R03. Micotossine - Scienze Ambientali a Ravenna

Prof. Giorgio Sartor
MICOTOSSINE
Copyright © 2001-2014 by Giorgio Sartor.
Versione 0.2 – mar 2014
All rights reserved.
Patologie alimentari
Intossicazioni
Infezioni
Avvelenamento
chimico
Avvelenamento
da piante
Intossicazioni
microbiche
Tessuti
animali
velenosi
Infezione da
tossine
Altro
Neurotossine
Infezione
invasiva
Enterotossine
Sistemica
Micotossine
(tossine
fungine)
Diarroiche
gs © 2001-2014 ver 0.2
Tossine
algali
Emetiche
Tossine
batteriche
Enterotossine
R03 - Micotossine
Mucosa
intestinale
Neurotossine
Altro tessuto
o organo
(Muscolo,
fegato ecc.)
Altro
2
1
Patogeni non batterici
• Funghi (muffe), Protozoi, Elminti,
Alghe
– I sintomi possono essere causati da:
• componenti delle cellule, tossine, prodotti di
scarto
• Risposta allergica dell’ospite
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R03 - Micotossine
3
Tossine fungali
• Le tossine fungali si dividono in due
categorie principali:
– Le tossine da muffe (micotossine):
• prodotti naturali che evocano una risposta tossica
quando introdotte a bassa concentrazione in
vertebrati;
• prodotti del metabolismo secondario: non essenziali
per la crescita cellulare o per mantenere le funzione
vitali di base delle cellule
– Le tossine da funghi (veleni)
• Non chiaro il ruolo biologico: possibili armi
nei confronti di patogeni ambientali
(battericidi o antibiotici).
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R03 - Micotossine
4
2
Veleni fungali
• Alcaloidi
– Muscarina,
Psilocibina
CH3
O
H 3C
+
N CH
3
H 3C
HO
• Peptidi ciclici
Amanita muscaria
– α-Amanitina,
Falloidina
• Terpenoidi
• Valinopina
CH3
HN
H
HO
O
S
N
O
H H
N
OH
O
O
HN
N
H
O
OH
H
N
N
H H O
H3C
CH3
H
N
H
OH
CH3
O
Amanita phalloides
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5
Diagnosi
• Problema medico, le malattie prodotte da tossine
sono difficili da diagnosticare:
• Solo poche tossine producono segni manifesti di
avvelenamento o altri sintomi;
• Sono molecole di struttura “bizzarra” e con bassi
pesi molecolari (50 – 500);
• Molecole così piccole non attivano il sistema
immunitario e la loro pericolosità, negli alimenti,
è legata alla difficoltà del riconoscimento
biologico.
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6
3
Muffe contaminanti
• I maggiori organismi che producono micotossine
appartengono ai generi:
1.
2.
3.
Aspergillus
Fusarium
Penicillium
• Le contaminazioni di alimenti possono avvenire
in ogni punto della filiera produttiva: nella
crescita in campo, durante il raccolto, nel
trasporto o nell’immagazzinamento.
• Il problema delle muffe tossicogeniche è uno dei
maggiori problemi in agricoltura e coinvolge i
cereali, la frutta fresca e secca e prodotti
derivati.
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7
Micotossine
• Sono generalmente molto stabili chimicamente e,
quindi, difficili da degradare con i comuni
processi dell’industria alimentare;
• Possono causare effetti acuti (tossicità renale e/o
epatica) e effetti cronici (carcinogenesi, difetti
neonatali, neuro tossicità);
• Possono essere letali;
• Tre meccanismi di azione generali:
– Mutageniche;
– Teratogeniche;
– Carcinogeniche.
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8
4
Chi fa cosa
Organismo
Substrato
Micotossina
Aspergillus flavus, A. parasiticus, A.
columnaris e A. nomius
Mais, arachidi,
cotone, semi da
olio.
Aflatossine
Aspergillus ochraceus
Orzo, grano.
Aspergillus carbonerius
Uva, caffè.
Ocratossine
Grano, orzo, mais.
Fumonisine
Penicillium verrucosum
Fusarium oxysporum, F. verticillioides
e F. proliferatum
Tricoteceni (Tossina
T-2), Zearalenone
Fusarium spp.
Claviceps purpurea
Segale
Penicillium patulatum, P. claviforme
Mele
Patulina
Fieno
Tricoteceni (Tossina
T-2)
Stachybotrys
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Alcaloidi dell’Ergot
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Chi fa cosa
Micotossina
Patologia
Aflatossine
Epatossiche, carcinogeniche.
Ocratossine
Nefrotossiche, immuno soppressive.
Fumonisine
Epatossiche, leucoencefalomalacia (cavallo).
Tricoteceni (Tossina T-2)
Citotossiche, inibiscono la sintesi di proteine
e DNA.
Zearalenone
Micoestrogeni.
Alcaloidi dell’Ergot
Ergotismo: allucinazioni, fuoco di
Sant’Antonio, ecc.
Patulina
Antibiotico e antitumorale, interviene nella
sintesi di tRNA
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5
Aflatossine
Aspergillus spp.
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Ciclo vitale
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6
Ciclo vitale si Aspergillus
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Aspergillus
• Genere comprendete più di 100 specie di cui
almeno 50 producono micotossine.
• Tossine prodotte:
–
–
–
–
–
–
Aflatossine
Ocratossina A
Sterignmatocistina
Acido ciclopiazonico
Citrinina
Patulina
• A. niger è usato per produrre acido citrico usato
nelle bibite.
• A. oryzae è usato per produrre salsa di soia e sakè.
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7
Aflatossine
•
•
•
Sono un gruppo di tossine
prodotte da Aspergillus flavus,
A. parasiticus, A. columnaris e
A. nomius.
Quattro prodotti naturali:
– Aflatossina B1, B2, G1 e G2
e due prodotti del loro
metabolismo: Aflatossina M1
e M2
È dimostrata la tossicità delle
molecole è legata alle attività
mutageniche indotte sul DNA
con conseguente danno
genetico.
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Prodotti interessati
• Aspergillus flavus è stato
identificato nelle arachidi.
• A. parasiticus e/o A. columnaris
sono stati identificati in avena,
segale, riso, orzo, grano, miglio,
mais, ceci, noci di pecan e
cassava, patata dolce.
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Aflatossine
O
O
O
O
H
Aflatossina B1
O
O
CH3
O
H
H O
CH3
O
O
O
O
O
O
O
H
O
O
Aflatossina G2
O
H
O
CH3
O
O
OH
Aflatossina M1
H
O
CH3
O
O
O
O
OH
O
O
O
Aflatossina M2
O
H
O
CH3
O
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H
O
O
O
O
H
O
17
O
O
O
O
H
O
H
CH3
O
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O
OH
Aflatossina B2
O
O
Aflatossina G1
O
O
O
O
CH3
O
O
O
H
O
O
CH3
H
O
O
CH3
FASE I
O
H
H
H
H
O
H
O
O
O
H
O
O
O
CH3
H
O
O
O
O
O
OH
O
O
O
H
H
O
O
CH3
FASE II
Coniugazione
ESCREZIONE
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Legame covalente
al DNA - Carcinogenesi
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9
Meccanismo d’azione
• Aflatossina B1 (AFB1) è metabolizzata da vari citocromi P450,
producendo AFB1-exo-8,9-epossido. L’epossido po’ reagire con
il N7 della guanina nel DNA per formare l’addotto AFB1-N7-dG.
• La reazione dell’addotto con una base induce l’apertura dell’anello
della guanina formando l’addotto finale AFB1-FAPY.
O
H
O
O
O
O
P450
H
O
H
O
O
O
O
O
CH3
H
O
O
H3 C
CH3
H 3C
O
O
O
O
H
O
O
O
O
HN
H
O
O
O
+
H2 N
N
OH-
DNA
H2 N
N
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N
H
H 2N
O
N
HN
N
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O
HO
O
O
N
HN
O
H
H
HO
O
CH3
O
O
H
O
N
O
O
N
DNA
O
H
NH
DNA
19
Meccanismo d’azione
Both AFB(1)-N7-dG and
the β-anomer of the
AFB(1)-FAPY adduct yield
G→T transversions in
Escherichia coli, but the
latter is more mutagenic.
We show that the Sulfolobus
solfataricus P2 DNA
polymerase IV (Dpo4)
bypasses AFB(1)-N7-dG in
an error-free manner but
conducts error-prone
replication past the AFB(1)FAPY adduct, including
misinsertion of dATP,
consistent with the G→T
mutations observed in E.
coli.
Bypass of aflatoxin B1 adducts by the Sulfolobus solfataricus DNA polymerase IV.
Banerjee S, Brown KL, Egli M, Stone MP.
J Am Chem Soc. 2011 Aug 17;133(32):12556-68
gs © 2001-2014 ver 0.2
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10
Meccanismo d’azione
gs © 2001-2014 ver 0.2
R03 - Micotossine
Bypass of aflatoxin B1 adducts by the
Sulfolobus solfataricus DNA polymerase IV.
Banerjee S, Brown KL, Egli M, Stone MP.
J Am Chem Soc. 2011 Aug
21
17;133(32):12556-68
Biosintesi delle aflatossine
gs © 2001-2014 ver 0.2
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11
Biosintesi delle aflatossine
Aflatoxin B1 biosynthesis.
(A) Biosynthetic pathway. PksA accepts a
C6 fatty acid from the associated fatty
acid synthase subunits (HexA/HexB)
and homologates acetyl units while
attached to either the acyl carrier
protein (ACP) or ketosynthase (KS) to a
fixed chain length (octaketide), as
shown in the hypothetical intermediate
1 (shown as the keto form), R = ACP or
KS. PksA controls specific cyclization
chemistry to release the norsolorinic
acid anthrone, which is auto-oxidized in
vitro to norsolorinic acid. 3 is processed
through a series of oxidative
rearrangements to aflatoxin B1.
(B) Fungal nonreducing PKS domain
architecture (PksA). Domains include
SAT, KS, malonyl-CoA:ACP transacylase
(MAT), PT, ACP, and
thioesterase/Claisen cyclase (TE/CLC).
Many known and apparently
homologous enzymes that share similar
domain organization synthesize an
assortment of products with alternative
chain lengths and cyclization scaffolds.
Deconstruction of Iterative Multidomain Polyketide Synthase Function
J. M. Crawford, P.M. Thomas, J.R. Scheerer, A.L. Vagstad, N.L. Kelleher,
C.A. Townsend.
SCIENCE VOL 320 11 APRIL 2008
gs © 2001-2014 ver 0.2
R03 - Micotossine
23
Biosintesi delle aflatossine
Biosynthesis of norsolorinic acid anthrone (1) by PksA
a, Native catalytic cycle. The SAT domain in PksA selects a hexanoyl starter unit. The MAT domain loads the free ACP with malonyl units.
After seven successive condensation events with malonyl-ACP catalysed in KS, the linear ACP-bound polyketide 6 is cyclized (C4–C9 and
C2–C11 cyclization events) and aromatized in the product template (PT) domain to give the bicyclic intermediate 7. The TE catalyses C-C
cyclization to release anthrone (1), which undergoes oxidation to the anthraquinone norsolorinic acid (2), to initiate the complex
biosynthetic pathway to aflatoxin B1 (3). Asterisks denote the C and O nucleophiles involved in on-path and off-path cyclizations,
respectively. b, In the absence of TE, the PT product 7 undergoes spontaneous O-C cyclization to norpyrone (4). The PT monodomain
structure was solved with intermediate/product mimic 5 (HC8). c, Conversions from 6 to 7 via intermediates 8, 9 and 10.
Structure and function of an iterative polyketide synthase thioesterase domain catalyzing Claisen cyclization in aflatoxin biosynthesis
T.P. Korman, J.M. Crawford, J.W. Labonte, A.G. Newman, J. Wong, C.A. Townsend and Shiou-Chuan Tsa
PNAS (2010), vol. 107, no. 14
gs © 2001-2014 ver 0.2
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12
Biosintesi delle aflatossine
Overall structure of the PksA TE domain. (A) Ribbon
diagram of the TE α/β-hydrolase fold with the core domain
shown in blue and the unique lid in yellow. The location of
the S1937-H2088-D1964 catalytic triad and the oxyanion
site residue G1874 is shown in balls-and-sticks and labeled
green. The position of the lid-loop, which presumably opens
upon presentation of substrate by ACP, is closed. (B)
Topology diagram of PksA TE showing the location of the
catalytic triad residues along with G1874 (Black Dots),
which is thought to act as the oxyanion hole for the
reaction, and the lid region (Yellow) as an insertion
between β6 and β7, a common feature of FAS, PKS and
NRPS TE domains. The core sheets and helices are colored
blue and green, respectively, and are numbered as the
canonical α/β-hydrolase fold showing that PksA TE lacks the
first N-terminal sheet necessary for dimerization. (C)
Comparison of open and closed lid conformations found in
TE crystal structures.
Structure and function of an iterative polyketide synthase
thioesterase domain catalyzing Claisen cyclization in
aflatoxin biosynthesis
T.P. Korman, J.M. Crawford, J.W. Labonte, A.G. Newman, J.
Wong, C.A. Townsend and Shiou-Chuan Tsa
PNAS (2010), vol. 107, no. 14
gs © 2001-2014 ver 0.2
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Biosintesi degli acidi grassi
• Negli animali la sintesi è catalizzata da una serie di
enzimi componenti del complesso acido grasso sintasi
(EC 2.3.1.85 EC 2.3.1.86) mentre nelle piante e nei
batteri gli enzimi sono separati
• La biosintesi usa come sistema redox il NADP+/NADPH
(la degradazione usa il sistema NAD+/NADH).
• L’addizione dell’unità C2 è alimentata dal ∆G negativo
della decarbossilazione del malonil-CoA.
• L’allungamento è ripetuto fino alla formazione di C16
(Acido palmitico).
• Altri enzimi catalizzano la ramificazione e
l’insaturazione.
gs © 2001-2014 ver 0.2
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13
Strategia
Acetil-CoA
Malonil-CoA
CO2
O
O
H3C
S
O
CoA
CoA
S
O
CO2
Acetil-ACP
O
H3 C
ACP
S
CO2
O
O
6
S
O
CH3
CoA
O
O
CH3
S
Dopo sette cicli
EC 2.3.1.85
EC 2.3.1.86
S
O
ACP
ACP
O
CH3
O
(CH2)14
NADPH
NADP+
INVERSO DELLA β-OSSIDAZIONE
H2O
NADPH
gs © 2001-2014 ver 0.2
NADP+
R03 - Micotossine
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Energia
• La spinta è il potere riducente del
NADPH
Acetil-CoA + 7 Malonil-CoA + 14 NADPH + 14H+ →
→ Palmitoil-CoA + 7 HCO3- + 7 CoA-SH + 14 NADP+
Formazione di esteri
gs © 2001-2014 ver 0.2
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Formazione di malonil-CoA
O
H3C
O
O
CoA
S
O
+ ATP +
HO
Acetil-CoA
carbossilasi
EC 6.4.1.2
O
Acetil-CoA
S
O
CoA
+ ADP + Pi +H+
Malonil-CoA
• L’acetil-CoA carbossilasi (ACC) è un enzima biotina dipendente
che funziona in modo simile alla piruvato carbossilasi,
• Non fa parte del complesso acido grasso sintasi,
• Ha un meccanismo a ping-pong:
HCO3-
ATP
ADP
Pi
Acetil-CoA
E-biotina
E-carbossibiotina
E-biotina
gs © 2001-2014 ver 0.2
Malonil-CoA
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Acyl Carrier Protein (ACP)
• Il legame avviene attraverso la Ser terminale
che lega il gruppo prostetico:
O
H
S
O
H
N
N
H
H
CH3
O
OH
CH3
O
P
O
ACP
O
Fosfopanteina
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Strategia
CO2
O
H3 C
O
O
Acetil-CoA
S
CoA
S
O
Malonil-CoA
CoA
CO2
O
Acetil-ACP
H3 C
S
ACP
CO2
O
6 Malonil-CoA
6
CoA
S
O
CH3
β-chetoacil-ACP
sintetasi
EC 2.3.1.41
O
O
O
S
Palmitoil-ACP
ACP
CH3
Dopo sette cicli
S
CH3
O
(CH2)14
O
NADP+
O
CH3
O
(CH2) 14
Acetoacetil-ACP
β-chetoacil [ACP]
reduttasi
EC 1.1.1.100
ACP
S
Butirril-ACP
Acil-ACP-idrolasi
EC 3.1.2.14
ACP
Acido grasso sintasi
EC 2.3.1.85
EC 2.3.1.86
Enoil-[ACP] reduttasi
NADPH EC 1.3.1.10
NADH EC 1.3.1.9
CH3
NADPH
H
Palmitato
CH3
β-idrossibutirril
[ACP] deidratasi
EC 4.2.1.58
H
O
HO
H
O
S
H2O
S
ACP
Crotonil-ACP
NADPH
NADP+
ACP
D-idrossibutirril-ACP
(nella β-ossidazione
L-idrossienoil-CoA)
INVERSO DELLA β-OSSIDAZIONE
gs © 2001-2014 ver 0.2
R03 - Micotossine
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Acido grasso sintasi
Subunità α
• Il meccanismo è lo
stesso sia per gli
organismi superiori
che per i batteri che le
piante,
• È diversa
l’organizzazione degli
enzimi:
– Nel lievito e nelle piante
il complesso acido
grasso sintasi è un
complesso enzimatico
α6β6.
Enzima di
Condensazione
(Chetoacil-ACP-sintasi)
B-chetoacil
ACP-reduttasi
Acetiltransferasi
Maloniltransferasi
β-idrossialcil
deidratasi
Enoilreduttasi
Subunità β
gs © 2001-2014 ver 0.2
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Acido grasso sintasi
• Il meccanismo è lo stesso
sia per gli organismi
superiori che per i batteri
che le piante,
• È diversa l’organizzazione
degli enzimi:
– Negli animali è un dimero
nel quale ognuno dei
monomeri contiene le
attività enzimatiche della
catena sintetica, i
monomeri sono organizzati
testa-coda in modo tale che
il prodotto di una catena di
reazioni entra nella
successiva catena di
reazioni
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Meccanismo
3-chetoacil-ACP sintasi
Acetil transferasi
Malonil transferasi
AT
MT
KSasi
O
H
AT
O
S
H
H
KSasi
O
O
S
MT
AT
O
O
O
O
H3C
O
H
CoA
S
S
Acetil-CoA
O
H
S
H
H
CH3
O
O
CoA
O
S
ACP
S
O
O
H
O
CH3
MT
KSasi
O
ACP
O
Malonil-CoA
S
ACP
AT
H
MT
KSasi
O
O
S
H
CH3
AT
KSasi
O
H2O
H
H
MT
AT
O
O
S
H
CO2
H
CH3
H
KSasi
NADP+
S
ACP
NADPH
NADP+
NADPH
O
H
CH3
O
MT
KSasi
S
O
O
O
CH3
O
H
O
S
O
ACP
S
ACP
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AT
O
H
O
O
O
MT
S
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O
S
ACP
O
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Aspergillus spp. negli alimenti
•
La presenza e lo sviluppo di Aspergillus
nei prodotti alimentari è legato a diversi
fattori:
–
–
–
–
Granaglie e alimenti da esse derivati
immagazzinati in ambienti caldi e umidi;
Raccolti effettuati in stagioni piovose o prima
della maturazione;
Contaminazione diretta da suolo;
Crescita in suoli con alti livelli di
contaminazione fungina.
gs © 2001-2014 ver 0.2
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35
Aflatossicosi
• Causata da alte dosi in piccoli
intervalli temporali o basse dosi
per tempi prolungati.
• Nel 1961, ha causato la morte di
oltre 100000 tacchini di
allevamento (Turkey X disease) a
causa di mangimi provenienti da
arachidi brasiliane contaminate
con aflatossina;
• Crescita migliore tra 25°C – 35°C
(allevamento);
• La proliferazione può essere
innescata e favorita anche su altri
prodotti.
gs © 2001-2014 ver 0.2
R03 - Micotossine
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18
Aflatossina B-1
• Provoca il cancro in animali e, probabilmente, in umani;
• È teratogenica, causa difetti neonatali e, in adulti, può
dare sintomi influenzali, convulsioni, paralisi, coma e
morte;
• Bersaglio principale è il fegato dove può provocare
cirrosi, necrosi e carcinoma epatico;
• Ha, come effetto secondario, quello di sopprimere la
risposta immunitaria;
• In caso di consumo materno può provocare l’ittero
neonatale;
• Non permane a lungo nell’organismo, viene escreta dagli
animali in circa 96 ore.
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Concentrazioni
•
Sorgenti normative:
– REGOLAMENTO (CE) N. 1881/2006 DELLA COMMISSIONE EUROPEA del 19
dicembre 2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti
alimentari
– REGOLAMENTO (CE) N. 1126/2007 DELLA COMMISSIONE del 28 settembre 2007
che modifica il regolamento (CE) n. 1881/2006 che definisce i tenori massimi di
alcuni contaminanti nei prodotti alimentari per quanto riguarda le Fusarium tossine nel granoturco e nei prodotti a base di granoturco
Tenore massimo µg/Kg (ppb)
Prodotto
Mais da sottoporre a cernita o ad altro
trattamento fisico prima del consumo umano
o dell’impiego come ingredienti di prodotti
alimentari
B1
B1+B2+G1+G2
5
10
M1
Alimenti per lattanti e alimenti di
proseguimento, compresi il latte per lattanti e
il latte di proseguimento
0.025
Latte crudo, latte trattato termicamente e
latte destinato alla fabbricazione di prodotti a
base di latte
0.050
Alimenti dietetici a fini medici speciali,
destinati specificatamente ai lattanti
gs © 2001-2014 ver 0.2
0.10
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0.025
38
19
Test
1. Test immunoenzimatico (ELISA) su
un campione rappresentativo
2. Test del peso (arachidi): densità (le
arachidi infettate con Aspergillus sono
più leggere delle arachidi sane)
3. Tecniche di campionamento
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Ocratossina A
Aspergillus ochraceus
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20
Ocratossina A
Cl
CH3
H
N
HO
O
O
O
OH
O
• Aspergillus ochraceus e altre specie comprese Penicillium spp.
producono sette diverse tossine tra loro correlate, le ocratossine;
• Le ocratossine sono presenti in molti alimenti: cereali, soia, frutta
secca, caffè, carne, pesce secco e latte;
• È una tossina epatotossica e nefrotossica ed è un potente
carcinogenico;
• Il pollame può essere affetto da ocratossicosi con conseguente
scarso accrescimento e scarse quantità e qualità delle uova.
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Ocratossine
R1
CH3
O
R2
O
Ocratossina
OH
O
R1
R2
*
A
HN
Cl
OH
O
*
B
HN
H
OH
O
*
C
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Cl
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HN
O
CH 3
O
42
21
Nefropatia
• È il maggior effetto conosciuto dell'Ocratossina A
in mammiferi non ruminanti;
• Studi epidemiologici nel nord Europa hanno
dimostrato che riveste un ruolo importante nella
eziologia della nefropatia porcina;
• È stata anche associata ad alcune nefropatie
umane [Balkan Endemic Nephropathy (BEN) e
Tunisian Nephropathy (TCIN)].
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Patulina
Aspergillus clavatus, A. giganteus, A. longivesica,
Penicillium patulum, P. clariform, P. carneum, P.
clavigerum, P. concentricum, P. coprobium, P.
dipodomyicola, P. expansum, P. glandicola, P. gladioli, P.
griseofulvum, P. marinum, P. paneum, P. sclerotigenum,
P. vulpinum, Byssochlamys nivea, Paecilomyces saturatus
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Patulina
• È presente nella frutta e derivati
(succo di mela) oltre che nel pane e
in insaccati;
• Per dare effetti tossici deve esser
presente ad alti dosaggi
• È un carcinogenico responsabile del
sarcoma sottocutaneo;
• Il limite è di 0.4 mg/kg di peso
corporeo;
• Può esistere sia infase vapore che
in fase particolata quando rilasciata
in aria, nella fase vapore viene
degradata attraverso reazioni di
fotoossidazione via radicale
idrossile.
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OH
O
O
O
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23
Meccanismo
• Possiede una forte affinità per I
gruppi sulfidrilici;
• Gli addotti che forma con la cisteina
sono meno tossici del composto non
modificato nella tossicità acuta e in
quella cronica (attività teratogena e
mutagenica);
• La sua alta affinità per i gruppi SH la
rende un potente inibitore di molti
enzimi.
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Biosintesi
• Fedeshko R.W. 1992. Polyketide enzymes and genes in Penicillium urticae. PhD thesis, University of Calgary, Calgary,
Alberta, Canada
• Artigot M.P., Loiseau N., Laffitte J., Mas-Reguieg L., Tadrist S., Oswald I.P., Puel O. Molecular cloning and functional
characterization of two CYP619 cytochrome P450s involved in biosynthesis of patulin in Aspergillus clavatus. Microbiology.
2009;155:1738–1747
• Priest J.W., Light R.J. Applications of high-performance liquid chromatography to quantitation of metabolites and enzymes
of the patulin pathway from Penicillium patulum. J. Chromatogr. 1990;513:237–246
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Fusarium spp.
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Fusarium spp.
• Genere di funghi filamentosi largamente
distribuito nel suolo e in associazione con i
vegetali;
• Alcune specie producono micotossine in
colture cerealicole (grano e mais) che
possono avere effetti sulla salute umana e
animale ed entrare nella catena
alimentare;
• Le principali tossine prodotte sono le
fumonisine e i tricoteceni.
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Ciclo vitale di Fusarium
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Fumonosine
• Sono prodotte da
Fusarium che infetta il
mais, i pomodori, gli
asparagi e l’aglio;
• Sono molto idrosolubili
non avendo nessun
aromatico nella
struttura;
• Sono molto stabili al
calore a a molti
processi chimici;
• È riportato che
possono causare
tumori all’esofago.
HO
O
O
O
OH OH
CH3
H3C
CH3
HO
CH3 OH
NH2
O
O
HO
HO
O
O
O
O
Fumonosina B1
O
HO
O
OH OH
CH3
H3C
CH3
HO
CH3
NH2
O
O
HO
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O
HO
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O
O
Fumonosina B2
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26
Fumonosine
• I cavalli sono estremamente sensibili alle
Fumonosine.
• Concentrazioni molto basse delle tossine possono
causare leucoencefalomalacia (ELEM) o
liquefazione del cervello, conosciuta come
“malattia del cavallo pazzo”
– I sintomi sono: cecità, atassia, disordini motori seguiti
dalla morte.
• Nei suini attaccano il sistema cardiocircolatorio e
respiratorio (polmoni) causando edema
polmonare e lesioni epatiche e pancreatiche
• Negli umani le Fumonosine sono state correlate al
cancro.
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Tricoteceni e altre tossine
H
H3C
O
H
O
HO
OH
O
O
R1
R2
R4
CH3
RO
OH
O
CH3
Zearalenone
H3C
OH
O
O
O
N
OH
OH
O
O
O
H3C
H3C
Acido Fusarico
O
H3C
H
O
Satratossina H
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Tricoteceni
H
H3C
O
H
OH
O
R1
R2
H
H3C
O
H
OH
H
H3C
O
O
O
O
HO
HO
H
O
O
H
O
HO
HO
CH3
OH
CH3
O
Fusarenone X
H
H3C
CH3
O
O
CH3
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O
O
H
CH3
OH
O
CH3
CH3
OH
H
H3C
O
H3C
OH
Tossina HT-2
CH3
O
H
CH3
O
O
Deossivalenolo (DON)
Vomitotossina
OH
O
O
O
O
CH3
HO
H
H3C
O
H3C
HO
Nivalenolo
H3C
H
O
OH
CH3
R4
CH3
RO
O
O
H
OH
O
O
Diacetossisciprenolo
O
CH3
CH3
O
O
CH3
Tossina T-2
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Fusarium
• F. graminearum
– Nel grano: danni all’involucro del chicco
e ruggine della spiga;
• Tossina: Deossivalenolo (DON)
– Nel mais: marcescenza della pannocchia
• Tossine: DON, Zearalenone e Tossina T-2
• F. moniliforme
– Patogeno del mais, si trova anche nel
riso, sorgo noci e nel formaggio.
• Livello massimo 5 ppm mangimi
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DON e Tossina T-2
• Causano necrosi ed emorragia del tratto digestivo,
danni al midollo osseo con diminuita produzione di
cellule del sangue e cambi al sistema riproduttivo
• Nel pollame causano ridotta produzione di uova,
lesioni cornee (becco e piumaggio anormale).
• Il livello consentito di DON è 1 ppm.
H
H3C
O
O
H
OH
CH3
HO
HO
CH3
O
O
Deossivalenolo
Vomitotossina
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O
O
H
O
H3C
O
H
H3C
O
CH3
CH3
OH
OH
Tossina HT-2
R03 - Micotossine
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Zearalenone
• È un micoestrogeno che causa femminilizzazione negli
animali maschi;
• Nelle femmine produce aborti, danneggia l’ovulazione e lo
sviluppo fetale.
• Particolarmente sensibili sono i suini, meno sensibili il
pollame e i bovini.
O
HO
O
OH
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O
CH3
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Aleuchia tossica alimentare (ATA)
• Durante la II guerra mondiale nell’Unione
Sovietica il mais lasciato in deposto durante
l’inverno venne contaminato da Fusarium con
produzione di tossina T-2 che produsse una
severa micotossicosi;
• I sintomi erano bruciore all’apparato
digerente (bocca, lingua, esofago e stomaco);
• Cessazione del funzionamento del midollo
osseo con sviluppo di severa anemia;
• Emorragia al naso e allo stomaco.
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Alcaloidi dell’Ergot
Claviceps purpurea
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Ciclo vitale dell’Ergot
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Tossine da Claviceps
• Sono alcaloidi molto stabili, resistono al
calore, ai processi fermentativi e a lunghi
periodi di quiescenza;
• Gli organi bersaglio sono il sistema
circolatorio, il sistema nervoso e muscolare;
• Sintomi di intossicazione da alcaloidi
dell’ergot:
– Nell’uomo: sintomi parainfluenzali, convulsioni,
confusione mentale e allucinazioni (LSD), paralisi
degli arti, aborto, gangrena gassosa dovuta alla
vasocostrizione, attacchi epilettici;
– Nell’animale: gangrena secca, emorragie interne,
vomito diarrea e aborto (nel maiale).
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Tossine da Claviceps
• L’ergotismo è una tossicosi che ha provocato vittime fino
dal 857 D.C. con proporzioni epidemiche;
• Derivato dal consumo di pane di segale contenente spore di
Claviceps che attraverso le tossine provocavano, tra l’altro,
il “Fuoco di Sant’Antonio”, allucinazioni e altre patologie;
– Il “Fuoco di Sant’Antonio” è stato chiamato in questo modo
perché, scendendo a sud per il pellegrinaggio, le popolazioni
nordiche cambiavano dieta passando dal pane di segale a
quello di grano, graminacea meno sensibile alla
contaminazione da Claviceps, e i sintomi si alleviavano.
• Altre tossicosi da Ergot sono avvenute in Russia (1926),
Irlanda (1929), Francia (1953), India (1958) e Etiopia
(1973).
• È una contaminazione che colpisce la segale, l’avena e il
grano.
• La tossina principale è l’ergotamina.
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Ergotismo
• Si manifesta con disturbi circolatori agli arti
(vasocostrizione), fino alla cancrena delle estremità, nausea
e vomito, convulsioni, allucinazioni, mutismo, confusione,
attacchi di panico e angina pectoris;
• Il meccanismo patogenetico degli effetti sull’SNC, da parte
degli alcaloidi della segale cornuta, passa attraverso un
agonismo parziale e un antagonismo nei confronti dei
recettori della dopamina;
• Albert Hofmann nel 1944 sfruttò la struttura centrale di tali
alcaloidi (acido lisergico) con diverse sostanze e ne
sintetizzò la dietilammide (LSD), come stimolante
cardiorespiratorio: il 16 aprile 1943, dopo una
autosomministrazione, Hofmann descrisse il “viaggio” da
LSD;
• L’ergotamina è stata usata come farmaco per l’emicrania.
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Alcaloidi dell’Ergot
O
CH3
H
N
O
OH
N
N
O
N
N
H
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O
CH3
Ergotamina
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Biosintesi
O
OH
N
CH3
H
N
H
Acido Lisergico
•
•
•
•
La biosintesi dell’ergotamina richiede il triptofano e dimetidiallilfosfato che
sono substrati dell’enzima dimetilallil-triptofano sintasi (DMAT sintasi) che
catalizza la prenilazione del triptofano
Successive reazioni, che coinvolgono metiltransferasi e ossigenasi, portano
alla sintesi di ergolina e acido lisergico acid (LA)
LA è il substrato della lisergil-peptide sintetasi, una peptide sintetasi non
ribosomiale che lega LA a Ala, Pro, Phe.
Si ha poi la ciclizzazione (spontanea o catalizzata) che porta alla
formazione di ergotamina.
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Altri alcaloidi dell’Ergot
O
CH3
H3C
CH3
H3C
H
N
O
OH
H
N
N
N
CH3
H
H
N
H
Agroclavine
H3C
O
H
N
O
N
N
H
O
H3C
CH3
N
H α-Ergocriptina
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H
O
N
H
N
O
O
H
N
O
CH3
H
Ergocristina
CH3
OH
N
O
N
CH3
CH3
N
H
H3C
OH
H
O
N
Ergocornina
CH3
OH
N
O
CH3 H3C
O
N
O
H
N
H
O
CH3
H
N
H
H
CH3
O
N
N
CH3
R03 - Micotossine
OH
CH3
O
H
CH3
N
H β-Ergocriptina
H
N
N
H
CH3
Ergonovina
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34
Meccanismo d’azione
Ergotamina
• L’ergotamina condivide similarità
strutturali con diversi
neurotrasmettitori: serotonina,
dopamina, e epinefrina e si lega con
diversi recettori come agonista;
• L’effetto anti-emicrania deriva dalla
vasocostrizione dei vasi intracranici
extracerebrali attraverso i recettori 5HT1B e l’inibizione della
neurotrasmissione trigemina
attraverso l’interazione con i recettori
5-HT1D;
• L’erogotamina ha anche effetti sui
recettori della dopamina e della
norepinefrine che provocano gli
effetti collaterali per azione sui
recettori dopaminergici D2 e 5-HT1A.
O
CH 3 OH
O
H
N
N
N
O
O
N
CH3
N
H
H
N
HO
NH2
Serotonina
HO
NH2
HO
Dopamina
OH
HO
NH2
HO
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Norepinefrina
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Controllo di Claviceps purpurea
• Piante geneticamente modificate per
resistere alla muffa
• Uso di sostanze per prevenire la crescita
della muffa:
–
–
–
–
Ammoniaca
Acido proprionico
Vapori di cloro
Acido sorbico
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Penicillium spp.
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Tossine da Penicillium
• Genere con più di 150specie;
• 100 specie producono micotossine di cui la
più conosciuta è la penicillina con
proprietà antibatteriche
• Ci sono nove specifiche tossine che hanno
effetti sulla salute umana:
– citreoviridina, citrinina, acido ciclopiazonico,
ocratossina A, patulina, penitrema A, tossina
PR, Roquefortina C e acido secalonico;
• Due gruppi:
– Epatotossiche e nefrotossiche
– Neuro tossiche: causano visibili tremori
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36
Acido Ciclopiazonico (CPA)
• Isolato da mais e arachidi
in Georgia;
• Maggior responsabile degli
scarti caseari causati da
Penicillium;
• Epatotossico e
nefrotossico, causa
degenerazione grassa nel
fegato e nel rene
• Il pollame è
particolarmente sensibile;
• Può agire sinergicamente
con le aflatossine.
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H3 C
H
CH3
N
N
H
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H H
HO
O
CH3
O
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Appendice
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Azioni contro le micotossine
• Selezionare specie resistenti alla
contaminazione da parte delle muffe;
• Piante geneticamente modificate;
• Uso di additivi in grado di
sequestrare le tossine per prevenirne
l’assorbimento gastrointestinale
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Review degli effetti
Organo o Sistema
coinvolto
Vascolare
Digestivo
Tossina
Aflatossina
Aflatossina, Tossina T-2,
Vomitotossina (DON)
Respiratorio
Nervoso
Cutaneo
Tricoteceni
Urinario
Riproduttivo
Immune
Ocratossina A, Citrinina
Zearalenone, Tossina T-2
Tante
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Effetti sugli animali
da: http://www.mycotoxins.info/myco_info/anim.html
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Crediti e autorizzazioni all’utilizzo
• Questo materiale è stato assemblato da informazioni raccolte da testi di Biochimica:
– CHAMPE Pamela , HARVEY Richard , FERRIER Denise R. LE BASI DELLA BIOCHIMICA [ISBN 9788808-17030-9] – Zanichelli
– NELSON David L. , COX Michael M. I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER - Zanichelli
– GARRETT Reginald H., GRISHAM Charles M. BIOCHIMICA con aspetti molecolari della Biologia
cellulare - Zanichelli
– VOET Donald , VOET Judith G , PRATT Charlotte W FONDAMENTI DI BIOCHIMICA [ISBN 9788808-06879-8] - Zanichelli
• E dalla
–
–
–
–
consultazione di svariate risorse in rete, tra le quali:
Kegg: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes http://www.genome.ad.jp/kegg/
Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/
Protein Data Bank: http://www.rcsb.org/pdb/
http://www.mycotoxins.info
Questo ed altro materiale può essere reperito a partire da:
http://www.ambra.unibo.it/giorgio.sartor/ oppure da http://www. gsartor.org/
Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza
limitazione, purché venga riconosciuto l’autore usando questa frase:
Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor
Università di Bologna a Ravenna
Giorgio Sartor - [email protected]
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