Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β’, Τόμος 15, Τεύχος 4, σελ. 174-188 2010 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΕΙΣ ΔΙΕΙΣΔΥΤΙΚΕΣ ΑΣΠΕΡΓΙΛΛΩΣΕΙΣ: ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΚΑΙ ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ Τ-Α. ΒΥΖΑΝΤΙΑΔΗΣ Οι ασπεργιλλώσεις αποτελούν το σημαντικότερο ποσοστό των εν τω βάθει λοιμώξεων από νηματοειδείς μύκητες. Στη σύγχρονη εργαστηριακή πρακτική φαίνεται ότι η συνδυαστική προσέγγιση με τη χρησιμοποίηση φαινοτυπικών, ορολογικών και μοριακών τεχνικών προσφέρει σαφώς καλύτερα διαγνωστικά αποτελέσματα και έγκαιρη, τεκμηριωμένη και αποτελεσματικότερη θεραπευτική αντιμετώπιση. Κοινή είναι η διαπίστωση, σε διεθνές επίπεδο, για τις ασπεργιλλώσεις, πως υπάρχει ανάγκη τυποποίησης των μεθόδων, των οδηγιών και των πρωτοκόλλων μεταξύ των μυκητολογικών εργαστηρίων. Καθώς υπάρχουν κενά ακόμα στην επιλογή και αξιολόγηση των καταλληλότερων μεθοδολογιών, χρειάζεται περαιτέρω έρευνα σε αυτόν τον τομέα. Ταυτόχρονα με τη χρήση και την αξιολόγηση των νέων τεχνικών χρειάζεται περισσότερη προσπάθεια στην εκπαίδευση του ιατρικού και λοιπού επιστημονικού προσωπικού σε θέματα της ταυτοποίησης με ακρίβεια, της άμεσης μικροσκόπησης, της επιλογής και χρήσης των κατάλληλων θρεπτικών υλικών καθώς και αξιολόγηση της κλινικής ωφέλειας και της ανταπόδοσης του κόστους από την εφαρμογή της μιας ή της άλλης μεθοδολογίας. (Λέξεις ευρετηρίου: ασπεργιλλώσεις, εργαστηριακή διάγνωση, παρακολούθηση). Εισαγωγή Το 2008 δημοσιεύθηκαν τα αναθεωρημένα κριτήρια-ορισμοί για τις διεισδυτικές μυκητιάσεις από την ομάδα των EORTC/MSG (European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Α΄ Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Ιατρική Σχολή, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης. Group). Τα κριτήρια αυτά προτάθηκαν ως οδηγός για τον ορισμό της διάγνωσης μιας διεισδυτικής μυκητίασης ως πιθανής ή αποδεδειγμένης1. Στο κείμενο αυτό, γενικά για τις διεισδυτικές μυκητιάσεις, τα μικροβιολογικά-μυκητολογικά κριτήρια, που όταν υπάρχουν κατατάσσουν τη διάγνωση ως πιθανή, είναι τα άμεσα και τα έμμεσα. Στα άμεσα περιλαμβάνονται η ανεύρεση μυκητιακών στοιχείων με την άμεση μικροσκόπηση στα πτύελα, στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, στις βρογχικές εκκρίσεις και στην αναρρόφηση υλικού από τους παραρρίνιους κόλπους ή Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 4, 2010 η ανάπτυξη ενός νηματοειδούς μύκητα σε καλλιέργεια, όπως τα είδη των Aspergillus, Fusarium, Zygomycetes και Scedosporium. Στα έμμεσα περιλαμβάνονται η ανεύρεση αντιγόνων ή συστατικών του κυτταρικού τοιχώματος· για την ασπεργίλλωση το αντιγόνο γαλακτομαννάνης στο πλάσμα, στον ορό, στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό, ενώ γενικά για τις διεισδυτικές μυκητιάσεις (εκτός των κρυπτοκοκκιάσεων και ζυγομυκητιάσεων) η (1,3)-β-D-γλυκάνη στον ορό. Ως αποδεδειγμένη από μικροβιολογικής άποψης θεωρείται μια διεισδυτική μυκητιακή λοίμωξη όταν υπάρχει παρουσία μύκητα (νηματοειδούς ή ζυγομύκητα) στη μικροσκόπηση υλικού που έχει ληφθεί με αναρρόφηση με βελόνα ή με βιοψία από φυσιολογικά στείρα περιοχή σε συνδυασμό με αντίστοιχη εικόνα νέκρωσης του ιστού σε παθολογοανατομικό παρασκεύασμα. Επίσης, όταν υπάρχει ανάπτυξη μύκητα σε καλλιέργεια υλικού που προέρχεται από φυσιολογικά στείρα περιοχή και έχει ληφθεί με αποστειρωμένο τρόπο. Ακόμα, όταν αναπτύσσονται στην καλλιέργεια αίματος νηματοειδείς μύκητες όπως οι μύκητες του γένους Fusarium, ή ζυγομύκητες όπως τα είδη Candida και τα είδη Cryptococcus και Trichosporon. Η ανάπτυξη ασπεργίλλων στην καλλιέργεια αίματος είναι δύσκολη και σπάνια και όταν συμβαίνει συνήθως θεωρείται επιμόλυνση. Έτσι σε μεγάλη 10ετή μελέτη στις Η.Π.Α. αναφέρεται ότι απομονώθηκαν μόλις 37 στελέχη ασπεργίλλων σε 300.000 καλλιέργειες αίματος και συσχετίσθηκε με κλινική ασπεργίλλωση μόνο το 34% των απομονωθέντων στελεχών2. Ορολογικά, η ανίχνευση του αντιγόνου του κρυπτοκόκκου στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό παρέχει επιβεβαίωση διάγνωσης. Όλα αυτά τα κριτήρια βέβαια αντιμετωπίζονται στο πλαίσιο της κλινικής ένδειξης και σε συνδυασμό με τα παθολογοανατομικά, κυτταρολογικά και ακτινολογικά ευρήματα. Όσον αφορά στις μοριακές μεθόδους παρόλο που υπήρχε η ελπίδα, ότι μετά τη δημοσίευση3 των πρώτων κριτηρίων το 2002, θα είχαν εντωμεταξύ βελτιωθεί πολύ, ώστε να περιληφθούν τα αποτελέσματά τους στους καινούργιους ορισμούς, δεν συ- 175 μπεριλήφθηκαν τελικά, καθώς θεωρήθηκε ότι δεν είχαν ακόμα αποδεκτά επίπεδα τυποποίησης και κυρίως κλινικής αξιολόγησης1,3. Με αφορμή και οδηγό τις παραπάνω κατευθύνσεις μπορεί να γίνει η καταγραφή των σύγχρονων και απαραίτητων διαγνωστικών στόχων, γενικά για τις διεισδυτικές μυκητιάσεις, αλλά και ειδικότερα για τις ασπεργιλλώσεις, που είναι και το θέμα της συγκεκριμένης ανασκόπησης. Ταυτόχρονα μπορούν να φανούν και οι δυνατότητες που υπάρχουν στην προσέγγιση αυτών των στόχων. Διεθνώς, η προσπάθεια που γίνεται συνολικά αποσκοπεί συνδυαστικά και βάσει κριτηρίων να προσεγγιστεί ταχύτερα και με μεγαλύτερα ποσοστά επιτυχίας η διάγνωση και τεκμηρίωση της μυκητιακής λοίμωξης. Με δεδομένο την ύπαρξη ποικίλων προβλημάτων στην προσπάθεια διάγνωσης, αξιολόγησης και θεραπείας των μυκητιακών λοιμώξεων και ιδίως των απειλητικών για τη ζωή και, καθώς ήταν γνωστό ότι ήδη περίπου 30 εκατομμύρια βρετανικές λίρες ξοδεύονταν στα νοσοκομεία κάθε χρόνο για αντιμυκητιακή θεραπεία4 και όχι πάντα με τον καλύτερο τρόπο, η Βρετανική Εταιρεία Ιατρικής Μυκητολογίας το 2003 διαπίστωνε, μεταξύ άλλων, ότι οι ακολουθούμενες μεθοδολογίες και οι επιδόσεις των βρετανικών μικροβιολογικών εργαστηρίων σχετικά με τη μυκητολογία απείχαν αρκετά από το ιδεώδες5,6. Έτσι πρότεινε οδηγίες για όλο το εύρος των ιατρικών ειδικοτήτων που εμπλέκονται στη φροντίδα των ασθενών με διεισδυτική μυκητιακή λοίμωξη. Πολύ σημαντικό τμήμα των οδηγιών αυτών είναι και οι συστάσεις που αφορούν στη μικροβιολογική διάγνωση και παρακολούθηση των παραπάνω λοιμώξεων5. Ειδικά όσον αφορά τους ασπεργίλλους πρότεινε ότι όλα τα κλινικά στελέχη ασπεργίλλων πρέπει να ταυτοποιούνται μέχρι είδους με παραπομπή σε ειδικό εργαστήριο, αν είναι απαραίτητο. Ενδεικτικό της πολύ σημαντικής συμβολής της σωστής αναγνώρισης είναι το γεγονός ότι όλοι οι μεταμοσχευμένοι ασθενείς ή οι βαριά ουδετεροπενικοί, που παρουσιάζουν καινούργια θετική καλλιέργεια με ασπέργιλλο ή άλλο νηματοειδή μύκητα, πρέπει ιδανικά να λά- 176 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία βουν κατάλληλη αντιμυκητιακή θεραπεία εντός έξι ωρών, καθώς η πρώιμη διάγνωση και η κατάλληλη θεραπεία είναι σημαντικές για τη μείωση της θνητότητας5. Επιπλέον οι ασθενείς με διεισδυτική ασπεργίλλωση χρειάζονται παρατεταμένη νοσηλεία της οποίας το κόστος μπορεί να ανέρχεται μέχρι και 75000 ευρώ· συνεπώς υπάρχουν σημαντικοί ιατρικοί και κοινωνικοοικονομικοί λόγοι για τους οποίους είναι απαραίτητη η έγκαιρη και ακριβής εργαστηριακή διάγνωση7. Άμεση μικροσκόπηση Η μικροσκόπηση του κλινικού δείγματος είναι απαραίτητη καθώς η διαγνωστική επιτυχία αυξάνεται συγκριτικά με μόνη την καλλιέργεια. Σε διάφορες κατηγορίες ασθενών, και ιδίως των ανοσοκατεσταλμένων, η μικροσκόπηση του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος π.χ., φαίνεται ότι επιφέρει βελτίωση της πιθανότητας διάγνωσης πάνω από 20%5,8,9. Η συμπύκνωση του δείγματος με φυγοκέντρηση, όπου είναι δυνατό, και κατόπιν η μικροσκόπηση και η καλλιέργεια υλικού από το ίζημα, βοηθούν στην προσπάθεια ανίχνευσης του μύκητα. Σημαντικό πλεονέκτημα της μικροσκόπησης είναι η ταχύτητα. Καθώς π.χ. η καθυστερημένη διάγνωση μιας πνευμονικής μυκητιακής λοίμωξης από νηματοειδή μύκητα μπορεί να είναι μοιραία, η γρήγορη έκδοση ενός θετικού αποτελέσματος μικροσκόπησης μέσα σε 2-4 ώρες είναι πολύ σημαντική5. Μπορεί να βοηθήσει στη διάκριση μεταξύ νηματοειδών μυκήτων που παρουσιάζουν υφές με διαφράγματα ή όχι. Διαφράγματα διαθέτουν πολλοί νηματοειδείς μύκητες. Οι πιο συνηθισμένοι στα κλινικά δείγματα, είναι υφομύκητες των γενών Aspergillus, Fusarium και Scedosporium, των οποίων οι υφές είναι σταδιακά διχοτομούμενες (χαρακτηριστικά στους ασπεργίλλους με γωνία 45°), με παράλληλα τοιχώματα και χωρίς παρουσία χρωστικής. Χωρίς διαφράγματα εμφανίζονται μύκητες της τάξης Mucorales όπως οι Rhizomucor spp., Rhizopus spp., Mucor spp., Absidia spp. και Cunninghamella bertholetiae, των οποίων οι υφές είναι πολύ ευρείες, χωρίς παράλληλα τοιχώματα και οι διακλαδώσεις τους είναι ακανόνιστες και συχνά σε ορθές γωνίες. Άλλο πολύ τυπικό χαρακτηριστικό είναι οι κονιδιακές κεφαλές των ασπεργίλλων. Το όφελος της μικροσκοπικής αναγνώρισης είναι σημαντικό καθώς η διεισδυτική ασπεργίλλωση μπορεί να θεραπευτεί με αζόλες όπως η ιτρακοναζόλη, η βορικοναζόλη και η ποζακοναζόλη, οι Mucorales όμως μπορούν να αντιμετωπισθούν κυρίως με αμφοτερικίνη Β, αν και φαίνεται πως έχει δράση και η ποζακοναζόλη. Ακόμα οι λοιμώξεις από ζυγομύκητες συχνά βελτιώνονται ή και θεραπεύονται με τη χειρουργική εξαίρεση του προσβεβλημένου ιστού5. Έχει επικρατήσει το δείγμα να μικροσκοπείται άμεσα αυτούσιο, αν είναι υγρό ή με την προσθήκη φυσιολογικού ορού ή με λευκό Calcofluor με τη χρησιμοποίηση μικροσκοπίου φθορισμού στα 420 nm. Μπορούν ακόμα να χρησιμοποιηθούν γαλακτοφαινόλη-κυανού του βάμβακος ή κυανό του μεθυλενίου. Το διάλυμα ΚΟΗ 10%20%, με ή χωρίς επώαση στους 56°C, είναι πολύ χρήσιμο, ειδικά σε στερεά δείγματα, όπως τμήματα ιστών από βιοψίες. Επίσης το Calcofluor ή το Blankophor μπορούν να συνδυαστούν με ΚΟΗ. Το Blankophor, σε αντίθεση με το Calcofluor, δεν κρυσταλλώνει σε αλκαλικό pH και μπορεί να διατηρηθεί σε διάλυμα εργασίας μέχρι και ένα χρόνο στο ψυγείο, προστατευμένο από το φως10. Τα μικροσκοπικά κριτήρια, αν και ίσως λιγότερο ευαίσθητα από τα κλινικά, όσον αφορά στη διάγνωση της μυκητιακής νόσου, είναι πολύ σημαντικά για την αντικειμενική διάγνωση. Η ευαισθησία της άμεσης μικροσκόπησης εξαρτάται από την ποιότητα και το είδος του δείγματος, την ποιότητα του μικροσκοπίου και την εμπειρία του μικροσκοπιστή11. Η μικροσκόπηση σε αυτό το στάδιο και αργότερα στην αρχική ταυτοποίηση του μύκητα, γίνεται με τον μικρής μεγέθυνσης αντικειμενικό φακό (× 10) ή με τον μεγαλύτερης (× 40), για λεπτομερέστερη εξέταση. Τόσο από την εμπειρία του εργαστηρίου μας όσο και άλλων, προκύπτει ότι ο καταδυτικός φακός (× 100) μπορεί να είναι πολύ χρήσιμος και να αποκαλύψει σημαντικά στοιχεία που αλλιώς μπορεί να διαφύγουν12. Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 4, 2010 Φαινοτυπική και μοριακή ταυτοποίηση και διάγνωση Η ακριβής ταυτοποίηση των ιατρικά σημαντικών μυκήτων είναι μια από τις σπουδαιότερες εργασίες του εργαστηρίου κλινικής μυκητολογίας13. Η ταυτοποίηση στο επίπεδο του είδους ή τουλάχιστον του γένους είναι απαραίτητη για την ορθή και έγκαιρη θεραπεία, τη γνώση και την κατανόηση της παθογένειας και της εξέλιξης της μυκητιακής λοίμωξης, την ανίχνευση πιθανής αντοχής στους αντιμυκητιακούς παράγοντες και την ανίχνευση των αιτίων των νοσοκομειακών λοιμώξεων. Ταυτόχρονα είναι επίσης σημαντικό να αναγνωρίσει κανείς ότι πολλά στελέχη μυκήτων που αναπτύσσονται στα κλινικά δείγματα δεν αντιπροσωπεύουν νόσο. Για το λόγο αυτό, είναι κάθε φορά απαραίτητο να αναγνωρίζεται η ύπαρξη ή όχι της κλινικής σχέσης των στελεχών που απομονώνονται13-14. Οι ασπέργιλλοι είναι πολύ διαδεδομένοι στη φύση και είναι πιθανό να επιμολύνουν τα κλινικά δείγματα και τα θρεπτικά υλικά. Ο καθορισμός ενός στελέχους που αναπτύσσεται σε μια καλλιέργεια ως κλινικά σημαντικού είναι ορισμένες φορές δύσκολος, ειδικά όταν η μικροσκόπηση του δείγματος είναι αρνητική15. Η πλειοψηφία των κλινικά σημαντικών ταυτοποιήσεων, ιδίως για τους νηματοειδείς μύκητες, γίνεται φαινοτυπικά με τη χρήση μορφολογικών κριτηρίων16. Είναι αλήθεια ότι οι περισσότερες από τις μεθοδολογίες που χρησιμοποιούνται για τη φαινοτυπική αυτή ταυτοποίηση βασίζονται στην εμπειρία και όχι σε συγκριτικές μελέτες Η ακριβής όμως φαινοτυπική ταυτοποίηση έχει γίνει όλο και πιο δύσκολη στην εποχή μας, καθώς οι πρόοδοι στη φυλογενετική ταξινομική έχουν αποκαλύψει την ύπαρξη διαφορετικών «κρυφών» ειδών μεταξύ μορφολογικά πανομοιότυπων στελεχών. Έτσι για παράδειγμα διάφορα νέα είδη ασπεργίλλων έχουν τώρα αναγνωρισθεί και δημοσιευθεί ως είδη της γενικότερης ομάδας Fumigati που περιλαμβάνει και τον ευκαιριακά παθογόνο μύκητα για τον άνθρωπο, τον Aspergillus fumigatus16. Διαφορετικά είδη του ίδιου γένους μυκήτων μπο- 177 ρεί να έχουν διαφορετική απόκριση στα διάφορα αντιμυκητιακά φάρμακα. Οι ασπέργιλλοι είναι ανθεκτικοί στη φλουκοναζόλη. Ο Aspergillus terreus αντιπροσωπεύει περίπου το 3 με 6% όλων των περιπτώσεων διεισδυτικής ασπεργίλλωσης και είναι ανθεκτικός στην αμφοτερικίνη Β, ενώ και ο Aspergillus nidulans δεν ανταποκρίνεται στην αμφοτερικίνη το ίδιο καλά με τον A. fumigatus. Επίσης έχουν αναφερθεί κλινικά στελέχη A. fumigatus με αντοχή στις καινούργιες τριαζόλες17-20. Ο Aspergillus niger είναι λιγότερο πιθανό να προκαλέσει πνευμονική νόσο από τον Aspergillus fumigatus στους ασθενείς με λευχαιμία και έτσι αν ανιχνευθεί στην καλλιέργεια του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος είναι πιο πιθανό να είναι αποικιστής παρά αίτιο της διεισδυτικής λοίμωξης, αν και η διάκριση αυτή δεν είναι απόλυτη14-21. Έχει φανεί από μελέτες στο παρελθόν ότι η υποκείμενη νόσος είναι καθοριστικός παράγοντας για την αξιολόγηση της σημασίας μιας θετικής καλλιέργειας με ασπέργιλλο σε δείγματα εκκρίσεων του αναπνευστικού συστήματος (πτύελα και τραχειοβρογχικές εκκρίσεις). Η διαγνωστική ειδικότητα και η πιθανότητα κλινικής αξιολόγησης της απομόνωσης ασπεργίλλων από τα παραπάνω δείγματα αυξάνει όσο αυξάνει και ο βαθμός της ανοσοκαταστολής των ασθενών. Έτσι στους μη ανοσοκατεσταλμένους η απομόνωση αυτή σπανίως είναι ενδεικτική διεισδυτικής πνευμονικής ασπεργίλλωσης. Η παρουσία χρόνιας πνευμονικής νόσου και το κάπνισμα κάνουν τον αποικισμό πιο πιθανό. Επίσης σπάνια σχετίζεται με διεισδυτική ασπεργίλλωση σε ασθενείς με συμπαγείς καρκίνους (και απουσία ουδετεροπενίας). Στους ανοσοκατεσταλμένους, αλλά μη ουδετεροπενικούς, μεταμοσχευμένους ή υπό κορτικοθεραπεία ή πάσχοντες από λέμφωμα, η απομόνωση ασπεργίλλου σε δείγματα από το αναπνευστικό είναι σημαντικός παράγοντας επαγρύπνησης. Στους ουδετεροπενικούς ασθενείς ή σε αυτούς που πάσχουν από λευχαιμία (εκτός της χρόνιας λεμφογενούς) η απομόνωση ασπεργίλλου από τις εκκρίσεις του αναπνευστικού είναι ουσιαστικά διαγνωστική διεισ- 178 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία δυτικής πνευμονικής ασπεργίλλωσης22. Η απομόνωση ειδών ασπεργίλλου από δείγματα του κατώτερου αναπνευστικού και μάλιστα πτυέλων και τραχειοβρογχικών εκκρίσεων έχει σημαντική θετική προγνωστική αξία ανάλογα με την ομάδα κινδύνου: 82% για τους μεταμοσχευμένους μυελού των οστών, 72% για τους ασθενείς με αιματολογικές κακοήθειες, 56% για τους μεταμοσχευμένους συμπαγών οργάνων και 63% για τους ασθενείς υπό κορτικοθεραπεία. Η λήψη των δειγμάτων αυτών και η αποστολή στο εργαστήριο για καλλιέργεια πρέπει να γίνεται επαναλαμβανόμενα, τουλάχιστο τρεις φορές, και όσο το δυνατό πιο γρήγορα, μόλις υπάρξει υποψία λοίμωξης, καθώς έτσι αυξάνεται η πιθανότητα έγκαιρης ανίχνευσης διεισδυτικής πνευμονικής ασπεργίλλωσης23. Είναι δυνατόν να παρατηρείται σχετικά μικρή ανάπτυξη αποικιών ασπεργίλλων στις καλλιέργειες μολυσμένων ιστών και αυτό γιατί συχνά έχει ήδη ξεκινήσει η αντιμυκητιακή αγωγή ή γιατί ίσως ο μύκητας που έχει προσαρμοσθεί και αναπτύσσεται στον ιστό δεν μπορεί γρήγορα να προσαρμόσει το μεταβολισμό του στις συνθήκες της καλλιέργειας in vitro22,24. Επίσης φαίνεται ότι η ευρεία προφυλακτική και θεραπευτική χρήση της αμφοτερικίνης Β και διαφόρων αζολών πιθανώς έχει οδηγήσει, (τουλάχιστο σε ορισμένα κέντρα) σε συχνότερη εμφάνιση περισσότερο ανθεκτικών ειδών από τον κυρίαρχο παλαιότερα Aspergillus fumigatus24. Η καλλιέργεια ειδικά για μύκητες, με τη χρήση των κατάλληλων μυκητολογικών θρεπτικών υλικών και των αντίστοιχων συνθηκών επώασης, είναι σαφώς ευνοϊκότερη για την ανάπτυξη των ασπεργίλλων από τη συνήθη καλλιέργεια για μικρόβια και μύκητες σε κοινά μικροβιολογικά υλικά23. Είναι πάντα επιθυμητή η επιβεβαίωση των πιθανών μικροσκοπικών ευρημάτων, με την ανάπτυξη σε καλλιέργεια οπότε υπάρχει και η δυνατότητα οριστικής ταυτοποίησης. Παρά την ύπαρξη ειδικών μορφολογικών χαρακτηριστικών στη μικροσκόπηση των ασπεργίλλων, η προσπάθεια αναγνώρισής τους μόνο από τη μικροσκόπηση, πιθανόν να μη δίνει σωστό αποτέλεσμα15. Υλικά που συ- χνότερα χρησιμοποιούνται είναι το Sabouraud’s glucose agar (συνήθως με χλωραμφενικόλη) και το malt extract agar σε διάφορες συγκεντρώσεις (2%, 3% ή 4%). Η cycloheximide (actidione) χρησιμοποιείται για την καταστολή των γρήγορα αναπτυσσόμενων σαπροφυτικών μυκήτων, ιδίως στις επιφανειακές μυκητιάσεις, αλλά δεν είναι γενικής χρήσης, καθώς μπορεί παθογόνοι μύκητες, όπως οι ασπέργιλλοι και οι ζυγομύκητες, να ανασταλούν. Για την οριστική ταυτοποίηση των ασπεργίλλων η ανακαλλιέργεια σε κάποιο λιγότερο πλούσιο θρεπτικό υλικό, κυρίως στο Czapek Dox agar, που είναι το υλικό εκλογής για την ταυτοποίηση των ασπεργίλλων, θα επιτρέψει την πλουσιότερη σπορογένεση και τη συγκριτική ανάπτυξη όλων των μορφολογικών τους χαρακτηριστικών. Κατόπιν με τη χρησιμοποίηση ειδικών αλγορίθμων ταυτοποίησης (κλείδες) θα γίνει δυνατή η οριστική αναγνώριση του είδους στις περισσότερες περιπτώσεις κλινικών στελεχών. Η εμπειρία δείχνει ότι είναι χρήσιμη τακτική, ιδίως για λόγους μείωσης του χρόνου, να χρησιμοποιούνται ταυτόχρονα υλικά αρχικής καλλιέργειας και ταυτοποίησης, όπως π.χ. Sabouraud’s glucose agar, malt extract agar και Czapek Dox agar. Η θερμοκρασία επώασης των αρχικών καλλιεργειών στις ασπεργιλλώσεις, όπως και για τους περισσότερους ευκαιριακά παθογόνους μύκητες, είναι 30°C, ενώ η επώαση ταυτόχρονα και στους 35° ως 37°C είναι χρήσιμη για τη διαφορική διάγνωση με την εμφάνιση ή μη διαφόρων μορφολογικών χαρακτηριστικών, τον αποκλεισμό της ύπαρξης ενός δίμορφου μύκητα στο κλινικό δείγμα και τη γρηγορότερη ανάπτυξη25. Συνήθως αναπτύσσονται πλήρως μέσα σε περίπου επτά με δέκα ημέρες. Όλες οι καλλιέργειες πρέπει να ελέγχονται δύο με τρεις φορές εβδομαδιαίως και να γίνονται οι κατάλληλες ανακαλλιέργειες25,26. Ήδη από το 1965 οι Raper και Fennell σημείωναν πως όταν μελετούμε τους ασπεργίλλους είναι σημαντικό να κατανοούμε: 1) ότι στελέχη του ιδίου είδους μπορεί να διαφέρουν μεταξύ τους, 2) τα είδη μπορεί να ποικίλλουν μέσα σε μια ομάδα ειδών και 3) οι διάφορες ομά- Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 4, 2010 δες μπορεί να αλληλεπικαλύπτονται μέσα στο ίδιο γένος27. Υπάρχουν δυσκολίες στη φαινοτυπική ταυτοποίησή τους που αφορούν: α) στα μη σταθερά φαινοτυπικά χαρακτηριστικά, όπως η παραγωγή ασκοσπορίων ή το χρώμα των αποικιών, που είναι εξαρτώμενο από τις περιβαλλοντικές συνθήκες (σύσταση του θρεπτικού υλικού, θερμοκρασία επώασης, ηλικία των αποικιών) ή το σχήμα και η εμφάνιση των κονιδιακών κεφαλών και των κονιδιογόνων κυττάρων που μεταβάλλονται με την ηλικία της αποικίας, β) στους άτυπους φαινοτύπους των ασπεργίλλων που αναπτύσσονται σε καλλιέργειες κλινικών δειγμάτων, γ) στα αλληλεπικαλυπτόμενα μορφολογικά χαρακτηριστικά μεταξύ των ειδών σε μια ομάδα-τομέα (section) ειδών, π.χ. ομοιότητες μεταξύ διαφορετικών μελών της ομάδας-τομέα (section) των Fumigati, δ) στη χρησιμοποίηση διαφόρων μη συνηθισμένων θρεπτικών υλικών και ε) στην αναγκαιότητα ύπαρξης ειδικά εκπαιδευμένου προσωπικού για την ταυτοποίηση που είναι κοπιώδης και χρονοβόρος28. Παρόλ’ αυτά το 2003 η Αμερικανική Εταιρεία Μικροβιολογίας διαπίστωνε ότι το 89% των εργαστηρίων που ασχολούνταν με τις μυκητιακές λοιμώξεις στις Η.Π.Α. πραγματοποιούσαν μόνο καλλιέργειες, 16% χρησιμοποιούσαν και ορολογικές μεθόδους, ενώ λιγότερο από 5% χρησιμοποιούσαν μοριακές τεχνικές29. Συνεπώς με δεδομένη την εξάρτηση από τις φαινοτυπικές μεθόδους για τη διάγνωση και ταυτοποίηση των ασπεργίλλων, αλλά και των άλλων, νηματοειδών κυρίως μυκήτων, μεγάλη προσπάθεια πρέπει να καταβληθεί στην έρευνα για την αξιολόγηση των μεθόδων αυτών και τη βελτίωση της διαγνωστικής αξίας τους με την τυποποίηση των υλικών και των τεχνικών, καθώς και στη στρατηγική εκπαίδευσης του εργαστηριακού προσωπικού28. Το γένος των ασπεργίλλων αρχικά είχε διαχωριστεί σε υπογένη και ομάδες (groups)27. Στην εποχή μας το γένος έχει διαχωριστεί σε 7 υπογένη τα οποία χωρίζονται σε διάφορους τομείς (sections) αντί ομάδες (groups). Οι τομείς αυτοί αποτελούνται από διάφορα συγγενικά είδη30. Τα κλινικά μικροβιολογικά εργαστήρια βασίζονται 179 και θα συνεχίσουν να βασίζονται πολύ στη μορφολογική ταυτοποίηση των διαφόρων κλινικών στελεχών, αλλά καθώς υπάρχουν μια σειρά προβλημάτων που ήδη αναφέρθηκαν παραπάνω και κυρίως γιατί το ταχύ και ολοκληρωμένο αποτέλεσμα μπορεί να είναι εξαιρετικά σημαντικό για τους ασθενείς υψηλού κινδύνου, καταβάλλεται διεθνώς προσπάθεια για την κατάλληλη επιλογή και εφαρμογή μοριακών μεθόδων ταυτοποίησης. Φαίνεται ότι η ταυτοποίηση των ειδών μέσω της σύγκρισης προσδιορισμού αλληλουχίας των βάσεων (comparative sequencing) του DNA είναι πολλά υποσχόμενη στα θέματα της ταχύτητας, της ευκολίας, της αντικειμενικότητας και της οικονομίας31. Διεθνώς αρκετά εργαστήρια μυκητολογίας χρησιμοποιούν ήδη και προσπαθούν να αξιολογήσουν μοριακές μεθόδους είτε για την άμεση ανίχνευση στο κλινικό υλικό είτε για την ταυτοποίηση μυκήτων που αναπτύσσονται σε καλλιέργειες κλινικών δειγμάτων, συμπληρωματικά προς τις μορφολογικές μεθόδους ή και προσπαθώντας να υποκαταστήσουν τις τελευταίες όταν υπάρχει μεγάλη καθυστέρηση στο αποτέλεσμα. Οι πιο διαδεδομένοι μυκητιακοί γονιδιακοί στόχοι για τις μοριακές προσεγγίσεις βρίσκονται στο ριβοσωμιακό DNA (rDNA). Εκεί περιέχονται ισχυρά διατηρημένες περιοχές, που χωρίζονται από άλλες περισσότερο μεταβλητές που παρουσιάζουν ειδικές του είδους αλληλουχίες. Αυτές όλες οι περιοχές είναι ιδεώδεις για το σχεδιασμό «οικουμενικών» (πανμυκητιακών) εκκινητών (primers) ή ειδικών για το γένος ή το είδος. Ένα άλλο σημαντικό πλεονέκτημα είναι ότι οι αλληλουχίες αυτού του DNA είναι αυτές που βρίσκονται πιο συχνά στις δημόσιας χρήσης βάσεις αλληλουχιών. Γενικά η οργάνωση των γονιδίων του rDNA περιλαμβάνει το γονίδιο της SSU (small subunit) περιοχής (18S rDNA), το γονίδιο της 5.8S περιοχής και το γονίδιο της LSU (large subunit) περιοχής (28S rDNA). Ανάμεσα στις παραπάνω περιοχές βρίσκονται οι ITS (internal transcribed spacer) περιοχές, η ITS1 μεταξύ της 18S και της 5.8S περιοχής και η ITS2 μεταξύ της 5.8S και της 28S περιοχής. Ανεξάρτητα από αυτές τις ομάδες υπάρ- 180 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία χει και γονίδιο της 5S rDNA περιοχής με την ΝTS (nontranscribed spacer). Τόσο οι περιοχές D1 και D2 της LSU όσο και η 18S, αλλά και πιο πρόσφατα οι περιοχές ITS1 και ITS2 έχουν χρησιμοποιηθεί εκτενώς με πληθώρα εκκινητών και για τους ασπεργίλλους. Η περιοχή 18S έχει χρησιμοποιηθεί επιτυχώς για την αναγνώριση μεταξύ διαφορετικών γενών παθογόνων μυκήτων32. Οι ταχύτερα εξελισσόμενες περιοχές ITS1 και ITS2, με τη μεγαλύτερη μεταβλητότητα και τη μεγαλύτερη καταλληλότητα για την ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους και στελέχους, έχουν ευρέως μελετηθεί και φαίνεται πως υπάρχει ένας διεθνής «προσανατολισμός» προς τη χρήση αυτών των περιοχών, τουλάχιστον για την αναγνώριση των ιατρικά σημαντικών μυκήτων, τόσο για τις εν τω βάθει όσο και για τις επιφανειακές μυκητιάσεις28,33-40. Φαίνεται όμως πως οι περιοχές αυτές δεν είναι αρκετές για την αναγνώριση και το διαχωρισμό μεταξύ διαφόρων ειδών που απαρτίζουν κοινούς τομείς (sections) ιατρικά σημαντικών ειδών, όπως π.χ. ο Aspergillus lentulus και οι Neosartorya pseudofischeri και udagawae στoν τομέα (section) των Fumigati. Επίσης παρουσιάζουν προβλήματα στο διαχωρισμό πολύ κοντινών ειδών όπως ο Aspergillus fumigatus και ο Αsperglllus lentulus13,41,42. Παρόλα αυτά μπορούν να αναγνωρίσουν σημαντικά και συνηθέστερα είδη παθογόνων μυκήτων όπως οι Aspergillus terreus, flavus και fumigatus και έτσι είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν στα μυκητολογικά εργαστήρια για αυτό το σκοπό13,43. Το 2008 δημοσιεύτηκε ένα πολύ σημαντικό άρθρο, ως πρόταση μιας διεθνούς ομάδας εργασίας στο πλαίσιο της ISHAM (International Society for Human and Animal Mycology), για τη μοριακή ταυτοποίηση των κυριότερων παθογόνων νηματοειδών μυκήτων, δηλαδή των Aspergillus, Fusarium και Mucorales41. Οι συγγραφείς κάνουν σαφές ότι προσεγγίζουν τον όρο ταυτοποίηση από τη σκοπιά της κλινικής χρησιμότητας και όχι της ταξινομικής κατηγοριοποίησης. Τους ενδιαφέρει ο τρόπος με τον οποίο ένα εργαστήριο κλινικής μικροβιολογίας θα μπορέσει να ταυτοποιήσει ένα παθογόνο μύκητα, γρή- γορα και με ακρίβεια, ώστε να προσφέρει την αναγκαία πληροφόρηση στον κλινικό ιατρό, οποίος θα τη χρησιμοποιήσει για να αποφασίσει και να καθοδηγήσει τη θεραπεία του αρρώστου. Προτείνουν τη χρήση της ITS περιοχής ως πιο κατάλληλης για τη διαγνωστική αυτή προσέγγιση καθώς είναι πανμυκητιακή και μπορεί να πολλαπλασιασθεί αξιόπιστα για τους περισσότερους μύκητες, ενώ ταυτόχρονα οι περισσότερες βιβλιοθήκες αλληλουχιών περιέχουν μεγάλο αριθμό πληροφοριών από αυτή την περιοχή. Παρά το ότι αναγνωρίζουν τα προβλήματα που αναφέρθηκαν παραπάνω και επιπλέον ότι στις βάσεις δεδομένων υπάρχουν λάθη στις μυκητιακές αλληλουχίες ως και 20%, υποστηρίζουν ένθερμα τη χρησιμοποίηση της συγκεκριμένης περιοχής41,42, έτσι ώστε μέσω των κλινικά χρήσιμων ταυτοποιήσεων σε επίπεδο γένους ή είδους, να προαχθεί διαγνωστικά ο ρόλος της μοριακής προσέγγισης. Επίσης να ενισχυθεί σταδιακά η ακρίβεια των πληροφοριών που υπάρχουν και να μπορέσει να υπάρξει ένας κοινός τόπος μελέτης και περαιτέρω ανάπτυξης αυτής της μεθοδολογίας στο εργαστήριο κλινικής μυκητολογίας. Είτε το εργαστήριο χρησιμοποιεί φαινοτυπικές μεθόδους ταυτοποίησης των στελεχών των ασπεργίλλων, είτε μοριακές, που κυρίως βασίζονται στον προσδιορισμό της αλληλουχίας των περιοχών ITS, προτείνεται να αναφέρονται τα είδη και ειδικά αυτά που ανήκουν στους τομείς (sections) των Fumigati, Flavi, Nidulantes, Usti και Terrei, ως σύμπλεγμα ειδών (species complex), π.χ. Aspergillus fumigatus complex ή Aspergillus flavus complex31,41. Χρησιμοποιείται δηλαδή η λέξη complex ως εναλλακτική της λέξης section. Ο όρος complex καθορίζει τη θέση ενός στελέχους μέσα σε ένα κοινό σύμπλεγμα ειδών (species complex), αλλά δεν ταυτοποιεί απαραίτητα το ακριβές είδος του στελέχους μέσα στο σύμπλεγμα. Aν υπάρχουν κλινικοί ή επιδημιολογικοί λόγοι περαιτέρω ταυτοποίησης, ώστε να αναγνωρισθούν ακριβώς τα επιμέρους είδη μέσα στο σύμπλεγμα (complex), τότε θα πρέπει να γίνει επιπλέον προσδιορισμός της αλληλουχίας του DNA με τη χρησιμοποίηση κάποιου γο- Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 4, 2010 νιδιακού τόπου κωδικοποίησης πρωτεϊνών28,31,41. Υπάρχει π.χ. ανάγκη να καθορισθούν ακριβώς το είδος του A. terreus (ανθεκτικός στην αμφοτερικίνη) σε σχέση με τον A. fumigatus ή διάφορα είδη μέσα στο A. fumigatus complex, όπως ο A. lentulus (χαμηλότερη ευαισθησία στην αμφοτερικίνη), ενώ υπάρχει μικρότερο ενδιαφέρον για τον ακριβή καθορισμό του είδους μέσα στους A. Usti41,44,45. Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η σύγκριση προσδιορισμού αλληλουχίας των γονιδίων που κωδικοποιούν την παραγωγή της καλμοδουλίνης, της rodlet A και ιδίως της β-τουμπουλίνης μπορεί να ταυτοποιήσει τα επιμέρους είδη16,31,44-46. Το 2006, μια κοινή ομάδα εργασίας από το Ηνωμένο Βασίλειο και την Ιρλανδία δημοσίευσε τα αποτελέσματα μιας από τις πρώτες πολυκεντρικές μελέτες αξιολόγησης των μεθόδων PCR που χρησιμοποιούνταν ήδη στις δύο αυτές χώρες για την ανίχνευση των μυκήτων Candida και Aspergillus στα κλινικά δείγματα47. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ενώ για την Candida οι μέθοδοι, αν και διαφορετικές μεταξύ τους, ήταν απόλυτα συγκρίσιμες και είχαν πολύ καλή ευαισθησία, για τον Αspergillus τα αποτελέσματα ήταν περισσότερο ποικίλα. Η πρόταση της ομάδας οδηγούσε περισσότερο προς τη χρήση αυτοματοποιημένων συστημάτων για την ενίσχυση του DNA (real-time PCR), με απώτερο στόχο την τυποποίηση της εργασίας και τη μεγαλύτερη αξιοπιστία του αποτελέσματος. Στο άρθρο αυτό δε γινόταν συζήτηση για το αποτρεπτικό συχνά κόστος των αυτοματοποιημένων μεθοδολογιών. Τονίστηκε πάντως ότι, ειδικά για τον ασπέργιλλο πρέπει να γίνουν συγκριτικές διεργαστηριακές μελέτες με διαφορετικό πρωτόκολλο PCR για να βρεθεί η καλύτερη. Πολύ ενδιαφέρουσα πρόταση για το μέλλον, η οποία είναι ήδη σε αρχική αξιολόγηση, είναι η χρησιμοποίηση μιας πανμυκητιακής μεθόδου PCR σε συνδυασμό με προσδιορισμό αλληλουχίας DNA, καθώς μάλιστα ο αριθμός των περιπτώσεων λοιμώξεων και από άλλους μύκητες είναι αυξανόμενος. Αυτό θα μπορούσε να επιφέρει χαμηλότερη ευαισθησία καθώς μεγαλώνει η ποικιλότητα του γο- 181 νιδιακού στόχου με σκοπό την κάλυψη περισσότερων γενών μυκήτων. Θα μπορούσε όμως να γίνει συνδυασμός και με ειδικές του γένους ή του είδους μεθόδους PCR, ώστε να εξασφαλιστεί το διαγνωστικό αποτέλεσμα47. Η ευρεία αποδοχή της μοριακής διάγνωσης των διεισδυτικών ασπεργιλλώσεων βρίσκει εμπόδια στην έλλειψη τυποποίησης και στην περιορισμένη γνώση της πορείας της νόσου48. Για το λόγο αυτό, αλλά και με την εμπειρία της παραπάνω μελέτης δημιουργήθηκε στο πλαίσιο της ISHAM η ομάδα εργασίας της EAPCRI (European Aspergillus PCR Initiative), που έχει σκοπό την ανάπτυξη και την εφαρμογή τυποποιημένης μεθοδολογίας εκχύλισης και ενίσχυσης του DNA των ασπεργίλλων στα κλινικά δείγματα, την αξιολόγηση των πληροφοριών, τη συγκριτική μελέτη και την εκτίμηση των αποτελεσμάτων, μέσω της κλινικής εφαρμογής, έτσι ώστε στο μέλλον οι μοριακές μέθοδοι να περιληφθούν πιθανώς στα επόμενα αναθεωρημένα διαγνωστικά κριτήρια για τις διεισδυτικές μυκητιάσεις48. Προτείνουν όμως, την PCR ασπεργίλλου στο αίμα ως δοκιμασία ελέγχου (screening test) και όχι ως επιβεβαιωτική, με απώτερο στόχο να διασφαλιστεί η μέγιστη δυνατή ευαισθησία και να επιτευχθεί η μέγιστη αρνητική προγνωστική αξία, καθώς είναι το σημαντικότερο στην κλινική πρακτική. Επίσης προβαίνουν σε συγκεκριμένες προτάσεις, επισημαίνοντας ότι η εκχύλιση είναι καθοριστικότερος παράγοντας για την αποτελεσματικότητα της PCR του ασπεργίλλου, από την ίδια την ενίσχυση του DNA48. Ορολογική διάγνωση και παρακολούθηση Από όσα αναφέρονται στο άρθρο των EORTC/MSG, σχετικά με τις διεισδυτικές ασπεργιλλώσεις, φαίνεται ότι περιλαμβάνονται στα αναθεωρημένα προτεινόμενα διαγνωστικά κριτήρια, εκτός από τη μικροσκόπηση και την καλλιέργεια, και άλλες εξετάσεις όπως ο έλεγχος για το αντιγόνο (γαλακτομαννάνη) ασπεργίλλου στον ορό, αλλά και στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και το εγκεφαλονωτιαίο υγρό1. Η ε- 182 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία ξέταση αυτή μπορεί να συμβάλει σημαντικά στη διάγνωση των συγκεκριμένων μυκητιάσεων, καθώς μπορεί οι καλλιέργειες για διάφορους λόγους να είναι αρνητικές, ενώ επιπλέον είναι και πολύ πιο χρονοβόρες. Επίσης με τη συχνή παρακολούθηση του τίτλου μπορεί να επιτευχθεί ο έλεγχος της απόκρισης στη θεραπεία και η έγκαιρη ανίχνευση μιας πιθανής υποτροπής. Ο προσδιορισμός της γαλακτομαννάνης του ασπεργίλλου βασίζεται σε μια ευαίσθητη ανοσοενζυμική μέθοδο που ειδικά στους ουδετεροπενικούς ασθενείς φαίνεται πως έχει ευαισθησία 67-100% και ειδικότητα 86-99%. Στους μη ουδετεροπενικούς παρουσιάζει χαμηλότερη ειδικότητα49-51. Όταν γίνονται συνεχόμενοι επαναλαμβανόμενοι προσδιορισμοί, ένα θετικό αποτέλεσμα φαίνεται πως προηγείται της αποδεδειγμένης διάγνωσης 6-14 ημέρες52. Το όριο εκτίμησης της θετικότητας (cutoff) για τη μέθοδο της γαλακτομαννάνης του ασπεργίλλου στον ορό αποτέλεσε θέμα έντονου επιστημονικού διαλόγου. Αρχικά είχε τεθεί στο 1,5, αλλά όταν τελικά μειώθηκε στο 0,5 φάνηκε ότι βελτιώθηκε πάρα πολύ η διαγνωστική αξία της μεθόδου, με σημαντική βελτίωση της ευαισθησίας. Επίσης συστήνεται η μέτρηση σε περισσότερα του ενός δείγματα (δύο την εβδομάδα), ενώ η ανίχνευση δύο συνεχόμενων θετικών δειγμάτων με τιμή ≥0,5 οδηγεί σε ειδικότητα μέχρι 97,5% και θετική προγνωστική αξία 87,5%· η ολική ευαισθησία διατηρείται στο 92,1% και η αρνητική προγνωστική αξία στο 98,5%1,53. Μια άλλη παράμετρος που έχει περιληφθεί στα αναθεωρημένα κριτήρια διάγνωσης είναι ο προσδιορισμός της (1,3)-β-D-γλυκάνης, η οποία είναι ένα συστατικό του κυτταρικού τοιχώματος πολλών παθογόνων μυκήτων, εκτός των ζυγομυκήτων και των κρυπτοκόκκων, και μπορεί να χρησιμοποιηθεί όχι μόνο για τις ασπεργιλλώσεις αλλά και ως πανμυκητιακός δείκτης. Η ευαισθησία αυτής της χρωματομετρικής μεθόδου αναφέρεται ότι είναι 67-100% και η ειδικότητα 84-100%54-56. Φαίνεται ότι ένα θετικό αποτέλεσμα μπορεί να προηγείται της οριστικής αποδεδειγμένης διάγνωσης, σύμφωνα με τα κριτήρια των EORTC/MSG, με διάμεση τιμή τις τρεις ημέρες για τη διεισδυτική ασπεργίλλωση και 14 για τη διεισδυτική καντιντίαση, μετά την έναρξη του πυρετού57. Έλεγχος της ευαισθησίας και παρακολούθηση των φαρμακευτικών επιπέδων Αν και ο Aspergiluus fumigatus είναι ο πιο συνηθισμένος νηματοειδής μύκητας που απαντάται στις διεισδυτικές μυκητιάσεις, τα τελευταία χρόνια υπάρχει συνεχώς αυξανόμενη κλινική εμφάνιση πολλών άλλων γενών και ειδών ευκαιριακών νηματοειδών μυκήτων και μεταξύ αυτών και πολλών άλλων ειδών ασπεργίλλων. Ο Aspergillus terreus είναι ένας από αυτούς. Όπως ήδη αναφέρθηκε είναι ανθεκτικός στην αμφοτερικίνη Β. Αντοχή στα πολυένια εμφανίζεται συχνότερα και σε άλλα είδη ασπεργίλλων, όπως ο flavus, αλλά ακόμα και στον fumigatus που παραδοσιακά ήταν ο πιο ευαίσθητος16,58,59. Συχνά τέτοιοι ασπέργιλλοι, αρχικά ταυτοποιημένοι ως A. fumigatus, είναι στην πραγματικότητα A. lentulus16. Έχουν αναφερθεί κλινικά στελέχη A. fumigatus πολυανθεκτικά στις αζόλες (ιτρακοναζόλη, βορικοναζόλη και ποζακοναζόλη) και μάλιστα με συσχέτιση με την κλινική εικόνα60,61. Για τον fumigatus, ελάχιστες ανασταλτικές πυκνότητες (MIC) >2 μg/ml για τη βορικοναζόλη, >0,5 για την ποζακοναζόλη και >2 μg/ml για την ιτρακοναζόλη θεωρούνται αυξημένες και ενδεικτικές αντοχής62. Υπάρχουν ακόμα αναφορές για αντοχή στις εχινοκανδίνες (MIC >16 μg/ml) σε λοιμώξεις από ασπέργιλλο 63. Ο Aspergillus calidustus είναι ένα νέο αναδυόμενο είδος, προηγουμένως ταυτοποιούμενο ως Aspergillus ustus που τώρα αποτελεί μέλος του Aspergillus ustus complex. Παρουσιάζει ΜIC >4 μg/ml σε όλες τις τριαζόλες (ιτρακοναζόλη, βορικοναζόλη, ποζακοναζόλη και ραβουκοναζόλη)64,65. Ο έλεγχος της ευαισθησίας των μυκήτων στα διάφορα αντιμυκητιακά φάρμακα είναι συχνά απαραίτητος, ειδικά στις εν τω βάθει μυκητιάσεις. Παρόλα αυτά δεν είναι αυτονόητη η διενέργειά του καθώς υπάρχουν τεχνικές δυσκολί- Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 4, 2010 ες (ιδίως για τους νηματοειδείς μύκητες) ενώ για αρκετά φάρμακα και για τους περισσότερους μύκητες δεν υπάρχουν ακόμα καθορισμένα κριτήρια αξιολόγησης των ορίων ευαισθησίας. Τα βιβλιογραφικά δεδομένα και η εμπειρία είναι σημαντικά βοηθήματα στην εκτίμηση της MIC ως ενδεικτικού αποτελέσματος ευαισθησίας ή αντοχής του μύκητα. Μέθοδοι που κυρίως χρησιμοποιούνται διεθνώς για τον έλεγχο της ευαισθησίας των ασπεργίλλων είναι οι μέθοδοι των μικροαραιώσεων, όπως προτείνονται από το CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) των Η.Π.Α. με την οδηγία Μ38-Α2 και από την EUCAST (European Committee for Antibiotic Susceptibility Testing) με την οδηγία για τους νηματοειδείς μύκητες (E. DEF 9.1), καθώς και εμπορικές τυποποιημένες μέθοδοι, όπως οι ταινίες διαβαθμισμένης πυκνότητας Ε-test (ΑΒ Biodisk, Solna, Sweden) και η μέθοδος μικροαραιώσεων Sensititre YeastOne (TREK Diagnostic Systems). Επίσης γίνεται προσπάθεια αξιολόγησης των δίσκων διάχυσης στο άγαρ. Πέρα από τον παραπάνω έλεγχο, αν και δεν περιλαμβάνεται στις διαγνωστικές δοκιμασίες, πολύ σημαντική τα τελευταία χρόνια αναδεικνύεται η παρακολούθηση των θεραπευτικών φαρμακευτικών επιπέδων (TDM-Therapeutic Drug Monitoring) διαφόρων αντιμυκητιακών φαρμάκων, κυρίως στον ορό των ασθενών, αλλά και σε άλλα βιολογικά υγρά. Σκοπός της παρακολούθησης είναι να γίνει μεγαλύτερη η πιθανότητα θεραπευτικής επιτυχίας και να ελαχιστοποιηθεί η πιθανότητα τοξικής δράσης. Να δημιουργηθεί δηλαδή ένα πλαίσιο εξατομίκευσης της θεραπείας. Απαραίτητο είναι να μπορούν να διακριθούν και να μελετηθούν τόσο η μητρική ουσία όσο και οι πιθανοί μεταβολίτες της. Οι μεταβολίτες αυτοί μπορεί να έχουν σημαντική συμμετοχή στην αποτελεσματικότητα ή την τοξικότητα του φαρμάκου συνολικά. Γενικά, για να έχει κλινική αξία και λόγο να πραγματοποιηθεί η παρακολούθηση των θεραπευτικών φαρμακευτικών επιπέδων, πρέπει να υπάρχει ακριβής, γρήγορη και ανταποδοτική του κόστους της μέθοδος, μεταβαλλόμενη σχέση μεταξύ δόσης του φαρμάκου και συ- 183 γκεντρώσεων και συγκεκριμένη σχέση μεταξύ συγκεντρώσεων του φαρμάκου στο αίμα και τοξικότητας ή θεραπευτικής επιτυχίας66. Φάρμακα που χρησιμοποιούνται ευρέως στις διεισδυτικές ασπεργιλλώσεις για την προφύλαξη και τη θεραπεία, για τα οποία θεωρείται ότι υπάρχει ανάγκη παρακολούθησης των επιπέδων τους είναι τρεις τριαζόλες: η ιτρακοναζόλη, η βορικοναζόλη και η ποζακοναζόλη. Σε ορισμένες χώρες, όπως η Μεγάλη Βρετανία, η μέτρηση της ιτρακοναζόλης σε εβδομαδιαία βάση, τείνει να γίνει καθιερωμένη πρακτική, είτε επιτόπου σε εξειδικευμένα κέντρα είτε με παραπομπή στα εργαστήρια αναφοράς. Η ιτρακοναζόλη είναι αποτελεσματική για την προφύλαξη και τη θεραπεία των ασπεργιλλώσεων και συνιστάται να μετράται στους ασθενείς που υπάρχει υποψία χαμηλής απορρόφησης, αναμένονται πιθανές αλληλεπιδράσεις με άλλα φάρμακα και όταν υπάρχει πιθανή θεραπευτική αποτυχία ή έχει συμβεί υποτροπή της λοίμωξης. Μεγάλη μεταβλητότητα των συγκεντρώσεων της ιτρακοναζόλης στον ορό έχει περιγραφεί σε διάφορες κατηγορίες ασθενών67. Για τις νεότερες τριαζόλες βορικοναζόλη και ποζακοναζόλη υπάρχουν ενδείξεις ότι η μέτρηση των επιπέδων είναι χρήσιμη λόγω ποικίλης βιοδιαθεσιμότητας και προς αποφυγή επιπλοκών. Η βορικοναζόλη είναι φάρμακο πρώτης γραμμής για τη θεραπεία των διεισδυτικών μυκητιάσεων. Παρουσιάζεται όμως μεταβλητότητα των συγκεντρώσεών της μεταξύ ασθενών υπό την ίδια δοσολογία67. Η ποζακοναζόλη χρησιμοποιείται για τη θεραπεία εκρίζωσης σε ασθενείς με διεισδυτική ασπεργίλλωση και για την προφύλαξη ουδετεροπενικών ασθενών και ληπτών μοσχευμάτων αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Επίσης παρουσιάζεται σημαντική μεταβλητότητα των επιπέδων της μεταξύ των ασθενών67. Υπάρχουν διάφορες μέθοδοι για τη μέτρηση των συγκεντρώσεων των αντιμυκητιακών φαρμάκων. Οι μικροβιολογικές μέθοδοι είναι απλούστερες και φθηνότερες, αλλά οι αναλυτικές προσφέρουν μεγαλύτερη ευαισθησία και επαναληψιμότητα · επιπλέον επιτρέπουν τον προσδιορισμό των επιμέρους μεταβολιτών68. Από τις μη μικροβιολογικές 184 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία μεθόδους, διάφορες έχουν χρησιμοποιηθεί όπως η αέριος-υγρή χρωματογραφία, φθορισμομετρικές τεχνικές, ενζυματικές, ανοσοενζυμικές, υγρή χρωματογραφία υψηλής ευκρίνειας (HPLC) και πιο πρόσφατα υγρή χρωματογραφία σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας. Η μέθοδος που έχει επικρατήσει, λόγω της σχετικά εύκολης εφαρμογής της, αλλά κυρίως λόγω της μεγάλης ευαισθησίας και ακρίβειάς της είναι η HPLC, ενώ η φασματομετρία μάζας προσφέρει ακόμα μεγαλύτερη ευαισθησία, αλλά με πολύ μεγαλύτερο κόστος. Συμπέρασμα Καθώς στους ασπεργίλλους υπάρχει σημαντική μεταβλητότητα μεταξύ των ειδών, η ταυτοποίηση του είδους πρέπει να βασίζεται σε συστήματα που να έχουν δημιουργηθεί βάσει σημαντικού αριθμού για το κάθε είδος. Συνδυασμός μεθόδων πρέπει να χρησιμοποιείται με την αξιοποίηση μορφολογικών και μοριακών μεθόδων. Δημόσιας πρόσβασης, ευρείας έκτασης βάσεις αξιολογημένων αλληλουχιών DNA ασπεργίλλων πρέπει να δημιουργηθούν ταυτόχρονα με την παράλληλη αξιολόγηση και χρήση των μοριακών μεθόδων. Επιτακτική είναι συνολικά η ανάγκη τυποποίησης των μεθόδων, των οδηγιών και των πρωτοκόλλων μεταξύ των μυκητολογικών εργαστηρίων. Καθώς υπάρχουν κενά ακόμα στην επιλογή και αξιολόγηση των καταλληλότερων φαινοτυπικών και άλλων μεθοδολογιών, χρειάζεται περαιτέρω έρευνα σε αυτόν τον τομέα. Χρειάζεται επίσης περισσότερη προσπάθεια στην εκπαίδευση ιατρικού και λοιπού επιστημονικού προσωπικού στα θέματα της ακριβούς ταυτοποίησης, της άμεσης μικροσκόπησης, της επιλογής και χρήσης των κατάλληλων θρεπτικών υλικών καθώς και της κλινικής ωφέλειας και της ανταπόδοσης του κόστους από την εφαρμογή της μιας ή της άλλης τεχνικής. Σε πολλές κλινικές περιπτώσεις η γρήγορη απόφαση για την κατάλληλη θεραπεία είναι συχνά περισσότερο σημαντική από την άμεση ταυτοποίηση του είδους ενός συγκεκριμένου στελέχους. Αλ- λά και η ταυτοποίηση του είδους μπορεί να δώσει σημαντικές πληροφορίες για την κατάλληλη επιλογή της θεραπείας. Ταυτόχρονα όμως διάφορα στελέχη ενός είδους μπορεί να διαφέρουν ως προς την ευαισθησία τους στα αντιμυκητιακά φάρμακα. Η ταυτοποίηση του είδους είναι επίσης χρήσιμη για την πρόγνωση της πορείας της νόσου, τον εντοπισμό των νοσοκομειακών λοιμώξεων, την επιδημιολογία και διάφορα νομικά θέματα. Σε αυτές τις περιπτώσεις η ακρίβεια της ταυτοποίησης είναι πιο σημαντική από την ταχύτητα. Από τα περίπου 200 είδη ασπεργίλλων που υπάρχουν στη φύση, περίπου 40 έχουν αναφερθεί ως αίτιο μυκητίασης. Τα πιο συχνά είδη στις ασπεργιλλώσεις του ανθρώπου είναι οι A. fumigatus, A. flavus, A. terreus και A. niger. Συγχρόνως όμως, είναι και εκείνοι που αναφέρεται πιο συχνά ότι αναπτύσσονται σε καλλιέργειες υλικών από το περιβάλλον69. Τα είδη των ασπεργίλλων που προκαλούν ασπεργιλλώσεις δεν περιορίζονται μέσα σε ελάχιστους ταξινομικούς τομείς του γένους, αλλά είναι πολύ πιο διάσπαρτα. Οι ασπεργιλλώσεις είναι απόλυτα ευκαιριακές λοιμώξεις και θεωρητικά οποιοδήποτε είδος ασπεργίλλου θα μπορούσε να προκαλέσει νόσο, κάτω από τις κατάλληλες συνθήκες. Αυτό που έχει πολύ μεγάλη σημασία για τον άρρωστο είναι η δυνατότητα γρήγορης διάγνωσης της πιθανής μυκητίασης και η εξακρίβωση των φαρμάκων που είναι αποτελεσματικά για το συγκεκριμένο λοιμογόνο στέλεχος. Στη σύγχρονη πρακτική δεν υπάρχουν αξιολογημένες μεθοδολογικές προσεγγίσεις που να μην επηρεάζονται από μεταβολές στο επίπεδο της ταυτοποίησης και άρα η ταυτοποίηση και ό,τι συνεπάγεται αυτή (εκπαίδευση, αξιολόγηση, τυποποίηση) είναι απαραίτητα στην κλινική πράξη. Διεύθυνση επικοινωνίας: Τιμολέων-Αχιλλέας Βυζαντιάδης Επίκουρος Καθηγητής Ιατρικής Σχολής Α΄ Εργαστήριο Μικροβιολογίας Ιατρική Σχολή Α.Π.Θ. 54124 Θεσσαλονίκη e-mail: [email protected] Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 4, 2010 185 Summary ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Laboratory diagnosis and follow-up of invasive aspergilloses 1.De Pauw B, Walsh TJ, Donnelly JP, et al. European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group; National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group (EORTC/ MSG) Consensus Group. Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/ Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group (EORTC/ MSG) Consensus Group. Clin Infect Dis 2008, 46(12): 1813-1821. 2.Kontoyiannis DP, Sumoza D, Tarrand JJ, et al. Significance of aspergillemia in patients in patients with cancer: a 10-year study. Clin Infect Dis 2002, 31: 188-189. 3.Ascioglu S, Rex JH, de Pauw B, et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clin Infect Dis 2002, 34: 7-14. 4.Kibbler CC, Hamilton A. Medical mycology in the UK: time to stop the dry rot. Commun Dis Public Health 2000, 3: 80-81. 5.Denning DW, Kibbler CC, Barnes RA. British Society for Medical Mycology proposed standards of care for patients with invasive fungal infections. The Lancet Infectious Diseases 2003, 3: 230-240. 6.Barnes RA, Denning DW, Evans EGV, et al for the British Society for Antimicrobial Chemotherapy and Denning DW, Evans EGV, Kibbler CC, et al for the British Society for Medical Mycology. Fungal infections: a survey of laboratory services for diagnosis and treatment. CDR Rev 1996, 6: R69. 7.Tong KB, Lau CJ, Murtagh K, et al. The economic impact of aspergillosis: analysis of hospital expenditures across patient subgroups. Int J Infect 2009, 13: 24-36. 8.Levy H, Horak DA, Tegtmeier BR, at al. The value of bronchoalveolar lavage and bronchial washings in the diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis. Respir Med 1992, 86: 243-248. 9.Pagano L, Pagliari G, Basso A, et al. The role of bronchoalveolar lavage in the microbiological diagnosis of pneumonia in patients with haema- T-A. VYZANTIADIS 1st Department of Microbiology, Medical School, Aristotle University of Thessaloniki The last years there has been an increasing incidence of invasive aspergilloses in the immunocompromised patients. It is the most common among the invasive mycoses due to moulds. Simultaneously, despite the important progress and the constant awareness of the scientific community, there are still problems concerning the laboratory diagnosis and follow-up. Internationally, there is an effort for combined and evidence-based diagnostic approach in order to provide quicker and more efficient diagnosis. This will help to timely and efficient pre-emptive treatment. According to the contemporary laboratory practice, it seems that the combined approach of phenotypic, serological and molecular techniques could offer better results. In an international level, common is the belief (and not only for aspergilloses) that there is a need for standardisation of methods, guidelines and protocols used by the mycology laboratories. As there are still gaps in the choice and evaluation of the more appropriate methodologies, further research is need at this field. Also, simultaneously to the evaluation and use of the modern techniques, further effort is need on the training of medical and other scientific personnel on the issues of exact identification, direct microscopy, choice of the culture media, clinical value and cost effectiveness by the application of one or other methodology. (Key words: Aspergilloses, laboratory diagnosis, follow-up). 186 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία tological malignancies. Ann Intern Med 1997, 29: 535-540. 10.Ruchel R, Schaffrinski M. Versatile fluorescent staining of fungi in clinical specimens by using the optical brightener Blankophor. J Clin Microbiol 1999, 37: 2694-2696. 11.Glenn DR, Goodman NL. Laboratory diagnosis, p. 82-96, in: Merz WG, Hay RJ. Topley and Wilson’s Microbiology & Microbial infections, Medical Mycology, 10th ed. London, England: ASM Press, 2005. 12.de Hoog GS, Guarro J, Gene J, Figueras MJ. Atlas of Clinical Fungi, 2nd ed., Centraalbureau voor Schimmelcultures / Universitat Rovira i Virgili, 2000. 13.Balajee SA, Sigler L, Brandt ME. DNA and the classical way: identification of medically important molds in the 21st century. Med Mycol 2007, 45(6): 475-490. 14.Perfect JR, Cox GM, Lee JY, Kauffman CA, de Repentigny L, Chapman SW, Morrison VA, Pappas P, Hiemenz JW, Stevens DA · Mycoses Study Group. The impact of culture isolation of Aspergillus species: a hospital-based survey of aspergillosis. 2001, 33(11): 1824-1833. 15.McClenny N. Laboratory detection and identification of Aspergillus species by microscopic observation and culture: the traditional approach. Medical Mycology 2005, 43: S125-S128 16.Balajee SA, Gribskov JL, Hanley E, et al. Aspergillus lentulus sp. nov., a new sibling species of A. fumigatus. Eukaryot Cell 2005, 4(3): 625-632. 17.Sutton DA, Sanche SE, Revankar SG, et al. In vitro amphotericin B resistance in clinical isolates of Aspergillus terreus, with a head-to-head comparison to voriconazole. J Clin Microbiol 1999, 37: 2343-2345. 18.Herbrecht R, Denning DW, Patterson TF, et al. Randomised comparison of voriconazole and amphotericin B in primary therapy of invasive aspergillosis. N Engl J Med 2002, 347: 408-415. 19.Segal BH, DeCarlo ES, Kwon-Chung KJ, et al. Aspergillus nidulans infection in chronic granulomatous disease. Medicine 1998, 77: 345-354. 20.Moore CB, Sayers N, Mosquero J, et al. Antifungal drug resistance in Aspergillus. J Infect 2000, 41: 203-220. 21.Nalesnik MA, Myerowitz RL, Jenkins R, et al. Significance of Aspergillus species isolated from respiratory secretions in the diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis. J Clin Microbiol 1980, 11: 370-376. 22.Yu VL, Muder RR, Poorsattar A. Significance of isolation of Aspergillus from the respiratory tract in diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis. Am J Med 1986, 81: 249-254. 23.Horvath JA, Dummer S. The use of respiratorytract cultures in the diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis. Am J Med 1996, 100: 171-178. 24.Tarrand JJ, Lichterfeld M, Warraich I, et al. Diagnosis of invasive septate mold infections. A correlation of microbiological culture and histologic or cytologic examination. Am J Clin Pathol 2003, 119: 854-858. 25.Brandt ME, Warnock DW. Laboratory aspects of medical mycology, p. 3-22, in: Dismukes WE, Pappas PG, Sobel JD. Clinical Mycology. New York, USA: Oxford University Press, 2003. 26.Evans EGV, Richardson MD. Medical mycology: a practical approach. Oxford, England: IRL Press, 1989. 27.Raper BK, Fennell DI. The Genus Aspergillus. Baltimore MD, USA: The Williams and Wilkins Company, 1965. 28.Balajee SA, Marr KA. Phenotypic and genotypic identification of human pathogenic aspergilli. Future Microbiol 2006, 1(4): 435-445. 29.American Society for Microbiology. Washington, DC: Getting the work done! Clinical microbiology workforce issues; [Powerpoint presentations for ASM’s May 2004 General Meeting, New Orleans; cited 2004 June 23]. Available from: http://www.asm.org/Policy/index.asp?bid = 28422 30.Gams W, Christensen M, Onions AH, et al. Infrageneric taxa of Aspergillus. In: Samson RA, Pitt JI. Advances in Penicillium and Aspergillus systematics. New York: Plenum Press, 1985, 55-62. 31.Balajee SA, Houbraken J, Verweij PE, et al. Aspergillus species identification in the clinical setting. Studies in Mycology 2007, 59: 39-46. 32.Einsele H, Hebart H, Gottfried R. Detection and identification of fungal pathogens in blood by using molecular probes. J Clin Microbiol 1997, 35 (6): 1353-1360. 33.Kanbe T. Molecular approaches in the diagnosis of dermatophytosis Mycopathologia 2008, 166 (56): 307-317. 34.Leaw SN, Chang HC, Sun HF, et al. Identification of medically important yeast species by se- Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 4, 2010 quence analysis of the internal transcribed spacer regions. J Clin Microbiol 2006, 44: 693-699. 35.Chen YC, Eisner JD, Kattar MM, et al. Polymorphic internal transcribed spacer region 1 DNA sequences identify medically important yeasts. J Clin Microbiol 2001, 39 (11): 4042-4051. 36.Chen YC, Eisner JD, Kattar MM, et al. Identification of medically important yeasts using PCR-based detection of DNA sequence polymorphisms in the internal transcribed spacer 2 region of the rRNA genes. J Clin Microbiol 2000, 38 (6): 2302-2310. 37.Henry T, Iwen PC, Hinrichs SH. Identification of aspergillus species using internal transcribed spacer regions 1 and 2. J Clin Microbiol 2000, 38 (4): 1510-1515. 38.Borman AM, Linton CJ, Miles SJ, et al. Molecular identification of pathogenic fungi. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2008, 61 (suppl 1): i7-i12. 39.Arabatzis M, Bruijnesteijn van Coppenraet LE, Kuijper EJ, et al. Diagnosis of common dermatophyte infections by a novel multiplex real-time polymerase chain reaction detection/identification scheme. Br J Dermatol 2007, 157(4): 681-689. 40.Kardjeva V, Summerbell R, Kantardjiev T, et al. Forty-eight-hour diagnosis of onychomycosis with subtyping of Trichophyton rubrum strains. J Clin Microbiol 2006, 44(4): 1419-1427. 41.Balajee SA, Borman AM, Brandt ME, et al. Sequence-Based Identification of Aspergillus, Fusarium, and Mucorales Species in the Clinical Mycology Laboratory: Where Are We and Where Should We Go from Here? J Clin Microbiol 2009, 47 (4): 877-884. 42.Nilsson RH, Ryberg M, Kristiansson E, et al. 2006. Taxonomic reliability of DNA sequences in public sequence databases: a fungal perspective. PLoS One 2006, 1: e59. 43.Hinrikson HP, Hurst SF, Lott TJ, et al. Assessment of ribosomal large-subunit D1-D2, internal transcribed spacer 1, and internal transcribed spacer 2 regions as targets for molecular identification of medically important Aspergillus species. J Clin Microbiol 2005, 43: 2092-2103. 44.Alcazar-Fuoli L, Mellado E, Alastruey-Izquierdo A, et al. Aspergillus section Fumigati: antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrob Agents Chemother 2008; 52: 1244-1251. 187 45.Varga J, Houbraken J, Van Der Lee HA, et al. Aspergillus calidoustous sp. nov., causative agent of human infections previously assigned to Aspergillus ustus. Eukaryot Cell 2008, 7: 630-638. 46.Hong SB, Go SJ, Shin HD, et al. Polyphasic taxonomy of Aspergillus fumigatus and related species. Mycologia 2005, 97: 1316-1329. 47.White PL, Barton R, Guiver M, et al. A consensus on fungal polymerase chain reaction diagnosis? A United Kingdom-Ireland evaluation of polymerase chain reaction methods for detection of systemic fungal infections. J Mol Diagn 2006, 8: 376-384. 48.White PL, Bretagne S, Klingspor L, et al. Aspergillus PCR: One Step Closer to Standardization. J Clin Microbiol 2010, 48(4): 1231-1240. 49.Maertens J, Verhaegen J, Lagrou K, et al. Screening for circulating galactomannan as a noninvasive diagnostic tool for invasive aspergillosis in prolonged neutropenic patients and stem cell transplantation recipients: a prospective validation. Blood 2001, 97: 1604-1610. 50.Rohrlich P, Sarfati J, Mariani P, et al. Prospective sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for serum galactomannan : early predictive value and clinical use in invasive aspergillosis. Pediatr Infect Dis J 1996, 15: 232-237. 51.Ulusakarya A, Chachaty E, Vantelon JM, et al. Surveillance of Aspergillus galactomannan antigenemia for invasive aspergillosis by enzymelinked immunosorbent assay in neutropenic patients treated for haematological malignancies. Hemato J 2000, 1: 111-116. 52.Maschmeyer G, Calandra T, Singh N, Wiley J, Perfect J. Invasive mould infections: a multi-disciplinary update. Med Mycol. 2009, 47(6): 571-583. 53.Maertens JA, Klont R, Masson C, et al. Optimization of the cutoff value for the Aspergillus double-sandwich enzyme immunoassay. Clin Infect Dis 2007, 44(10):1329-1336. 54.Miyazaki T, Kohno S, Mitsutake K, et al. Plasma (1-3)-beta–D-glucan and fungal antigenemia in patients with candidemia, aspergillosis and cryptococcosis. J Clin Microbiol 1995, 33: 3115-3118. 55.Obayashi T, Yoshida M, Mori T, et al. Plasma (1-3)-beta–D-glucan measurement in diagnosis of invasive deep mycosis and fungal febrile episodes. Lancet 1995, 345: 17-20. 56.Yasa K, Goto H, Iguchi M, et al. Evaluation of the diagnostic value of the measurement of 188 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία (1-3)-beta–D-glucan in patients with pulmonary aspergillosis. Respiration 1996, 63: 78-83. 57.Senn L, Robinson JO, Schmidt S, et al. 1,3-BetaD-glucan antigenemia for early diagnosis of invasive fungal infections in neutropenic patients with acute leukemia. Clin Infect Dis. 2008 Mar 15, 46(6): 878-885. 58.Lass-Flörl C. The changing face of epidemiology of invasive fungal diseases in Europe. Mycoses 2009, 52: 197-205. 59.Lass-Flörl C, Alastruey-Izquiderdo A, CuencaEstrella M, et al. In vitro activities of various antifungal drugs against Aspergillus terreus: Global assessment using the methodology of the European committee on antimicrobial susceptibility testing. Antimicrob Agents Chemother 2009, 53: 794-795. 60.Snelders E, van der Lee H, Kuijper J et al. Emergence of azole resistance in Aspergillus fumigatus and spread of a single resistance mechanism. Plos Med 2009, 5: e 219. 61.van der Linden J, Jansen R, Bresters D et al. Azole-resistant central nervous system aspergillosis. Clin Infect Dis 2009, 48: 1111-1113. 62.Verweij PE, Howard SJ, Melchers WJ, et al. Azole-resistance in Aspergillus: proposed nomenclature and breakpoints. Drug Resist Updat 2009, 12(6):141-147. 63.Ruchel R, Perske C, Glass B, et al. A case of pulmonary aspergillosis with lack of response to caspofungin. Rev Iberoam Micol 2006, 23: 94–96. 64.Alastruey-Izquierdo A, Cuesta I, Houbraken J, et al. In vitro activity of nine antifungal agents against clinical isolates of Aspergillus calidoustus. Med Mycol 2010, 48(1): 97-102. 65.Varga J, Houbraken J, Van Der Lee HA, et al. Aspergillus calidoustus sp. nov., causative agent of human infections previously assigned to Aspergillus ustus. Eukaryot Cell 2008, 7(4): 630-638. 66.Andes D, Pascual A, Marchetti O. Antifungal therapeutic drug monitoring: established and emerging indications. Antimicrob Agents Chemother 2009, 53(1): 24-34. 67.Hope WW, Billaud EM, Lestner J, et al. Therapeutic drug monitoring for triazoles. Curr Opin Infect Dis 2008, 21(6): 580-586 68.Warnock DW, Turner A, Burke J. Comparison of high performance liquid chromatographic and microbiological methods for determination of itraconazole. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 1988, 21: 93-100. 69.Klich MA. Biogeography of Aspergillus species in soil and litter. Mycologia 2002, 94: 21-27. Υποβλήθηκε: 16/09/2010 Εγκρίθηκε: 09/11/2010 ΣΩΣΤΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΙΣ ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΤΟΥ ΠΡΟΗΓΟΥΜΕΝΟΥ ΤΕΥΧΟΥΣ Ερώτηση 1η: Ερώτηση 2η: Ερώτηση 3η: Ερώτηση 4η: Γ. Δ. Β. Γ. PCR στο ΕΝΥ Noro-ιός προκαλεί συχνότερα μεγάλες επιδημίες Η ανίχνευση του πυρηνικού οξέος* του ιού με RT-PCR Αντιγόνο του ιού στις βλάβες με άμεσο ανοσοφθορισμό * Στην 3η ερώτηση του προηγούμενου τεύχους, από τυπογραφικό λάθος, αναφέρεται «ανίχνευση του DNA αντί RNA του ιού» Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β’, Τόμος 15, Τεύχος 4, σελ. 189-193 2010 ΜΕΛΕΤΕΣ ΕΜΒΟΛΙΑΣΜΟΣ ΕΝΑΝΤΙ ΤΟΥ ΙΟΥ Α (Η1Ν1) ΣΤΟ ΝΟΜΟ ΦΩΚΙΔΑΣ Η. ΠΕΡΥΣΙΝΑΚΗΣ1, Π. ΒΑΣΙΛΟΠΟΥΛΟΣ2, Π. ΠΝΕΥΜΑΤΙΚΟΥ3, Ν. ΖΑΠΑΝΙΩΤΗΣ3, Π. ΤΣΙΑΧΡΗΣ3, Π. ΔΗΜΟΛΙΑΝΗΣ3, Ε. ΠΑΠΟΥΛΙΑ3 Στη μελέτη που ακολουθεί, καταγράφεται η ανταπόκριση των κατοίκων του Νομού Φωκίδας στον εμβολιασμό που έγινε σύμφωνα με τις οδηγίες του Π.Ο.Υ. για την αντιμετώπιση τυχόν πανδημίας γρίπης από τον ιό Α (Η1Ν1). Ο εμβολιασμός έγινε στο διάστημα από 17/11/2009 έως 5/1/2010. Συμπεραίνεται ότι οι κάτοικοι της περιοχής δεν επείσθησαν από τις σχετικές ομιλίες, τα Μ.Μ.Ε. και τα έντυπα τα οποία διανεμήθηκαν και το ποσοστό των εμβολιασθέντων υπήρξε ιδιαίτερα χαμηλό (1,01%). (Λέξεις ευρετηρίου: Η1Ν1, πανδημία, εμβολιασμός, ΜΜΕ και γρίπη). Την εμφάνιση και την τυποποίηση τον Μάρτιο του 2009 του νέου ιού της γρίπης Α (Η1Ν1) 1-3 ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (ΠΟΥ) 4 αντιμετώπισε αρχικά με προσπάθειες περιορισμού της εξάπλωσής του και στη συνέχεια με οδηγίες για προστασία των νοσηλευομένων, καθώς και μαζικό εμβολιασμό των επίνοσων ατόμων με έμφαση σε εκείνα υψηλού κινδύνου. Στις 16 Νοεμβρίου του 2009 ξεκίνησε πανελλαδικά η διαδικασία εμβολιασμού σε όλα τα νοσοκομεία και κέντρα υγείας της χώρας. Προτεραιότητα είχαν τα παιδιά άνω των έξι μηνών, αλλά και ενήλικοι με χρόνια προβλήματα υγείας, οι 1 Χειρουργική Κλινική, Γ.Ν. Άμφισσας Φυλακές Μαλανδρίνου 3 Μικροβιολογικό Τμήμα, Γ.Ν. Άμφισσας 2 έγκυες γυναίκες που βρίσκονταν στο 2ο και 3ο τρίμηνο της κύησης, οι εργαζόμενοι σε χώρους με παιδιά ηλικίας κάτω των έξι μηνών και οι επαγγελματίες υγείας. Στο πλαίσιο αυτό, την ίδια χρονική περίοδο ξεκίνησε το πρόγραμμα εμβολιασμού και στο νομό Φωκίδας, ενώ παράλληλα οι κάτοικοι διαμόρφωσαν γνώμη από τα μέσα μαζικής ενημέρωσης, κυρίως την τηλεόραση, από ειδικές ομιλίες στις σχολικές κοινότητες5 και τα νοσοκομεία6, και από ενημερωτικά έντυπα που αναρτήθηκαν ή διανεμήθηκαν. Σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η καταγραφή της ανταπόκρισης των κατοίκων του νομού Φωκίδας στην εκστρατεία του ΠΟΥ και του Κέντρου Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων (ΚΕΕΛΠΝΟ)7 για προληπτικό εμβολιασμό έναντι του ιού Α (Η1Ν1). Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Αριθμός ατόμων 190 Διάγραμμα 1. Ηλικιακή κατανομή του συνόλου των εμβολιασθέντων. 1-9 10-19 20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79 80-89 90-99 Ηλικία σε έτη Αποτελέσματα Την ευθύνη της οργάνωσης του εμβολιασμού σε τοπικό επίπεδο ανέλαβε η επιτροπή νοσοκομειακών λοιμώξεων του Γ.Ν. Άμφισσας με βάση τις οδηγίες του ΚΕΕΛΠΝΟ. Έγινε επιτροπή γρίπης και συνεργεία εμβολιασμού. Λειτούργησαν τρία εμβολιαστικά κέντρα στις βασικές μονάδες Δημόσιας Υγείας του νομού, ειδικότερα στο Νοσοκομείο Άμφισσας και στα Κέντρα Υγείας Ιτέας και Λιδορικίου. Επιπλέον εμβολιαστική ομάδα κάλυψε τις ανάγκες των κρατουμένων στις φυλακές ανδρών υψίστης ασφαλείας του Μαλανδρίνου, με επί τόπου εμβολιασμό. Η έναρξη του εμβολιασμού πραγματοποιήθηκε στις 17/11/2009. Το 1ο δεκαήμερο εμβολιάστηκαν ομάδες υψηλού κινδύνου και στη συνέχεια εμβολιάζονταν όσοι προσέρχονταν με βάση το αναρτημένο πρόγραμμα ωρών και ημερών. Κάθε υποψήφιος απαντούσε σε σχετικό ερωτηματολόγιο του ΚΕΕΛΠΝΟ που αφορούσε δημογραφικά στοιχεία και καταγραφή παραγόντων κινδύνου. Εμβολιάστηκαν συνολικά 605 άτομα, 493 από το γενικό πληθυσμό και 112 κρατούμενοι. Ο γενικός πληθυσμός του νομού Φωκίδας, σύμφωνα με την απογραφή του 2009, είναι 48.382 άτομα, διαμορφώνοντας έτσι το ποσοστό εμβολιασμού στο 1,01%. Οι εμβολιασθέντες κρατούμενοι αποτελούσαν το 22% του συνόλου των κρατουμένων στις Φυλακές Μαλανδρίνου. Είχε προηγηθεί εμβολιασμός για την κοινή γρίπη σε ποσοστό 17%. Η κατανομή των εμβολιασθέντων του γενικού πληθυσμού βάσει του φύλου ήταν 287 άνδρες και 206 γυναίκες. Ο μέσος όρος ηλικίας των εμβολιασθέντων του γενικού πληθυσμού του νομού ήταν 61,9 έτη, με εύρος ηλικιών 1-96, ενώ των κρατουμένων 37,3 έτη, με εύρος 19-76. Στο Διάγραμμα 1 φαίνεται αναλυτικά η ηλικιακή κατανομή του συνόλου των εμβολιασθέντων. Η χρονική κατανομή της προσέλευσης καταγράφεται στο Διάγραμμα 2. Εξαιρέθηκαν οι Αριθμός ατόμων Πληθυσμός και μέθοδος Χρόνος σε εβδομάδες 0 5/1/201 29/12/2 009 22/12/2 009 09 15/12/2 0 09 8/12/20 09 1/12/20 24/11/2 009 17/11/2 009 Διάγραμμα 2. Χρονική κατανομή της προσέλευσης ατόμων για εμβολιασμό (εξαιρούνται οι κρατούμενοι). Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 4, 2010 Διάγραμμα 3. Ποσοστά προσέλευσης ανά εμβολιαστικό κέντρο. κρατούμενοι, καθώς δεν είχαν δυνατότητα επιλογής του χρόνου εμβολιασμού τους. Παρατηρήθηκε κορύφωση του αριθμού των εμβολιασθέντων την 3η εβδομάδα μετά την έναρξη του εμβολιασμού, δηλαδή από 30/11/2009 και συγκεκριμένα στις 4/12/2009. Από τους επαγγελματίες υγείας ανταποκρίθηκαν μόνο 21 άτομα που υπολείπονται κατά πολύ των 76 που εμβολιάστηκαν για την κοινή γρίπη το φθινόπωρο του 2009, ενώ καμία έγκυος γυναίκα δεν εμβολιάσθηκε στην περιοχή μας. Στο Διάγραμμα 3 φαίνεται η προσέλευση ανά εμβολιαστικό κέντρο. Ποσοστό 52,6% των εμβολιασθέντων ατόμων δεν είχε ειδικές ενδείξεις εμβολιασμού, ενώ το 47,6% ανήκε σε ομάδες υψηλού κινδύνου με επιμέρους παράγοντες κινδύνου, όπως φαίνονται στους Πίνακες 1 και 2. Συμπέρασμα - Συζήτηση Η εμφάνιση των πρώτων κρουσμάτων της νέας γρίπης στην Ελλάδα, οδήγησε στην ανάγκη Πίνακας 1. Αριθμός ατόμων και ομάδες που εμβολιάσθηκαν. Γενικού πληθυσμού Κρατούμενοι Σύνολο 493 112 605 Με ειδικές ενδείξεις Χωρίς ειδικές ενδείξεις Σύνολο 287 318 605 191 του μέσου πολίτη για αυξημένη πληροφόρηση. Η άποψη των ειδικών ότι δεν μπορεί κανείς με ασφάλεια να γνωρίζει την εξέλιξη της πανδημίας, θεωρήθηκε από το κοινό ως ένδειξη αδυναμίας και όχι γνώσης. Η αύξηση των κρουσμάτων, των παρενεργειών και των πρώτων θανάτων έτυχαν ιδιαίτερης δημοσιότητας και είχε ως συνέπεια την εμφάνιση αντιδράσεων που έφθαναν στα όρια πανικού. Όμως η καθυστερημένη έλευση του πανδημικού κύματος στην Ελλάδα αποφόρτισε τη μαζική ψυχολογία, ενώ ταυτοχρόνως επηρέασε αρνητικά την προσέλευση για εμβολιασμό. Ο εμβολιασμός αποτέλεσε το επίκεντρο ιδιότυπης αντιπαράθεσης απόψεων από τα Μ.Μ.Ε. Αβάσιμες πληροφορίες, αρνητισμός συντηρούμενος από τα Μ.Μ.Ε. αλλά και ανακριβής πληροφόρηση από το διαδίκτυο, δαιμονοποίηση του εμβολίου οδήγησε σε ανεπαρκή ανταπόκριση στον εμβολιασμό8. Ο πληθυσμός της Φωκίδας ανταποκρίθηκε στην καμπάνια των φορέων Υγείας για εμβολιασμό έναντι της γρίπης Α (Η1Ν1) με το εξαιρετικά χαμηλό ποσοστό του 1,01% που υπολείπεται Πίνακας 2. Αριθμός ατόμων (και % συχνότητα) με επιμέρους ειδικές ενδείξεις, που εμβολιάσθηκαν. Ειδικές ενδείξεις Αριθ. (%) Αιματολογικές διαταραχές Αιμοδότες Ανοσοκατασταλμένοι Άτομα που φροντίζουν βρέφη Επαγγελματίες υγείας Μεταβολικές διαταραχές Νευρολογικά νοσήματα Σακχαρ. διαβήτης Χρ. ηπατικές διαταραχές Χρ. νεφρικές διαταραχές Χρ. αναπνευστικά νοσήματα Χρ. καρδιαγγειακά νοσήματα 10 1 13 5 21 12 10 39 5 14 58 80 3,5 0,30 4,5 1,7 7,3 4,2 3,5 13,6 1,7 4,9 20,2 27,9 Κρατούμενοι φυλακών 112 39,0 Σύνολο 287 192 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία σημαντικά του απαιτούμενου για την προστασία έναντι της πανδημίας (60%), ενώ συνολικά στον ελλαδικό χώρο την αντίστοιχη χρονική περίοδο, σύμφωνα με στατιστικά στοιχεία του ΚΕΕΛΠΝΟ εμβολιάστηκαν 358.131 άτομα, ποσοστό που αντιστοιχεί στο 3,2% του πληθυσμού9. Κυρίως ανταποκρίθηκαν οι άνω των εξήντα ετών οι οποίοι είναι εξοικειωμένοι με τους εμβολιασμούς και ιδιαίτερα με εκείνο της κοινής γρίπης, ενώ δεν παρατηρήθηκε ανάλογη ανταπόκριση από παιδιά. Οι κρατούμενοι με μικρότερο Μ.Ο. ηλικίας, είχαν την ίδια συμμετοχή με εκείνη προς το εμβόλιο για την κοινή γρίπη. Όσοι αποφάσισαν τον εμβολιασμό προσήλθαν τις ημέρες κορύφωσης της προσπάθειας του ΚΕΕΛΠΝΟ και της επικαιρότητας του θέματος, δηλαδή το πρώτο δεκαπενθήμερο του Δεκεμβρίου 2009 και σταμάτησαν εντελώς μετά το πρώτο δεκαήμερο του Ιανουαρίου 2010. Η προσέλευση ανά εμβολιαστικό κέντρο αντανακλά την πληθυσμιακή κατανομή. Η ειδική ομάδα με την καλύτερη ανταπόκριση ήταν εκείνη των κρατουμένων και ακολούθησαν όσοι είχαν επιβαρυντικούς παράγοντες από το καρδιαγγειακό σύστημα, χρόνια αναπνευστικά προβλήματα και σακχαρώδη διαβήτη. Σύμφωνα με τηλεφωνική έρευνα που πραγματοποίησε το Πανεπιστήμιο Αθηνών 10, σχετικά με το σύνδρομο γρίπης, συνολικά εκτιμήθηκε ότι το 17,3% του πληθυσμού είχε ήδη μολυνθεί από τον ιό της νέας γρίπης από την 35η εβδομάδα έως την 52η εβδομάδα του 2009. Παρατηρήθηκε επίσης χαμηλό ποσοστό όσον αφορά την πρόθεση εμβολιασμού. Το μεγαλύτερο ποσοστό πρόθεσης εμβολιασμού παρατηρήθηκε τις πρώτες εβδομάδες (35η έως 38η) και έφτασε μόλις το 24%, ενώ υπήρξε μια σημαντική αύξηση του αριθμού των ατόμων που ήταν σαφώς αρνητικοί απέναντι στον εμβολιασμό καθώς περνούσαν οι εβδομάδες. Σύμφωνα με τους ερευνητές, ο βασικότερος λόγος μη εμβολιασμού ήταν η πεποίθηση του κόσμου ότι το εμβόλιο δεν ήταν ασφαλές. Αύξηση παρουσίασε τις τελευταίες εβδομάδες το ποσοστό των ατόμων που αιτιολογεί την αρνητική πρόθεση με το επιχείρημα ότι η γρίπη αποτελεί ήπια νόσο καθώς και ότι δεν ανήκει στις ομάδες που προτείνονται για εμβολιασμό. Ως εκ τούτου, μέχρι την 52η εβδομάδα, είχε εμβολιαστεί μόλις το 3,3% του συνόλου των ατόμων χωρίς χρόνια νοσήματα, ενώ το αντίστοιχο ποσοστό για τα άτομα με χρόνια νοσήματα έφτανε το 11,8%. Επίσης, ενδιαφέρον παρουσιάζει η ανταπόκριση του πληθυσμού στον εμβολιασμό για την κοινή γρίπη έως τη 52η εβδομάδα που έφτασε το 16,9%, σαφώς μεγαλύτερο σε σύγκριση με το αντίστοιχο ποσοστό εμβολιασμού για τη νέα γρίπη. Η έρευνά μας έδειξε ότι οι κάτοικοι του νομού Φωκίδας δεν πείσθηκαν να εμβολιαστούν και συνεπώς ότι κινδυνεύουν από τον ιό Α (Η1Ν1), αντανακλώντας τη γενικότερη στάση που τήρησε ο πληθυσμός ολόκληρης της Ελλάδος. Καθοριστικοί παράγοντες για τη στάση αυτή ήταν τα αντιφατικά μηνύματα των ΜΜΕ και της ιατρικής κοινότητας, ο φόβος παρενεργειών από το νέο εμβόλιο και η ηπιότητα της νόσου. Ο κίνδυνος ωστόσο είναι ακόμα υπαρκτός και, ενόψει της παρασκευής του νέου εμβολίου κατά της γρίπης Α(Η1Ν1) για την περίοδο 20102011, οι υπεύθυνοι οργανισμοί Υγείας θα πρέπει να τεκμηριώσουν την απειλή του κινδύνου από το λοιμογόνο παράγοντα και να μελετήσουν πιο επισταμένα τους παράγοντες που ευαισθητοποιούν και κινητοποιούν τις κοινωνίες για να ανταποκριθούν σε παγκόσμιες προσπάθειες ελέγχου πανδημιών όπως αυτή11. Διεύθυνση Επικοινωνίας: κ. Ε. Παπούλια Διευθύντρια Μικροβιολογικού Τμήματος Γ.Ν. Άμφισσας 193 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Summary The efficacy of vaccine campaign against A(H1N1) virus H. PERISINAKIS1, P. VASILOPOULOS2, P. PNEUMATIKOU3, N. ZAPANIOTIS3, P. TSAXRIS3, P. DIMOLIANIS3, E. PAPOULIA3 1 Dept. of Surgery and Microbiology Dept.3 General Hospital of Amfissa Greece The immunization campaign against pandemic influenza A(H1N1) started in Fokida prefecture, population ≈48.000 in line with national campaign, on November 16th 2009, following the instructions of the World Health Organization. The population correspondence rate in Fokida (1,01%) was considerably lower than the national average (3,2%) and below the threshold against pandemic protection (60%). The majority of the correspondents came from elderly people (above 60yo), while 47% of the vaccinated population reported special medical indications. The population concerns on the vaccine safety was the main reason for the high levels of abstinence, further stiffened by the contradictory stance of the medical community and media, and the mildness of disease. [Key words: immunization, campaign, influenza, A(H1N1) virus]. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. ΒΙΚΙΠΑΙΔΕΙΑ. Γρίπη Η1Ν1 http://el.wikipedia.org/wiki/%CE%93%CF%81 %CE%AF%CF%80%CE%B7_%CE%971%CE% 9D1, 28 Ιουνίου, 2010 2.Αντωνιάδης Α, Καρτάλη Σ, Λεγάκης ΝΣ, Μανιάτης Α, Τσελέντης Ι. Ιατρική Μικροβιολογία 3η Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 4, 2010 193 Έκδοση, Πασχαλίδης, Αθήνα (2005) ΤΟΜΟΣ ΙΙ, Κεφ. 36, σσ. 360-367. 3.Tortora GJ, Funke BR, Case CL. Eισαγωγή στη Μικροβιολογία. Επιμέλεια: Α. Τσακρής, Πασχαλίδης Αθήνα (2009) ΤΟΜΟΣ ΙΙ, Κεφ. 24, σσ. 877880. 4.WHO (2009) World Health Organization. Global Alert and Report. http://www.who.int/csr/disease/swineflu/notes/briefing_20100810/en/index. html, 10 August, 2010 5.HEALTH VIEW. Πληροφορίες για ταξιδιώτες σχετικά με τη γρίπη από τον νέο ιό Η1Ν1. http://www.healthview.gr/%CE%BA%CE%B5% CE%B5%CE%BB%CF%80%CE%BD%CE%BF,1 Μαΐου, 2009 6. Υπουργείο Παιδείας, Διά Βίου Μάθησης και Θρησκευμάτων. Ενημέρωση για τη νέα γρίπη Α(Η1Ν1), Οδηγίες για τη νέα γρίπη http://www.ypepth.gr/el_ec_category11867.htm , 25 Νοεμβρίου, 2009. 7.Nοσοκομεία. Νέα Γρίπη Α (Η1Ν1). Ερωτήσεις και απαντήσεις για τα εμβόλια κατά του Η1Ν1 h t t p : / / w w w. n o s o k o m i a . g r / w e b / i n d e x . php?option=com_content&task=view&id=370&I temid=203, 15 Νοεμβρίου, 2009. 8.Παππάς Γ. Ψυχοκοινωνικές παράμετροι της πανδημίας Η1Ν1. Δελτίο Ελληνικής Μικροβιολογικής Εταιρείας, Νοέμβριος-Δεκέμβριος 2009, σ.σ. 335-338. 9.ΚΕΕΛΠΝΟ (2009) Κέντρο Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων. ΔΕΛΤΙΑ ΤΥΠΟΥ ΣΧΕΤΙΚΑ ΜΕ ΤΟΝ ΕΜΒΟΛΙΑΣΜΟ http://www.keel.org.gr/articles/topic/?id=917, 26 Φεβρουαρίου, 2010. 10.ΤΜΗΜΑ ΥΓΙΕΙΝΗΣ ΚΑΙ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ. ΤΗΛΕΦΩΝΙΚΗ ΕΡΕΥΝΑ ΓΡΙΠΩΔΟΥΣ ΣΥΝΔΡΟΜΗΣ– http://www.epistat.gr/, 14 Ιανουαρίου, 2010. 11.Tsiodras S, Sypsa V, Hatzakis A. The vaccination campaign against 2009 pandemic influenza A(H1N1) and its continued importance in view of the uncertainty surrounding the risk associated with the pandemic. www.eurosurveillance.org. Υποβλήθηκε: 19/9/2010 Εγκρίθηκε: 9/11/2010 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β’, Τόμος 15, Τεύχος 4, σελ. 194-198 2010 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΟΥ ΙΟΥ ΓΡΙΠΗΣ ΤΥΠΟΥ Α ΚΑΙ Β ΔΙΑ ΤΗΣ ΤΑΧΕΙΑΣ ΔΟΚΙΜΗΣ ΣΤΗΝ ΕΠΑΡΧΙΑ ΤΡΙΦΥΛΙΑΣ Μ. ΘΕΟΔΩΡΟΥ1, Α. ΜΑΣΤΡΟΓΙΑΝΝΑΚΗ-ΜΑΡΙΝΗ2, Ι. ΜΑΡΙΝΗ3, Π. ΦΛΑΡΗΣ4, Ε. ΔΡΑΚΟΥ5 Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η αναζήτηση και παρακολούθηση κρουσμάτων της νέας γρίπης Α(Η1Ν1) στον πληθυσμό της επαρχίας Τριφυλίας του Ν. Μεσσηνίας, με τη χρήση γρήγορων ποιοτικών δοκιμασιών ανοσοχρωματογραφίας για ανίχνευση του ιού της γρίπης τύπου Α και Β. Ελέγχθηκαν 114 ασθενείς με συμπτώματα εμπύρετου γριπώδους συνδρομής, 63 γυναίκες και 51 άνδρες, ηλικίας 1-82 ετών, κατά το χρονικό διάστημα 4 μηνών (Σεπτεμβρίου-Δεκεμβρίου 2009). Χρησιμοποιήθηκε ταχεία δοκιμή ποιοτικής ανίχνευσης του ιού γρίπης τύπου Α και Β. Το υλικό ήταν ρινικό ή ρινοφαρυγγικό επίχρισμα. Από τους 114 ασθενείς βρέθηκαν 30 (26,31%) θετικοί για Influenza A και 7 (6,14%) θετικοί για Influenza Β. Εκ των θετικών, 5 ασθενείς ήταν ταυτόχρονα θετικοί για Influenza Α και Β, ποσοστό 4,38% του συνόλου των εξεταζομένων. 10 από τους ελεγχθέντες διερευνήθηκαν περαιτέρω διά της μεθόδου RT-PCR. Δύο ασθενείς που βρέθηκαν αρνητικοί με την ταχεία δοκιμή, βρέθηκαν θετικοί για γρίπη Α(Η1Ν1) με RT-PCR, ενώ ένας ασθενής που ήταν θετικός τόσο στη γρίπη Α όσο και στη Β, με PCR βρέθηκε θετικός για Α(Η1Ν1) και για Influenza B. Οι υπόλοιποι 7 που ήταν θετικοί διά της ταχείας δοκιμής στη γρίπη Α, με την RT-PCR βρέθηκαν θετικοί στον Α(Η1Ν1). (Λέξεις ευρετηρίου: Εργαστηριακή διάγνωση, γρίπη Α και Β, αναζήτηση αντιγόνου του ιού). Εισαγωγή Η γρίπη είναι μία συνήθης λοίμωξη του αναπνευστικού συστήματος με πιθανότητα σοβαρών και θανατηφόρων επιπλοκών, που εμφανίζεται κάθε χρόνο, κυρίως τους χειμερινούς μήνες. Πολλές φορές παίρνει τη μορφή επιδημίας ή 1 Ιδιώτης Ιατρός Παθολόγος, 2 Ιδιώτης Ιατρός Μικροβιολόγος-Βιοπαθολόγος, 3 Φοιτήτρια Φαρμακευτικής Αθηνών, 4 Ιδιώτης Ιατρός Καρδιολόγος, 5 Φοιτήτρια Ιατρικής Αθηνών. Κυπαρισσία Ν. Μεσσηνίας και πανδημίας. Οι πανδημίες της γρίπης παρουσιάζονται ανά μεγάλα χρονικά διαστήματα και αρχίζουν ξαφνικά όταν εμφανιστεί ένα νέο στέλεχος ιού, στο οποίο ο πληθυσμός παρουσιάζει μηδενική ανοσία και είναι ικανό για συνεχόμενη μετάδοση από άνθρωπο σε άνθρωπο1. Η εμφάνιση τον Απρίλιο του 2009 των πρώτων κρουσμάτων2-4 γρίπης σε Η.Π.Α. και Μεξικό από το νέο στέλεχος του ιού της γρίπης Α(Η1Ν1), έθεσε σε συναγερμό τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (WHO) και σε συνεργασία με Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 4, 2010 τις εθνικές οργανώσεις υγείας πρώτα έθεσε την παγκόσμια κοινότητα σε επίπεδο επαγρύπνησης για πανδημία γρίπης (φάση 5) και από την 21/07/09 (για πρώτη φορά από το 1968) ανέβασε το επίπεδο συναγερμού για τη νέα γρίπη στην ανώτερη κατηγορία (φάση 6), συνιστώντας σε όλα τα κράτη να πάρουν τα ενδεικνυόμενα μέτρα για την αντιμετώπισή της5. Ο ιός της γρίπης ανήκει στην οικογένεια των ορθομυξοϊών. Περιέχει γενετικό υλικό RNA που περικλείεται από πρωτεϊνικό περίβλημα. Διακρίνεται σε τρεις τύπους Α, Β και C με βάση τα δύο δομικά αντιγονικά του στοιχεία. Στην επιφάνεια φέρει δύο τύπους γλυκοπρωτεϊνών, την αιμοσυγκολλητίνη (ΗΑ) και τη νευραμινιδάση (ΝΑ)1. Βάσει των γλυκοπρωτεϊνών αυτών αναγνωρίζονται οι υπότυποι του ιού της γρίπης που είναι περίπου 14 Η και 9 Ν. Οι γλυκοπρωτεΐνες αυτές είναι πολύ σημαντικές, γιατί εκτός του ότι αποτελούν τα μείζονα αντιγονικά υλικά του ιού που τον χαρακτηρίζουν επιδημιολογικά, είναι υπεύθυνες αφενός η ΗΑ για την ενδοκύττωση του ιού στο κύτταρο-ξενιστή, ώστε να πολλαπλασιαστεί, αφετέρου η ΝΑ στην τελική διάδοση της φλεγμονής. Η εμφάνιση ενός νέου υποτύπου ιού με εντελώς διαφορετικές ΗΑ ή ΝΑ και έναντι του οποίου δεν υπάρχει προηγούμενη α- Πίνακας 1. Τα εμπορικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν και η αναφερόμενη από τον κατασκευαστή ευαισθησία και ειδικότητα αντίστοιχα. 1.Clearview Exact Influenza A+B test Medical. Influenza A sensitivity 81,7%, Specifity 98,5% Influenza B sensitivity 88,6%, Specifity 97,4% 2.SD BIO LINE Influenza Antigen, Ingbert Germany Sensitivity 91,8%, Specifity 98,9% 3.Influ A & A Rapi - strip, Coris BIOCONCEPT, BELGIUM. Influenza A Sensitivity 76,6%, Specifity 100% Influenza B Sensitivity 97,22%, Specifity 100% 4.Rapid Influenza A/B Test Panel Ameritech Diagnostic Reagent Co. Ltd., U.S.A. Sensitivity 84,2%, Specifity 95%. Ειδικά για το flu-A test η ευαισθησία είναι 86,3% 195 νοσία στον πληθυσμό, ονομάζεται αντιγονική διαφυγή (shift) και οδηγεί σε πανδημία. Στη δημιουργία του νέου ιού Α(Η1Ν1) πιθανώς σημαντικό ρόλο έπαιξαν οι χοίροι, οι οποίοι είναι γνωστό ότι λειτουργούν ως «δοχείο γενετικής μίξης» διαφόρων ιών γρίπης και δημιουργίας νέων υποτύπων μέσω αντιγονικής μεταβολής, δηλαδή αντικατάσταση τμημάτων RNA6-8. Για την παρακολούθηση της επιδημίας νέας γρίπης στην περιοχή μας, ελέγχθηκαν 114 ασθενείς με συμπτώματα εμπύρετου γριπώδους συνδρομής, 63 γυναίκες και 51 άνδρες, ηλικίας 1-82 ετών, κατά το χρονικό διάστημα ΣεπτεμβρίουΔεκεμβρίου 2009. Το υλικό ήταν ρινικό ή ρινοφαρυγγικό επίχρισμα. Χρησιμοποιήθηκαν τέσσερα διαφορετικά εμπορικά αντιδραστήρια γρήγορης δοκιμής, ποιοτικής ανίχνευσης του ιού γρίπης τύπου Α και Β στηριζόμενα στη μέθοδο της ανοσοχρωματογραφίας (Πίνακας 2). Η ανοσοχρωματογραφία βασίζεται στην ειδική ανοσοδέσμευση του ιού σε αντισώματα έναντι του ιού γρίπης που βρίσκονται προσδεδεμένα σε μια ταινία ή μεμβράνη και συνδέουν τον ιό στην περίπτωση παρουσίας του στο δείγμα. Η παρουσία του ιού διαπιστώνεται από την ανάπτυξη ευδιάκριτου χρώματος στις ειδικές θέσεις της ταινίας, χαρακτηριστικές για τη γρίπη Α και Β. Ως δείγμα, χρησιμοποιείται ρινικό επίχρισμα που λαμβάνεται με στυλεούς που περιέχονται στη συσκευασία, και ακολούθως εκχυλίζεται σε ειδικά σωληνάρια που επίσης παρέχονται από Πίνακας 2. Ηλικίες ασθενών με θετική την ταχεία δοκιμή για αντιγόνο Η1Ν1, σε σύνολο 114 ελεγχθέντων. Ηλικία 1-10 ετών 11-20 ετών 21-30 ετών 31-40 ετών 41-50 ετών 51-60 ετών 61-70 ετών Ασθενείς Ποσοστό 9 8 4 3 2 3 1 7,89% 7,01% 3,50% 2,63% 1,75% 2,63% 0,87% 196 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία τον κατασκευαστή. Η διαδικασία της δοκιμασίας ολοκληρώνεται με απλή εμβάπτιση της ανοσοχρωματογραφικής ταινίας στο σωληνάριο με το εκχύλισμα του δείγματος και την οπτική εξέταση για την ανάπτυξη ή μη χρώματος στις ειδικές για τη γρίπη Α και Β θέσεις εντός 15 λεπτών. Κάθε ταινία φέρει επίσης ειδική θέση μάρτυρος, για την επιβεβαίωση της ορθής εκτέλεσης της δοκιμασίας. Έτσι, η αξιολόγηση καθίσταται εξαιρετικά απλή, αφού η ύπαρξη χρώματος μόνο στη θέση του μάρτυρα σημαίνει ότι το δείγμα είναι αρνητικό για γρίπη Α και Β, ενώ η ύπαρξη χρώματος στη θέση του μάρτυρα και στη θέση Α σημαίνει γρίπη Α, στο μάρτυρα και στη θέση Β σημαίνει γρίπη Β, στο μάρτυρα και στη θέση Α και Β σημαίνει γρίπη Α και Β. Εάν δεν υπάρχει χρώμα στη θέση του μάρτυρα (ανεξάρτητα από την παρουσία ή μη χρώματος σε οποιαδήποτε άλλη θέση), σημαίνει μη ορθή εκτέλεση της δοκιμασίας και επανάληψη της εξέτασης. Η όλη διαδικασία είναι εξαιρετικά απλή, εύκολη στην εφαρμογή της και γρήγορη. Αποτελέσματα Από του ς 114 ασ θ εν είς βρέθ ηκαν 30 (26,31%) θετικοί για Influenza A και 7 (6,14) θετικοί για Influenza B. Εκ των θετικών, 5 ασθενείς ήταν ταυτόχρονα θετικοί για Influenza A και B, ποσοστό 4,38% του συνόλου των εξεταζομένων. Δέκα από τους ελεγχθέντες διερευνήθηκαν περαιτέρω διά της μεθόδου RT-PCR (Ελληνικό Ινστιτούτο Pasteur). Δύο ασθενείς που βρέθηκαν αρνητικοί με ταχεία μέθοδο, ήσαν θετικοί για γρίπη Α(Η1Ν1) με RT-PCR, ενώ ένας ασθενής που ήταν θετικός στη γρίπη Α και τη Β με RT-PCR βρέθηκε θετικός για Α(Η1Ν1) και για Influenza B. Οι υπόλοιποι 7 που ήταν θετικοί με την ταχεία δοκιμή στη γρίπη Α, διά της PRTCR (Pasteur) βρέθηκαν επίσης θετικοί στον Α(Η1Ν1). Το γεγονός ότι τα παιδιά και οι νέοι ενήλικες, στην παρούσα τουλάχιστον φάση της επιδημίας, νοσούν από τον ιό πιο εύκολα σε σχέ- ση με τους μεγαλύτερους ενήλικες, όπως φαίνεται και από τον Πίνακα 2, είναι αποτέλεσμα τόσο του συγχρωτισμού στο σχολείο, όσο και της έλλειψης διασταυρούμενης ανοσίας, που πιθανώς υπάρχει στα μεγαλύτερης ηλικίας άτομα, λόγω λοίμωξης από παλαιότερους Η1Ν1 ιούς6,7. Η συντριπτική πλειονότητα των ασθενών είχε ήπια συμπτωματολογία και καλή εξέλιξη. Ανάλογα συμπεράσματα αναφέρονται και σε μελέτη σε παιδιά από το νοσοκομείο Παίδων «Η Αγία Σοφία»4. Από τους 30 ασθενείς που βρέθηκαν θετικοί στη γρίπη Α διά της ταχείας δοκιμής μόνο μία, με υποκείμενο νόσημα (σακχαρώδη διαβήτη), νοσηλεύθηκε στο νοσοκομείο λόγω αναπνευστικής δυσχέρειας, όπου έλαβε και αντι-ιική αγωγή με οσελταμιβίρη (tamiflu). Οσελταμιβίρη χορηγήθηκε και σε μία ακόμα ασθενή που είχε ιστορικό εξαιρεθέντος σαρκώματος κοιλιακού τοιχώματος και ρευματοειδή αρθρίτιδα και βρισκόταν υπό αγωγή με ανοσοκατασταλτικά, ως εκ τούτου υπαγόταν στις ομάδες υψηλού κινδύνου για σοβαρή νόσηση και εμφάνιση επιπλοκών από τη νέα γρίπη Α(Η1Ν1), σύμφωνα και με τις οδηγίες του ΚΕΕΛΠΝΟ9-11. Από τους 114 ασθενείς που εξετάστηκαν κανείς δεν είχε υποβληθεί σε εμβολιασμό για τη νέα γρίπη Α(Η1Ν1). Συζήτηση Θεμελιώδες στοιχείο στην εξέταση και διάγνωση της γρίπης, αποτελεί η κλινική εξέταση του ασθενούς από γιατρό. Ακόμα και στην πρόσφατη έκρηξη στη συχνότητα των κρουσμάτων γρίπης τύπου Η1Ν1, εκείνο που διαπιστώνεται όλο και περισσότερο είναι ότι ανεξάρτητα από το είδος της γρίπης (παλιότερα ή νεότερα στελέχη), εκείνο που καθορίζει την αναγκαιότητα ή μη νοσηλείας ή/και χορήγησης φαρμακευτικής αντιμετώπισης, είναι η εκτίμηση από το γιατρό των συμπτωμάτων, σε συνδυασμό με το ιστορικό και τη γενικότερη κατάσταση του ασθενούς (ηλικία, άλλες παθήσεις, χαρακτηριστικά «ευπαθών ομάδων» κ.λπ.). Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 4, 2010 Παράλληλα με την κλινική εκτίμηση, ουσιαστικό εργαλείο στα χέρια του γιατρού αποτελεί η εργαστηριακή διαγνωστική προσέγγιση, που θα του προσφέρει πρόσθετες πληροφορίες, ιδιαίτερα χρήσιμες για τον τελικό καθορισμό της αντιμετώπισης κάθε περίπτωσης. Τέτοιες είναι για παράδειγμα η δυνατότητα διάκρισης της γρίπης από άλλης μορφής εποχικές ιώσεις (που πολύ συχνά εμφανίζονται με παρόμοια αρχικά συμπτώματα), η διάκριση γρίπης τύπου Α και Β (η γρίπη Β προσβάλλει συχνότερα μικρές ηλικίες με κίνδυνο επιπλοκών) ή ακόμη, η ταυτοποίηση του συγκεκριμένου στελέχους γρίπης από την οποία νοσεί ο ασθενής (π.χ. Η1Ν1, Η3Ν2, κ.λπ.) όταν αυτό κρίνεται αναγκαίο. Από πλευράς εργαστηριακής διερεύνησης, τρεις είναι οι βασικές προσεγγίσεις: α) Η καλλιέργεια φαρυγγικού ή ρινικού επιχρίσματος διαγνωστικά και επιδημιολογικά, θεωρείται η μέθοδος αναφοράς. Ωστόσο, απαιτεί 5-10 ημέρες για τη λήψη αποτελέσματος, και ως εκ τούτου, σε περιόδους έξαρσης ή πανδημίας όπου ο περιορισμός της μετάδοσης του ιού είναι πρωτεύουσας σημασίας και απαιτούνται γρήγορα αποτελέσματα, δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως κύρια μέθοδος ελέγχου. Μπορεί ωστόσο να χρησιμοποιείται επικουρικά και συμπληρωματικά από κέντρο αναφοράς, για την περαιτέρω διερεύνηση θετικών δειγμάτων και την ακριβή ταυτοποίηση του στελέχους γρίπης. β) Μοριακές μέθοδοι Η λήψη των δειγμάτων του αναπνευστικού από άτομα με γριπώδη συνδρομή, που πρόκειται να εξετασθούν με μοριακές μεθόδους, πρέπει να γίνεται εντός των τριών πρώτων ημερών από την εμφάνιση των συμπτωμάτων5. Οι μοριακές μέθοδοι, που στηρίζονται στην αναζήτηση της ύπαρξης ή μη της ειδικής γονιδιακής αλληλουχίας του ιού στο προς εξέταση δείγμα, παρέχουν αυξημένη ευαισθησία (ελαχιστοποίηση ψευδώς αρνητικών δειγμάτων) και ειδικότητα (ελαχιστοποίηση ψευδώς θετικών δειγμάτων), ενώ δίνουν τη δυνατότητα ταυτοποίησης του ειδικού στελέχους της γρίπης. Σε τέτοιες μεθόδους έχει βασιστεί η μέχρι τώρα διαγνωστική προσέγγιση και 197 στη χώρα μας (Ινστιτούτο Pasteur). Ωστόσο, παρά τα σημαντικά πλεονεκτήματά τους, οι συγκεκριμένες μέθοδοι απαιτούν ειδικό εργαστηριακό εξοπλισμό, ιδιαίτερα εξειδικευμένο εργαστηριακό προσωπικό, ενώ παράλληλα, είναι και υψηλού κόστους. Τα μειονεκτήματα αυτά καθιστούν εξαιρετικά δύσκολη έως αδύνατη τη χρήση τους ως εργαλείου μαζικού ελέγχου, σε περίπτωση που θα απαιτούνται εκατοντάδες ή και χιλιάδες εργαστηριακοί έλεγχοι ημερησίως. γ) Ταχεία διαγνωστική προσέγγιση Οι μέθοδοι αυτές βασίζονται στην ταχεία ανίχνευση του ιού σε ρινικό επίχρισμα, παρέχοντας αποτέλεσμα το πολύ σε 30 λεπτά. Μειονεκτούν σε σχέση με τις μοριακές μεθόδους από πλευράς ευαισθησίας, παρέχουν όμως εφάμιλλη ειδικότητα. Οι πληροφορίες που παρέχουν αφορούν τη θετικότητα ή μη του δείγματος σε κάποιο στέλεχος γρίπης τύπου Α ή τύπου Β (παρέχοντας διάκριση μεταξύ των δύο), όχι όμως ταυτοποίηση του ειδικού στελέχους. Σημαντικά πλεονεκτήματα των μεθόδων αυτών έναντι των μοριακών τεχνικών αποτελούν: 1) το ότι δεν απαιτείται ειδικός εργαστηριακός εξοπλισμός, αλλά μπορεί να εκτελεστούν από στοιχειωδώς εκπαιδευμένο προσωπικό, 2) η ταχύτητα λήψης αποτελέσματος (συνήθως απαιτούνται μόλις 15-20 λεπτά), 3) η δυνατότητα χειρισμού μεγάλου αριθμού δειγμάτων και 4) το σημαντικά χαμηλότερο κόστος σε σχέση με το μοριακό έλεγχο4. Τα χαρακτηριστικά αυτά καθιστούν τη συγκεκριμένη διαγνωστική προσέγγιση μέθοδο εκλογής σε περιπτώσεις αυξημένων αναγκών ελέγχου (π.χ. πανδημία), χωρίς κατά κανένα τρόπο να αναιρείται η χρησιμότητα του εργαλείου της περαιτέρω μοριακής διαγνωστικής προσέγγισης, όταν ο κλινικός γιατρός το κρίνει απαραίτητο. Διεύθυνση επικοινωνίας: κ. Αλ. Μαστρογιαννάκη-Μαρίνη Ιατρός-Βιοπαθολόγος Αμβροσίου Φραντζή 19 - Κυπαρισσία Τηλ.: 27610 - 23845 198 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Summary Monitoring influenza virus A by the rapid test M. THEODOROU, A. MASTROGIANNAKI-MARINI, I. MARINI, P. FLARIS, E. DRAKOU Medical Doctors in private practice. Kyparissia, Messinia prefecture In this study, the rapid test is used to follow the incidence of infected people in the community, during the 2009 influenza A(H1N1) outbreak, at a small town (Kyparissia) of Peloponnesus-Greece. [Key words: laboratory diagnosis, influenza A(H1N1) virus, rapid test]. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1.Σφηκάκης Π, Γιαμαρέλλου Ε και συν. Λοιμώξεις και αντιμικροβιακή χημειοθεραπεία. Ιατρ. Εκδόσεις Λίτσας, 1991, σελ. 835-841. 2.CDC Swine Influenza A (H1N1). Infection in two children southern, California, March-April 2009, MMWR 2009, 58(15): 400-402. 3.CDC Outbreak of Swine Origin Influenza A (H1N1). Virus infection, Mexico, March-April 2009, MMWR 2009, 58(17): 467-476. 4.Γιαννάκη Μ, Οικονόμου Σ, Πατσαρούλιας Κ, Δαβάνου Α και συν. Η νέα γρίπη Α (Η1Ν1)ν στη χώρα μας: η εμπειρία στα παιδιά. Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική, 2009, 14(3): 143-149. 5.Γιαννάκη Μ, Μεντής Α. Εργαστηριακή διερεύνηση και επιτήρηση πανδημικού στελέχους γρίπης Α(Η1Ν1)ν - Πρακτική θεώρηση. Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική, 2009, 14(3): 137-142. 6.Βρυώνη Γ, Τσακρής Α. Η γενετική προέλευση και η δυναμική του νέου ιού της γρίπης Α(Η1Ν1): νεότερα δεδομένα. Δελτίο Ελληνικής Μικροβιολογικής Εταιρείας 2009, 54(9): 171-174. 7.Webby RS, Webster RG. Emergence of Influenza A viruses, Philoi TeamsR Soc Land B Biol Sci 2001, 356: 1817-1828. 8.Van Reeth K, Nicoll A. A human case of Swine Influenza virus infection in Europe - Implications for human health and research. Euro Surveill 2009, 14 pii: 19124. 9.KEEΛΠNO. Τρέχουσες οδηγίες για τη χρήση αντι-ιικών για την αντιμετώπιση ασθενών με γρίπη από το νέο ιό Α/Η1Ν1 και των στενών επαφών τους. Ιούλιος 2009. www.keelpno.gr. 10.KEEΛΠNO. Τρέχουσες οδηγίες για τη φροντίδα ασθενών με γρίπη από το νέο ιό Α/Η1Ν1 στο σπίτι. Ιούλιος 2009. www.keelpno.gr. 11.KEEΛΠNO. Επικαιροποίηση μέτρων πρόληψης μετάδοσης του νέου ιού γρίπης Α/Η1Ν1. Οδηγίες για ιδιωτικά ιατρεία. Αύγουστος 2009. www. keelpno.gr. Υποβλήθηκε: 12/5/2010 Εγκρίθηκε: 9/11/2010 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β’, Τόμος 15, Τεύχος 4, σελ. 199-202 2010 ΟΙ ΕΠΙΠΤΩΣΕΙΣ ΤΗΣ ΓΡΙΠΗΣ Α (Η1Ν1) ΣΤΟ ΠΡΟΣΩΠΙΚΟ ΠΑΙΔΙΑΤΡΙΚΟΥ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟΥ Μ. ΓΙΑΝΝΑΚΗ1, Ε. ΠΕΤΡΙΔΟΥ1, Μ. ΝΤΟΥΜΠΑΝΑΚΗ1, Μ. ΖΙΩΓΑ1, Κ. ΚΑΛΟΓΡΙΟΠΟΥΛΟΥ2, Κ. ΞΕΡΑΚΙΑ2, Α. ΜΕΝΤΗΣ4, Α. ΤΣΑΚΡΗΣ5, Β. ΣΥΡΙΟΠΟΥΛΟΥ3, Μ. ΘΕΟΔΩΡΙΔΟΥ3, Α. ΠΑΓΚΑΛΗ1 Από την εμφάνιση της γρίπης Α (Η1Ν1) ως το τέλος Δεκεμβρίου 2009, 164 άτομα (10,9%) του προσωπικού του ΝΠΑΣ εξετάστηκαν με PCR και ταχεία δοκιμή για αντιγόνο. Παρουσία του ιού διαπιστώθηκε σε 30 εργαζόμενους, με συχνότερα συμπτώματα καταβολή, βήχα και πυρετό, οι οποίοι πήραν αναρρωτική άδεια επτά ημερών. Οσελταμιβίρη χορηγήθηκε προληπτικά σε δύο εργαζόμενους με υποκείμενο νόσημα που ήρθαν σε επαφή με ασθενείς θετικούς στον ιό. Μετάδοση από άτομα του προσωπικού σε νοσηλευόμενα παιδιά δεν σημειώθηκε. Στις 16 Νοεμβρίου 2009 άρχισε ο εμβολιασμός. Συνολικά εμβολιάστηκαν 320 εργαζόμενοι (21,5%) [Λέξεις ευρετηρίου: γρίπη Α(Η1Ν1), προσωπικό νοσοκομείου, εμβολιασμός]. Εισαγωγή Η πανδημία από τον ιό γρίπης Α (Η1Ν1) απεδείχθη λιγότερο επικίνδυνη από ό,τι αρχικά είχε θεωρηθεί. Τα μέτρα που εφαρμόσθηκαν σε διεθνές επίπεδο αξιολογήθηκαν από πολλούς εκ των υστέρων ως υπερβολικά. Αναμφισβήτητα όμως μας παρείχε μια σημαντική εμπειρία τόσο για την πρόληψη όσο και για τη διαχείριση μιας νέας επιδημίας στο μέλλον. Σκοπός της παρού1. Μικροβιολογικό Τμήμα 2. Νοσηλευτική Υπηρεσία και 3. Α΄ Παιδιατρική Πανεπιστημιακή Κλινική Νοσοκομείου Παίδων «Η Αγία Σοφία» 4. Ελληνικό Ινστιτούτο Pasteur 5. Μικροβιολογικό Εργαστήριο Πανεπιστημίου Αθηνών σας μελέτης ήταν η παρουσίαση των επιπτώσεων της γρίπης στους εργαζόμενους στο Νοσοκομείο Παίδων «Η Αγία Σοφία» (ΝΠΑΣ) από την εμφάνιση της επιδημίας ως το τέλος Δεκεμβρίου του 2009, όσον αφορά τις κλινικές εκδηλώσεις, τον εργαστηριακό έλεγχο, την απουσία από την εργασία και την προστασία από τον εμβολιασμό. Α. Εξέταση για τον ιό γρίπης Α (Η1Ν1) Στο Νοσοκομείο εργάζονται περίπου 1.500 άτομα. Αίτια προσέλευσης στο Μικροβιολογικό Εργαστήριο για εξέταση απετέλεσαν οι κλινικές εκδηλώσεις γριπώδους συνδρομής, η επαφή με επιβεβαιωμένο κρούσμα στο χώρο εργασίας, η επαφή με πιθανό ή επιβεβαιωμένο κρούσμα 200 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία στο οικογενειακό τους περιβάλλον, αλλά κυρίως η ανησυχία για την επιδημία όπως αυτή προβαλλόταν από τα Μέσα Μαζικής Ενημέρωσης. Από όλους τους προσερχόμενους για εξέταση λαμβανόταν φαρυγγικό επίχρισμα για PCR και ταχεία τεχνική ανίχνευσης αντιγόνου. Αμέσως μετά τη λήψη του δείγματος τα άτομα απομακρύνονταν από το χώρο εργασίας ως την ανακοίνωση του αποτελέσματος. Αν η απάντηση ήταν θετική, έπαιρναν αναρρωτική άδεια επτά ημερών για την αποφυγή της διασποράς του ιού στο χώρο εργασίας, σύμφωνα με τις οδηγίες του Κέντρου Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων (ΚΕΕΛΠΝΟ) και του Εθνικού Κέντρου Επιχειρήσεων Υγείας (ΕΚΕΠΥ). Ο πρώτος εργαζόμενος εξετάστηκε στο Μικροβιολογικό Εργαστήριο του Νοσοκομείου την 21η Μαΐου 2009. Επρόκειτο για υπάλληλο διοικητικής υπηρεσίας του Νοσοκομείου, 45 ετών, με κυνάγχη και δεκατική πυρετική κίνηση, ο οποίος είχε επιστρέψει την προηγούμενη ημέρα από τον Καναδά, όπου ταξίδεψε για λίγες ημέρες. Ο Καναδάς περιλαμβανόταν στις χώρες από τις οποίες οι προερχόμενοι όφειλαν να εξετάζονται για τον Η1Ν1 κατά τη διάρκεια της φάσης περιχαράκωσης του ιού. Το αποτέλεσμα της εξέτασης ήταν αρνητικό. Η πρώτη θετική περίπτωση παρουσιάστηκε την 25η Σεπτεμβρίου 2009. Επρόκειτο για μία παιδίατρο, 35 ετών, με πυρετό, ρινική καταρροή, κυνάγχη και μυαλγίες. Πέντε ημέρες πριν, το τετράχρονο παιδί της παρουσίασε την τυπική συμπτωματολογία της γρίπης χωρίς να κάνει εργαστηριακό έλεγχο. Συνολικά εξετάστηκαν 164 άτομα (10,9% του συνόλου), 20 άνδρες και 144 γυναίκες, μέσης ηλικίας 39,3 ετών, οι ειδικότητες των οποίων αναφέρονται στον Πίνακα 1. Παρουσία του ιού διαπιστώθηκε σε 30 άτομα, (18%) οι κλινικές εκδηλώσεις των οποίων αναφέρονται στον Πίνακα 2. Η έκβαση της γρίπης σε όλες τις περιπτώσεις ήταν καλή. Οσελταμιβίρη χορηγήθηκε προληπτικά σε δύο εργαζόμενους με υποκείμενο νόσημα (μυελοϋπερπλαστικό σύνδρομο και αναπνευστικό νόσημα αντίστοιχα) που ήρθαν σε επαφή με Πίνακας 1. Αριθμός ατόμων κατά ειδικότητα που εξετάστηκαν για τον ιό γρίπης Α Η1Ν. 48 52 22 19 20 ιατροί νοσηλευτές τεχνολόγοι εργαστηρίων εργαζόμενοι στις διοικητικές υπηρεσίες εργαζόμενοι σε βοηθητικές υπηρεσίες (καθαριότητα κ.λπ.) 2 φοιτητές της Ιατρικής Σχολής εκπαιδευόμενοι στο Νοσοκομείο 1 εργαζόμενη στο Τραπεζικό Κατάστημα που στεγάζεται στο Νοσοκομείο ασθενείς θετικούς στον ιό. Μετάδοση από άτομα του προσωπικού θετικά για τον ιό σε νοσηλευόμενα παιδιά δεν σημειώθηκε. Β. Εμβολιασμός έναντι του ιού γρίπης Α/Η1Ν1 Στις 16 Νοεμβρίου 2009 άρχισε ο εμβολιασμός του προσωπικού σύμφωνα με τις οδηγίες του ΚΕΕΛΠΝΟ και του ΕΚΕΠΥ. Άτομα της Νοσηλευτικής υπηρεσίας και της Επιτροπής Λοιμώξεων εμβολίαζαν ανά τμήμα του Νοσοκομείου, Πίνακας 2. Κλινικές εκδηλώσεις των 30 επιβεβαιωμένων κρουσμάτων. Σύμπτωμα Καταβολή Βήχας Πυρετός Μυαλγία Κυνάγχη Αιφνίδια έναρξη Ρινική καταρροή Κεφαλαλγία Διάρροια Αναπν. Δυσχέρεια Πνευμονία Έμετοι Αρθραλγία Αριθμός ασθενών Ποσοστό % 28 24 21 21 21 18 18 12 1 1 0 0 0 93,3 80 70 70 70 60 60 40 0,33 0,33 0 0 0 Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 4, 2010 σε ειδικό χώρο και σε ικανοποιητικά ευρύ ωράριο για την καλύτερη εξυπηρέτηση. Ο εμβολιασμός ήταν προαιρετικός και χωρίς χρέωση. Προηγήθηκε διανομή ενημερωτικών δελτίων καθώς και ομιλίες στο Αμφιθέατρο του Νοσοκομείου από ειδικούς κατά τις οποίες αναλύθηκαν τα πλεονεκτήματα του εμβολιασμού και συζητήθηκαν οι απορίες του ακροατηρίου σχετικά με τις ανεπιθύμητες ενέργειές του. Στο διάστημα που ακολούθησε εμβολιάστηκαν 320 άτομα (21,5%) σύμφωνα με στοιχεία της Επιτροπής Νοσοκομειακών Λοιμώξεων του Νοσοκομείου1. Συζήτηση Η εμφάνιση του ιού Α (Η1Ν1) τον Απρίλιο του 2009 συνοδεύτηκε από μεγάλη ανησυχία γιατί επρόκειτο για ένα νέο τύπο, που ήταν ανθεκτικός στην αμανταδίνη και τη ριμπαβιρίνη, προκαλούσε πνευμονία (όχι ως μικροβιακή επιπλοκή) και κυρίως μεταδιδόταν πολύ εύκολα από άτομο σε άτομο2. Η ανάγκη για την περιχαράκωση του ιού και την παρεμπόδιση της εξάπλωσής του είχε ως αποτέλεσμα τη λήψη μέτρων από τους αρμόδιους φορείς (WHO, CDC, ECDC κ.ά.) τα οποία, εξαιτίας του υψηλού κόστους, έγιναν αντικείμενο κριτικής. Στη χώρα μας τα ΜΜΕ υπέθαλψαν και διόγκωσαν την ανησυχία τόσο του γενικού πληθυσμού όσο και των εργαζομένων στα νοσοκομεία, οι οποίοι αρκετά συχνά συνεχίζουν να εργάζονται όταν εμφανίζουν συμπτώματα ήπιας αναπνευστικής λοίμωξης. Επομένως, σε μια επιδημία από ιό του οποίου η συμπεριφορά δεν είχε ακόμη αποσαφηνισθεί ήταν δικαιολογημένη η προσέλευση για εξέταση του προσωπικού των νοσοκομείων. Αν ληφθεί μάλιστα υπόψιν ότι στο ΝΠΑΣ, εκτός των άλλων, νοσηλεύονται και παιδιά σε ειδικές μονάδες, π.χ. προώρων νεογνών, ανοσοκατασταλμένων ή μεταμοσχευμένων παιδιών, είναι κατανοητή και η ανησυχία που προέρχεται από τον υψηλό κίνδυνο που διατρέχουν οι μικροί αυτοί ασθενείς από τη μόλυνση με τον ιό. Με τον έλεγχο του 10,9% (164/1500) του προσωπικού και την απομάκρυνση από το χώρο 201 εργασίας του 18% (30/164) που βρέθηκαν θετικοί στον ιό δεν σημειώθηκε μετάδοση από εργαζόμενο σε ασθενή. Επίσης με τον εμβολιασμό του προσωπικού του νοσοκομείου αποφεύγεται η μετάδοση του ιού στους ασθενείς αλλά και η απουσία από την εργασία, η οποία διαταράσσει την παροχή των υπηρεσιών υγείας. Αυτό ισχύει και για τον εμβολιασμό κάθε χρόνο έναντι της εποχικής γρίπης. Το ποσοστό μάλιστα της κάλυψης του προσωπικού από το εμβόλιο αποτελεί δείκτη ποιότητας και ασφάλειας των παρεχομένων υπηρεσιών3. Το 21,5% του ΝΠΑΣ που εμβολιάστηκε δεν είναι ικανοποιητικό και θα πρέπει να γίνει προσπάθεια να αυξηθεί ο αριθμός των εμβολιαζομένων κάθε χρόνο. Σε ακόμη χαμηλότερα ποσοστά περιορίστηκε η κάλυψη άλλων νοσοκομείων της χώρας μας με το εμβόλιο, ενώ το Ιπποκράτειο Νοσοκομείο της Αθήνας πέτυχε υψη. λότερο ποσοστό (50,6%) εμβολιάστηκαν 729 από τα 1440 άτομα που εργάζονται εκεί4. Ερωτηματολόγιο που συμπληρώθηκε από 105 εργαζόμενους στο ΝΠΑΣ έδειξε ως κύριο λόγο εμβολιασμού την προστασία των ίδιων (96,7%) και των ασθενών (91,9%)5. Κύριος λόγος άρνησης ήταν ο φόβος για τυχόν ανεπιθύμητες ενέργειες. Καλύτερη ενημέρωση και διενέργεια του εμβολιασμού στον τόπο εργασίας πιθανόν να αυξήσει την κάλυψη του προσωπικού με το εμβόλιο ώστε να μειωθεί ο κίνδυνος από τη γρίπη κυρίως των ιδιαίτερα ευπαθών ομάδων ασθενών6,7. Διεύθυνση επικοινωνίας: κ. Μαρία Γιαννάκη Διευθύντρια Μικροβιολογικού Τμήματος Νοσοκομείο Παίδων «Η Αγία Σοφία» 202 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Summary ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Influenza A (H1N1) and healthcare workers in a children΄s Hospital 1.Θεοδωρίδου M. Εμβολιασμός ιατρονοσηλευτικού προσωπικού σε Νοσοκομείο Παίδων «Ημερίδα για την Προώθηση του Αντιγριπικού Εμβολιασμού του Προσωπικού σε Χώρους Παροχής Υπηρεσιών Υγείας», ΚΕΕΛΠΝΟ, Αθήνα 11 Νοεμβρίου 2010. 2.Miller MA, Viboud C, Balinska M, Simonsen I. The Signature Features of Influenza Pandemics - Implications for Policy. N Engl J Med, June 18, 2009, 360: 25. 3.CD Salgado, ET Giannetta, FG Hayden, BM Farr. Preventing Nosocomial Influenza by Improving the Vaccine Acceptance Rate of Clinicians, Infect Contr Hosp Epidemiol 2004, 25 (11): 923-928. 4. Μ. Πηρουνάκη. Η αναγκαιότητα αντιγριπικού εμβολιασμού εργαζομένων σε τμήματα ασθενών με χρόνια νοσήματα ή ανοσοκαταστολή. «Ημερίδα για την Προώθηση του Αντιγριπικού Εμβολιασμού του Προσωπικού σε Χώρους Παροχής Υπηρεσιών Υγείας», ΚΕΕΛΠΝΟ, Αθήνα 11 Νοεμβρίου 2010. 5.Mammas IN, Koutsaftiki C, Theodoridou M, Myriokefalitakis N. Vaccination coverage of Greek paediatric healthcare workers against seasonal and A/H1N1 influenza. Acta Paediatrica ISSN 0803-5253. 6.Carman WF, Elder AG, Wallace LA, McAulay K, Walker A, Murray GD, Stott DJ. Effects of influenza vaccination of health-care workers on mortality of elderly people in long-term care: a randomized controlled trial. The Lancet, 2000, 355: 93-97. 7.G Redelman - Sidi et al 2009. H1N1 influenza infection in cancer patients and hematopoietic stem cell transplant recipients J Infect 2010, 60: 257-263. M. GIANNAKI1, E. PETRIDOU1, M. NTOUMPANAKI1, M. ZIOGA1, K. KALOGRIOPOULOU2, K. XERAKIA2, A. MENTIS4, A. TSAKRIS5, V. SYRIOPOULOU3, M. THEODORIDOU3, A. PAGKALIS1 1 Microbiology Dept, 2Nursing Service, 1st Paediatric Clinic (University of Athens) “Agia Sophia” Children’s Hospital, 4 Hellenic Institute Pasteur-Athens, 5 Microbiology Laboratory Medical School University of Athens 3 The effects of influenza A (H1N1) in “Agia Sofia” Children’s Hospital employees are reported in this study. During the last epidemic, 164 out of 1500 people (10,9%) who work in the hospital were tested for influenza A(H1N1) virus by rapid antigen test and PCR. Presence of virus was detected in 30/164 (18%) who had time off from work for seven days. Weakness, cough and fever were the main clinical manifestations. Oseltamivir was given to two persons, without symptoms, who had severe underlying disease (lymphoproliferative and respiratory syndrome respectively). Virus transmission from workers to hospitalized patients was not noticed. The healthcare workers vaccination coverage rate for A (H1N1) was 21,5%. [Key words: influenza A(H1N1), healthcare workers, vaccination]. Υποβλήθηκε: 16/9/2010 Εγκρίθηκε: 3/11/2010 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β’, Τόμος 15, Τεύχος 4, σελ. 203-208 2010 ΕΝΔΙΑΦΕΡΟΥΣΕΣ ΠΕΡΙΠΤΩΣΕΙΣ ΠΑΡΑΤΕΤΑΜΕΝΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΟΥ ΙΟΥ ΤΗΣ ΝΕΑΣ ΓΡΙΠΗΣ Κ. ΔΗΜΟΥΛΑΣ, Μ. ΚΥΡΙΑΖΗ, Ε. ΜΙΧΑΗΛΕΛΛΗΣ, Α. ΧΑΡΙΤΑΚΗΣ, Σ. ΚΑΝΑΚΗ, Ζ. ΑΡΧΟΝΤΑΚΗΣ, Σ. ΦΟΥΝΤΟΥΛΑΚΗΣ, Β. ΛΙΑΚΟΥ Περιγράφονται δύο περιπτώσεις ασθενών στους οποίους παρατηρήθηκε παρατεταμένη ανίχνευση του ιού της νέας γρίπης Α (H1N1). Η διάρκεια της λοίμωξης ήταν 30 και 15 ημέρες αντίστοιχα. Για την ανίχνευση του ιού σε όλα τα δείγματα χρησιμοποιήθηκε η RT-PCR. Η παρατεταμένη ανίχνευση του ιού δεν συσχετίσθηκε με αντοχή του στην οσελταμιβίρη, η οποία χορηγήθηκε και στους δύο ασθενείς. [Λέξεις ευρετηρίου: Α (Η1Ν1), νέα γρίπη, παρατεταμένη ανίχνευση, έλεγχος αντοχής, οσελταμιβίρη]. Περιγραφή περίπτωσης Α Άνδρας, ηλικίας 61 ετών, με χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (πρώην καπνιστής), υπό οξυγονοθεραπεία, προσήλθε στο Βενιζέλειο Νοσοκομείο με δεκατική πυρετική κίνηση έως 37,6°C, δύσπνοια, βήχα, πυώδη απόχρεμψη, αδυναμία και καταβολή. Ο ασθενής μια ημέρα πριν είχε εμβολιαστεί για τη νέα γρίπη Α (Η1Ν1). Αρχικά εισήχθη στην Πνευμονολογική Kλινική και την ίδια ημέρα μεταφέρθηκε στη ΜΕΘ λόγω επιδείνωσης των συμπτωμάτων. Εργαστηριακές εξετάσεις Κατά την εισαγωγή ο ασθενής είχε: αιμοσφαιρίνη (Hb) 12,3 gr/dl, αριθμό λευκών αιμοΜικροβιολογικό Εργαστήριο Βενιζέλειο Πανάνειο Νοσοκομείο, Ηράκλειο Κρήτης σφαιρίων (WBC) 10.400/μl με τύπο πολυμορφοπυρηνικό (80%). Οι βιοχημικές εξετάσεις της ηπατικής και νεφρικής λειτουργίας ήταν εντός φυσιολογικών ορίων, ενώ η C αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP) ήταν 1,76 mg/dl (ΦΤ <0,5mg/l) και η TKE 15 mm/h. Τα αέρια αίματος με χορήγηση οξυγόνου 35% (8lt) ήταν: paO2 58,5mmHg και paCO2 77,3 mmHg. Στον ασθενή χορηγήθηκε αμέσως θεραπευτική αγωγή με οσελταμιβίρη 300 mg ημερησίως, αφού έγινε λήψη ρινοφαρυγγικού επιχρίσματος για την ανίχνευση του ιού Α (Η1Ν1). Το πρώτο αυτό δείγμα βρέθηκε θετικό με RT-PCR στο Ινστιτούτο Pasteur. Λόγω μη βελτίωσης της κλινικής εικόνας και προκειμένου να καθοριστεί η διάρκεια της θεραπευτικής αγωγής της οσελταμιβίρης, ελήφθησαν διαδοχικά δείγματα την 6η, 14η, 20ή και 30ή μέρα νοσηλείας τα οποία βρέθηκαν επίσης θετικά με την ίδια μέθοδο. 204 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Κατά τη διάρκεια της νοσηλείας του ο ασθενής παρουσίαζε επιδείνωση της γενικής του κατάστασης με αύξηση των WBC έως 41.800/ μl, των ηπατικών ενζύμων (SGOT έως 1280 U/l, SGPT έως 4400 U/l), της CRP έως 35 mg/dl των D – DIMERS έως 35 mg/l (Φ.Τ. <0,5 mg/l) και της α1 αντιθρυψίνης 485 mg/dl (Φ.Τ. 90-200 mg/ dl). Στον ασθενή μας ελέγχθηκαν και τα επίπεδα ανοσοσφαιρίνης ορού IgG, που βρέθηκαν 1200mg/dl (Φ.Τ.:700-1600 mg/dl). Λίγες μέρες μετά την εισαγωγή του αρρώστου στη ΜΕΘ από διάφορα δείγματα που έφτασαν στο εργαστήριο για καλλιέργεια αναπτύχθηκαν πολυανθεκτικά μικρόβια. Στις καλλιέργειες ούρων απομονώθηκε Pseudomonas aeruginosa ανθεκτική σε: κεφαλοσπορίνες, καρβαπενέμες, κινολόνες, καθώς και συνδυασμούς πενικιλινών με αναστολείς (piperacillin/tazobactam και ticarcillin/clavulanic acid). Επίσης από τις βρογχικές εκκρίσεις, τις αιμοκαλλιέργειες καθώς και μια καλλιέργεια εγκεφαλονωτιαίου υγρού απομονώθηκε Klebsiella pneumoniae, ο φαινότυπος της οποίας παρουσίαζε αντοχή στις κινολόνες, κεφαλοσπορίνες και καρβαπενέμες, λόγω παραγωγής KPC καρβαπενεμάσης, όπως επιβεβαιώθηκε από τον έλεγχο του γονιδίου αντοχής με PCR. Ο ασθενής κατέληξε την 30ή μέρα νοσηλείας από πολυοργανική ανεπάρκεια. Περίπτωση Β Γυναίκα 76 ετών διακομίσθηκε από οικείους της στο Βενιζέλειο Νοσοκομείο Ηρακλείου με αναφερόμενη έντονη αδυναμία από 24 ώρου, υπνηλία, θωρακικό άλγος αριστερά, δύσπνοια και δεκατική πυρετική κίνηση από διημέρου. Είχαν προηγηθεί πολλαπλές διάρροιες τρεις ημέρες πριν την εισαγωγή της στη ΜΕΘ. Στο ατομικό ιστορικό αναφέρθηκε πνευμονική ίνωση, βαλβιδοπάθεια μιτροειδούς, αρτηριακή υπέρταση, χρόνια ψυχωσική συνδρομή. Κατά την εισαγωγή ο αρχικός εργαστηριακός έλεγχος της αρρώστου έδειξε: Hb 14,5 grdl, WBC 16700/μl με πολυμορφοπυρηνικό τύπο (85%). Οι βιοχημικές εξετάσεις της ηπατικής και νεφρικής λειτουργίας ήταν εντός φυσιολογικών ορίων. Η CRP ήταν 7,97 mg/dl και η TKE 43 mm/h. Τα αέρια αίματος ήταν paO2 63 mmHg και paCO2 37 mmHg. Έγιναν πολλαπλές λήψεις ρινοφαρυγγικών επιχρισμάτων, συγκεκριμένα την 1η, την 5η και την 8η μέρα νοσηλείας, για την ανίχνευση του ιού Α (Η1Ν1), τα οποία βρέθηκαν θετικά με RTPCR, ενώ τη 10η μέρα το αποτέλεσμα αρνητικοποιήθηκε. Όμως σε δείγματα που ελέγχθηκαν την 15η μέρα νοσηλείας, από το κατώτερο αναπνευστικό σύστημα (BAL), ανιχνεύθηκε και πάλι η παρουσία ιϊκού RNA. Στην ασθενή χορηγήθηκε θεραπευτική αγωγή με οσελταμιβίρη 300 mg ημερησίως, από της εισαγωγής της και καθ’ όλη τη διάρκεια της νοσηλείας της. Επανειλημμένως κατά τη διάρκεια της νοσηλείας της έγιναν αιματολογικές και βιοχημικές εξετάσεις και τα αποτελέσματα κυμάνθηκαν γύρω από τις ακόλουθες τιμές: WBC έως 25800 (τύπος πολυμορφοπύρηνα 94%, λεμφοκύτταρα 3,4%), CRP έως 24,8 mg/dl, ουρία έως 309 mg/dl, κρεατινίνη έως 2,26 mg/dl, χολερυθρίνη ολική 5,9 mg/dl και άμεση 2,7mg/dl, D – DIMERS έως 4 mg/l. Στην ασθενή έγινε προσδιορισμός πρωτεϊνών ο οποίος έδειξε α1 σφαιρίνες 3,1 mg/dl, α2 σφαιρίνες 13,8 mg/dl, β σφαιρίνες 9,4 mg/dl, γ σφαιρίνες 21,6 mg/dl και IgΑ/IgG 1.09. Κατά την 15η ημέρα εισαγωγής έγινε, στo 1o Κέντρο Αναφοράς Γρίπης Νοτίου Ελλάδας (Ινστιτούτο Pasteur), έλεγχος του ιού για αντοχή στην οσελταμιβίρη, ο οποίος έδειξε ευαισθησία του ιού. Λίγες μέρες μετά την εισαγωγή της στη ΜΕΘ απομονώθηκε Klebsiella pneumoniae στις βρογχικές εκκρίσεις της αρρώστου. Η δοκιμή ευαισθησίας και ο μοριακός έλεγχος για παραγωγή ΚPC καρβαπενεμάσης, έδειξε ότι επρόκειτο για το στέλεχος K. pneumoniae που επικρατεί στις ΜΕΘ, με αντοχή στις κινολόνες, κεφαλοσπορίνες και καρβαπενέμες ενώ είχε ευαισθησία στην γενταμυκίνη και τετρακυκλίνη. Η ασθενής κατέληξε την 20ή μέρα νοσηλείας από λοίμωξη αναπνευστικού και καρδιακή ανεπάρκεια. Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 4, 2010 Συζήτηση Τον περασμένο αιώνα υπήρξαν τρεις πανδημίες γρίπης. Η ισπανική γρίπη του 1918 με τον ιό Α(Η1Ν1) η οποία υπολογίζεται ότι προσέβαλε το ένα τρίτο του παγκόσμιου πληθυσμού και προκάλεσε το θάνατο 40 εκατομμυρίων ανθρώπων σε ένα έτος, η ασιατική γρίπη το 1957 με έναν νέο ανασυνδυασμένο ιό, τον Η2Ν2, που πιστεύεται ότι προκάλεσε πάνω από δύο εκατομμύρια θανάτους και τέλος, έντεκα χρόνια αργότερα, προέκυψε ένας ακόμα ιός, ο Η3Ν21. Ο ιός 2009 Α (Η1Ν1) ανιχνεύτηκε για πρώτη φορά στις ΗΠΑ τον Απρίλιο του 2009. Επρόκειτο για έναν συνδυασμό γόνων των ιών της γρίπης που δεν είχε περιγραφεί ως τότε να έχει προσβάλει άνθρωπο ή ζώο. Το γενετικό υλικό του ήταν ένα μείγμα γονιδίων που σχετιζόταν περισσότερο με τον ιό των χοίρων της Β. Αμερικής Α (Η1Ν1) καθώς και του ιού της ευρασιατικής γρίπης των χοίρων Α (Η1Ν1). Έτσι οι αρχικές αναφορές παρέπεμπαν σε ένα νέο ιό με προέλευση τους χοίρους. Όμως, μετά από έρευνα, αποδείχθηκε ότι ο ιός δεν προσέβαλλε τους χοίρους, αλλά μεταδιδόταν από άνθρωπο σε άνθρωπο. Ήταν ένας ιός που προέκυψε από ανασυνδυασμό γονιδίων με προέλευση τέσσερις διαφορετικές πηγές ιών γρίπης2. Σύμφωνα με τα στοιχεία που δόθηκαν από το ΚΕΕΛΠΝΟ, στην Ελλάδα έως τα τέλη Μαΐου 2010 επιβεβαιώθηκαν εργαστηριακά 18.230 κρούσματα με τον ιό της νέας γρίπης Α (Η1Ν1), ενώ οι θάνατοι ανέρχονται σε 149. Από τα συστήματα επιδημιολογικής επιτήρησης που λειτουργούν στη χώρα μας για τη γρίπη συνάγεται ότι στην Ελλάδα το επιδημικό κύμα της γρίπης 2009 Α (Η1Ν1)ν έχει παρέλθει και βρισκόμαστε σε περίοδο «εκτός εποχής γρίπης». Είναι όμως πιθανό να εμφανιστεί ένα νέο κύμα γρίπης και είναι επομένως σημαντικό ο μηχανισμός πρόληψης και αντιμετώπισης να βρίσκεται σε επαγρύπνηση. Από τις διαθέσιμες στο εμπόριο διαγνωστικές δοκιμασίες για την ανίχνευση του ιού της γρίπης, που χρησιμοποιούνται σήμερα στα ερ- 205 γαστήρια, μεταξύ άλλων είναι η ανίχνευση αντιγόνων του ιού που γίνεται με ταχεία δοκιμή και στηρίζεται κυρίως σε ανοσολογικές μεθόδους. Ορισμένα από αυτά τα αντιδραστήρια διαχωρίζουν τους ιούς γρίπης Α και Β, ενώ άλλα δεν κάνουν σαφή διαχωρισμό ή έχουν χαμηλή ευαισθησία. Μια δεύτερη μέθοδος με περιορισμένη χρησιμότητα στη διάγνωση της γρίπης (αλλά σημαντική επιδημιολογικά για τη διερεύνηση των επιδημιών και για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας των εμβολίων), είναι η ανίχνευση των ειδικών αντισωμάτων έναντι του ιού της νέας γρίπης με αναστολή της αιμοσυγκολλήσεων και με αντίδραση μικροεξουδετέρωσης. Επίσης, η καλλιέργεια του ιού είναι μια ακόμα μέθοδος που επιτρέπει και την αντιγονική τυποποίηση των στελεχών που απομονώνονται. Όμως, δεν χωρά αμφιβολία ότι ο πιο ακριβής τρόπος διάγνωσης του ιού της νέας γρίπης είναι η μοριακή μέθοδος, με την εφαρμογή της real time RT-PCR για την ειδική ανίχνευση του ιού, η οποία εφαρμόζεται σε ειδικά διαγνωστικά κέντρα, τα εθνικά κέντρα αναφοράς. Με αυτή τη μέθοδο υπάρχει η δυνατότητα ανίχνευσης τόσο του ιού της εποχικής γρίπης, όσο και του πανδημικού στελέχους, καθώς και ο έλεγχος αντοχής σε διάφορα αντι-ιικά φάρμακα, που οφείλεται σε μεταλλάξεις3. Πρόσφατα το CDC, έχοντας λάβει υπόψη ένα μεγάλο αριθμό γενετικών πληροφοριών του ιού ανέπτυξε μία νέα δοκιμή για την ανίχνευση και επιτήρηση του ιού Α (Η1Ν1) «CDC Influenza 2009 A(H1N1)pdm Real-Time RTPCR Panel (IVD)» με ειδικότητα και ευαισθησία >96% σε δείγματα του ανώτερου αναπνευστικού και με δυνατότητα να δώσει αποτελέσματα μετά από 4 ώρες4. Στο εργαστήριο του Νοσοκομείου μας από τις 14/7/2009 έως τις 31/12/2009 προσκομίστηκαν 1.217 φαρυγγικά δείγματα. Αρχικά χρησιμοποιήθηκε η διαθέσιμη δοκιμή για γρήγορη ανίχνευση αντιγόνων των πυρηνικών πρωτεϊνών με τη βοήθεια μονοκλωνικών αντισωμάτων των ιών influenza A και B (Influ A&B Respi-Strip, 206 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Coris, BioConcept, Belgium). Όμως λόγω χαμηλής ευαισθησίας κρίθηκε ανεπαρκής και εγκαταλείφθηκε· οπότε, όλα τα δείγματα εστάλησαν στο 1ο Κέντρο Αναφοράς Γρίπης Νοτίου Ελλάδας (Ινστιτούτο Pasteur). Από τα αποτελέσματα των εξετάσεων των ασθενών 488 βρέθηκαν θετικά (40,09%). Το εύρος των κλινικών εκδηλώσεων της γρίπης είναι μεγάλο και εκτείνεται από τη σχεδόν ασυμπτωματική λοίμωξη ως τη βαριά πνευμονία. Οι επιπλοκές είναι συχνότερες στους ηλικιωμένους και σε πάσχοντες από χρόνια νοσήματα. Ο ιός της εποχικής γρίπης υπολογίζεται ότι διασπείρεται για ένα διάστημα 5-7 ημερών. Παρατεταμένη ανίχνευση έχει περιγραφεί σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς με εποχική γρίπη ακόμα και μετά από θεραπεία με αντι-ιικά φάρμακα5. Αλλά και για τον ιό της νέας γρίπης [2009 Α(Η1Ν1)] υπάρχουν δημοσιεύματα που αναφέρουν ότι ανοσοκατασταλμένοι διασπείρουν τον ιό για αρκετές εβδομάδες ή μήνες6. Στους δύο ασθενείς μας που νοσηλεύθηκαν με το πανδημικό στέλεχος γρίπης Α(Η1Ν1) στη ΜΕΘ λόγω σοβαρής επιδείνωσης της νόσου υπήρχε η δυνατότητα να λαμβάνονται και να εξετάζονται επανειλημμένως δείγματα (ρινοφαρυγγικό, BAL, πτύελα κ.λπ.) κατά τη διάρκεια της νοσηλείας τους. Έτσι επιβεβαιώθηκε με την RT-PCR ότι για τον ασθενή Α η διάρκεια αποβολής του ιού ήταν 30 ημέρες, ενώ για την ασθενή Β, 15 ημέρες. Το αρνητικό ρινοφαρυγγικό δείγμα (της ασθενούς Β) την 10η ημέρα, ενώ το δείγμα την 15η από το κατώτερο αναπνευστικό βρέθηκε πάλι θετικό, ίσως να οφείλεται στη διαφορετική ευαισθησία της ταχείας δοκιμασίας από αυτή της RT-PCR για την ανίχνευση του ιού της νέας γρίπης, την οποία οι Ginocchio και συν.7 αναφέρουν ότι κυμαίνεται από 10-70%. Ακριβώς επειδή ορισμένοι ασθενείς με γρίπη είναι δυνατόν να έχουν αρνητικά επιχρίσματα για τον ιό Α(Η1Α1), συνιστάται να εξετάζονται δείγματα επανειλημμένα, καθώς και από περιοχές του κατώτερου αναπνευστικού συστήματος (πτύελα, τραχειακές εκκρίσεις ή BAL). Οι δύο ασθενείς μας πρέπει να θεωρηθούν ανοσοκατασταλμένοι λόγω της χρόνιας αγωγής με κορτιζόνη που ακολουθούσαν και υποκειμένων νοσημάτων που αναφέρθηκαν. Παρατεταμένη ανίχνευση του ιού Α(Η1Ν1) για 14 και 28 ημέρες έχει δημοσιευθεί και σε δύο ανοσοεπαρκείς ασθενείς στο Bordeaux 8. Πρέπει να σημειωθεί ότι και σε παιδιά κάτω των 13 ετών η διάρκεια ανίχνευσης του ιού είναι σημαντικά μεγαλύτερη από αυτή των ενηλίκων ακόμα και μετά από αντι-ιική αγωγή 9. Επίσης νοσηλευόμενοι επί μακρόν, ασθενείς με υποκείμενη νόσο, συχνά παρουσιάζουν σοβαρή λοίμωξη, με αυξημένο ιϊκό φορτίο και παρατεταμένη ανίχνευση του ιού10, όπως παρατηρήθηκε και στους ασθενείς μας. Η εξασθενημένη άμυνα του οργανισμού καθυστερεί την απομάκρυνση του ιού, ενώ η αντι-ιική αγωγή βοηθά τη γρηγορότερη ίαση όταν χορηγηθεί τις πρώτες 4 ημέρες της νόσου9. Μεμονωμένες περιπτώσεις αντοχής στους αναστολείς της νευρομινιδάσης (ζαναμιβίρη και οσελταμιβίρη) αναφέρονται στη βιβλιογραφία μετά από χορήγηση αυτών των φαρμάκων11,12. Ο έλεγχος της ευαισθησίας γίνεται στα εργαστήρια αναφοράς με αναζήτηση των μεταλλάξεων, στο γονίδιο της νευραμινιδάσης του ιού, που σχετίζονται με την αντοχή17. Για να αποκλεισθεί η πιθανότητα παρατεταμένης ανίχνευσης του ιού λόγω ανάπτυξης αντοχής στη θεραπευτική αγωγή, έγινε έλεγχος των τελευταίων θετικών δειγμάτων που απομονώθηκαν από τους ασθενείς μας στο Εθνικό Κέντρο Αναφοράς (Ινστιτούτο Pasteur) για την παρουσία της μετάλλαξης Η 275Υ, η οποία ευθύνεται για την αντοχή στα φάρμακα που δρουν ως αναστολείς της νευραμινιδάσης. Και στους δύο ασθενείς (Α και Β) ο ιός βρέθηκε ευαίσθητος στην οσελταμιβίρη. Από τις μέχρι τώρα ενημερωτικές δημοσιεύσεις τα στελέχη του νέου ιού Α (Η1Ν1) παραμένουν ευαίσθητα στην οσελταμιβίρη και ζαναμιβίρη, αλλά ανθεκτικά στην αμανταδίνη και ριμανταδίνη14. Γι’ αυτό οι συστάσεις του CDC για την αντιμετώπιση όλων των ασθενών που νο- Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 4, 2010 σηλεύονται με πιθανή ή επιβεβαιωμένη γρίπη Α(Η1Ν1), είναι αγωγή με οσελταμιβίρη ή ζαναμιβίρη· καθώς και για εξωτερικούς ασθενείς με αυξημένο κίνδυνο επιπλοκών (π.χ. μικρά παιδιά, γυναίκες που εγκυμονούν και άτομα με χρόνιες παθήσεις). Ωστόσο η ζαναμιβίρη δεν συνιστάται σε ασθενείς με υποκείμενη νόσο των αεραγωγών. Ένας τρίτος αναστολέας της νευραμινιδάσης, η περαμιβίρη, που χορηγείται ενδοφλεβίως βρίσκεται σε πειραματικό στάδιο και αναμένεται η έγκριση από το FDA15. Συμπερασματικά τονίζεται η ανάγκη ελέγχου ευαισθησίας στα αντι-ιικά φάρμακα, εάν οι ασθενείς παρουσιάζουν παρατεταμένη ανίχνευση του ιού και απομόνωση με αυστηρή τήρηση των μέτρων για τον περιορισμό διασποράς στο νοσοκομείο ή στην κοινότητα, του ανθεκτικού στελέχους16. Η μέχρι τώρα εμπειρία πρέπει να γίνει οδηγός για την έγκαιρη και αποτελεσματική αντιμετώπιση μιας νέας, ίσως σοβαρής, επιδημίας. Διεύθυνση επικοινωνίας: κ. Λιάκου Βασιλική Διευθύντρια Μικροβιολογικού τμήματος Βενιζέλειο Πανάνειο Νοσοκομείο Ηράκλειο, Κρήτη ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Εκφράζουμε τις ευχαριστίες μας προς το επιστημονικό προσωπικό του Ινστιτούτου Pasteur, για τον έλεγχο των δειγμάτων, καθώς και για τον έλεγχο ευαισθησίας στα αντι-ιικά φάρμακα. 207 Dept. of Microbiology, Venizeleion Pananeion Hospital, Herakleion, Crete In this report two cases of prolonged shedding of the influenza virus A 2009(H1N1) are presented. The first case, a male patient, aged 61, with chronic obstructive respiratory disease was admitted with influenza like symptoms. RT-PCR of pharyngeal sample was positive for influenza. Consecutive samples taken on the 6th, 14th, 20th and 30th day of hospitalization respectively were all positive for influenza virus A 2009(H1N1). The second case, a woman aged 76, with lung fibrosis, mitral valve disease and hypertension, was hospitalized for drowsiness, chest pain, shortness of breath and diarrheas three days before admission. Multiple nasopharyngeal samples taken the 1st, 5th, 8th and 15th day of hospitalization, were found positive for the detection of H1N1 virus, by RT-PCR. Both patients were treated with high doses of oseltamivir. Prolonged shedding was not associated with viral resistance to neuraminidase inhibitors. Patients with severe disease, treated with oseltamivir, should be checked for prolonged shedding of the virus, and for virus resistance to antivirals. Appropriate measures should be taken to limit the spread of a resistant strain in the community. Infected patients with underlying disease can be carriers of virus even if upper respiratory samples tested with PCR are negative. (Key words: prolonged shedding of H1N1, novel influenza virus, oseltamivir resistance). ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Summary Prolonged viral shedding of the new influenza A virus H1N1 - report of two cases K. DIMOULAS, M. KIRIAZI, E. MICHAILELIS, A.CHARITAKIS, S. KANAKI, Z. ARCHONTAKIS, S. FOUNTOULAKIS, V. LIAKOU 1.Nicholls H. Pandemic influenza: the inside story. PLOS Biology. 2006, 4: 156–160. Epub 2006 Feb 14. PubMed DOI 2.CDC. http://www.cdc.gov/h1n1flu/cdcresponse. htm 3.WHO information for laboratory diagnosis of New Influenza A (H1N1) virus in humans. May 21 2009. http:// www.who.int/csr/resources /publications/swineflu/WHO_Diagnostiv_RecommendationH1N1_20090521.pdf 208 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία 4.CDC. http://www.cdc.gov/media/pressrel/2010/ r100622.htm 5.Klimov AI, Rocha E, Hayden FG, Shult PA, Roumillat LF, Cox NJ. Prolonged shedding of amantadine-resistant influenzae A viruses by immunodeficient patients: detection by polymerase chain reaction-restriction analysis. J Infect Dis 1995, 172: 1352-1355. 6.CDC. Morbidity and Mortality Weekly Report, Oseltamivir-Resistant Novel Influenza A (H1N1) Virus Infection in Two Immunosuppressed Patients - Seattle, Washington, 2009 August 21, 2009, 58(32): 893-896. 7.Ginocchio CC, Zhang F, Manji R, Arora S, Bornfreund M, Falk L, et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. J Clin Virol 2009, 45(3): 191-195. Epub 2009 Jun 16. 8.Fleury H, Burrel S, Balick Weber C, Hadrien R, Blanco P, Cazanave C, Dupon M. Prolonged shedding of influenza A(H1N1)v virus: two case reports from France 2009. Euro Surveill. 2009, 14(49):pii=19434. Available online: http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle. aspx?Articled=19434 9.Li C-C, Wang L, Eng H-W, You H-W, Chang L-S, Tang K-S, et al. Correlation of pandemic (H1N1) 2009 viral load with disease severity and prolonged viral shedding in children. Emerg Infect Dis [serial on the Internet]. 2010 Aug [date cited]. Available from http://www.cdc.gov/EID/ content/16/8/1265.htm 10.Lee N, Chan PK, Hui DS, Rainer TH, Wong E, Choi KW, et al. Viral loads and duration of viral shedding in adult patients hospitalized with influenza. J Infect Dis. 2009, 15: 200(4): 492-500. 11.Englund J, Zerr D, Heath J, Pergam S, Kuypers J, Yager J et al. Oseltamivir-Resistant Novel Influenza A (H1N1) Virus Infection in Two Immunosuppressed Patients - Seattle, Washington, 2009. Morbidity & Mortality Weekly Report. 2009, 58(32): 893-896. 12.Sy CL, Lee S S-J, Liu M-T, Tsai H-C, Chen Y-S. Rapid emergence of oseltamivir resistance [letter]. Emerg Infect Dis [serial on the Internet]. 2010 Apr [date cited]. http://www.cdc.gov/EID/ content/16/4/723.htm 13.World Health Organization. CDC pyrosequencing assay to detect H275Y mutation in the neuraminidase of novel A (H1N1) viruses. Available at http://www.who.int/csr/resources/ publications/swineflu/NA_DetailedPyrosequencing_20090513.pdf 14.Drug susceptibility of swine-origin influenza A (H1N1) viruses, April 2009. Morbidity and Mortality Weekly Report, 2009, 58: 433–435 (http:// www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/ mm5816a6.htm, accessed October 2009). 15.CDC. http://www.cdc.gov/h1n1flu/recommendations.htm 16.Leekha S, Zitterkopf NL, Espy MJ, Smith TF, Thompson RL, Sampathkumar P. Duration of influenza A virus shedding in hospitalized patients and implications for infection control. Infect Control Hosp Epidemiol. 2007, 28(9): 10711076. Epub 2007 Jul 6. 37o Ετήσιο Πανελλήνιο Ιατρικό Συνέδριο Αθήνα, 17 - 21 Μαΐου 2011 Ξενοδοχείο HILTON Προθεσμία υποβολής εργασιών Παρ ασκε υή 14 Ιαν ου αρίου 2011 Πληροφορίες-Γραμματεία: Ιατρική Εταιρεία Αθηνών, Μαιάνδρου 23, 115 28 ΑΘΗΝΑ Τηλ. 210-72 11 845, 210-72 43 161, Fax: 210-72 15 082 http://www.mednet.gr, e-mail: [email protected], [email protected] Υποβλήθηκε: 6/5/2010 Εγκρίθηκε: 16/7/2010 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β’, Τόμος 15, Τεύχος 4, σελ. 209-211 2010 ΝΕΑ ΑΠΟ ΣΕΜΙΝΑΡΙΑ ΠΡΑΚΤΙΚΟ ΜΕΤΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟ ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΟ Το Ειδικό Εργαστήριο Μυκητολογίας, Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Ιατρική Σχολή, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών (Ε.Κ.Π.Α.) οργάνωσε μονοήμερο Πρακτικό Μετεκπαιδευτικό Φροντιστήριο με θέμα «Δερματόφυτα: από την Κλινική στο Εργαστήριο», υπό την αιγίδα της Διεθνούς Μυκητολογικής Εταιρείας, ISHAM και της Ομάδας Εργασίας της ISHAM για τα Δερματόφυτα. Το Φροντιστήριο, που διεξήχθη στις 17 Ιουλίου 2010 στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας, παρακολούθησαν συνολικά 28 ειδικευμένοι ιατροί Βιοπαθολόγοι και ειδικευόμενοι στη Βιοπαθολογία. Στο Φροντιστήριο παρουσιάστηκε συστηματικά η οικολογία δέρματος, η κλινική νοσολογία καθώς και η εργαστηριακή διάγνωση των δερματοφυτικών λοιμώξεων με διδάσκοντες την επιστημονικώς υπεύθυνη του μετεκπαιδευτικού προγράμματος του Ε.Κ.Π.Α. (Κ.Α. 70/3/6915) Επικ. Καθηγήτρια και Αντιπρόεδρο ISHAΜ, Α. Βελεγράκη, (http://www.isham.org/council.html) και τους επιστημονικούς συνεργάτες Μ. Αραμπατζή, Μ.Ε. Καμπούρη και Σ. Αντωνοπούλου. Το Φροντιστήριο ξεκίνησε με χαιρετισμό της Προέδρου της Εταιρείας Κλινικής Μικροβιολογίας και Εργαστηριακής Διαγνωστικής κυρίας Χρύσας Κούτσια-Καρούζου, ο οποίος δημοσιεύεται αυτούσιος, και με τις ευχαριστίες της διοργανώτριας Επίκουρης Καθηγήτριας στον Καθηγητή και Διευθυντή του Εργαστηρίου Μικροβιολογίας κ. Α.Ζ. Τσακρή για την παραχώρηση της αίθουσας προς διεξαγωγή του Φροντιστηρίου. Το διδακτικό πρόγραμμα περιλάμβανε ένα προκαταρκτικό μέρος που κάλυπτε γενικές γνώσεις γύρω από τα δερματόφυτα (ιστορία, θέση τους στο βασίλειο των μυκήτων, επιδημιολογία, γεωγραφική κατανομή, ονοματολογία), την ιατρική κατάταξή τους, τις νόσους που προκαλούν και τη μικροβιακή οικολογία του δέρματος. Κατόπιν παρουσιάστηκαν εργαστηριακά θέματα, όπως η τεχνική δειγματοληψίας και παρασκευής δείγματος, η μεταφορά δειγμάτων, οι τεχνικές άμεσης μικροσκόπησης, η τεχνική καλλιέργειας, τα υλικά και οι συνθήκες για την απομόνωση δερματοφύτων. Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε: α) στην ταυτοποίηση των δερματοφύτων όπου έγινε εισαγωγή ειδικού πρακτικού προγράμματος ταυτοποίησης και διδάχτηκε πρακτικά ο τρόπος χρήσης του και β) στην κλινική ερμηνεία των αποτελεσμάτων μικροσκόπησης και καλλιέργειας. Η παρουσίαση των θεμάτων του προγράμματος ήταν σύμφωνη με τα διεθνή πρότυπα διδασκαλίας στην ιατρική εκπαίδευση. Αναλυτικά, η δομή του προγράμματος περιλάμβανε θεωρητική ανάλυση, επιστημονική κάλυψη του αντικειμένου και πρακτική άσκηση. Για τη θεωρητική ανάλυση της εκπαιδευτικής ενότητας των δερματοφύτων, έγιναν εισηγήσεις και συζητήσεις με τους συμμετέχοντες. Η επιστημονική κάλυψη του αντικειμένου και των επιμέρους θεμάτων του προγράμματος είχε σχεδιαστεί ώστε να υπάρχει συνάφεια της ανάλυσης περιστατικών, της ανταλλαγής απόψεων κατόπιν επιστημονικής επιχειρηματολογίας και πρακτικής άσκησης, ώστε να ενισχυθεί 210 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία η εμπέδωση του θεωρητικού μέρους και να διευκολυνθεί η πρακτική εφαρμογή με άσκηση προσομοίωσης. Η διαδραστική συζήτηση, η ανάλυση περιστατικών, η επιστημονική επιχειρηματολογία και η διεπιστημονική συνεργασία με τους διδάσκοντες μέσω διαλόγου και συζήτησης, βοήθησαν στην ανταλλαγή απόψεων και λύσεων επί πρακτικών προβλημάτων ως προς την ερμηνεία των αποτελεσμάτων των εργαστηριακών δοκιμασιών στη διάγνωση των δερματοφυτιάσεων. Οι ασκήσεις προσομοίωσης έγιναν με ηλεκτρονικά μέσα αλλά και με τη χρήση Πρακτικού Εγχειριδίου 100 περίπου σελίδων με έγχρωμες φωτογραφίες, κλείδα αναγνώρισης δερματοφύτων και αλγορίθμους επεξεργασίας δείγματος, το οποίο έχει εκπονηθεί από τον κ. Μ. Αραμπατζή, και δόθηκε δωρεάν σε όλους τους συμμετέχοντες. Η σημαντικότερη βιβλιογραφία, καθώς και τα δημοσιευμένα ελληνικά επιδημιολογικά στοιχεία, δόθηκαν σε ειδικό CD ως συνοδευτικό του Εγχειριδίου. Καθώς το πρόγραμμα ήταν εξαιρετικά εντατικό, όλοι οι συμμετέχοντες εκτίμησαν τα τα- κτικά σύντομα διαλείμματα ανάπαυσης με καφέ, αναψυκτικά και το ελαφρύ γεύμα το μεσημέρι. Τέλος, το Φροντιστήριο, που επιδοτήθηκε εξ ολοκλήρου από το Εκπαιδευτικό Πρόγραμμα Κ.Α. 70/3/6915 του Ε.Κ.Π.Α., και με τη συμβολή χορηγιών από τη φαρμακευτική βιομηχανία, είχε πριμοδοτηθεί με 6 μονάδες συνεχιζόμενης ιατρικής εκπαίδευσης (CME) από την UEMS. Όλοι οι συμμετέχοντες συμπλήρωσαν δελτίο αξιολόγησης στο τέλος του Φροντιστηρίου, το οποίο κατατίθεται και αξιολογείται από τον Ιατρικό Σύλλογο, ως πάροχο μορίων συνεχιζόμενης Ιατρικής Εκπαίδευσης (CME) στην Ελλάδα. Σύμφωνα με τα δελτία αξιολόγησης, το Φροντιστήριο ήταν πολύ ευπρόσδεκτο και εκτιμήθηκε από τους συμμετέχοντες καθώς, όπως αναφέρεται σε αυτά, «συνεισέφερε στην εκπαίδευση των ειδικευομένων στη Βιοπαθολογία ως προς την εργαστηριακή διαχείριση των δερματοφυτιάσεων, που παρά τη μεγάλη συχνότητά τους στην Ελλάδα και παγκοσμίως παραμένει ένα θέμα εξειδικευμένο και περιορισμένης προσβασιμότητας για τον εργαστηριακό ιατρό». ΧΑΙΡΕΤΙΣΜΟΣ κας ΧΡΥΣΑΣ ΚΟΥΤΣΙΑ- ΚΑΡΟΥΖΟΥ Προέδρου Δ.Σ. Εταιρείας Κλινικής Μικροβιολογίας και Εργαστηριακής Διαγνωστικής Το Δοικητικό Συμβούλιο της Εταιρείας Κλινικής Μικροβιολογίας και Εργαστηριακής Διαγνωστικής, το οποίο αυτή τη στιγμή εκπροσωπώ ως πρόεδρος, θεωρεί ιδιαίτερη τιμή την πρόσκληση από την κ. Βελεγράκη και τους άλλους διοργανωτές του πολύ ενδιαφέροντος αυτού Πρακτικού Φροντιστηρίου (το οποίο διοργανώνεται από το Ειδικό Εργαστήριο Μυκητολογίας, του Εργαστηρίου Μικροβιολογίας, της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών, στα πλαίσια δραστηριοτήτων της Ομάδας Εργασίας της ISHAM) να απευθύνει χαιρετισμό κατά την έναρξη των εργασι- ών του. Η Ιατρική Μυκητολογία, τα τελευταία χρόνια, έχει κάνει μεγάλη πρόοδο και αποτελεί στόχο έρευνας της Ιατρικής αλλά και των άλλων βασικών επιστημών όπως η Βιολογία, εξαιτίας της ευρείας διάδοσης νόσων που οφείλονται σε μύκητες, κυρίως σε ασθενείς με ιδιαίτερους προδιαθεσικούς παράγοντες, αλλά και σε υγιείς πληθυσμούς λόγω γενικότερων παραγόντων και συνθηκών διαβίωσης, που αυξάνουν τις πιθανότητες ανάπτυξης μυκητιάσεων και αλλεργικών εκδηλώσεων προς τους μύκητες. Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 4, 2010 Η διοργάνωση παρόμοιων εκδηλώσεων από το Εργαστήριο Μικροβιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών, που να αφορούν ειδικά θέματα, τα οποία ο έλληνας Βιοπαθολόγος δεν έχει τη δυνατότητα να προσεγγίσει διεξοδικά κατά τη διάρκεια της ειδικότητάς του, απευθύνονται σε μικρές ομάδες και περιλαμβάνουν πρακτική και θεωρητική εκπαίδευση, θεωρώ ότι αποτελεί πολύτιμο στοιχείο για την εκπαίδευση στην ειδικότητα, το οποίο πραγματικά λείπει από την Ελλάδα. Γνωρίζοντας τους επιστήμονες που έχουν ασχοληθεί με τη διοργάνωση του Πρακτικού Φροντιστηρίου, τη γνώση τους για το αντικείμενο, τη 211 σοβαρότητα, το έργο και την προσφορά τους στο αντικείμενο της Μυκητολογίας, αλλά και τη βοήθεια που μας έχουν προσφέρει στα προβλήματα που κατά καιρούς αντιμετωπίζουμε στα νοσοκομεία στα θέματα της Μυκητολογίας, είμαι σίγουρη για την επιτυχία του Φροντιστηρίου. Ευχαριστώ τους ανθρώπους που εργάστηκαν για την πραγματοποίησή του και συγχαίρω το Εργαστήριο της Μικροβιολογίας και τον καθηγητή κ. Τσακρή για τη στήριξη παρόμοιων εκδηλώσεων, οι οποίες ελπίζω να επαναλαμβάνονται συχνά για διάφορα ειδικά θέματα. Εύχομαι ολόψυχα ΚΑΛΗ ΕΠΙΤΥΧΙΑ και ευόδωση των σκοπών και στόχων της εκδήλωσής σας. Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β’, Τόμος 15, Τεύχος 4, σελ. 212 2010 ΡΩΤΟΥΜΕ - ΑΠΑΝΤΟΥΜΕ - ΜΑΘΑΙΝΟΥΜΕ Ερώτηση 1η Για την εργαστηριακή διάγνωση της HPV λοίμωξης αναζητούμε: Α. Τον ιό με καλλιέργεια υλικού από τα κονδυλώματα Β. Αντισώματα IgG και IgM στον ορό με PCR Γ. Την παρουσία του ιού με ανοσοφθορισμό Δ. Τον ιό HPV στις βλάβες με υβριδισμό Ε. Τον ιό στις βλάβες με PCR Ερώτηση 2η Ποιος ιός της ηπατίτιδας μεταδίδεται μέσω της κοπρανοστοματικής οδού; Α. Ο ιός Α Β. Ο ιός Β Γ. Ο ιός C Δ. Κανένας από τους ανωτέρω Ερώτηση 3η Ποια από τα παρακάτω θεωρείται μειονέκτημα της προληπτικής θεραπείας για CMV λοίμωξη σε μεταμοσχευμένους ασθενείς; Α. Η αυξημένη τοξικότητα Β. Η εμφάνιση στελεχών αντοχής Γ. Η ανάγκη για εβδομαδιαία παρακολούθηση των ασθενών Δ. Η παρατεταμένη ουδετεροπενία Ερώτηση 4η Ποια κλινική εκδήλωση από VZV απαντά σχεδόν αποκλειστικά σε HIV θετικούς ασθενείς; Α. Ο διάχυτος ζωστήρας Β. Συστηματική νόσος Γ. Οξεία νέκρωση του αμφιβληστροειδούς Δ. Προοδευτική νέκρωση του αμφιβληστροειδούς Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β’, Τόμος 15, Τεύχος 4, σελ. 213 2010 ΣΥΝΕΔΡΙΑ - ΣΕΜΙΝΑΡΙΑ 31 January - 1 February 2011 Biofilms in Nosocomial Fungal infections Paris - France ESCMID Postgraduate Education Course 4-5 March 2011 Improving Antibiotic Prescribing in Hospitals Belgrade, Serbia ESCMID Postgrad Education Course 10-12 March 2011 Clinical Implications of Antimicrobial Susceptibility testing Izmir, Turkey ESCMID Postgrad Technical Workshop 30 March - 1 April 2011 Acute Infectious Encephalitis: Challenges in Clinical and Biological Diagnosis Grenoble, France ESCMID Postgrad Education Course 11-15 April 2011 Basic Parasitology ESCMID Postgraduate Technical Workshop Ankara, Turkey ESCMID Postgrad Technical Workshop 1-2 April 2011 The impact of vaccines on Public Health Prague, Czech Republic ESCMID Conference 7-10 May 2011 21st ESCMID / 27th ICC Milan - Italy www.escmid-icc2011.org 22 Ιανουαρίου 2011 11η Ημερίδα Κλινικής Μικροβιολογίας «Το μικροβιολογικό δείγμα στη διάγνωση των λοιμώξεων: από τη λήψη στην αξιολόγηση» Αμφιθέατρο, 251 Γενικού Νοσοκομείου Αεροπορίας, Αθήνα 10-12 Φεβρουαρίου 2011 5ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας και Νοσοκομειακών Λοιμώξεων Μέγαρο - Διεθνές Συνεδριακό Κέντρο Αθηνών Γραμματεία: ASCENT Τηλ.: 210 7213255 Fax: 210 7246180 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β’, Τόμος 15, Τεύχος 4, σελ. 214-215 2010 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΔΕΚΑΤΟΥ ΠΕΜΠΤΟΥ ΤΟΜΟΥ ΚΑΤΑ ΘΕΜΑΤΑ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΕΙΣ Τα αντιπυρηνικά αντισώματα και τα αναλυτικά σφάλματα κατά τον προσδιορισμό τους με διαφορετικές εργαστηριακές μεθόδους Π. Καρκαλούσος Σύγχρονη διαγνωστική προσέγγιση των ιώσεων Μ. Γιαννάκη-Ψινάκη Εργαστηριακή διερεύνηση ιογενών λοιμώξεων αναπνευστικού συστήματος Κ. Καλλέργη Εργαστηριακή διερεύνηση ιογενών λοιμώξεων πεπτικού συστήματος Π. Καραμπογιά-Καραφυλλίδη Διαγνωστική προσέγγιση των ιογενών λοιμώξεων του γεννητικού συστήματος Ε. Παπαδογεωργάκη Ιογενείς λοιμώξεις κεντρικού νευρικού συστήματος. Διαγνωστική προσέγγιση Α. Φραντζίδου-Αδαμοπούλου Διερεύνηση ιογενών λοιμώξεων σε ανοσοκατασταλμένους-μεταμοσχευμένους ασθενείς Μ. Αναγνωστοπούλου Ερμηνεία αποτελεσμάτων ιολογικών διαγνωστικών εξετάσεων Α. Μεντής Θεραπεία ιογενών λοιμώξεων και ανάπτυξη αντοχής Ε. Κρανιωτάκη, Ευαγγ. Πλατσούκα PANDAS: Μια νέα μεταστρεπτοκοκκική επιπλοκή; Μ. Δασκαλάκη, Μ. Κανελλοπούλου Διεισδυτικές ασπεργιλλώσεις: Εργαστηριακή διάγνωση και παρακολούθηση Τ-Α. Βυζαντιάδης ΜΕΛΕΤΕΣ Mεταβολή της κατανομής καί συχνότητας των δερματοφυτώσεων στη Νοτιοδυτική Ελλάδα Μ. Τζουμάνη, Ε. Γελαστοπούλου, Ελ. Ντιάζ, Β. Σταμούλη, Χρ. Μπαρτζάβαλη, Σ. Βαμβακοπούλου, Γ. Δημητρακόπουλος, Ε.Δ. Αναστασίου, Χ. Χριστοφίδoυ 33-39 54-60 61-73 74-80 81-90 91-99 100-114 115-120 127-141 142-147 174-188 17-25 Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 4, 2010 215 Εμβολιασμός έναντι του ιού Α (Η1Ν1) στο νομό Φωκίδας 189-193 Η. Περυσινάκης, Π. Βασιλόπουλος, Π. Πνευματικού, Ν. Ζαπανιώτης, Π. Τσιαχρής Π. Δημολιάνης, Ε. Παπούλια Ανίχνευση του ιού γρίπης τύπου Α και Β διά της ταχείας δοκιμής στην επαρχία 194-198 Τριφυλίας Μ. Θεοδώρου, Α. Μαστρογιαννάκη-Μαρίνη, Ι. Μαρίνη, Π. Φλάρης, Ε. Δράκου Οι επιπτώσεις της γρίπης Α(Η1Ν1) στο προσωπικό παιδιατρικού νοσοκομείου 199-202 Μ. Γιαννάκη, Ε. Πετρίδου, Μ. Ντουμπανάκη, Μ. Ζιώγα, Κ. Καλογριοπούλου, Κ. Ξεράκια, Α. Μεντής, Α. Τσακρής, Β. Συριοπούλου, Μ. Θεοδωρίδου, Α. Πάγκαλη ΕΝΔΙΑΦΕΡΟΥΣΕΣ ΠΕΡΙΠΤΩΣΕΙΣ Θανατηφόρος ζυγομύκωση από Saksenaea vasiformis 26-32 Π. Γιαννοπούλου, Α. Κυράτσα, Ν. Χαραλαμπάκη, Μ. Κομπότη, Μ. Αραμπατζής Α. Βελεγράκη, Φ. Κλούβα-Μολυβδά, Ε. Τρίκκα-Γραφάκου Παρατεταμένη ανίχνευση του ιού της νέας γρίπης 203-208 Κ. Δημούλας, Μ. Κυριαζή, Ε. Μιχαηλέλλης, Α. Χαριτάκης, Σ. Κανάκη, Ζ. Αρχοντάκης Σ. Φουντουλάκης, Β. Λιάκου ΕΙΔΙΚΑ ΑΡΘΡΑ Επιδημιολογία νοσοκομειακών λοιμώξεων Ε. Περιβολιώτη Λοιμώξεις από Acinetobacter spp Μυρτώ Κατραμάδου ΝΕΑ ΑΠΟ ΣΕΜΙΝΑΡΙΑ Λοιμώξεις που παρουσιάζουν σοβαρά διαγνωστικά και θεραπευτικά προβλήματα Αικ. Ταρπατζή, Κων. Π. Τσιβεριώτης Πρακτικό μετεκπαιδευτικό φροντιστήριο: Δερματόφυτα ΒιβλιοπαρουσΙαση: Ε.Γ. Πρόγια «Προσέγγιση στην Ιατρική Βιοχημεία» ΣχΟλια - Βιβλιογραφική ενημΕρωση 7-16 148-158 159-164 209-211 40 41-44 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β’, Τόμος 15, Τεύχος 4, σελ. 216 2010 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΣΥΓΓΡΑΦΕΩΝ A Αναγνωστοπούλου Μ. 100 Αναστασίου Ε. 17 Αραμπατζής Μ. 26 Αρχοντάκης Ζ. 203 Β Βαμβακοπούλου Σ. 17 Βασιλόπουλος Π. 189 Βελεγράκη Α. 26 Βυζαντιάδης Τ-Α. 174 Γ Γελαστοπούλου Ε. 17 Γιαννάκη-Ψινάκη Μ. 54, 199 Γιαννοπούλου Π. 26 Δ Δασκαλάκη Μ. 142 Δημητρακόπουλος Γ. 17 Δημολιάνης Π. 189 Δημουλας Κ. 203 Δράκου Ε. 194 Ζ Ζαπανιώτης Ν. 189 Ζιώγα Μ. 199 Θ Θεοδωρίδου Μ. 199 Θεοδώρου Μ. 194 Κ Καλλέργη Κ. 61 Καλογριοπούλου Κ. 199 Κανάκη Σ. 203 Κανελλοπούλου Μ. 142 Καραμπογιά-Καραφυλλίδη Π. 74 Καρκαλούσος Π. 33 Κατραμάδου Μ. 148 Κλούβα-Μολυβδά Φ. 26 Κομπότη Μ. 26 Κρανιωτάκη Ε. 127 Κυράτσα Α. 26 Κυριαζή Μ. 203 Λ Λιάκου Β. 203 Μ Μαρίνη Ι. 194 Μαστρογιαννάκη-Μαρίνη Α. 194 Μεντής Α. 115, 199 Μιχαηλέλλης Ε. 203 Μπαρτζάβαλη Χρ. 17 Ν Ντιάζ Ελ. 17 Ντουμπανάκη Μ. 199 Ξ Ξεράκια Κ. 199 Π Πάγκαλη Α. 199 Παπαδογεωργάκη Ε. 81 Παπούλια Ε. 189 Πάσχου-Πετροχείλου Β. 40, 43, 141 Περιβολιώτη Ε. 7 Περυσινάκης Η. 189 Πετρίδου Ε. 199 Πλατσούκα Ε. 127 Πνευματικού Π. 189 Σ Σταμούλη Β. 17 Συριοπούλου Β. 199 Τ Ταρπατζή Αικ. 159 Τζουμάνη Μ. 17 Τρίκκα-Γραφάκου Ε. 26 Τσακρής Α. 199 Τσιαχρής Π. 189 Τσιβεριώτης Κ. 159 Φ Φλάρης Π. 194 Φουντουλάκης Σ. 203 Φραντζίδου-Αδαμοπούλου Α. 91 Χ Χαριτάκης Α. 203 Χριστοφίδου Χ. 17 Χαραλαμπάκη Ν. 26
© Copyright 2024 Paperzz
