ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΓΟΝΙ∆ΙΩΜΑΤΙΚΗ
ΑΝΑΣΤΡΟΦΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ (γονίδιο
φαινότυπος)
¾ Πρόσθεση εξωγενών γονιδίων (διαγονιδιακά)
¾ Τροποποίηση ενδογενών γονιδίων
• Αφαίρεση γονιδίων (knockout)
ΥΠΟΘΕΣΗ
• Στοχευμένη μεταλλαξογένεση γονιδίων
• Ελεγχόμενη έκφραση γονιδίων (conditional)
ΠΡΟΣΘΙΑ ΓΕΝΕΤΙΚΗ
(φαινότυπος
¾Τυχαία μεταλλαξογένεση
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
γονίδιο)
ΧΩΡΙΣ ΥΠΟΘΕΣΗ
Ε Ντούνη
∆ΙΑΓΟΝΙ∆ΙΑΚΑ ΖΩΑ-TRANSGENIC ANIMALS
Η διαδικασία κατά την οποία προστίθεται ένα εξωγενές γονίδιο
στο γονιδίωμα ενός οργανισμού και το γονίδιο αυτό
μεταφέρεται στους απογόνους.
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
Τεχνικές διαγένεσης σε ζώα
1.
2.
3.
4.
5.
6.
DNA microinjection
DNA transfer via a transposon
DNA transfer via a lentiviral vector
DNA transfer via sperm
DNA transfer via ES cells
DNA transfer via cloning
9∆ιαγονιδιακά ποντίκια
9∆ιαγονιδιακά κτηνοτροφικά ζώα
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
∆ημιουργία διαγονιδιακών ζώων
¾ Τεχνική μικροένεσης DNA σε προπυρήνες γονιμοποιημένων
ωαρίων
¾ Με χρήση λεντιιών
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΟΥ
Α) γονιδιωματική περιοχή
Υποκινητής
3’UTR
Β) cDNA
Υποκινητής
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
cDNA
3’UTR
Ε Ντούνη
ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΚΑΤΑΣΚΕΥΗΣ
¾Χρησιμοποιείται οποιοδήποτε κλωνοποιημένο τμήμα DNA (γενομικό, cDNA) ¾Απαραίτητη είναι η ύπαρξη τουλάχιστον ενός εσωνίου στην κατασκευή
¾Aφαιρούνται οι προκαρυωτικές αλληλουχίες των πλασμιδίων‐φορέων
ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ DNA
Απομόνωση κλώνου που περιέχει την γονιδιακή κατασκευή
Πέψη με περιοριστικές ενδονουκλεάσες
Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης
Πέψη με β‐αγαράση
Απομόνωση DNA από κολώνα
Ποσοτική εκτίμηση
Συγκέντρωση DNA: 4-6 ng/ml ( ~ 500 αντίγραφα)
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
Δημιουργία διαγονιδικών ζώων
με μικροένεση
Γιατί;
Μελέτη της υπερέκφρασης μιας πρωτεΐνης
Πως;
Ενσωμάτωση του διαγονιδίου :
τυχαία στο γονιδίωμα
Έκφραση:
(υποκινητής)
Ιστοειδική
Εκτοπική
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
• Tg : διαγονιδιακό ποντίκι
• Founder : ιδρυτής σειράς
concatemers
Ενσωμάτωση του διαγονιδίου :
τυχαία σε μία ή > θέσεις
Αριθμός αντιγράφων : ένα ή περισσότερα
Μωσαϊκισμός : 30-40% των ιδρυτών
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
H έκφραση ενός διαγονιδίου εξαρτάται από:
1. Τον υποκινητή, δηλ. αν είναι ισχυρος ή ιστοειδικός
2. Την θέση ενσωμάτωσης, που είναι πάντα τυχαία
ευχρωματίνη
ετεροχρωματίνη
έκφραση
έκφραση
BAC κλώνοι ή
Αλληλουχίες «θέσης ελέγχου περιοχών» (Locus Control region, LCR)
Επιτρέπουν έκφραση του διαγονιδίου:
1. ανεξάρτητη της θέσης ενσωμάτωσης
2. ανάλογη του αριθμού των αντιγράφων
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
Ποσοστά επιβίωσης στα διάφορα στάδια
¾Μετά από μικροένεση: 75%
200 αυγά
150 αυγά
¾Μετά την εμφύτευση: 20%
30 ποντίκια
¾Ποσοστό διαγονιδιακών: 25%
7 διαγονιδιακά
Τεχνικές ταυτοποίησης διαγονιδιακών ποντικών
A
Υβριδοποίηση
C
hu p75Υ
Slot blot
mu p55Υ
E1322
E1335
E1334
Φυσιολογικό
HL-60
Southern blot
B
PCR
Φυσιολογικό
E1334
E1335
E1322
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
Παραγωγή φαρμακευτικών πρωτεϊνών από κτηνοτροφικά ζώα
1. Επιλογή υποκινητών γονιδίων που εκφράζονται σε
κύτταρα του μαστικού αδένα π.χ. καζεΐνη, β-γαλακτοσφαιρίνη
2. Προετοιμασία διαγονιδιακής κατασκευής
3. Εισαγωγή διαγονιδίου στον προπυρήνα γονιμοποιημένου
ωαρίου με μικροένεση
4. Εμφύτευση σε θετή μητέρα
5. Ταυτοποίηση διαγονιδιακών απογόνων με PCR
6. Συλλογή γάλακτος
7. Απομόνωση και καθαρισμός φαρμακευτικής πρωτεΐνης
από το γάλα
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
Πλεονεκτήματα τεχνικής μικροένεσης
¾ ∆εν υπάρχει περιορισμός στο μέγεθος του διαγονιδίου
(μπορεί να χρησιμοποιηθούν κλώνοι BACs μεγέθους 200kb).
¾ Η έκφραση του διαγονιδίου παραμένει συνήθως σταθερή και
δεν μειώνεται από επιγενετικούς μηχανισμούς.
¾ ∆εν εμφανίζονται προβλήματα που σχετίζονται με τοξικότητα,
ενεργοποίηση του ανοσολογικού συστήματος με φλεγμονώδεις
αντιδράσεις.
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
Μειονεκτήματα τεχνικής μικροένεσης
¾ Η τυχαία ενσωμάτωση μπορεί να δημιουργήσει προβλήματα
(καταστροφή ενδογενών γονιδίων, νεοπλασίες)
¾ Χαμηλή αποτελεσματικότητα
~4% σε ποντίκια
~1% σε κτηνοτροφικά ζώα (30.000$ διαγονιδιακός χοίρος,
300.000$ διαγονιδιακή αγελάδα)
¾ Τεχνικές δυσκολίες: Το κυτταρόπλασμα των χοίρων και των
βοοειδών είναι αδιαφανές σε αντίθεση με αυτό των τρωκτικών,
κάτι που καθιστά τον εντοπισμό των προπυρήνων δύσκολο.
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
∆ημιουργία διαγονιδιακών ζώων
¾ Τεχνική μικροένεσης DNA σε προπυρήνες γονιμοποιημένων
ωαρίων
¾ Με χρήση λεντιιών: ανήκουν στους ρετροϊούς
ενσωματώνονται στο γονιδίωμα των κυττάρων στόχων
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
και
Ε Ντούνη
ΡΕΤΡΟΙΟΙ
Αποτελείται από:
•Ένα εξωτερικό φάκελο που προέρχεται από την κυτταρική μεμβράνη του κυττάρου ξενιστή
•Αρκετά αντίγραφα μιας πρωτεΐνης φακέλου που βρίσκεται στην λιπιδική διπλοστιβάδα του φακέλου
•Ένα καψίδιο; Ένα πρωτεινικό κέλυφος που περιβάλει:
• δύο μόρια RNA και
• το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση (reverse transcriptase)
Το γονιδίωμα των ρετροιών
περιβάλλεται από επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες ("R") που
• επιτρέπουν ενσωμάτωση στο γονιδίωμα του ξενιστή
• λειτουργούν ως ενισχυτής
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
∆ημιουργία διαγονιδιακών ζώων με λεντιιούς
∆ημιουργία ανασυνδυασμένου
λεντιικού φορέα που φέρει το
διαγονίδιο
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
Σύγκριση των δύο τεχνικών
Σε πολλά ζώα τα ωάρια
είναι αδιαφανή οπότε
δεν
ενδείκνυται
η
μικροένεση.
Επειδή η διαφανής ζώνη
αποτελεί φυσικό εμπόδιο
για την λεντιική μόλυνση,
ο ανασυνδυασμένος ιός
ενίεται
μεταξύ
της
κυτταρικής μεμβράνης και
της διαφανούς ζώνης.
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
Σύγκριση των δύο τεχνικών στον χοίρο
Λεντιιοί:
¾ υψηλότερα ποσοστά στον αριθμό των διαγονιδιακών χοίρων ανά αριθμό
ενεθέντων εμβρύων.
¾ υψηλότερα ποσοστά στον αριθμό των διαγονιδιακών χοίρων που
εκφράζουν το διαγονιδίο
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
Σύγκριση των δύο τεχνικών
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
Μειονεκτήματα χρήσης λεντιιών
¾Μειωμένη ικανότητα μεταφοράς μεγάλης ποσότητας γενετικού υλικού (< 8 kb).
¾Η ενσωμάτωση του ιού όπως και στην μέθοδο μικροένεσης είναι τυχαία. Άρα
πάντα υπάρχει η πιθανότητα αλλαγής στην έκφρασης ενδογενών γονιδίων
(ανάπτυξη κακοήθειας).
¾Παύση έκφρασης διαγονιδίου από επιγενετικούς μηχανισμούς.
¾Προβλήματα που σχετίζονται με τοξικότητα, έντονη
ανοσολογικού συστήματος με φλεγμονώδεις αντιδράσεις.
ενεργοποίηση
του
¾Παθογονικότητα ιού: εξακολουθεί να υπάρχει ο κίνδυνος ο ιός να αρχίσει να
αναπαράγεται
¾Όχι καλά αποσαφηνισμένη η χρονική διάρκεια παραμονής του γενετικού υλικού
στον ιστό-κύτταρο στόχο και ακόλουθη μείωση της αρχικής δραστικότητας.
¾Πρακτικά προβλήματα (οικονομικά, προβλήματα ασφάλειας).
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
Τεχνικές διαγένεσης σε κτηνοτροφικά ζώα
1.
2.
3.
4.
5.
6.
DNA microinjection
DNA transfer via a transposon
DNA transfer via a lentiviral vector
DNA transfer via sperm
DNA transfer via ES cells
DNA transfer via cloning
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
Σταθμοί στην διαγένεση και κλωνοποίηση κτηνοτροφικών
ζώων
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
Παραγωγή φαρμακευτικών πρωτεΐνών από γάλα
διαγονιδιακών ζώων
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
Παραδείγματα διαγονιδιακών ζώων
¾ Παραγωγή αντιθρομβίνης-α από διαγονιδιακές αίγες (θρόμβωση)
¾ Παραγωγή λακτοφερίνης σε αγελάδες (αντιβακτηριδιακές ιδιότητες)
¾ Παραγωγή ενζύμου αναστολέα της C1-εστεράσης (οιδήματα)
¾ Παραγωγή αντισωμάτων από αγελάδες (ανοσοανεπάρκειες)
¾ Παραγωγή λυσοζύμης σε αυγά (λοιμώξεις)
¾∆ημιουργία χοίρων που απελευθερώνουν λιγότερο φωσφόρο στο
περιβάλλον
¾ ∆ημιουργία διαγονιδιακών ψαριών για γρηγορότερη ανάπτυξη και αύξηση
βάρους
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
Παραγωγή α-αντιθρομβίνης από διαγονιδιακές αίγες
Πλεονεκτήματα
• Μεγάλη παραγωγή = 90.000 δείγματα αίματος
∆ιαγονιδιακά=2-10γρ πρωτεΐνης ανά λίτρο
Βακτήρια ή κυτταρικές σειρές= 0.2γρ πρωτεΐνης ανά λίτρο καλλιέργειας
• Κόστος
• Καθαρισμός
• Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις
Μειονεκτήματα
• Κόστος παραγωγής διαγονιδιακών ζώων
• Ευζωία των διαγονιδιακών ζώων
• Μετάδοση ασθενειών
• Αναπαραγωγή με φυσικό πληθυσμό
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
Εφαρμογές τεχνολογίας διαγονιδιακών συστημάτων
¾Μελέτη της γονιδιακής έκφρασης in vivo
¾∆ημιουργία πειραματικών μοντέλων ασθενειών του ανθρώπου
¾Ανάλυση των μοριακών, κυτταρικών μηχανισμών που εμπλέκονται στην επαγωγή
του φαινοτύπου
¾∆οκιμές νέων φαρμακευτικών ουσιών στα μοντέλα ασθενειών
¾∆ημιουργία οργανισμών με νέα βελτιωμένα χαρακτηριστικά χρήσιμα στην ιατρική
(π.χ. παραγωγή ινσουλίνης), στην κτηνοτροφία και στην γεωργία
¾Γονιδιακή θεραπεία
¾Ξενομεταμοσχεύσεις
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
Προβληματισμοί
• Μετάδοση
ασθενειών
στον
άνθρωπο
ξενομεταμοσχεύσεων (πχ. νόσος των τρελών αγελάδων)
• Ευζωίας των διαγονιδιακών
κληρονομήσιμης ασθένειας
ζώων
λόγω
μέσω
εκδήλωσης
• Αναπαραγωγή με φυσικούς πληθυσμούς
• Ασφάλεια καταναλωτών
• Ο άνθρωπος επεμβαίνει στη φύση προς ίδιον όφελος
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
Ευζωία‐Animal welfare
•
•
•
Καταστροφή εμβρύων
Η γενετική τροποποίηση δεν θα πρέπει να επιβαρύνει την υγεία και
ευζωία των ζώων
Έγκριση πειραματισμού και συνθηκών διαβίωσης από αρμόδιες
αρχές
Η βιοτεχνολογία μπορεί να οφελήσει τα ζώα:
• Ανθεκτικότητα σε ασθένειες
• Απαλλαγή από χαρακτηριστικά που συχνά προκαλούν
τραυματισμούς (πχ κέρατα)
• Εάν αναπαράγονται πιο αποτελεσματικά σε σχέση με το επιλεκτικό
ζευγάρωμα
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
Λειτουργική ανάλυση διαγονιδιακών ζώων
1. Ανάλυση της έκφρασης σε επίπεδο RNA
• RT-PCR, Northern blot,
• In situ εντοπισμός της έκφρασης σε ιστούς
2. Αναλυση της έκφρασης σε επίπεδο πρωτεΐνης
• Western blot
• Ανοσοϊστοχημεία
• Κυτταρομετρία ροής
• ELISA σε ορό
• Λειτουργικές δοκιμές
3. Φαινοτυπική ανάλυση
• Κλινικά συμπτώματα (βάρος)
• Βιωσιμότητα
• Ιστοπαθολογία
Εργαστήριο Γενετικής, ΓΠΑ
Ε Ντούνη
© Copyright 2024 Paperzz
