Micotossine: nuovi sviluppi in campo analitico Meschiari Marco, NEOTRON S.p.A. - R&D Padova - 29 Aprile 2014 Neotron S.p.a. Stradello Aggazzotti, 104 Tel:+39 059 461711 Fax:+39 059 461777 www.neotron.it Neotron S.p.A. – Modena • ~ 370 impiegati • ~ 9000 m2 di laboratorio Neotron S.p.a. Stradello Aggazzotti, 104 Tel:+39 059 461711 Fax:+39 059 461777 www.neotron.it Campioni analizzati nel 2013 = 206617 Circa 940 campioni al giorno Category parameters Contaminants % 63 Pesticides 36 Others 27 Nutritional Microbiological 15 micotossine 14 Packaging 5 Others 3 Pharma (GMP) Cosmesi Neotron S.p.a. Stradello Aggazzotti, 104 Tel:+39 059 461711 Fax:+39 059 461777 www.neotron.it Micotossine analizzate presso i nostri laboratori AFLATOXINS FUMONISINS ALTERNARIA TOXINS AFLATOXIN B1 FUMONISIN B1 AFLATOXIN B2 FUMONISIN B2 Alternariolo Alternariolo mono methyl ether AFLATOXIN G1 Tenuazonic Acid AFLATOXIN G2 TRICHOTHECENES AFLATOXIN M1 HT-2 TOXIN (HT-2) ZEARALENONES AFLATOXIN M2 T-2 TOXIN (T-2) ZEARALENONE NIVALENOLO (NIV) ALPHA-ZEARALENOL OCHRATOXIN A DEOXYNIVALENOL(DON) BETA-ZEARALENOL PATULIN 3-ACETYL-DEOXYNIVALENOL 15-ACETYL-DEOXYNIVALENO DIACETOSSISCIRPENOLO (DAS) OTHER MYCOTOXINS CITRININ FUSARENON X (FX) NEOSOLANIOL (NEO) Neotron S.p.a. Stradello Aggazzotti, 104 Tel:+39 059 461711 Fax:+39 059 461777 www.neotron.it Fattori critici nell’analisi di micotossine Perche l’analisi delle micotossine è “difficile”? Disomogeneità CAMPIONAMENTO Scarsa rappresentatività Matrici complesse Interferenze di matrice Falsi positivi/negativi ANALISI Bassi limiti (ug/Kg) Neotron S.p.a. Stradello Aggazzotti, 104 Tel:+39 059 461711 Fax:+39 059 461777 www.neotron.it Campionamento Partita di prodotto da analizzare Campionamento Campione che arriva al laboratorio Metodo di analisi Espressione del risultato analitico CRITICITA’ • Distribuzione eterogenea • Grandezza del campione • Contaminazione puntiforme • Pochi campioni elementari • Scarsa omogeneità del campione globale prima del prelievo del campione Neotron S.p.a. Stradello Aggazzotti, 104 Tel:+39 059 461711 finale Fax:+39 059 461777 www.neotron.it Metodo di analisi Tecniche analitiche principalmente utilizzate HPLC-FL (Aflatossine) HPLC-MS/MS Kit per screening rapido Tecniche STRUMENTALI (Analisi di laboratorio) ELISAs Dipsticks – Lateral Flow Neotron S.p.a. Stradello Aggazzotti, 104 Tel:+39 059 461711 Fax:+39 059 461777 www.neotron.it Metodo di analisi Cosa SAPPIAMO del metodo di analisi utilizzato ? Cosa capiamo dal rapporto di prova? Recupero Accreditamento Risultato Incertezza Limite di quantificazione Neotron S.p.a. Stradello Aggazzotti, 104 Tel:+39 059 461711 Fax:+39 059 461777 www.neotron.it Metodo di analisi La maggior parte dei metodi di analisi possono essere suddivisi in diverse “fasi”: • Preparazione del campione • Estrazione / Purificazione • Rivelazione Metodo di analisi Neotron S.p.a. Stradello Aggazzotti, 104 Tel:+39 059 461711 Fax:+39 059 461777 www.neotron.it Preparazione del campione circa 0,02 Kg 0,5 - 1 Kg (cereali) Campione che arriva al laboratorio Omogeneizzazione Subcampione sul quale viene eseguita l’analisi PASSAGGIO CRITICO Il subcampione analizzato deve essere rappresentativo dell’intero campione arrivato al laboratorio Il campione che arriva al laboratorio (o una parte rappresentativa) deve essere reso OMOGENEO Preparazione del campione Estrazione / Purificazione Rivelazione Neotron S.p.a. Stradello Aggazzotti, 104 Tel:+39 059 461711 Fax:+39 059 461777 www.neotron.it Preparazione del campione OMOGENEITA DEL CAMPIONE (cereali) • Macinazione del campione con CO2 allo stato solido (-78°C) • Preparazione dello “Slurry” campione + acqua frullatore a lame 40g si quali viene eseguita l’analisi ottenimento di un preparato semiliquido senza separazioni tra le fasi µg/Kg Preparazione del campione Estrazione / Purificazione Rivelazione Analisi aflatossina B1 ripetuta 5 volte sullo stesso campione Neotron S.p.a. Stradello Aggazzotti, 104 Tel:+39 059 461711 Fax:+39 059 461777 www.neotron.it Preparazione del campione Campione Macinato Slurry Preparazione del campione Estrazione / Purificazione Rivelazione Neotron S.p.a. Stradello Aggazzotti, 104 Tel:+39 059 461711 Fax:+39 059 461777 www.neotron.it Estrazione ESTRAZIONE Gli analiti di interesse vengono: 1) Estratti dalla matrice che li contiene 2) Separati da altri componenti presenti nella matrice Estrazione dipendente dalla matrice Cereali: Estrazione con miscela di CH3OH / H2O acida Estrazione con miscela di CH3CN / H2O acida Preparazione del campione Estrazione / Purificazione Rivelazione Neotron S.p.a. Stradello Aggazzotti, 104 Tel:+39 059 461711 Fax:+39 059 461777 www.neotron.it Purificazione Purificazione dell’estratto con colonne ad immunoaffinità condizionamento semina eluizione lavaggio Purificazione su colonne ad immunoaffinità SELETTIVITA’ matrice Preparazione del campione Estrazione / Purificazione Rivelazione analita Neotron S.p.a. Stradello Aggazzotti, 104 Tel:+39 059 461711 Fax:+39 059 461777 www.neotron.it Purificazione HPLC-MS/MS SENZA purificazione immunoaffinità OCRATOSSINA A Campione: Cacao HPLC-MS/MS CON purificazione immunoaffinità Preparazione del campione Estrazione / Purificazione Rivelazione Neotron S.p.a. Stradello Aggazzotti, 104 Tel:+39 059 461711 Fax:+39 059 461777 www.neotron.it Rivelazione Mais Mais + 0,10 mg/kg Fumonisina B1 Tipologia di detector utilizzai: Fluorimetro: Alfa / Ocratossina MS/MS: Tutte le altre Fumonisine HPLC-MS/MS Aflatossine Preparazione del campione Estrazione / Purificazione Rivelazione RIVELAZIONE (HPLC-FL) Neotron S.p.a. Stradello Aggazzotti, 104 Tel:+39 059 461711 Fax:+39 059 461777 www.neotron.it Multideterminazione di micotossine AFLATOXINS FUMONISINS ALTERNARIA TOXINS AFLATOXIN B1 FUMONISIN B1 AFLATOXIN B2 FUMONISIN B2 Alternariolo Alternariolo mono methyl ether AFLATOXIN G1 Tenuazonic Acid AFLATOXIN G2 TRICHOTHECENES AFLATOXIN M1 HT-2 TOXIN (HT-2) ZEARALENONES AFLATOXIN M2 T-2 TOXIN (T-2) ZEARALENONE NIVALENOLO (NIV) ALPHA-ZEARALENOL OCHRATOXIN A DEOXYNIVALENOL(DON) BETA-ZEARALENOL PATULIN 3-ACETYL-DEOXYNIVALENOL 15-ACETYL-DEOXYNIVALENO DIACETOSSISCIRPENOLO (DAS) Multideterminazione OTHER MYCOTOXINS CITRININ FUSARENON X (FX) NEOSOLANIOL (NEO) Neotron S.p.a. Stradello Aggazzotti, 104 Tel:+39 059 461711 Fax:+39 059 461777 www.neotron.it Multideterminazione di micotossine Difficoltà nello sviluppo metodo per multideterminazione di micotossine - Proprietà chimico fisiche differenti - Limiti di legge molto diversi (es. Aflatossine, Tricoteceni) - Quantitativi presenti nei campioni differenti Unica detection Limite di quantificazione Fattore diluizione estratto analizzzato Neotron S.p.a. Stradello Aggazzotti, 104 Tel:+39 059 461711 Fax:+39 059 461777 www.neotron.it Multideterminazione di micotossine Two-dimensional LC/MSMS Fasi analitiche (ABSCIEX API 5500) • Caricamento campione sulla Colonna 1 • Eluizione del campione dalal colonna 1 • Separazione cromatografica sulla colonna 2 Aflatoxin LoQ = 0,01 µg/Kg Ochratoxin A = 0,02 µg/Kg Mycotoxin multidetermination • Detector MS/MS column1 column2 Neotron S.p.a. Stradello Aggazzotti, 104 Tel:+39 059 461711 Fax:+39 059 461777 www.neotron.it Multideterminazione di micotossine Aflatossine Aflatossina B1 0,50 ng/Kg RIVELAZIONE (HPLC-MS/MS) ALTA sensibilità Aflatossina G1 0,56 ng/Kg Aflatossina B2 0,52 ng/Kg Ocratossina A 1,2 ng/Kg Aflatossina M1 0,40 ng/Kg Neotron S.p.a. 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