευτικής επιτυχίας. Θεωρητικά, ο συνδυασμός χαμηλών δόσεων αμφοτερικίνης Β με ποσακοναζόλη θα μπορούσε να έχει κλινική εφαρμογή σε περιπτώσεις λοιμώξεων από ανθεκτικά στελέχη, σε
περιστατικά όπου λόγω τοξικότητας δεν επιτρέπεται η χρήση υψηλών δοσολογιών αμφοτερικίνης Β, καθώς και σε περιπτώσεις όπου η εμπειρική αγωγή με αμφοτερικίνη Β δεν παρουσιάζει
κλινική ανταπόκριση και θα χρειαζόταν να συνδυαστεί με μία αζόλη. Τέλος, η συνδυαστική θεραπεία μπορεί να αποτελέσει μια εναλλακτική
θεραπευτική προσέγγιση ειδικά έναντι μυκητιάσεων όπου η αποτελεσματικότητα της μονοθεραπείας είναι περιορισμένη, όπως ασπεργιλλώσεων, ζυγομυκητιάσεων και άλλων δύσκολα θεραπεύσιμων μυκητιάσεων. Οι υποθέσεις αυτές απαιτούν επικύρωση με περαιτέρω μελέτες.
Ευχαριστίες
Ευχαριστούμε το Κέντρο Προτύπων Ζωικών
Μοντέλων του Π.Γ.Ν. «Αττικόν» για τη διάθεση
του χώρου και του εξοπλισμού και το προσωπικό
του για τη συνεργασία κατά τη διάρκεια των in
vivo πειραμάτων.
Διεύθυνση Επικοινωνίας:
Ιωσήφ Μελετιάδης, Ph.D.
Λέκτορας Μικροβιολογίας
Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών
Εργαστήριο Κλινικής Μικροβιολογίας,
ΠΓΝ «Αττικόν»,
Ρίμινι 1, Χαϊδάρι, Αθήνα 12462
Τηλ: +30-210-583-1909,
Φαξ: +30-210-532-6421,
Email: [email protected]
Summary
Combination therapy of posaconazole with
amphotericin B in a murine model of
experimental disseminated candidiasis:
Correlation with in vitro results
ANT. ELEFANTI1, PAV. ALEXAKOS2,
J. MOUTON3, L. ZERVA1,
JOS. MELETIADIS1
1. Clinical Microbiology Laboratory, Attikon
University General Hospital, Medical School,
University of Athens, 2. Center of experimental
surgery, Biomedical Research foundation,
Academy of Athens, 3. Department of Medical
Microbiology, Radbaud University Medical
Center, Nijmegen, The Netherlands
Applied Clinical Microbiology
The increasing incidence of serious fungal infections in immunocompromised patients necessitates the search for new therapeutic approaches
such as combination antifungal therapy. In this
context, the interaction between polyene and azoles
are not yet fully understood. The purpose of this
Περίοδος B’, Τόμος 17, Τεύχος 1, 2012
study was initially to investigate the in vitro activity of the of amphotericin B and posaconazole
combination against Candida albicans and then to
correlate laboratory results to in vivo efficacy of the
combination in a suitable model of disseminated
candidiasis in mice. Pharmacodynamic interactions were assessed based on Bliss independence
interaction analysis, where the activity of a combination was compared statistically with the theoretical activity if the two drugs acted independently. In
vitro Bliss antagonism of –23% (–23% - –22%) was
found in combinations of concentrations of 0.03 to
0.125 mg/L amphotericin B and 0.004-0.015 mg/L
posaconazole, and Bliss synergy of 27% (14%58%) was found in combinations of concentrations
0.008-0.0625 mg/L amphotericin B and 1.5×10-50.001 mg/L posaconazole. In vivo Bliss synergy
(13±4%) was found for the combinations 1 mg/kg
amphotericin B with 0.2-0.9 mg/kg posaconazole,
and Bliss antagonism (35-83%) for the combinations of 2-3.2 mg/kg amphotericin B and 0.9 mg/
kg posaconazole. Bliss interaction analysis revealed
in vitro and in vivo dose-dependent interaction for
the combination of posaconazole + amphotericin
B, with synergy at lower doses of amphotericin B
and antagonism at higher doses. Therefore, laboratory testing of antifungal combinations could be
applied in order to detect synergistic combinations
which may improve the clinical outcome and avoid
antagonistic combinations that would reduce the
chances of therapeutic success.
(Key words: candidiasis, combination therapy
surgery, antagonism, Bliss interaction analysis).
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
1.Enoch DA, Ludlam HA, Brown NM. Invasive
fungal infections: a review of epidemiology and
management options. J Med Microbiol 2006, 5(Pt
7): 809-818.
2.Groll AH, Walsh TJ. Antifungal chemotherapy: advances and perspectives. Swiss Med Wkly.
2002, 132(23-24): 303-311.
3.Marr K. Combination antifungal therapy: where
33­
are we now, and where are we going? Oncology
(Williston Park). 2004, 18(13 Suppl 7): 24-29.
4.Kontoyiannis DP, Lewis RE. Combination chemotherapy for invasive fungal infections: what
laboratory and clinical studies tell us so far. Drug
Resist Updat. 2003, 6(5): 257-269.
5.Meletiadis J, Verweij PE, TeDorsthorst DT, Meis
JF, Mouton JW. Assessing in vitro combinations
of antifungal drugs against yeasts and filamentous
fungi: comparison of different drug interaction
models. Med Mycol 2005, 43(2): 133-152.
6.Sugar AM. Use of amphotericin B with azole
antifungal drugs: what are we doing? Antimicrob
Agents Chemother 1995, 39(9): 1907-1912.
7.Johnson MD, MacDougall C, Ostrosky-Zeichner L, Perfect JR, Rex JH. Combination antifungal therapy. Antimicrob Agents Chemother 2004,
48(3): 693-715.
8.CLSI. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi;
Approved standard. Second edition M38-A2.
2008, 28 (16).
9.Committee. Institute of Laboratory Animal Research. Guide for the Care and Use of Laboratory
Animals. Washington, DC: The National Academic Press, 2001.
10.Lewis RE, Diekema DJ, Messer SA, Pfaller MA,
Klepser ME. Comparison of Etest, chequerboard
dilution and time-kill studies for the detection of
synergy or antagonism between antifungal agents
tested against Candida species. J Antimicrob
Chemother 2002, 49(2): 345-351.
11.Meletiadis J, Petraitis V, Petraitiene R, Lin P,
Stergiopoulou T, Kelaher AM, et al. Triazolepolyene antagonism in experimental invasive pulmonary aspergillosis: in vitro and in vivo correlation. J Infect Dis 2006, 194(7): 1008-1018.
12.Louie A, Banerjee P, Drusano GL, Shayegani
M, Miller MH. Interaction between fluconazole
and amphotericin B in mice with systemic infection due to fluconazole-susceptible or -resistant
strains of Candida albicans. Antimicrob Agents
Chemother 1999, 43(12): 2841-2847.
13.Sugar AM, Liu XP. Interactions of itraconazole
with amphotericin B in the treatment of murine
invasive candidiasis. J Infect Dis 1998, 177(6):
1660-1663.
14.Louie A, Kaw P, Banerjee P, Liu W, Chen G,
Miller MH. Impact of the order of initiation of
fluconazole and amphotericin B in sequential
34 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία­
or combination therapy on killing of Candida
albicans in vitro and in a rabbit model of endocarditis and pyelonephritis. Antimicrob Agents
Chemother 2001, 45(2): 485-494.
15.Sanati H, Ramos CF, Bayer AS, Ghannoum MA.
Combination therapy with amphotericin B and
fluconazole against invasive candidiasis in neutropenic-mouse and infective-endocarditis rabbit
models. Antimicrob Agents Chemother 1997,
41(6): 1345-1348.
16.Sugar AM, Hitchcock CA, Troke PF, Picard M.
Combination therapy of murine invasive candidiasis with fluconazole and amphotericin B. Antimicrob Agents Chemother 1995, 39(3): 598-601.
17.Polak A. Combination therapy of experimental candidiasis, cryptococcosis, aspergillosis and
wangiellosis in mice. Chemother 1987, 33(5):
381-395.
18.Cacciapuoti A, Gurnani M, Halpern J, Norris
C, Patel R, Loebenberg D. Interaction between
posaconazole and amphotericin B in concomitant
treatment against Candida albicans in vivo. Antimicrob Agents Chemother 2005, 49(2): 638-642.
19.Cohen BE. A sequential mechanism for the formation of aqueous channels by amphotericin B
in liposomes. The effect of sterols and phospholipid composition. Biochim Biophys Acta, 1992,
8, 1108(1): 49-58.
20.Cohen BE. Concentration- and time-dependence
of amphotericin-B induced permeability changes
across ergosterol-containing liposomes. Biochim
Biophys Acta 1986, 9, 857(1): 117-122.
21.Baginski M, Czub J. Amphotericin B and its new
derivatives - mode of action. Curr Drug Metab
2009, 10(5): 459-469.
22.Meletiadis J, te Dorsthorst DT, Verweij PE. The
concentration-dependent nature of in vitro amphotericin B-itraconazole interaction against Aspergillus fumigatus: isobolographic and response
surface analysis of complex pharmacodynamic
interactions. Int J Antimicrob Agents 2006, 28(5):
439-449.
Υποβλήθηκε: 15/01/2012
Εγκρίθηκε: 14/02/2012
Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία
και Εργαστηριακή Διαγνωστική
Περίοδος Β’, Τόμος 17, Τεύχος 1, σελ. 35-40
2012
ΕΝΔΙΑΦΕΡΟΥΣΑ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ
ΙΣΧΑΙΜΙΚO ΕΓΚΕΦΑΛΙΚO EΜΦΡΑΚΤΟ ΣΕ ΒΡEΦΟΣ ΑΠO HSV
ΜΑΡΙΑ ΓΙΑΝΝΑΚΗ1, ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΓΕΩΡΓΟΥΛΗΣ2, ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑ ΤΣΑΠΡΟΥΝΗ1,
ΕΥΑΓΓΕΛΙΑ ΠΕΤΡΙΔΟΥ1, ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΣΥΡΙΟΠΟΥΛΟΥ3, ΑΝΑΣΤΑΣΙΑ ΠΑΓΚΑΛΗ1
Παρουσιάζεται η περίπτωση βρέφους πέντε μηνών που νοσηλεύτηκε για δεξιά ημιπάρεση, χωρίς αναφερόμενη προηγουμένως λοίμωξη. Ο απεικονιστικός έλεγχος έδειξε ισχαιμικό έμφρακτο του εγκεφάλου αριστερά, καθώς και διακοπή της ροής στην αριστερή μέση εγκεφαλική αρτηρία. Με τον προσδιορισμό IgM και IgG ειδικών ανοσοσφαιρινών επιβεβαιώθηκε ορολογικά λοίμωξη από HSV. Με Real Time
PCR ανιχνεύθηκε ο HSV τύπου 2 στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό. Στον ασθενή χορηγήθηκε Acyclovir. Ενάμιση χρόνο μετά και με τη βοήθεια φυσικοθεραπευτικής αγωγής, διαπιστώθηκε κλινικά ότι παραμένει
μια ήπια σπαστική ραιβοϊπποποδία.
(Λέξεις ευρετηρίου: ισχαιμικό εγκεφαλικό έμφρακτο, HSV-2, παιδιά).
Εισαγωγή
Το Ισχαιμικό Εγκεφαλικό Έμφρακτο (ΙΕΕ)
εμφανίζεται πολύ σπάνια στη βρεφική και παιδική ηλικία. Ενώ στους ενήλικες ως κύριο αίτιο θεωρείται η αγγειακή αθηρωμάτωση, στα παιδιά αναφέρονται ως παράγοντες κινδύνου η θρομβοφιλία, συγγενείς ανωμαλίες καρδιάς και των αγγείων, λοιμώξεις, νόσοι του κολλαγόνου και μεταβολικά νοσήματα1. Από τους λοιμογόνους παράγοντες έχει επιβεβαιωθεί η αιτιολογική σχέση του ιού της ανεμευλογιάς - έρπητα ζωστήρα. Η συμβολή άλλων λοιμωδών παραγόντων
στη δημιουργία ΙΕΕ δεν έχει πλήρως αποσαφη1. Μικροβιολογικό Τμήμα. 2. Νευρολογική Κλινική και
3. Τμήμα Λοιμώξεων, Α΄ Παιδιατρικής Κλινικής Πανεπιστημίου Αθηνών Νοσοκομείου Παίδων «Η Αγία Σοφία».
νιστεί. Μικροοργανισμοί που έχουν αναφερθεί
να σχετίζονται είναι η Borrelia burgdorferi, το
Mycoplasma pneumoniae, η Bartonella henselae,
ο ιός Parvo B19 και εντεροϊοί2. Στην παρούσα
μελέτη παρουσιάζεται περίπτωση ΙΕΕ με λοίμωξη του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ)
από HSV τύπου 2.
Περιγραφή περίπτωσης
Αγόρι, 5 μηνών, εισήχθη στο νοσοκομείο μας
γιατί παρουσίασε αιφνίδια πτώση της δεξιάς γωνίας του στόματος και κάμψη του δεξιού άνω άκρου.
Στο ιστορικό του, ατομικό και οικογενειακό, δεν αναφέρθηκε κάποιος επιβαρυντικός παράγων. Κατά την κλινική εξέταση διαπιστώθηκε
ότι το δεξί κάτω άκρο βρισκόταν σε έκταση και
36 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία­
Εικόνα 1. Υπερηχογράφημα. Αύξηση ηχογένειας στην
περιοχή θαλάμου αριστερά διαστάσεων 2,78 × 2,00
cm. Διεύρυνση υπαραχνοειδούς χώρου.
Εικόνα 2. Υπολογιστική Τομογραφία (CT). Υπόπυκνη
αλλοίωση: περιοχή της κεφαλής του αριστερού κερκοφόρου πυρήνα του προσθίου τμήματος του συστοίχου
φακοειδούς και του προσθίου σκέλους της έσω κάψας.
δεν συμμετείχε πλήρως στην κίνηση, ενώ για τη
σύλληψη αντικειμένων υπήρχε σαφής προτίμηση
στο αριστερό άνω άκρο.
Από το συνήθη εργαστηριακό έλεγχο, η Γενική Εξέταση Αίματος, η Γενική Ούρων, η CRP
και οι βιοχημικές εξετάσεις ήταν φυσιολογικές.
Το Εγκεφαλονωτιαίο Υγρό (ΕΝΥ) ήταν άχρωμο, διαυγές, με 33 κύτταρα/μL (μικρή αύξηση για την ηλικία του ασθενή), Λεύκωμα: 64 mg/
dL και Γλυκόζη 35 mg/dL. Η καλλιέργεια ΕΝΥ
ήταν αρνητική.
Από τον απεικονιστικό έλεγχο, που έγινε αμέσως μετά την εισαγωγή του παιδιού στη Νευρολογική Κλινική, Υπερηχογράφημα (Εικόνα 1)
και Υπολογιστική Τομογραφία εγκεφάλου (Ει-
κόνα 2), προέκυψαν ενδείξεις ισχαιμικού εμφράκτου στην περιοχή των βασικών γαγγλίων αριστερά και συγκεκριμένα στον κερκοφόρο πυρήνα και το πρόσθιο σκέλος της έσω κάψας. Με τη
Μαγνητική Τομογραφία (Εικόνα 3) επιβεβαιώθηκε η διάγνωση και με τη Μαγνητική Αγγειογραφία εντοπίσθηκε το σημείο της βλάβης (Εικόνα 4).
Ακολούθησαν εξετάσεις για διερεύνηση
των συνήθων παραγόντων κινδύνου εγκεφαλικού εμφράκτου στα παιδιά. Από τον έλεγχο για
θρομβοφιλία δεν προέκυψε παθολογικό εύρημα (Πίνακας 1). Η καρδιακή λειτουργία μετά από ακρόαση, μέτρηση αρτηριακής πίεσης, ηλεκτροκαρδιογράφημα και υπερηχογραφία (2D-
Εικόνα 3. Μαγνητική Τομογραφία (ΜRI). Υπόπυκνη
αλλοίωση στην Τ1 ακολουθία: απεικονίζεται στα βασικά γάγγλια (κερκοφόρος πυρήνας) με συνοδό εικόνα ισχαιμίας στο σύστοιχο ημισφαίριο.
Εικόνα 4. Mαγνητική Αγγειογραφία (ΜRA). Διακοπή της συνέχειας στην πορεία της αριστερής μέσης εγκεφαλικής αρτηρίας με δημιουργία παράπλευρου δικτύου.
Περίοδος B’, Τόμος 17, Τεύχος 1, 2012
Πίνακας 1. Έλεγχος θρομβοφιλίας.
Αδρός έλεγχος αιμόστασης
Χρόνος θρομβίνης (ΤΤ)
14,1 sec
Χρόνος προθρομβίνης (ΡΤ)
12,1 sec
Μερική θρομβοπλαστίνη (ΑΡΤΤ) 31,1 sec
Φ.Τ.
11-16 sec
10-14 sec
20-39 sec
Μέτρηση επιπέδων παραγόντων
Ιωδογόνο
Παράγοντας VIII
Παράγοντας ΧΙΙ
vWFAg
252 mg%
52%
82%
193%
200-400 mg%
50-150%
50-150%
50-150%
Μέτρηση φυσικών ανασταλτών
Αντιθρομβίνη ΙΙΙ (ΑΤΙΙΙ) Πρωτεΐνη C
Πρωτεΐνη S (ελεύθερη)
108%
62%
79%
80-120%
60-140%
60-140%
Μέτρηση επίκτητων ανασταλτών
Αντιπηκτικό Λύκου
ΑΡΝΗΤΙΚΟ
Μέτρηση παραμέτρων ινωδόλυσης
D-Dimmers
Πλασμινογόνο (Pig)
ΡΑΙ
0,2μ2/mL <=0,2 mg/mL
76%
80-120%
3,9 U/mL <3,5 U/mL
Ειδικές εξετάσεις
APC Resistance-V
3,0
2-4
Μοριακός έλεγχος θρομβοφιλίας
Factor V Leiden (PCR)
Prothrombin 2021 (PCR)
ΜΤΗFR (PCR)
ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟ
ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟ
ΕΤΕΡΟΖΥΓΟ
ECHO), εκτιμήθηκε ως φυσιολογική. Μεταβολικό νόσημα αποκλείστηκε γιατί οι τιμές του γαλακτικού και του πυροσταφυλικού οξέος, της ομοκυστεΐνης και της λιποπρωτεΐνης-α μετρήθηκαν σε φυσιολογικά όρια. Από τους λοιμογόνους
παράγοντες αναζητήθηκαν αντισώματα έναντι
του VZV και, λόγω της ηλικίας του βρέφους, α-
37­
ντισώματα για συγγενείς λοιμώξεις. Τα αποτελέσματα του ορολογικού ελέγχου αναγράφονται
στον Πίνακα 2. Μόνο θετικό εύρημα και ένδειξη
λοίμωξης ήταν η παρουσία αντισωμάτων έναντι
του ιού του απλού έρπητα (HSV): IgM 24 U/mL,
και IgG 12 U/mL. Για την επιβεβαίωση του ευρήματος αυτού ζητήθηκε νέο δείγμα ορού το οποίο εξετάστηκε ταυτόχρονα με το πρώτο. Χρησιμοποιήθηκε ανοσοενζυμική τεχνική με αντιδραστήρια της εταιρείας ΝοvaTec, με τα οποία
προσδιορίζονται αντισώματα έναντι HSV τύπων
1 και 2 μαζί. Όριο πάνω από το οποίο θεωρείται
θετική η τιμή IgM και IgG είναι οι 11 U/mL (αμφίβολη: 9-11 U/mL). Το δεύτερο δείγμα έδειξε
αύξηση τόσο στην τιμή της IgM όσο και της IgG
(34 και 23 U/mL αντίστοιχα).
Η αναζήτηση γονιδιώματος του HSV στον
ορό και το ΕΝΥ, που έγινε με Real Time PCR
στο LightCycler 2,0 και με αντιδραστήρια της εταιρείας Roche, έδειξε παρουσία του HSV τύπου
2 μόνο στο ΕΝΥ (1,7 × 104 αντίγραφα / mL).
Kατά τον ανοσολογικό έλεγχο, ο ρευματοειδής παράγων (RF) ήταν αυξημένος (108 ΙU/
mL) και τα αντισώματα έναντι καρδιολιπίνης (ACA IgG, IgM), πυρήνος (ANA) και β2γλυκοπρωτεΐνης (β2GOP IgG, IgM) αρνητικά. Από τον υπολογισμό των ανοσοσφαιρινών
στον ορό και στο ΕΝΥ (Ιndex: 1,63, φτ <0,8) διαπιστώθηκε παραγωγή IgG εντός του Κεντρικού
Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ) και δυσλειτουργία
του αιμοεγκεφαλικού φραγμού (Πίνακας 3 και
Εικόνα 5).
Οι ειδικές εξετάσεις για την εκτίμηση της βαρύτητας και την πρόγνωση του εμφράκτου ήταν
παθολογικές: η Ειδική Ενολάση Νευρώνων (NSE)
μετρήθηκε στο πρώτο δείγμα ορού της 10ης ηΠίνακας 2. Έλεγχος αντισωμάτων για λοιμώξεις.
CMV
Toxoplasma
Ερυθράς
HSV
RPR
IgG 142 U/mL
IgG (–)
IgG (–)
IgG 12 U/mL
αρνητική
IgM (–)
IgM (–)
IgM (–)
IgM 14 U/mL
VZV
IgG (–)
IgM (–)
38 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία­
Πίνακας 3. Ανοσοσφαιρίνες / αλβουμίνη ΕΝΥ και
ορού.
Εξέταση
Τιμή
Φυσιολογικά όρια
IgG ορού
IgA ορού
IgM ορού
Αλβουμίνη ορού
IgG ΕΝΥ
ΙgA ΕΝΥ
IgM ΕΝΥ
Aλβουμίνη ΕΝΥ
525
18
81
4600
9,31
0,16
1,08
50
590-1618 mg/dl
72-400 mg/dl
40-235 mg/dl
3400-5120 mg/dl
1,2-6,3 mg/dl
0,15-0,6 mg/dl
0,01-0,5 mg/dl
11-27 mg/dl
Index: 1,63
μέρας της νόσου 14,28 και σε δεύτερο, ένα μήνα αργότερα, 19,25 μg/L (φτ <12,5 μg/L). Το Ειδικό Νευροπεπτίδιο S-100b στο πρώτο δείγμα ήταν
0,48 και στο δεύτερο 0,71 μg/L (φτ <0,125 μg/L).
O ασθενής πήρε ακυκλοβίρη (60 mg/Kgr)
για τρεις εβδομάδες και εμφάνισε σαφή βελτίωση. Eνάμιση χρόνο μετά και με τη βοήθεια φυσικοθεραπευτικής αγωγής παραμένει κλινική εικόνα ήπιας σπαστικής ραιβοϊπποποδίας στο δεξιό
κάτω άκρο ως εναπομείναν εστιακό νευρολογικό έλλειμμα εξαιτίας βλάβης του ανώτερου κινητικού νευρώνα.
Συζήτηση
Το ΙΕΕ της παιδικής ηλικίας, αν και σπάνιο,
συχνά αποτελεί μια πολύ επικίνδυνη νοσολογική οντότητα με υψηλή θνητότητα, βαριά νευρολογικά κατάλοιπα ή σοβαρές συνέπειες στην ψυχοκινητική ανάπτυξη του παιδιού3.
Οι παράγοντες κινδύνου του ΙΕΕ των παιδιών διαφέρουν από των ενηλίκων, που είναι υπέρταση, υπερλιπιδαιμία διαβήτης, κάπνισμα
κ.ά. Στα παιδιά παράγοντες κινδύνου θεωρούνται συγγενείς καρδιαγγειακές ανωμαλίες, βλάβη αγγείων μετά από τραυματισμό, νευρολογικά
σύνδρομα, μεταβολικά νοσήματα, λοιμώξεις και
λήψη φαρμάκων1. Σε ένα μεγάλο ποσοστό (58%)
επιβαρυντικός ή αιτιολογικός παράγων δεν εντοπίζεται4. Από τις λοιμώξεις, ως αίτια θεωρού-
IgGc/IgGs*1000
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
25
30
Albc/Albs*1000
Εικόνα 5. Γραφική παράσταση σύνθεσης ανοσοσφαιρινών (πρόγραμμα νεφελομετρικού αναλυτή Boering).
νται η εγκεφαλίτιδα και η μηνιγγίτιδα, έχουν όμως ενοχοποιηθεί και η σήψη, το σύνδρομο επίκτητης ανοσολογικής ανεπάρκειας και το ουραιμικό – αιμολυτικό σύνδρομο1. Από τους λοιμογόνους παράγοντες έχει αποδειχθεί η σχέση του
VZV με το ΙΕΕ, ωστόσο έχουν ανιχνευθεί στο ΕΝΥ πασχόντων και άλλοι ιοί (εντεροϊοί, parvo
B19, ιός της ιαπωνικής εγκεφαλίτιδας), βακτήρια (Borrelia burgdoferi, Mycoplasma pneumonia,
Bartonella henselae, Mycobacterium tuberculosis)
και μύκητες (Aspergillus, Coccidioides immitis,
Candida species, Cryptococcus neoformans)2.
Στην περίπτωση που περιγράφεται στο άρθρο αυτό, δεν βρέθηκαν ειδικά έναντι VZV IgG
και IgM αντισώματα. Στο πλαίσιο όμως του ορολογικού ελέγχου για συγγενείς λοιμώξεις βρέθηκαν στο πρώτο δείγμα ορού θετικά τα IgM και
IgG αντι-ΗSV αντισώματα και στο δεύτερο δείγμα παρατηρήθηκε αύξηση της τιμής τους, γεγονός που αποτελεί σαφή ένδειξη λοίμωξης. Οι μετρήσεις ολικής IgG στον ορό και το ΕΝΥ (Index:
1,63) έδειξαν τοπική παραγωγή και επομένως
λοίμωξη στο ΚΝΣ. Με την PCR ανιχνεύτηκε ο
HSV τύπου 2 στο ΕΝΥ, όχι όμως και στον ορό
του ασθενή. Αυτό πιθανώς να οφείλεται στο ότι όταν έγινε ο έλεγχος είχε περάσει η φάση της
ιαιμίας, ο ιός είχε εγκατασταθεί στο ΚΝΣ όπου
πολλαπλασιάστηκε και προκάλεσε τις βλάβες.
Δεν είναι γνωστός ο μηχανισμός με τον οποίο ο
HSV-2 προκάλεσε το ΙΕΕ. Οι αναφορές αναλό-
Περίοδος B’, Τόμος 17, Τεύχος 1, 2012
γων περιστατικών στη βιβλιογραφία είναι ελάχιστες και αφορούν ενήλικες ασθενείς5. Για τον
παιδιατρικό πληθυσμό αποτελεί ερώτημα αν το
εύρος των εκδηλώσεων λοίμωξης από HSV περιλαμβάνει και το ΙΕΕ6. Στηριζόμενοι σε μελέτες
που αφορούν περιπτώσεις ΙΕΕ από VZV7-10 πιθανολογούμε ότι ο μηχανισμός είναι ίδιος με αυτόν που προκαλεί ο VZV θρομβωτικά έμφρακτα
στο ΚΝΣ: αγγειίτιδα από ανοσοσυμπλέγματα
στο ενδοθήλιο των αγγείων του εγκεφάλου11-13.
Η χρησιμότητα της μέτρησης στο αίμα των
δεικτών καταστροφής γλοιαδινικών κυττάρων
και νευρώνων αποτελεί θέμα αντιγνωμιών14. Η
Ειδική Ενολάση Νευρώνων (ΝSE) καθώς και το
Ειδικό Νευροπεπτίδιο 5-100b από πολλούς μελετητές θεωρούνται αξιόπιστοι προγνωστικοί
δείκτες15,16. Στη δική μας περίπτωση, αν και οι
δύο δείκτες βρέθηκαν σε αρκετά υψηλά επίπεδα,
ο ασθενής μας είχε καλή πορεία. Αυτό σημαίνει
ότι το ΙΕΕ στα παιδιά θα πρέπει να μελετηθεί περισσότερο για να αξιολογηθούν ακριβέστερα και
οι δείκτες βαρύτητας και πρόγνωσης.
Κατά τον έλεγχο για αυτοάνοσα νοσήματα,
ο Ρευματοειδής Παράγων (RF) ήταν αυξημένος.
Επειδή κανένα άλλο εύρημα δεν έδειξε συμμετοχή αυτοάνοσου μηχανισμού και η έκβαση του
νοσήματος ήταν καλή με τη χορήγηση μόνο ακυκλοβίρης, θεωρούμε ότι η αύξηση του RF οφείλεται στο ιογενές νόσημα του ασθενή17.
Η συμβολή των λοιμώξεων στη δημιουργία
και την εξέλιξη, άρα και την πρόγνωση, του ΙΕΕ
απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Οι σχετικές μελέτες που έχουν ως τώρα δημοσιευτεί αφορούν ενήλικες ή υπερήλικες. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των μελετών αυτών, κανένας μικροοργανισμός από όσους ελέγχθηκαν, δεν φάνηκε από
μόνος του να αποτελεί παράγοντα κινδύνου ΙΕΕ.
Αντίθετα έχει τεκμηριωθεί ότι η «συγκεντρωτική
επιβάρυνση» από λοιμώξεις του αναπνευστικού
(aggregate burden index) του παρελθόντος σχετίζεται με αύξηση κινδύνου για ΙΕΕ. Την πολλαπλή ή συνδυασμένη χρόνια έκθεση σε λοιμογόνους παράγοντες (π.χ. αίτια άτυπης πνευμονίας)
οι ερευνητές στήριξαν στην ύπαρξη IgG αντισωμάτων έναντι των μικροοργανισμών18-21.
39­
Η περίπτωση που παρουσιάζεται στο άρθρο
αυτό και η μελέτη της σχετικής βιβλιογραφίας έδειξαν ότι, όταν αντιμετωπίζουμε ΙΕΕ σε παιδί, θα
πρέπει να ελέγχονται και λοιμώξεις μεταξύ των
άλλων γνωστών αιτιολογικών παραγόντων, ώστε
να χορηγείται το συντομότερο η ειδική αγωγή.
Διεύθυνση Επικοινωνίας:
Μαρία Γιαννάκη
Μικροβιολογικό Εργαστήριο
Νοσοκομείο Παίδων «Η Αγία Σοφία»
Παπαδιαμαντοπούλου και Θηβών 115 27
Summary
HSV-2 and ischemic stroke in an infant
M. GIANNAKI1, G. GEORGOULIS2,
K. TSAPROUNI1, E. PETRIDOU1,
V. SΥRIOPOULOU3, A. PANGALIS1
1. Department of Microbiology,
2. Clinic of Neurology and
3. Department of Infection Diseases,
“Agia Sophia” Athens Children’s Hospital
Applied Clinical Microbiology
The contribution of infectious agents in the
occurrence of arterial ischemic stroke (AIS) is not
completely explained. Although Varicella has been
identified as one potential risk factor for AIS during childhood, increasing evidence indicate that
the “burden” of multiple past infections rather
than only one single infectious disease is associated with the risk of stroke. A five month old boy
developed an acute right-hemiparesis without
previous signs of infection. Routine haematology,
biochemistry, metabolic and coagulation profile
were normal. Cardiac evaluation was unremarkable. Presence of HSV IgM as well as elevation of
IgG were detected in his serum by ELISA while
presence of HSV-2 DNA was detected in CSF by
Real Time PCR. CSF protein and glucose were
normal and WBC 33/mL. Cranial US, CT and
40 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία­
MRI revealed an hemorrhagic infract in the left
basal ganglia. MRA showed a flow interruption of
the left middle cerebral artery. Acyclovir was given
(60 mgr./kgr) for three weeks. One and a half year
after, there was only a clinical image of right mild
spastic equinovarus deformity as a remnant result
of upper motor neuron lesion.
(Key words: HSV-2, arterial ischemic stroke (AIS),
childhood).
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
1.Sträter R, Becker S, Eckardstein A von, Heinecke A, Gutsche S, R Junker R, Kurnik K,
Schobess R, Nowak-Göttl U. Prospective assessment of risk factors for recurrent stroke during
childhood – a 5- year follow-up study. The Lancet
2002, 360: 1540-1545.
2.Riou EM, Amlie-Lefond C, Echenne, Farmer
M, Sébire C. Cerebrospinal Fluid Analysis in the
Diagnosis and Treatment of Arterial Ischemic
Stroke. Pediatric Neurology. 2008, 38(1): 1-9.
3.de Veber G, MacGregor D, Curtis R, Mayank
S. Neurologic outcome in survivors of childhood
arterial ischemic stroke and sinovenous thrombosis. J Child Neurol 2000, 15: 316-324.
4.Gökben S, et al. Arterial Ischemic Stroke in
Childhood: Risk Factors and Outcome in Old
Versus New Era, J of Child Neurology 2007, 22:
1204-1208.
5.Zepper P, et al. Pearls and Oy-sters: Cerebral
HSV-2 vasculitis presenting as hemorrhagic
stroke followed by multifocal ischemia. Neurology 2012, 78: e12-e15.
6.Elbers JM, et al. A 12-Year Prospective Study of
Childhood Herpes Simplex Encephalitis: Is There
a Broader Spectrum of Disease? Pediatrics 2007,
119: e399-e407.
7.Miravet E, Danchaivijjtr N, Basu H, Saunders
DE, Ganesan V. Clinical and radiological features
of childhood cerebral infraction following varicella zoster virus infection. Development Medicine
and Child Neurology 2007, 49: 417-422.
8.Askalan R, et al. Chickenpox and Stroke in
Childhood Stroke. 2001, 32: 1257-1262.
9.Gilden DH, et al. Two patients with Unusual
Forms of VZV Vasculopathy. New Engl J of Med
347: 1500-1503.
10.Melanson M, et al. VZV DNA in CSF and arteries in delayed contralateral hemiplegia: Evidence
for viral invation of cerebral arteries. Neurology
1996, 47: 569-570.
11.Alehan FK, Boyvat F, Baskin E, Derbent M,
Özlek N. Focal cerebral vasculitis and stroke after chickenpox. Europ J of Paediatric Neurology
2002, 6: 331-333.
12.Ganesan V, Kirkhan FJ. Mechanisms of ischaemic stroke after chickenpox Archives of Disease in Childhood. 1997, 76: 522-525.
13.Elkind M. Inflamatory Mechanisms of Stroke.
Stroke 2010: S3-S8.
14.Geiger S, et al. Nucleosomes as a new prognostic
marker in early cerebral stroke. J Neurol 2007,
254(5): 617-623.
15.Missler U, Wiesmann M, Friedrich C, Kaps M.
S-100 Protein and Neuron-Specific Enolase Concentrations in Blood as Indicators of Infraction
Volume and Prognosis in Acute Ischemic Stroke.
Stroke 1997, 28: 1956-1960.
16.Wunderlich MT, Wallesch CW, Goertler M. Release of neurobiochemical markers of brain damage is related to the neurovascular status on admission and the site of arterial occlusion in acute ischemic stroke. J Neurol Sci 2004, 15: 227 (1): 49-53.
17.Παυλίτου - Τσιόντου Αικ. Εργαστηριακή Διάγνωση Αυτοάνοσων Ρευματικών Νοσημάτων,
Κλινική σημασία Eφ Κλιν Μικροβιολ Εργ Διαγν
1998, 3(2): 67-81.
18.Ngeh J, Goodbourn C. Chlamydia pneumonia,
Mycoplasma pneumonia and Legionella pneumophila in Elderly Patients with Stroke (c-PEPS,
M-PEPS, L-PEPS): a case-control study on the infectious burden of atypical respiratory pathogens
in elderly patients with acute cerebrovascular disease. Stroke. 2005, 36: 259-263.
19.Ngeh J, Goodbourn C. Coxiella burnetii and
Atypical Respiratory Infectious Burden in Stroke.
Stoke 2006, 37: 1356.
20.Crau AJ, Urbanek C, Palm F. Common infections and the risk of stroke. Nat Rev Neurol. 2010,
6(12): 681-694.
21.Elkind MS, Ramakrishman P, et al. Infection
burden and risk of stroke: the northern Manhattan study. Arch Neurol 2010, 67(1): 33-38.
Υποβλήθηκε: 10/01/2012
Εγκρίθηκε: 20/02/2012
Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία
και Εργαστηριακή Διαγνωστική
Περίοδος Β’, Τόμος 17, Τεύχος 1, σελ. 41-43
2012
ΤΕΧΝΙΚΗ
Η ΧΡΩΣΗ «ZIEHL - NEELSEN»
ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ ΒΕΛΕΝΤΖΑ, ΕΥΣΤΑΘΙΑ ΛΙΑΚΟΥ
Η χρώση Ziehl-Neelsen αποτελεί απλή τεχνική διάγνωσης μυκοβακτηριδιακής λοίμωξης. Είναι σύντομη (20 min), οικονομική διαδικασία, η οποία δίνει τη δυνατότητα όχι μόνο ανίχνευσης των μολυσματικών περιπτώσεων φυματίωσης, αλλά και παρακολούθησης της ανταπόκρισης της θεραπείας και κατά
συνέπεια της άρσης τυχόν μέτρων μόνωσης που έχουν εφαρμοστεί. Βασίζεται στην ικανότητα δέσμευσης της φουξίνης στο πλούσιο σε λιπίδια κυτταρικό τοίχωμα των μυκοβακτηριδίων.
(Λέξεις ευρετηρίου: φυματίωση, οξεάντοχη χρώση, Ziehl-Neelsen).
Εισαγωγή
Στο κείμενο που ακολουθεί αναφέρεται η
χρώση Ziehl – Neelsen (ZN), η οποία αποτελεί
την κλασική, εύκολη και οικονομική μικροβιολογική εξέταση διάγνωσης της φυματίωσης στη
δύσκολη οικονομική συγκυρία της εποχής. Είναι
δυνατόν να εφαρμοστεί σε οποιοδήποτε μικροβιολογικό εργαστήριο, ακόμη και σε εργαστήριο
ενός κέντρου πρωτοβάθμιας περίθαλψης. Δεν
χρειάζεται εξειδικευμένο προσωπικό, ούτε και ειδικό ή ακριβό εξοπλισμό. Είναι ιδιαίτερα πολύτιμη σε περιπτώσεις πνευμονικής φυματίωσης, όπου η πιθανότητα διασποράς μυκοβακτηριδίων
είναι μεγάλη. Η χρώση ZN χρησιμοποιείται επίσης και για την παρακολούθηση της θεραπείας,
καθόσον μετά την έναρξη της αντιφυματικής αΜικροβιολογικό Τμήμα «Σισμανόγλειο» Γ.Ν.Α.
γωγής αρνητικοποιούνται πρώτα οι αρκετά χρονοβόρες καλλιέργειες λόγω αδυναμίας διαίρεσης
των μυκοβακτηριδίων, αλλά παραμένει η δυνατότητα σύνδεσης του κυτταρικού τοιχώματος με
τη χρωστική. Η ελάττωση του αριθμού των μυκοβακτηριδίων συνηγορεί υπέρ της επιτυχημένης θεραπευτικής αντιμετώπισης. Η ευαισθησία
της εξέτασης κυμαίνεται από 25-75% και εξαρτάται από πολλούς παράγοντες, σημαντικότεροι των οποίων είναι ο τύπος και η ποιότητα του
δείγματος, ο αριθμός των μυκοβακτηριδίων, η επίπτωση και η σοβαρότητα της νόσου.
Χρώση Ziehl – Neelsen
Αρχή τεχνικής: Είναι η μοναδική και σταθερή ικανότητα δέσμευσης της φουξίνης στα λιπίδια του κυτταρικού τοιχώματος των μυκοβακτηριδίων και η αδυναμία απομάκρυνσης της χρω-
42 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία­
στικής με διάλυμα οξινισμένης αλκοόλης. Η παραπάνω ιδιότητα μαζί με το χαρακτηριστικό σχήμα των μυκοβακτηριδίων και την κλινική εικόνα
του ασθενούς επιβεβαιώνει τη διαγνωστική σκέψη του ιατρού για μυκοβακτηριδιακή λοίμωξη.
Αντιδραστήρια
Βασική φουξίνη (Fuchsin Basic powder)
Κρύσταλλοι Φαινόλης (Phenol crystals)
Αιθυλική αλκοόλη (denaturated 95% ethanol)
Αποσταγμένο νερό (Distilled water)
Πυκνό Υδροχλωρικό οξύ (Hydrochloric acid
37%)
Κυανούν του μεθυλενίου (Methylene Blue
powder)
Γ. Δ
ιάλυμα μεταχρωματισμού – Κυανούν του
μεθυλενίου 0,3%
Για 1 λίτρο χρωστικής χρειάζονται:
Κυανούν του μεθυλενίου 3gr
Αποσταγμένο νερό 1000 ml
Ετοιμασία: Προστίθεται το κυανούν του μεθυλενίου σε 500 ml αποσταγμένου νερού σε κωνική
φιάλη. Η φιάλη ανακινείται μέχρι να διαλυθεί η
σκόνη. Προστίθεται το υπόλοιπο νερό. Ακολουθεί νέα ανακίνηση.
Διατήρηση των αντιδραστηρίων
Διαλύματα
Σημειώνεται πάνω στις φιάλες η ημερομηνία
παρασκευής των αντιδραστηρίων. Οι φιάλες είναι σκοτεινές και διατηρούνται μακριά από το ηλιακό φως για ένα έτος.
Α. Βασική φουξίνη 0,3%
Ποιοτικός έλεγχος
Για 1 λίτρο χρωστικής χρειάζονται:
Bασική φουξίνη 3 gr
Aιθυλική αλκοόλη 95% 100 ml
Kρύσταλλοι φαινόλης 50 gr
Aποσταγμένο νερό 900 ml
Ετοιμασία χρωστικής φαινικούχου φουξίνης: Ζυγίζεται χωριστά η βασική φουξίνη και η φαινόλη.
Τοποθετείται η αιθυλική αλκoόλη σε κωνική φιάλη, προστίθεται η φαινόλη και ανακινείται μέχρι να διαλυθεί. Προστίθεται και η φουξίνη. Συνεχίζεται η ανακίνηση, μέχρι να διαλυθεί η φουξίνη τελείως. Όταν διαλυθεί πλήρως –και μόνο
τότε– προστίθεται το νερό. Ακολουθεί διήθηση.
Για κάθε παρτίδα αντιδραστηρίων καταγράφονται: η ημερομηνία παρασκευής, το όνομα και
η υπογραφή του τεχνολόγου, καθώς και το αποτέλεσμα του ποιοτικού ελέγχου. Προτείνεται να
δοκιμάζονται δύο θετικά δείγματα μια φορά και
δυο αρνητικά τρεις φορές.
Β. Διάλυμα αποχρωματισμού
(οξινισμένη αλκοόλη 3%)
Υδροχλωρικό οξύ, HCL 37%, 30ml
Αιθυλική αλκοόλη 970 ml
Τοποθετείται η αιθυλική αλκοόλη σε κωνική φιάλη. Προστίθεται το HCL αργά-αργά στο τοίχωμα της φιάλης ανακινώντας σταθερά. Προσοχή: προστίθεται πάντα το οξύ στην αλκοόλη, ποτέ αντίθετα.
Στάδια της χρώσης
1. Τα παρασκευάσματα καλύπτονται με φαινικούχο φουξίνη και θερμαίνονται μέχρι να εκλυθούν υδρατμοί. Παραμένουν για δέκα λεπτά.
2. Α
κολουθεί ξέπλυμα με κρύο νερό βρύσης, μέχρι να απομακρυνθεί όλη η χρωστική.
3. Σ
τη συνέχεια τα παρασκευάσματα αποχρωματίζονται με το διάλυμα αποχρωματισμού για
τρία λεπτά.
4. Α
κολουθεί προσεκτικό ξέπλυμα με νερό βρύσης.
5. Μ
ε τη βοήθεια λαβίδας δίνεται κλίση σε κάθε πλακάκι προκειμένου να απομακρυνθεί όλο το νερό.
6. Π
ροστίθεται το διάλυμα μεταχρωματισμού
(κυανούν του μεθυλενίου) για πέντε λεπτά.
Περίοδος B’, Τόμος 17, Τεύχος 1, 2012
7. Ξ
επλένονται τα παρασκευάσματα με νερό.
8. Σ
τεγνώνουν στον αέρα και μικροσκοπούνται.
Διεύθυνση Επικοινωνίας:
Αικατερίνη Βελέντζα
«Σισμανόγλειο» Γ.Ν.Α.
Τηλ.: 213 2058769
E-mail: [email protected]
Summary
The Ziehl Neelsen stain
AIK. VELENTZA, EUST. LIAKOU
Departement of Microbiology
“Sismanoglion” General Hospital, Athens
Applied Clinical Microbiology
The Ziehl – Neelsen stain has been used for
acid fast bacteria detection for many years. It is a
simple and inexpensive method, which can be used
in any laboratory. The technique is based on the
fact that the mycobacterial cell wall is rich in lipids. The method is used not only for the Tb diag-
43­
nosis, but also to the monitoring level. The sensitivity of the smear microscopy is mainly depended
on the type and quality of the specimen as well as
on the prevalence and the severity of the disease.
(Key words: Tuberculosis, Ziehl – Neelsen stain).
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
1.Mastering the basics of Tb control. Development of a handbook on TB diagnostic methods.
Technical report .www.ecdc.europa.eu.
2.Winn Jr W, Allen S, Janda W, Koneman E, Procop G, Schreckenberger P,Woods G. In Koneman’s Color Atlas and Textbook of diagnosic Microbiology “Mycobacteria” . 6th Edition, Lippincott Williams &Wilkins, chapter 19, p. 1065-1124,
2006.
Το παραπάνω πρωτόκολλο ακολουθείται στο Μικροβιολογικό Τμήμα του «Σισμανογλείου» Γ.Ν.Α. σύμφωνα και με τις υποδείξεις του ECDC, υπό την επίβλεψη της διευθύντριας βιοπαθολόγου, κλινικής μικροβιολόγου κας Κανελλοπούλου Μαρίας.
Υποβλήθηκε: 10/01/2012
Εγκρίθηκε: 20/02/2012
ANAKOINΩΣH
Η Ιατρική Εταιρεία Αθηνών οργανώνει το 38ο Ετήσιο Πανελλήνιο Ιατρικό Συνέδριο στο
ξενοδοχείο Hilton, από 16 ως 19 Μαΐου 2012.
Το Συνέδριο περιλαμβάνει Διαλέξεις, Διεταιρικές Συζητήσεις, Στρογγυλά Τραπέζια,
Συμπόσια, Κλινικά Φροντιστήρια, Σεμινάρια και Ελεύθερες Ανακοινώσεις
Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία
και Εργαστηριακή Διαγνωστική
Περίοδος Β’, Τόμος 17, Τεύχος 1, σελ. 44-45
2012
ΡΩ­ΤΟ­ΥΜΕ - ΑΠΑ­Ν­ΤΟ­ΥΜΕ - ΜΑΘ­ΑΙ­Ν­Ο­ΥΜΕ
Ερώτηση 1η
Αναφορικά με την πρόληψη της νοσοκομειακής μετάδοσης της φυματίωσης ποια πρόταση είναι λάθος;
Α. Οι ασθενείς με φυματίωση μπορούν να νοσηλεύονται στον ίδιο θάλαμο με ασθενείς που πάσχουν από άλλο νόσημα, υπό την προϋπόθεση απόστασης μεταξύ των κλινών μεγαλύτερης
του ενός μέτρου.
Β. Ε
άν χρειαστεί μεταφορά ασθενούς με φυματίωση εντός του νοσοκομείου θα πρέπει να ενημερωθεί το τμήμα υποδοχής.
Γ. Απαιτείται έλεγχος του ιατρονοσηλευτικού προσωπικού που εκτέθηκε σε ασθενή με φυματίωση και ενδεχομένως χορήγηση προφυλακτικής αγωγής.
Δ. Ε
άν το ιατρονοσηλευτικό προσωπικό έχει ιστορικό ενεργού φυματίωσης στο παρελθόν, δεν
χρειάζεται να χρησιμοποιεί μάσκα υψηλής αναπνευστικής προστασίας.
Ερώτηση 2η
Ασφαλής συντήρηση μαγειρεμένων τροφίμων γίνεται σε θερμοκρασία:
Α. 10° C
Β. 35° C
Γ. >60° C
Δ. Θερμοκρασία βρασμού
Ερώτηση 3η
Η πρόληψη της νόσου των λεγεωναρίων στα νοσοκομεία γίνεται με:
Α. Αύξηση της θερμοκρασίας του νερού >60° C
Β. Συστηματικό καθαρισμό των πύργων ψύξης
Γ. Συντήρηση των μηχανικών εγκαταστάσεων
Δ. Όλα τα ανωτέρω
Περίοδος B’, Τόμος 17, Τεύχος 1, 2012
45­
Ερώτηση 4η
Ποια είναι σωστά;
Α. Το άκαρι της ψώρας μεταδίδεται με τους ψύλλους και εμφανίζεται συνήθως σε άτομα που ζουν
κάτω από πολύ κακές συνθήκες υγιεινής
Β. Τ
ο κουνούπι του είδους Anopheles σε θερμοκρασίες κάτω από 13°C και πάνω από 33°C δεν
μπορεί να μεταδώσει το πλασμώδιο λόγω αδυναμίας ωοτοκίας
Γ. Η αμερικάνικη τρυπανοσωμίαση μεταδίδεται με τα περιττώματα του κοριού κατά τον κνησμό
που προκαλείται μετά από το δήγμα
Δ. Τ
α τσιμπούρια μεταδίδουν τα παθογόνα μικρόβια με την έκκριση κολλώδους ουσίας που εκκρίνουν πριν από την απομύζηση
ΣΩΣΤΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΙΣ ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΤΟΥ ΠΡΟΗΓΟΥΜΕΝΟΥ ΤΕΥΧΟΥΣ
Ερώτηση 1η:
Ερώτηση 2η:
Ερώτηση 3η:
Ερώτηση 4η:
Γ.Αν η ποσότητα του δείγματος ΕΝΥ είναι ελάχιστη, προτεραιότητα κατά την
εξέταση έχουν: 1) η μέτρηση και ο τύπος των κυττάρων και 2) η μέτρηση της
γλυκόζης
Γ.Σε ασθενή με πυρετό αγνώστου αιτιολογίας προτείνεται να λαμβάνονται τρεις
αιμοκαλλιέργειες (από διαφορετικές θέσεις) με διάστημα μιας ώρας. Αν είναι
αρνητικές μετά 24 ώρες λαμβάνονται τρεις ακόμα.
Δ.Τα δείγματα πτυέλων πρέπει να μεταφέρονται ταχύτατα στο εργαστήριο και η
επεξεργασία τους να γίνεται αμέσως.
Δ.Ο σχηματισμός βιομεμβράνης εξαρτάται: από το είδος του μικροοργανισμού,
τον ξενιστή και το προσθετικό υλικό.
Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία
και Εργαστηριακή Διαγνωστική
Περίοδος Β’, Τόμος 17, Τεύχος 1, σελ. 46
2012
ΣΥΝΕΔΡΙΑ - ΣΕΜΙΝΑΡΙΑ
ΕΛΛΗΝΙΚΑ ΚΑΙ ΔΙΕΘΝΗ
25-27 Απριλίου 2012
Ταυτοποίηση Μυκήτων:
Υπεύθυνοι Διαχείρισης Ποιότητας
Μισσούρι, ΗΠΑ
www.microrite.com/Fungal_ID_April_2012.pdf
11-15 Ιουνίου 2012
18ο Συνέδριο της Διεθνούς Εταιρείας Μυκητολογίας (ISHAM 2012)
Βερολίνο, Γερμανία
www.isham2012.org/
08-12 Μαΐου 2012
30ό Ετήσιο Συνέδριο της Ευρωπαϊκής Εταιρείας
Παιδιατρικών Λοιμώξεων (ESPID)
Θεσσαλονίκη, Ελλάδα
www2.kenes.com/espid/pages/home.aspx
04-06 Ιουλίου 2012
6ο Συνέδριο της Διεθνούς Εταιρείας Καταπολέμησης Φυματίωσης και Πνευμονικών Παθήσεων
Λονδίνο, Ηνωμένο Βασίλειο
www.hpa-events.org.uk/hpa/frontend/reg/
thome.csp?pageID=56137&eventID=125&even
tID=125
15-17 Μαΐου 2012
35ο Διεθνές Συνέδριο Εταιρείας Μικροβιακής
Οικολογίας και Νόσου (SOMED)
Βαλέντσια, Ισπανία
www.somed2012valencia.com/
16-19 Μαΐου 2012
38o Ετήσιο Πανελλήνιο Ιατρικό Συνέδριο
Ξενοδοχείο Athens Hilton, Αθήνα
www.mednet.gr/app/webroot/
objects/1a7a2_5cd05_enimerotikodeltio_38.pdf
18-22 Αυγούστου 2012
30ό Παγκόσμιο Συνέδριο Βιοϊατρικής
Εργαστηριακής Επιστήμης
Berlin, Germany
www.ifbls-dvta2012.com
29 Σεπτεμβρίου-4 Οκτωβρίου 2012
6ο Συνέδριο για τα Biofilms της ASM
Μαϊάμι, Φλόριντα, ΗΠΑ
www.asm.org/conferences
Αίτηση εγγραφής μέλους της Εταιρείας Εφαρμοσμένης Κλινικής Μικροβιολογίας
και Εργαστηριακής Διαγνωστικής
Σύμφωνα με τον κανονισμό της Εταιρείας, μέλη της ΕΚΜΕΔ γίνονται ιατροί με την ειδικότητα του Μικροβιολόγου (Βιοπαθολόγου), που έχουν διδακτορική διατριβή (ή τουλάχιστον
τρεις μελέτες σε ελληνικά περιοδικά και μία σε ξενόγλωσσο) με αίτησή τους στο Διοικητικό
Συμβούλιο της Εταιρείας.
Οι Μικροβιολόγοι που επιθυμούν να γίνουν μέλη και διαθέτουν τα παραπάνω προσόντα,
μπορούν να αποστείλουν συμπληρωμένη τη σχετική Αίτηση (η οποία υπογράφεται και από
δύο παλαιότερα μέλη της Εταιρείας), μαζί με σύντομο βιογραφικό σημείωμα στη Διεύθυνση
Επιστημονικής Αλληλογραφίας του περιοδικού.
Το δικαίωμα εγγραφής είναι 10 Ευρώ εφ’ άπαξ και αποστέλλεται με ταχυδρομική επιταγή στην ίδια Διεύθυνση.
Είναι αυτονόητο ότι όλοι οι συνδρομητές του περιοδικού δεν αποτελούν αυτομάτως και
μέλη της Εταιρείας.
%
ΑΙΤΗΣΗ ΕΓΓΡΑΦΗΣ ΜΕΛΟΥΣ
Προς το
Δ.Σ. ΕΤΑΙΡΕΙΑΣ Εφ. Κλινικής Μικροβιολογίας
και Εργ. Διαγνωστικής
Παρακαλώ να εγκρίνετε την εγγραφή μου ως μέλους της Εταιρείας
ΟΝΟΜΑ: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ΕΠΩΝΥΜΟ: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ΗΜΕΡ. ΛΗΨΗΣ ειδικ.: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Εργασία (ΕΣΥ, Ελεύθ. επάγγελμα, πανεπιστήμιο)
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Θέση: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Τίτλος:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ΔΙΕΥΘΥΝΣΗ διαμονής: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Τηλέφωνο: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Fax: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Διεύθυνση εργασίας: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Τ.Κ.: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Τηλέφωνο: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Fax: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Μέλη τα οποία με προτείνουν και υπογράφουν:
1
2.

full paper - e-Περιοδικό Επιστήμης & Τεχνολογίας

7. Διαλύματα Ι

Πατήστε εδώ για να διαβάσετε την εργασία

Sustaining Value - UNEP Finance Initiative

Τα προϊόντα Udo`s Choice - Med Melon, Φυσικά Συμπληρώματα

Ranitidine/Generics

Φλεβική Ανεπάρκεια Κότσι – Νέα τεχνική αντιμετώπισης Ρινοπλαστική