La diagnostica di laboratorio Maria Rosaria Capobianchi, [email protected] Antonino Di Caro, [email protected] Concetta Castilletti, [email protected] WHO Collaborating Center for clinical care, diagnosis, response and training on Highly Infectious Diseases Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 La diagnostica di laboratorio Outline •Diagnostica di base •Diagnostica differenziale •Diagnostica specifica per Ebola Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 La diagnostica di laboratorio Outline •Diagnostica di base •Diagnostica differenziale •Diagnostica specifica per Ebola Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 FAQ 1. Possono essere eseguiti test diagnostici nei laboratori locali (urgenza, microbiologia, virologia, ecc.) prima di avere il risultato del test per Ebola? SI: se si adottano le adeguate misure di protezione il rischio per i laboratoristi è molto basso in caso di “bassa probabilità di malattia da virus ebola ”, e basso in caso di “elevata probabilità” Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 Prelievi Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 Prelievi •Valutazione del rischio Unlikely to have a VHF Low possibility of VHF High possibility of VHF Confirmed VHF • Avvisare il laboratorio locale del rischio assegnato, per consentire l’adozione di adeguate misure di biosicurezza •Inviare i campioni al laboratorio locale in contenitori chiusi e infrangibili Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 Indagini chimico cliniche Emocromo elettroliti transaminasi PCR coagulazione ecc. • Le indagini chimico-cliniche possono essere eseguite in loco, privilegiando i POCT (Point of Care Testing) o sistemi chiusi che consentano ad es. di forare la provetta e di centrifugarla, ove necessario, in modo automatico • Le provette contenenti i campioni vanno sempre aperte sotto cappa, proteggendo occhi e mucose da eventuali spruzzi • Se non si dispone di un laboratorio in grado di osservare queste misure, inviare i campioni allo Spallanzani Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 La diagnostica di laboratorio Outline •Diagnostica di base •Diagnostica differenziale •Diagnostica specifica per Ebola Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 Diagnostica differenziale • Malaria • Dengue • • • • • • • • • Febbre tifoide Shigellosi Colera Leptospirosi Peste Rickettsiosi Febbre ricorrente Borreliosi da pidocchi Meningiti e sepsi • Epatiti • Altre febbri emorragiche virali Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 FAQ 2. Il test di malaria può essere eseguito in loco? Si, se si adottano adeguate precauzioni Privilegiare il test rapido (POCT) • le positività vanno confermate con i test convenzionali In PS l’operatore è protetto dai dispositivi di protezione e dalle procedure In laboratorio il POCT va eseguito in BSL2, sotto cappa, proteggendo gli occhi e le mucose da eventuali spruzzi In caso di impossibilità di eseguire il test in loco, o in caso di elevata probabilità di MVE, la ricerca del parassita malarico può essere eseguita all’INMI Test rapido (risultato comunicato in tempo reale) Conferma con goccia spessa La diagnostica di laboratorio Outline •Diagnostica di base •Diagnostica differenziale •Diagnostica specifica per Ebola Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 Il virus ebola, come gli altri filovirus, è un virus di gruppo di rischio 4 •Alta contagiosità •Elevata mortalità •Assenza di terapia specifica •Assenza di vaccini La diagnostica per virus di gruppo di rischio 4 non è assimilabile ad analoghe procedure per microrganismi di gruppo inferiore, in quanto presenta requisiti strutturali, professionali ed organizzativi peculiari. Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 Difficoltà del laboratorio Necessità, specie in assenza di un sospetto clinico ben indirizzato, di una diagnosi differenziale ad ampio spettro Scarsità/assenza di kit commercialmente disponibili, validati Scarsità di materiali di riferimento per lo sviluppo e la validazione dei metodi diagnostici Necessità di partecipare ai network internazionali per poter accedere a: metodi, materiali/agenti, EQA, assistenza/conferme dei risultati Necessità di sviluppare, spesso in fretta, metodi nuovi e, in assenza di standard di riferimento, di sviluppare metodi di conferma Necessità di laboratori ad alto biocontenimento Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 Capacità diagnostiche per Ebola allo Spallanzani • Ricerca diretta del virus mediante metodi molecolari basata su un test iniziale di screening e vari test successivi di conferma • Caratterizzazione molecolare mediante sequenziamento ed analisi filogenetica • Ricerca diretta del virus mediante metodi colturali • Ricerca diretta del virus mediante microscopia elettronica • Ricerca degli anticorpi mediante Immunofluorescenza indiretta (IgM e IgG) • Ricerca di anticorpi mediante test di neutralizzazione • Diagnosi differenziale verso le principali eziologie alternative, nonché verso altre cause di sindromi emorragiche, incluse Lassa, Dengue, Alkhurma, febbre gialla, ecc. Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 Algoritmo di laboratorio Blood specimens sent to BSL3/4 VHF national reference laboratory Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 Cinetica dell’RNA (SUDV Uganda 2000) L’RNA virale è presente ad alti titoli fino a 10 g dopo inizio sintomi; la sensibilità dei test non è un problema rilevante Towner, J Virol 2004 Ricerca del virus mediante test di biologia molecolare (EBOV-RVNA) Rilevazione di una sequenza genica di EBOLA con RT-PCR Real-Time Conferma dei positivi con un metodo basato su un target diverso, ed esecuzione di una PCR classica Caratterizzazione mediante sequenziamento della regione amplificata con PCR classica La sequenza ottenuta viene confrontata con le sequenze disponibili nelle banche dati accessibili via Web Real-time PCR semi-quantitativa per il monitoraggio clinico Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 17 Tempi di risposta Dall’arrivo dei campioni al laboratorio di virologia dello Spallanzani, attivo h24 Test rapido malaria 1 ora Real Time PCR Filovirus (Ebola) 4-6 ore A meno di imprevisti…. Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 A proposito di imprevisti •Il campione è fuoriuscito dalla provetta primaria Necessità di bonificare la superficie esterna Difficoltà a recuperare il campione residuo disponibile •Le informazioni sull’etichetta sono incongruenti con quelle della scheda Necessità di contattare chi ha inviato il campione per escludere scambi di provette •Il campione contiene inibitori o sostanze che interferiscono con il saggio Necessità di ricominciare dall’estrazione •Altre circostanze impreviste (es. Scheda all’interno della confezione) Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 McElroy, JID 2014 A proposito di imprevisti •Il campione è fuoriuscito dalla provetta primaria Necessità di bonificare la superficie esterna Difficoltà a recuperare il campione residuo disponibile •Le informazioni sull’etichetta sono incongruenti con quelle della scheda Necessità di contattare chi ha inviato il campione per escludere scambi di provette •Il campione contiene inibitori o sostanze che interferiscono con il saggio Necessità di ricominciare dall’estrazione •Altre circostanze impreviste (es. Scheda all’interno della confezione) Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 McElroy, JID 2014 Esami accessori per la conferma Il sequenziamento Dudas, PloS Curr Outbreaks 2014 Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 Anticorpi La ricerca degli anticorpi in genere ha valore di documentazione retrospettiva •Le IgM compaiono dopo 3 giorni e sono fugaci (< 3 settimane) •Le IgG persistono a lungo e sembrano essere protettive Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 Cinetica della comparsa di IgG e IgM EBOV (Kikwit, DCR 1995) IgM Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 IgG Ksiazek, JID 1999 Rivelazione della risposta umorale e cellulare specifica • Risposta umorale: eseguita mediante metodi appositamente allestiti in laboratorio (immunofluorescenza indiretta e test di sieroneutralizzazione. • Per la risposta cellulare vengono eseguite colture di linfomonociti esposti agli agenti identificati, e la rilevazione delle sottopopolazioni linfocitarie attivate viene eseguita mediante rilevazione citofluorimetrica delle citochine intracitoplasmatiche. Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 24 Immunofluorescenza indiretta Negative control IgM positive sample IgG positive sample Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 25 Identificazione del virus • Isolamento virale in colture di tessuto (BSL4) e successiva caratterizzazione degli isolati con metodi immunologici o molecolari. • In casi particolari è previsto anche lo studio morfologico in Microscopia Elettronica, sia sull’isolato che sul campione biologico iniziale. Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 26 Coltivazione del virus: BSL4 0< 0 -15 BSL3 -5.1 -5,1 -33 -10 -33 -50 BSL3 -15 -35 BSL4 Tipologia di campioni Fase della malattia Tipologia di campioni Fase acuta • Sangue con EDTA per RT-PCR sintomatica • Sangue senza anticoagulanti per (Entro i primi 2-7 sierologia giorni dall’esordio) Eventuali campioni biologici aggiuntivi: • Urine • Tamponi mucosali • Altro Fase convalescente (risoluzione della sintomatologia, e comunque non prima di 15 giorni dall’inizio della sintomatologia) Tipologia di contenitore • Provetta sterile infrangibile con EDTA • Provetta sterile infrangibile • Contenitore infrangibile sterile • Tampone floccato in terreno di trasporto virale in flacone infrangibile • Da concordare con il Laboratorio • Sangue con EDTA per RT-PCR • Provetta sterile infrangibile con EDTA • Sangue senza anticoagulanti per • Provetta sterile infrangibile sierologia Eventuali campioni aggiuntivi: • Urine • Tamponi mucosali • Altro biologici • Contenitore infrangibile sterile • Tampone floccato in terreno di trasporto virale in flacone infrangibile • Da concordare con il Laboratorio Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 Prima di inviare campioni, è necessario contattare il laboratorio. Il Laboratorio di Virologia è attivo h24. Il virologo di turno può essere reperito ai seguenti numeri: •0655170666 •3204343793 Il virologo di turno effettuerà con il richiedente la valutazione congiunta preliminare, e provvederà ad attivare le procedure interne. Ulteriori recapiti utili: Accettazione: tel 0655170674; fax 0655170676 Segreteria: fax 065594555 Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 Preparazione dei campioni.1 • Il campione di scelta per la ricerca del virus è sangueEDTA (no eparina) • I campioni vanno mantenuti a +4°C prima dell’invio • Il trasporto al Laboratorio deve essere effettuato entro il più breve tempo possibile, preferibilmente entro le 24 ore e a temperatura refrigerata • Per tempi di consegna più prolungati, concordare con il Laboratorio le modalità di preparazione e conservazione Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 Preparazione dei campioni. 2 • I prelievi devono essere accompagnati dalla scheda dati, riportata in calce alle istruzioni, compilata in tutte le sue parti • Su ogni singolo campione deve essere apposta un’etichetta riportante a chiare lettere il nome del paziente, la tipologia del campione (sangue, urine, altro) e la data di prelievo. • Le informazioni riportate sulle provette devono essere coerenti con quelle inserite nella scheda dati. Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 Confezionamento e trasporto dei campioni • Il campione va confezionato seguendo il principio del triplo involucro • Il trasporto dei campioni al laboratorio va eseguito secondo le raccomandazioni per i campioni a rischio biologico (Circolare Ministeriale n°3/2003 “Raccomandazioni per la sicurezza del trasporto di materiali infettivi e di campioni diagnostici”) L’invio va concordato con il Laboratorio x Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 Consegna dei campioni L’indirizzo cui inviare in campioni è: Laboratorio di Virologia Padiglione Baglivi Istituto Nazionale per le Malattie Infettive “L. Spallanzani” Ingresso carrabile: via Giacomo Folchi, 6a 00149 Roma Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 Scheda di raccolta dati per la diagnosi di Laboratorio in caso di sospetta infezione da virus Ebola Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 Recapito del richiedente (possibilmente tel. cellulare)__________ Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014
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