le allergie un fenomeno in continua crescita

FRANCESCO ROLANDI
CLASSE 5^ B CHI
I.S.I.S “GIULIO NATTA” BERGAMO
ESAMI DI STATO 2014
MATERIE COINVOLTE: STORIA, BIOCHIMICA, IMPIANTI, ANALISI
INDICE
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Introduzione e ambito storico
Aspetti generali dell'allergia
Principali definizioni e distinzioni
Patologie allergiche
Acido glutammico, descrizione, funzione e produzione
Possibili cause dell'allergia
Le fasi di una reazione allergica
Principali metodi analitici di individuazione di allergeni
alimentari
1
pag. 3
pag. 8
pag. 9
pag. 11
pag. 12
pag. 16
pag. 19
pag. 22
1. INTRODUZIONE
Le allergie sono un fenomeno in continua crescita e ancora oggi non si è trovato il
modo di inibire permanentemente l'azione degli agenti esterni (polline, polvere,
specifici alimenti) considerati come una minaccia dal nostro organismo. Nella parte
iniziale del lavoro presentato ho legato l'instaurarsi dei sintomi allergici al
cambiamento dello stile di vita dell'uomo, come l'aumento dell'igiene dovuto alla
scoperta degli antibiotici (penicilline), avvenuto dalla seconda rivoluzione industriale
e proseguito per tutto il novecento. Successivamente ho descritto gli aspetti generali,
distinzioni e patologie dell'allergia, tra cui l'intolleranza agli additivi alimentari
(glutammato di sodio), e alle principali e più probabili cause di questo forte
incremento di casi allergici o di intolleranze. In seguito ho descritto le varie fasi di
una reazione allergica. Infine ho riportato i principali metodi di individuazione dei
peptidi specifici responsabili delle intolleranze alimentari. Ho scelto questo
argomento, oltre che per migliorare le conoscenze personali su un fenomeno che, tra
l’altro, mi riguarda direttamente, anche per sensibilizzare e far conoscere il fenomeno
delle allergie e delle intolleranze alimentari.
AMBITO STORICO
A partire dalla metà dell'ottocento e nel corso di tutto il novecento c'è stato un
mutamento radicale dello stile di vita dell'uomo. Questo ha contribuito in parte,
secondo alcuni esperti, al significativo aumento dei sintomi allergenici. I primi segni
di questo mutamento si possono notare nella “seconda rivoluzione industriale” una
rivoluzione che fu forse meno radicale della prima quanto alle conseguenze di lungo
periodo, ma che certo fecero sentire i suoi effetti su un'area più vasta ed ebbe una
diffusione più capillare, mutando le abitudini, i comportamenti, i modelli di consumo
di centinai di milioni di uomini.
La trasformazione scientifica della medicina si fondò su quattro cardini fondamentali:
la diffusione delle pratiche igieniste e la conseguente adozione di efficaci strategie di
prevenzione e contenimento delle malattie epidemiche; lo sviluppo della microscopia
ottica, che consenti' di identificare i microrganismi responsabili di alcune malattie
infettive; i progressi della chimica, in particolare della farmacologia che permise la
sintesi e l'estrazione di numerose sostanze in grado di modificare il corso naturale
della malattia. In questo periodo troviamo l'affermazione delle teorie igieniste, le
quali cercavano le cause delle malattie, e i mezzi per prevenirle, non tanto nei singoli
individui quanto nell'ambiente in cui essi vivevano e nei loro rapporti reciproci.
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Partendo da osservazioni empiriche e dati statistici e proponendo una serie di
interventi dimostratisi poi efficaci, gli igienisti riuscirono a diffondere alcune pratiche
preventive e a imporle, nonostante l'ostilità di gran parte della medicina
“accademica”, all'attenzione dei poteri pubblici.
Il successo della proposta igienista, che privilegiava il momento della prevenzione
rispetto a quello della cura della malattia, si
accompagnò a quel fondamentale evento scientifico
che fu l'identificazione, da parte di Louis Pasteur
(Fig1) e del tedesco Robert Koch, dei
microrganismi come agenti responsabili della peste,
del colera, e della tubercolosi. Una scoperta che,
sottolineando la necessaria presenza dei germi nella
genesi delle malattie infettive, dimostrava come le
condizioni ambientali non fossero di per sé
sufficienti a provocare l'insorgere del male e che fu
usata da molti medici per svalutare l'importanza dei
fattori genetici.
A mettere l'accento sui fattori individuali
Fig 1: Ritratto di Pasteur nel
suo laboratorio.
contribuirono anche gli studi microscopici del
patologo tedesco Rudolf Virchow, che riconducevano l'origine delle malattie alle
alterazioni delle cellule e dei tessuti.
Un ulteriore e decisiva spinta ai progressi della medicina curativa venne, sempre a
metà dell'800, dalle scoperte della chimica, che consentirono l'isolamento di una serie
di sostanze e la sintesi di numerosi farmaci agire sui processi fisiologici. Già nel
1846, la scoperta degli effetti dell'etere di-etilico sul sistema nervoso aveva aperto la
strada alla pratica dell'anestesia chirurgica. Nel 1857 fu sintetizzato il bromuro,
impiegato nel trattamento dell'epilessia e in genere come calmante. Nel 1860 fu la
volta dell'acido acetilsalicilico, che più tardi (1875) avrebbe costituito la base della
più diffusa fra le medicine dei nostri tempi, l'aspirina. Grazie a queste nuove scoperte
si sviluppò rapidamente una nuova industria farmaceutica.
La rivoluzione tecnologica dell'ultimo trentennio dell'800 non si limitò a cambiare
quella che oggi chiameremmo la “qualità” della vita degli abitanti dei paesi
economicamente più avanzati, ma ne allungò considerevolmente la durata media.
Inoltre i progressi della medicina e dell'igiene, assieme agli sviluppi dell'industria
alimentare, determinarono un ulteriore aumento della popolazione. I grandi fattori
che nei secoli precedenti avevano inciso negativamente sull'andamento demografico
(epidemie e carestie) sembravano ormai definitivamente eliminati, nonostante alcuni
episodi significativi ma marginali che ancora colpivano le aree più depresse, come il
colera a Napoli e a Palermo nel 1884-85.
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IL BOOM ECONOMICO (1950-70)
Dal 1950 il prodotto mondiale lordo, ottenuto dalla somma dei prodotti interni lordi
(PIL) dei singoli paesi, cominciò a crescere a ritmi sempre più sostenuti tanto che gli
economisti definirono lo sviluppo di questi paesi con l'espressione “boom
economico”. Il settore trainante di questa impressionante crescita su l'industria, in
particolare quella meccanica,siderurgica e chimica.
L'aumento della disponibilità della forza-lavoro fu dovuto anche a un fenomeno
parallelo alla diffusione mondiale dell'industrializzazione: a progressiva perdita di
centralità dell'agricoltura in sempre più numerose aree del pianeta. Il serbatoio di
manodopera, continuamente alimentato dall'espulsione di forza-lavoro dalle
campagne, poté anch'esso soddisfare la crescente domanda proveniente dal settore
industriale e sostenerne la crescita. Pertanto l'agricoltura, pur conoscendo innovazioni
che ne aumentarono sensibilmente la produttività, assunse un ruolo sempre più
marginale sia per il numero di addetti sul totale della forza-lavoro (tra il 5 e il 15%
nei paesi dell'Europa occidentale) sia in termini di percentuale sui prodotti interni
lordi. -Nei paesi comunisti lo scarto tra agricoltura e industria fu ancora più
divaricato, sia perché le pianificazioni vennero incentrate quasi esclusivamente
sull'industria pesante, sia perché le collettivizzazioni forzate dell'agricoltura ritardano
la ripresa produttiva nelle campagne.Infatti nell'Italia meridionale l'agricoltura non era più in grado di assorbire l'offerta di
manodopera proveniente dalle nuove generazioni, che dovettero prendere la via
dell'emigrazione. La “scomparsa dei contadini”, insieme alla trasformazione di un
paese prevalentemente agrario in un paese in prevalenza industriale, fu uno dei
fenomeni fondamentali della storia italiana degli anni cinquanta.
Nel XX secolo molte malattie infettive sono state sconfitte tramite lo sviluppo di
vaccini e antibiotici, e con il miglioramento delle condizioni di vita. Gli antibiotici
sono sostanze organiche prodotte da alcuni microrganismi che vanno a inibire
l'attività metabolica di altri
microrganismi, questo processo
viene detto “antagonismo
biologico”. Il primo antibiotico
fu la penicillina scoperta da
Alexander Fleming (Fig2) nel
1928 a Londra. Le penicilline
sono antibiotici beta-lattamici
(ovvero contengono un anello
beta-lattamico che deriva dalla
condensazione tra un gruppo
carbossilico e l'ammina sul Cβ)
prodotti da batteri e funghi, in
particolare isolati da prodotti del Fig 2: Alexander Fleming, medico e biologo britannico
metabolismo di alcune specie di
Penicillium, Penicillium Notatum e Penicillium chrysogenum, come
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metaboliti secondari (cioè prodotti dopo l’arresto della fase di crescita della
biomassa), attivi nei confronti dei batteri Gram positivi (stafilococchi streptococchi
meningococchi pneumococchi...), di cui
inibiscono la sintesi della parete cellulare
(inibizione dell’enzima transpeptidasi).
Essendo metaboliti secondari e non primari
le concentrazioni di penicillina, che si
ottengono durante la crescita batterica, sono
basse. Il batteriologo notò che in una piastra
che aveva lasciato vicino alla finestra, si
erano formate delle aree di inibizione,
(contaminate da una muffa), in cui i germi
non erano cresciuti. Pensò che ci potesse
essere un qualcosa che aveva bloccato la
Fig 3: penicillina G
crescita dei microrganismi, chiese quindi ad
un collega di analizzare quella piastra e questi vi trovò un fungo; nacque così la
penicillina G. Nella prima analisi però sbagliò e, invece del “Penicillium Notatum”
(che effettivamente aveva un potere inibente sulla crescita dei batteri) identificò un
altro Penicillium, non efficace. Fleming si accorse dell’errore e pubblicò il lavoro sul
Penicillium Notatum, che però rimase come una sorta di cura biologica tant’è che in
quel periodo l’estratto di Penicillium veniva usato solo per pulire le colture di batteri,
non come farmaco. Quando durante la Seconda Guerra Mondiale, fu necessario un
farmaco utile per combattere almeno una parte delle numerose infezioni, fu dato
l’incarico a Fleming, ad un chimico ebreo di origine tedesca Ernst Boris Chain (19061979), ed ad un medico australiano Howard Walter Florey (1898-1968), di far sì che
quella sostanza diventasse un farmaco. Vennero impiegati allo scopo ingenti capitali
e l’industria americana, spinta dalle necessità belliche, iniziò a produrre, su larga
scala, la Penicillina (1941). Divenne però un monopolio degli alleati, per cui per
averla, in Italia si doveva pagarla “oro” al mercato nero. La penicillina ha
rivoluzionato il mondo della medicina e ha creato una nuova era per la moderna
farmacoterapia.
Le PBP (Penicillin Binding Proteins o Proteine leganti la penicillina) sono enzimi
essenziali della parete batterica (per es., transpeptidasi, carbossipeptidasi), che
permettono la sintesi del peptidoglicano. Il peptidoglicano è una struttura che regola
la pressione esercitata dall'acqua dall'interno contro la parete, impedendo un
eccessivo rigonfiamento della cellula e una conseguente morte. Le penicilline si
legano a tali enzimi inibendo sia la sintesi del peptidoglicano (Fig 4) e quindi la
crescita batterica (effetto batteriostatico), sia la sintesi degli inibitori delle autolisine
(come l’acido lipoteicoico): quando non vengono più inibite le autolisine (come la
mureina idrolasi) si ottiene la distruzione della parete batterica (che normalmente
rimodellano), con conseguente morte del batterio (effetto battericida). Quindi le
penicilline, distruggendo la struttura del peptidoglicano, rompono la parete più
esterna della cellula batterica, la quale muore per motivi di lisi-osmotica (rottura della
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cellula tramite l'introduzione di acqua all'interno della membrana plasmatica).
Fig 4: Sintesi del peptidoglicano tramite l'utilizzo del PBP
Inibizione dell'enzima PBP tramite l'utilizzo di penicillina.
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MECCANISMO DI REZIONE PER LA PRODUZIONE DELLA
PENICILLINA G PER VIA SEMI-SINTETICA
In generale gli antibiotici possono essere prodotti in tre modi:
1) per via fermentativa, i principali step sono:
a) individuazione del ceppo batterico che ci occorre
b) fermentazione aerobica
c) estrazione-conservazione (purificazione)
2) per via sintetica ovvero tramite una sintesi chimica
3) per via semi-sintetica sfruttato, per esempio, per la produzione di penicillina:
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Con l'avvento dei primi antibiotici, vaccini e il continuo aumento dell'igiene si è
diminuito di molto il rischio di contrarre malattie e la possibilità di curarsi in caso
contrario. Oltre a questo indiscutibile vantaggio ha portato però alla forte riduzione
della capacità del nostro corpo a reagire o meglio contrastare il contatto con agenti
esterni (batter,microbi ecc..). Questa per il momento risulta l'ipotesi più plausibile
che spiegherebbe la comparsa delle allergie e la loro rapida diffusione.
2. ASPETTI GENERALI DELL'ALLERGIA
Con il termine "allergia" in medicina si intende la capacità del nostro organismo di
reagire in maniera anomala verso determinate sostanze, allergeni, con cui era stato
precedentemente sensibilizzato. Infatti non è il primo contatto che scatena la reazione
allergica ma il secondo in quanto l'organismo è già preparato a reagire rapidamente
contro l'agente estraneo considerato nocivo per il corpo. Le reazioni di ipersensibilità,
ovvero le manifestazioni allergiche, si distinguono in base al tempo di insorgenza in
seguito al contatto o all'introduzione dell'allergene in immediate e ritardate. Le
reazioni immediate, rappresentate con il termine atopia, riguardano individui che
hanno una particolare predisposizione, spesso genetica, che provoca la reazione
dell'organismo contro determinati allergeni, i quali risultano innocui se somministrati
ad altri soggetti. Questo fenomeno è dovuto al fatto che essi posseggono una grande
quantità di anticorpi, detti IgE, attaccati alla membrana delle cellule basofile e
mastcellule o mastociti (Fig 5) dove sono
presenti numerose sostanza, tra cui
istamine, prostaglandine, leucotrieni,
fattori chemiotattici, idrolasi e protesi, che
vengono liberate all'esterno in seguito al
legame dell'allergene con l'anticorpo IgE e
che sono direttamente responsabili dei
sintomi allergici. L'istamina e le altre
Fig 5: mastcellule o mastociti
sostanza rilasciate danneggiano i tessuti
provocando vasodilatazione, edema, aumento della permeabilità dei vasi sanguigni,
alterazioni della muscolatura liscia e del tessuto connettivo. Nelle reazioni allergiche
immediate i sintomi compaiono dopo qualche minuto per scomparire nella
maggioranza dei casi dopo 30-60 minuti, si manifestano in una determinata sede
corporea (apparato respiratorio, gastrointestinale, cute, congiuntiva) e possono avere
diversa gravità, con rischio per la vita del soggetto, come nel caso dello shock
anafilattico. In questo gruppo di reazioni sono compresi anche la rinite allergica, la
malattia da fieno, l'orticaria, la dermatite atopica, l'angioedema, l'allergia alle punture
di insetti, le allergie crociate pollini-alimenti e le forme allergiche dell'asma
bronchiale. Le reazioni allergiche ritardate non sono mediate da anticorpi ma da
linfociti T che, direttamente o attraverso sostanze solubili dette linfochine, attivano
secondariamente monociti e macrofagi, cellule dotate di enzimi litici che provocano il
danno tessutale. Le reazioni ritardate compaiono dopo 48-72 ore dall'esposizione
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all'allergene e sono esemplificate dalla reazione alla tubercolina, ovvero estratti di
bacilli tubercolari adoperati come antigeni per la diagnosi dell'infezione tubercolare
(TBC).
3. PRINCIPALI DEFINIZIONI E DISTINZIONI
Innanzitutto bisogna distinguere due tipi di reazioni avverse del nostro corpo:
reazioni tossiche e reazioni non tossiche.
Quelle tossiche sono legate alla sensibilità individuale che può scatenarsi al momento
dell'ingestione di una quantità sufficiente di cibo alterato. Mentre le reazione non
tossiche agli alimenti dipendono da una suscettibilità individuale, pertanto
quest'ultima varia da persona a persona, e vengono suddivise in reazioni
immunomediate (allergia alimentare) e reazioni non immunomediate (intolleranza
alimentare) (Fig 6).
L'allergia alimentare è una forma specifica di intolleranza ad alimenti o a componenti
che comportano l'attivazione del sistema immunitario. Questo alimento o il
particolare componente presente in esso, che innesca una serie di reazioni del sistema
immunitario tra cui la produzione di anticorpi, si definisce allergene. Gli anticorpi
provocano, come meccanismo di difesa, il rilascio di sostanza chimiche organiche, ad
esempio l'istamina che è uno dei mediatori chimici dell' infiammazione, in grado di
generare vari sintomi quali prurito, naso che cola, tosse o affanno. Le allergie
alimentari sono molto spesso ereditarie, in genere vengono diagnosticate nei prima
anni di vita e può comprendere reazioni IgE mediate e non IgE mediate.
A differenza delle allergie le intolleranze alimentari non coinvolgono il sistema
immunitario ma il metabolismo e possono essere di natura enzimatica, di tipo
farmacologico o rimanere sconosciuti (idiosincrasici). Un esempio di intolleranza
alimentare è l'intolleranza al lattosio dove le persone che presentano questo sintomo
hanno una carenza di lattasi ovvero l'enzima digestivo che scompone lo zucchero del
latte. Negli ultimi anni si è assistito a un notevole aumento di fenomeni allergici e
secondo molti studiosi questo incremento sia dovuto alla crescita di fenomeni di
intolleranza alimentare. Questi due fenomeni hanno comportamenti diversi infatti i
fenomeni di intolleranza alimentare sono dovuti a una condizione di accumulo della
sostanza alimentare non tossica continua, come se si trattasse di un avvelenamento
complessivo. Mentre nel caso delle allergie alimentari la risposta patologica si
evidenzia nel giro di minuti dalla ingestione della sostanza responsabile. è molto
importante conoscere l'esistenza di questo fenomeno in quanto gli effetti provocati da
un'intolleranza alimentare sull'organismo sono effetti di tipo subclinico, ovvero non si
manifestano immediatamente ma provocano giorno dopo giorno casi infiammatori
che possono portare a malattie più gravi. Infatti molto spesso le malattie
infiammatorie e catarrali ripetute vengono attribuite a banali influenze o sporadiche
infiammazioni invece, nella maggior parte dei casi, sono causate dall'esistenza di una
intolleranza alimentare. Dobbiamo pensare pero che il cibo non è responsabile della
malattia, per esempio della laringite,ma determina un'infiammazione costante
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rendendo la laringe un facile bersaglio per qualsiasi batterio o virus presente. Pertanto
è di estrema importanza imparare a nutrirsi correttamente in base alle esigenze del
nostro corpo seguendo quei piccoli segnali, senso di affaticamento,gonfiore,problemi
di digestione , che ci inducono a eliminare quel cibo o una determinata sostanza o
eventuali additivi e conservanti alimentari responsabili di una reazione immunologica
dell'organismo.
Fig 6: Classificazione delle reazioni avverse agli alimenti
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4. PATOLOGIE ALERGICHE
Le principali malattie in cui le allergie entrano in gioco sono la dermatite da contatto,
il rigetto ai trapianti, alcune forme di ipersensibilità a farmaci e ad agenti infettivi,
come virus, funghi, parassiti.
Un terzo tipo di reazioni allergiche prende origine dall'azione lesiva provocata dai
complessi antigene-anticorpo, immunocomplessi che si verificano quando l'anticorpo
riconosce l'antigene legandosi con quest'ultimo, che si depositano all'interno dei vasi
e nei tessuti e che, tramite l'attivazione del sistema del complemento, stimolano una
reazione infiammatoria locale responsabile del danno. Esempi di situazioni
patologiche in cui questo tipo di reazioni ha un ruolo fondamentale sono le vasculiti
allergiche, la malattia da siero, alcune glomerulonefriti e reazioni verso farmaci. In
questo tipo di ipersensibilità gli allergeni, oltre che esterni (siero, farmaci) possono
essere anche interni, cioè strutture appartenenti all'organismo ospite, dando così
origine a un processo autoimmunitario, come succede in malattie quali il lupus
eritematoso sistemico e l'artrite reumatoide.
Grande importanza hanno assunto anche le allergie alimentari, cioè quelle reazioni
abnormi provocate dall'ingestione di alimenti che in Italia colpiscono circa il 2%
della popolazione. I sintomi clinici sono comuni agli altri tipi di allergie; insorgono
pochi minuti o qualche ora dopo l'assunzione dell'alimento e si manifestano con
sintomi di diversa gravità, che possono consistere in shock anafilattico, asma, rinite,
orticaria, eczema, gastroenteropatie. I cibi maggiormente incriminati sono latte, uova,
pesci, soprattutto i crostacei, arachidi e noccioline americane, fragole e frutta secca.
Da ricordare il latte vaccino, che è l'allergene più importante della prima infanzia, e le
allergie dei lattanti ad alcuni alimenti assunti dalla madre e veicolati dal latte
materno. L'intolleranza agli additivi è confermata solo in 2 persone su 10 mila: è più
frequente nel bambino che nell'adulto e può aggravare la dermatite atopica, l'orticaria
cronica, la rinite e l'asma. Gli additivi maggiormente responsabili sono la tartrazina
(un colorante giallo), il sodio glutammato (salsa di soia e dadi per brodo), i nitrati e i
nitriti (sostanze impiegate nella conservazione delle carni cotte), agenti solforati
(conservanti presenti nel vino, nei succhi di frutta, nelle salsicce, nella frutta e nella
verdura), l'acido benzoico e i benzioati (conservanti antibatterici e anitimicotici per
molti alimenti), il carminio (un colorante rosso), la vanillina, gli antiossidanti e alcuni
enzimi, tra cui la papaina. Infine uno stato allergico può comparire in seguito
all'esposizione ad agenti fisici, come il caldo, il freddo e la luce solare e si manifesta
con prurito, orticaria ed eruzioni cutanee, insorgenti a volte anche dopo il bagno o il
nuoto.
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5. L'ACIDO GLUTAMMICO
In chimica gli amminoacidi sono molecole organiche che nella loro struttura recano
sia il gruppo funzionale amminico (-NH2) sia quello carbossilico (-COOH). In
biochimica il termine amminoacidi si riferisce più spesso agli L-α-amminoacidi, cioè
quelli il cui gruppo amminico e il cui gruppo carbossilico sono legati allo stesso
atomo di carbonio, chiamato appunto carbonio α , in configurazione L (con l'unica
eccezione della glicina, achirale, in cui -R = -H). Le proteine sono macromolecole
costituite da catene di amminoacidi uniti tra loro attraverso un legame chimico, il
legame peptidico. In natura, esistono venti amminoacidi, e a seconda del numero, del
tipo e dell'ordine di sequenza con cui si legano i diversi amminoacidi, è possibile
ottenere un infinito numero di proteine. Il nostro
organismo riesce a sintetizzare alcuni degli
amminoacidi necessari per costituire le proteine
mentre quelli che non riesce a sintetizzarli devono
essere introdotti con gli alimenti.
Descrizione e funzione dell'acido glutammico
L'acido glutammico è un amminoacido polare, la sua
molecola è chirale (Fig 7). L' enantiomero L è uno dei
Fig 7: Struttura dell'acido
venti amminoacidi ordinari, il suo gruppo laterale reca
glutammico
un carbossile, che gli conferisce il comportamento
acido da cui prende il nome. Negli esseri umani non è un amminoacido essenziale,
ovvero il nostro organismo è in grado di sintetizzarlo, è un composto essenziale di
importanza critica per il funzionamento della cellula. Tuttavia il suo fabbisogno
aumenta in caso di stress psicofisico e malattie, che il corpo non riesce a coprire. L'
acido glutammico è un amminoacido molto importante in quanto agisce come
molecola nervosa, neurotrasmettitore, in grado di conferire stimoli eccitatori. Inoltre è
anche il precursore del principale neurotrasmettitore inibitorio (GABA). L'acido
glutammico non attraversa la barriera ematoencefalica, per giungere al cervello, dove
viene utilizzato per la sintesi delle proteine, viene convertito in glutammina. Si
ipotizza che l'acido glutammico sia coinvolto nel cervello in funzioni cognitive quali
l'apprendimento e la memoria, benché in quantità eccessive possa causare danni
neuronali da eccitossicità tipici di sclerosi progressive. Il sale dell'acido glutammico è
ampiamente usato nell'industria alimentare come esaltatore di sapidità.
Produzione acido glutammico
Per la produzione, il batterio impiegato è il Corynebacterium glutammicum. L'acido
glutammico viene sintetizzato da microrganismi a partire dall'acido alfachetoglutarico, secondo una reazione catalizzata dall'enzima glutammato
deidrogenasi. La sintesi degli amminoacidi richiede una certa quantità di azoto che
deve essere fornito sotto forma di ammoniaca gassosa, urea, o vari sali d'ammonio,
questo deve essere fatto progressivamente durante la fermentazione per evitare un
effetto inibente ad alte concentrazioni.
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L'acido glutammico una volta sintetizzato deve essere espulso dalla cellula, per
questo, condizioni ottimali si ottengono mantenendo basse le concertazioni di biotina.
Senza l'aggiunta di agenti antibiotina (antibiotici, acido oleico, acidi grassi) la
quantità di acido glutammico ottenuta è piccola perché il suo accumulo nella cellula
viene bloccato da un meccanismo di retro-inibizione, per ovviare a questo si
interviene sulla struttura di membrana della cellula in modo da favorire
un'abbondante continua uscita di acido glutammico. Durante il processo di
fermentazione si utilizzano reattori discontinui in cui viene posto l'inoculo
precedentemente coltivato e il substrato sterilizzato; la fermentazione dura circa 1 o 2
giorni alla temperatura di 30 °C a pH 8. Il brodo di fermentazione viene sottoposto a
areazione moderata per evitare produzione di acido lattico o la formazione di un
eccesso di acido alfa-chetoglutarico; alla fine della fermentazione il brodo presenta
una concentrazione di acido glutammico di circa il 50-60 g/litro, con resa del 65%in
peso rispetto al glucosio di partenza. Per recuperare l'acido si sottopone il brodo a
centrifugazione per separare le cellule e gli altri materiali in sospensione quindi
l'acido viene precipitato regolando il pH ad un punto isoelettrico e successivamente
separato per centrifugazione ed infine essiccato. La quantità d’acido glutammico che
questi batteri riescono a produrre, non è molto elevata, perché esso è accumulato
all'interno della cellula ed esercita un’attività di tipo feed-back che arresta il processo
produttivo. Il problema è stato risolto essenzialmente in una serie di modificazioni del
microrganismo e delle condizioni colturali tali da favorire al massimo l'escrezione
dell'acido fuori della cellula, mantenendo in tal modo la concentrazione di esso
all'interno della cellula ad un livello sufficientemente basso da non influire sugli
enzimi regolatori connessi con la sua sintesi. La secrezione dell'acido glutammico
dipende dalla permeabilità cellulare; un incremento della permeabilità può essere
ottenuto in diversi modi:
1) per deficienza di biotina nel terreno:
tutti i ceppi produttori di acido glutammico richiedono biotina, coenzima essenziale
nella sintesi degli acidi grassi. A concentrazioni maggiori di 5 µg/ml si verifica un
aumento di acido oleico con conseguente formazione di una membrana cellulare ad
alto contenuto di fosfolipidi. Questo tipo di membrana impedisce alla cellula di
rilasciare acido glutammico e a elevate quantità inibisce, con un meccanismo
feedback , l'ulteriore biosintesi. Mentre utilizzando un terreno povero di biotina causa
un'alterazione nella biosintesi della membrana, dovuta ad una riduzione della sintesi
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dei fosfolipidi con un conseguente errato rapporto fra acidi grassi e insaturi, così da
consentire la fuoriuscita di acido glutammico;
2) per deficienza di acido oleico in auxotrofi che richiedono acido oleico;
3) per deficienza di glicerolo in auxotrofi che richiedono glicerolo;
4) per aggiunta di acidi grassi saturi:
é stato ipotizzato che un enzima acetil-CoA carbossilasi contenente biotina,
catalizzatore nel primo passaggio nella sintesi di malonil-CoA ad acetil-CoA, sia
coinvolto nella biosintesi di acidi grassi. Gli acidi grassi a 16 o 18 atomi di carbonio o
loro esteri di poli-alcoli reprimono proprio questo enzima. Quindi utilizzando
auxotrofi dell'acido oleico o del glicerolo o acidi grassi saturi si aumenta la quantità
di acido glutammico in quanto essi sintetizzano membrane cellulari a basso contenuto
di fosfolipidi, anche in presenza di biotina;
5) per aggiunta di penicillina:
la penicillina promuove la fuoriuscita dell'acido glutammico, anche in presenza di
biotina, in quanto l'inibizione della parete cellulare danneggia la membrana
citoplasmatica che, non essendo più protetta, aumenta la sua permeabilità.
Schema del processo di produzione dell'acido glutammico
Il processo fermentativo può essere così schematizzato: si prepara l'inoculo
coltivando il microrganismo a 30 °C per 18 ore in agitatore a 220 rpm in un substrato
costituito da: 2% glucosio, 1% peptone, 0,5% estratto di lievito,0,25% cloruro di
sodio (NaCl), a pH 7.0/7.2. Con questa coltura si inocula, al 10% il terreno
fermentativo di produzione composto da: 10% glucosio, 0,2% solfato di ammonio
((NH4)2SO4), 0,1% idrogenofosfato di potassio (KHSO4), 0,01% diidrogenofosfato di
potassio (KH2SO4), 0,025% solfato di magnesio (MgSO4), 0,001% solfato
ferroeptaidratato solfato di manganese monoidratato. S'incuba a 30 °C aggiungendo
all'inizio della fermentazione 0,65/l di acido oleico e automaticamente, durante tutto
il processo, ammoniaca a una soluzione al 10% d'urea per mantenere il pH a valori di
7.5. Quando la concentrazione di glucosio crolla a valori di 0,5-2% si inizia l'aggiunta
dello zucchero fino a completa fermentazione. L'areazione è controllata in modo tale
che il contenuto in CO2 nel gas esausto non superi mai il 4,5%. Al termine della
fermentazione, si separa la biomassa dal brodo colturale mediante centrifugazione o
filtrazione. Il brodo chiarificato viene poi acidificato con HCl a un valore di pH 3.2,
pari al punto isoelettrico dell'amminoacido, ottenendo così la cristallizzazione. I
cristalli sono recuperati per filtrazione, lavati e solubilizzati in una soluzione sodica.
Tale soluzione viene poi decolorata su carbone attivo, e concentrata per la successiva
cristallizzazione. (Fig 8)
14
SCELTE IMPIANTISTICHE
Viene utilizzata ammoniaca gassosa perché riesce ad agire uniformemente sul brodo.
Si utilizzano acidi grassi poiché sono più economici rispetto all'acido oleico o agli
antibiotici. Come fonte azotata si usano sali di ammonio,ammoniaca gassosa o in
soluzione, urea, poiché i batteri produttori presentano attività ureasica. Fra i fattori di
crescita, la biotina è senza dubbio il più importante; la sua concentrazione ottimale
dipende dal ceppo, dal tipo e dalla concentrazione della fonte carbonata: è di 5mg/l in
terreni con glucosio a circa il 10%, mentre è considerevolmente più bassa se si lavora
con concentrazioni di zucchero inferiori. L'aerazione è un parametro estremamente
importante a livello produttivo, in quanto la concentrazione di ossigeno disciolto non
deve essere né troppo alta né troppo bassa. In condizioni di insufficienza di ossigeno,
infatti si producono acido lattico e succinico, mentre in eccesso di ossigeno e
deficienza di ammonio si ha un inibizione dello sviluppo e produzione di alfachetoglutarato. Il PH ottimale per lo sviluppo è di 7-8 e la temperatura di 30-35°C. La
prima e la terza pompa è a membrana perché quella a centrifuga o a ingranaggio
potrebbe rompersi per la presenza di parti solide nel brodo. Le parti scartate dalla
centrifugazione vengono mandate a smaltimento presso ditte specializzate.
Fig 8: Impianto di produzione dell'acido glutammico
15
6. POSSIBILI CAUSE DELL'ALLERGIA
Considerando le molteplici cause che le scatenano, negli ultimi anni le allergie sono
diventate sempre più frequenti e complesse da diagnosticare e da trattare. Dagli anni
Settanta del sec. XX le allergie sono aumentate del 30-50%. In Italia circa il 15%
della popolazione presenta manifestazioni allergiche di diversa entità. In generale si
può ritenere che nelle popolazioni europee vi sia un aumento annuo di frequenza
delle allergopatie di almeno il 10-15%. Un incremento, questo, che si rileva per tutti
gli allergeni, siano essi da inalazione (pollini, acari, derivati animali, miceti, ecc.), da
ingestione (alimenti e farmaci), da inalazione o da puntura (farmaci, veleni di insetti)
o da contatto (sostanze chimiche varie, metalli).
La comparsa della dermatite atopica e delle manifestazioni cliniche legate all'allergia
alimentare privilegia soprattutto l'infanzia, per poi decrescere gradualmente nell'età
matura. L'asma bronchiale causata da allergeni ambientali, quali i Dermatofagoidi
(acari della polvere), inizia di frequente verso il 3°-4° anno di vita, la rinite allergica
compare in genere dopo il 5° anno, mentre la pollinosi esordisce più tardivamente
con un picco verso i 20 anni di età per l Parietaria e verso i 20/30 anni per i pollini di
Graminacee e di altre piante erbacee e arboree. Le allergopatie si manifestano inoltre
di preferenza nel sesso maschile fino al 15° anno di età e nel sesso femminile in età
successiva.
Il notevole incremento delle malattie allergiche, documentato da numerose ricerche
epidemiologiche, sembra essere causato dall'aumento del numero di sostanze
allergeniche circolanti, molte delle quali non esistenti in natura (per esempio,
sostanze chimiche, additivi alimentari, fibre sintetiche); dalla maggiore frequenza
delle esposizioni ai vari allergeni (si consideri per esempio l'enorme consumo di
farmaci); da un incremento dei fattori predisponenti, tra cui gli inquinanti atmosferici.
Esso sembra inoltre andare di pari passo con l'industrializzazione e la civilizzazione.
Alcuni studi hanno infatti messo in evidenza che le nazioni in via di sviluppo hanno
una bassa frequenza di allergopatie.
L'inquinamento dell'aria è spesso citato come causa principale dell'aumento dei
sintomi allergici. Alcune indagini hanno invece smentito inaspettatamente la
responsabilità dell'inquinamento atmosferico nell'aumento delle allergie.
Ha suscitato infatti un certo scalpore la ricerca che ha paragonato i dati di alcune città
dell'ex Germania dell'Est, ad alto inquinamento, con quelli di città della Germania
Ovest, a basso inquinamento. I risultati hanno dimostrato che in queste ultime la
prevalenza delle allergie era maggiore rispetto alle prime. All'elevata concentrazione
delle particelle di scarico dei motori diesel si attribuisce tuttavia la capacità di
interferire su diversi fenomeni immunologici. Pertanto l'aria inquinata non sembra
essere la principale causa dei sintomi allergici, ma piuttosto un fattore che li aggrava.
Questo perché l'aria inquinata danneggia le vie aeree rendendo più facile l'ingresso
degli allergeni sulla mucosa, talvolta aumentando l'intensità delle reazioni allergiche
e dei sintomi allergici. Per esempio il polline che fluttua nell'aria inquinata aderisce
alle particelle di fumo e polvere, provocando un cambiamento della loro struttura ed
aumentando la loro capacità di provocare reazioni allergiche.
16
Come l'inquinamento anche il fumo favorisce lo sviluppo di reazioni allergiche,
perché rende più sensibili le vie aeree agli allergeni. Indiscutibile è inoltre il
collegamento tra l'esposizione al fumo di sigaretta nei primi mesi di vita e
l'insorgenza di allergie, tra cui l'asma bronchiale. Chi appartiene a un'elevata classe
sociale ha inoltre una maggiore probabilità di sviluppare allergie, come pure chi si
espone a un'alta carica di allergene. La comparsa dell'allergia all'ambrosia in
Lombardia, un fenomeno del tutto inconsistente fino a 15 anni fa, è infatti legata
all'impressionante diffusione di questa pianta negli ultimi anni nella zona a Nord est
di Milano.
Un'altra interessante ipotesi, la cosiddetta “teoria dell'igiene”, avvalorata da diversi
ricercatori per giustificare l'incremento delle allergopatie, considera che le migliori
condizioni igieniche favorirebbero un maggior sviluppo delle allergie. La
diminuzione negli ultimi anni delle malattie infettive, che per millenni hanno
impegnato l'organismo nella produzione di anticorpi specifici per debellarle, avrebbe
causato una maggiore disponibilità del sistema immunitario alla sensibilizzazione agli
allergeni per deviazione dalla normale risposta antinfettiva a quella antiallergica. I
dati più aggiornati hanno inoltre messo in luce l'aumento del fenomeno nei bambini
che vivono nei Paesi industrializzati, dove dagli anni Ottanta i casi di asma da allergie
sono raddoppiati.
Un altro fattore implicato nella diffusione delle allergie è quello ereditario. Per
esempio se uno dei genitori soffre di allergie, il rischio di diventare allergici sarà
maggiore, tra il 20-40%, rispetto a quando nessuno dei due genitori è allergico.
Mentre se entrambi i genitori sono allergici, il rischio aumenta ulteriormente, tra il
40-75%. tuttavia la predisposizione ereditaria da solo non basta per sviluppare,
effettivamente, sintomi allergici.
La diminuzione dell'allattamento materno, l'inquinamento ambientale, il notevole
carico allergenico domestico (acari e animali domestici), le infezioni e la dieta in
gravidanza sono indicate come le cause principali dell'aumento del 30-50% delle
allergie durante l'infanzia.
Secondo alcuni studi, effettuati in Europa e negli Stati Uniti, l'ordine cronologico di
nascita dei bambini in una famiglia influenza la prevalenza delle malattie allergiche, e
soprattutto dell'asma. Gli ultimi nati in una famiglia con più figli hanno pertanto una
minore probabilità di ammalarsi di rinite allergica, dermatite atopica e asma.
Anche la genetica ha un ruolo riconosciuto. Un bambino che ha entrambi i genitori
allergici ha infatti un rischio del 60% di esserlo a sua volta. Rischio che si riduce al
40%, se ha un solo genitore allergico. Diverse indagini hanno inoltre indicato che il
mese di nascita del bambino può essere importante per la successiva
sensibilizzazione ai pollini, un'ipotesi che trova la sua ragion d'essere nella situazione
immunologica “in divenire” del bambino durante i primi 30 giorni di vita. Da altre
indagini effettuate in diversi Paesi europei è emerso che in media il 25% dei bambini
in età scolare abbia una o più patologie allergiche.
In Italia soffrono di allergie circa 3 milioni di bambini e ragazzi, di età compresa tra 0
e 18 anni.
17
Tra le allergie emergenti è da segnalare quella alle blattidi, gli scarafaggi neri o rossi,
che in Italia colpisce oltre il 6% dei bambini. Negli ultimi anni, parallelamente
all'incremento delle vendite di prodotti cosmetici, si è assistito a un progressivo
aumento dell'incidenza delle dermatiti da contatto da cosmetici, che attualmente
rappresentano il 15% delle dermatiti da contatto in generale e ben il 28% delle
dermatiti da contatto extraprofessionali, posizionandosi così al secondo posto dopo le
allergie dovute agli accessori metallici. Si stima pertanto che interessino circa il 2%
della popolazione prevalentemente femminile, compresa tra i 20 e i 40 anni.
Tra i fattori scatenanti vengono indicati la composizione dei cosmetici, la
concentrazione degli ingredienti, la sede di applicazione, il tempo di contatto, la
frequenza delle applicazioni e gli effetti cumulativi di conservanti, profumi,
eccipienti ed emulsionanti.
Esistono anche allergie ai veleni di Imenotteri: l'ipersensibilità a particolari secrezioni
velenose di questi insetti (api, calabroni, vespe) può provocare una modesta reazione
locale o un ponfo, di solito pruriginoso e spesso dolente. Di rado si può verificare uno
shock anafilattico.
Infine secondo alcuni studiosi l'incremento delle allergie sia dovuto all'utilizzo di
OGM, organismi geneticamente modificati. Uno dei potenziali rischi legato alla
modificazione genetica delle piante ad uso alimentare è che l'inserto genico porti alla
produzione di proteine non normalmente presenti nella pianta stessa e che potrebbero
causare reazioni allergiche in soggetti predisposti.
La possibilità è stata riscontrata nel corso dello sviluppo di una varietà di soia,
geneticamente modificata tramite l'inserimento di un gene della noce del Brasile per
migliorare il tenore in aminoacidi solforati (metionina, cisteina). Nel corso dei test di
laboratorio ci si è accorti che la proteina codificata dal gene inserito (Albumina 2S)
era il principale allergene alla noce. Alla luce di ciò la ricerca su questa varietà è stata
abbandonata.
18
7. LE FASI DI UNA REAZIONE ALLERGICA
ESPOSIZIONE PRIMARIA
I linfociti-T riconoscono l'allergene (il corpo estraneo) e rilasciano delle specifiche
molecole che inducono i linfociti-B a produrre milioni di anticorpi, denominati
immunoglobuline E (IgE).
Ogni volta che il corpo umano entra in contatto con un differente allergene viene
prodotto un tipo differente di IgE, specifico per quell'allergene. Le IgE, una volta
rilasciate, si attaccano ai mastociti, i quali possono poi restare all'interno del corpo
per anni, pronti a reagire in caso di contatto con lo stesso allergene.
1) La prima volta che viene inalato un allergene, come per esempio un polline di
graminacea, nell'organismo non compare alcun sintomo.
2) Il sistema immunitario rintraccia il polline e lo identifica come un pericoloso
invasore.
3) Il sistema immunitario forma anticorpi IgE specifici per il polline nel tentativo di
sconfiggere l'invasore.
19
4) Gli anticorpi IgE aderiscono alla superficie di alcune cellule nella mucosa nasale.
Queste cellule sono i mastociti e i basofili.
5) I mastociti e i basofili risiedono insieme agli anticorpi IgE nella mucosa nasale. Gli
anticorpi IgE sono pronti a reagire in caso di ulteriore contatto con il polline.
ESPOSIZIONE SUCCESSIVA
In caso di ulteriore contatto con l'allergene, questo interagisce direttamente con le IgE
attaccate ai mastociti, stimolando i mastociti a rilasciare rapidamente molecole del
tipo dell'istamina.
Il rilascio di queste molecole può causare:
la contrazione dei muscoli lisci delle vie respiratorie;
dilatazione dei piccoli vasi sanguigni, con conseguente aumento di temperatura della
cute e sudorazione abbondante;
aumento della secrezione di muco nelle cavità nasali e nelle vie respiratorie;
prurito.
20
1) Successivo contatto con l'allergene, per esempio un polline di graminacea.
2) Gli anticorpi IgE presenti nel naso riconoscono il polline.
3) Gli anticorpi IgE adesi alla superficie dei mastociti e dei basofili catturano il
polline e, così facendo, innescano una serie di reazioni che porta al rilascio di
numerose molecole specifiche, inclusa l'istamina. L'istamina entra poi in contatto con
le terminazioni nervose e causa starnuti e prurito. Entra inoltre in contatto con le
ghiandole che producono muco, causando arrossamento e rigonfiamento delle
mucose del naso e, di conseguenza, una congestione nasale.
21
4) Altre molecole fanno poi partire altre reazioni a catena che fanno proseguire la
reazione allergica. Si tratta di una sorta di "effetto domino", che è all'origine della
persistenza dei sintomi dell'allergia anche quando l'allergene non è più presente ormai
da molto tempo.
8. PRINCIPALI METODI DI INDIVIDUAZIONE DEGLI
ALLERGENI ALIMENTARI
Gli allergeni alimentari sono proteine capaci di indurre, dopo ingestione, una risposta
anomala del sistema immunitario in individui sensibilizzati. Le proteine allergeniche
costituiscono una classe di composti molto eterogenea, che può variare per peso
molecolare (da poche migliaia a decine di migliaia di dalton), punto isoelettrico,
quantità e tipo di modifiche post-traduzionali, e la cui varietà è incrementata dalla
presenza, per numerose proteine allergeniche, di diverse isoforme. Inoltre, i
trattamenti tecnologici degli alimenti possono modificare la struttura proteica,
incrementando la diversità molecolare ed influendo sul loro potenziale allergenico
(van Henghel 2007).
Tra i metodi sviluppati per l’identificazione di proteine allergeniche negli alimenti,
negli ultimi anni la spettrometria di massa (SM) ha svolto un ruolo sempre più
centrale, grazie alla sua specificità e sensibilità. Infatti essa ha la capacità di
identificare le molecole target in base ad una proprietà molecolare intrinseca, la
massa, mantenendo allo stesso tempo una buona sensibilità nella rivelazione, requisiti
indispensabili per identificare in maniera univoca molecole presenti in tracce in
matrici complesse. Per un approfondimento sulla SM, che in questi ultimi anni ha
avuto una grande evoluzione, si rimanda a testi qualificati. La MS viene spesso
accoppiata alla cromatografia liquida, in modo da abbinare il suo elevato potere
identificativo con l’alto potere separativo delle tecniche cromatografiche.
Le tecniche di analisi basate sulla SM delle proteine allergeniche negli alimenti
riportate in letteratura seguono essenzialmente due approcci (Poms, Klein, Anklam,
2004):
22
1) separazione cromatografica, rivelazione e quantificazione delle proteine intatte
(approccio diretto);
2) digestione delle proteine con enzimi specifici, seguita da separazione
cromatografica, rivelazione e quantificazione di peptidi marker caratteristici della
proteina cercata (approccio indiretto).
Il secondo metodo è molto più utilizzato del primo, a causa del fatto che i peptidi
(molecole a basso peso molecolare) sono più facilmente separabili delle proteine
(molecole ad alto peso molecolare) e, sempre a causa delle diverse dimensioni,
possono essere rivelati dagli spettrometri di massa con maggiore sensibilità, anche se
un fattore potenziale di errore viene introdotto dalla digestione enzimatica che
precede l’analisi, che ovviamente deve essere quantitativa sulla proteina target, al fine
di fornire risultati affidabili.
1) Rivelazione diretta di proteine allergeniche intatte
Come detto, i metodi pubblicati sulla rivelazione diretta di proteine allergeniche
intatte sono scarsi. Un metodo che accoppia una separazione HPLC con rivelazione
di massa utilizzando uno spettrometro a triplo quadrupolo (ma utilizzato in modalità
Full Scan o Multiple Ion Monitoring, come un singolo quadrupolo, senza utilizzare la
frammentazione) è stato pubblicato per la rivelazione di siero-proteine del latte (alfalattoalbumina - Proteina contenuta nel siero di latte. È costituita da un’unica catena
polipeptidica ed è ricca di acido aspartico e di triptofano; è la proteina più abbondante
nel siero di latte umano, impiegata per arricchire alcuni alimenti in proteine. Nel latte
dei Ruminanti e della mucca in particolare, invece, la l. è in quantità minore rispetto
alla β-lattoglobulina, formata da due catene polipeptidiche. Esistono due tipi diversi
di β-lattoglobulina, indicati con A e B. La presenza di uno piuttosto che dell’altro
tipo, o di tutti e due insieme, è determinata geneticamente -, beta-lattoglobulina A e
B, - Proteina presente nel siero del latte (liquido che si forma dopo la coagulazione
della Caseina ). La proteina è originata per sintesi nella ghiandola mammaria della
mucca, come anche l’alfa-lattoglobulina. Queste due proteine coagulano al calore ed
hanno un valore biologico elevato per cui sono utilizzate come integratori nelle
formulazioni di latte per l'infanzia o negli Alimenti per gli atleti. La betalattoglobulina è uno dei principali allergeni del Latte vaccino, definito Bos d 5 nella
nomenclatura IUIS, ed è responsabile, con la caseina ed altre proteine del latte,
dell’allergia al latte vaccino. La beta-lattoglobulina è resistente alla digestione e
quindi può superare la digestione gastrica presentandosi intatta nell’intestino dove
piccole quantità vengono assorbite integre, o parzialmente integre, dando così luogo
alla sensibilizzazione allergica-) nei succhi di frutta, dopo estrazione su fase solida. Il
limite di rivelazione di tale metodica si è rivelato essere di 1 mg/l (Monaci, van
Hengel, 2008).
Lo spettrometro di massa MALDI-TOF è un spettrometro di massa accoppiamento di
un sorgente laser assistita da un ionizzazione matrice ( MALDI, Matrix Assisted
Laser desorbimento / ionizzazione ) e un tempo di analisi volo (TOF, massa a tempo
23
di volo spettrometria). Una delle caratteristiche importanti spettrometria di massa è
la nitidezza dei picchi, come misurato dalla risoluzione dello spettrometro di massa.
La risoluzione è definita come il rapporto tra la massa m del picco ampiezza a metà
altezza Dm. Maggiore è la risoluzione, le cime più alte sono belle. È quindi possibile
visualizzare due molecole vicino masse. Gli strumenti MALDI-TOF possono essere
equipaggiati con un reflectron (specchio elettrostatico o "specchio ione") che devia
gli ioni con un campo elettrico, raddoppiando così la lunghezza del percorso di volo
dello ione e aumentando la risoluzione dello strumento . Uno spettrometro di massa
MALDI-TOF può raggiungere risoluzioni di 5000 modo lineare (senza reflectron) e
20000 con reflectron. Storicamente, dal tempo di analizzatori di volo, che richiedono
una sorgente di ionizzazione pulsata, sono stati accoppiati solo con sorgenti MALDI.
Attualmente, fonti MALDI possono essere accoppiati ad altri tipi di scanner (ad
esempio un analizzatore FT-ICR ) dall'analizzatore e tempo di volo da altre fonti (ad
esempio con una sorgente electrospray in uno strumento-ESI QTOF).
Un metodo basato su questo spettrometro è stato
anche riportato per la rivelazione del lisozima
(Fig 9), una proteina potenzialmente allergenica,
nei formaggi. Il lisozima (è un enzima, che fa parte
della categoria degli idrolasi, presente in tessuti
animali dotato di attività battericida) ,
preventivamente purificato mediante immunocattura
( è una tecnica che utilizza sfere magnetiche rivestite
in anticorpi per attirare i microbi in un campione di
Fig 9: un cristallo di lisozima
acqua . Questo tipo di analisi rilevamento rapido può
determinare se il virus e batteri sono presenti in un
campione di acqua in poche ore) con particelle magnetiche rivestite di un anticorpo
anti-lisozima, è stato rivelato con una sensibilità pari a 5 mg/kg (Schneider, Becker,
Pischetsrieder, 2010).
2) Rivelazione di peptidi specifici come marker di proteine allergeniche
Gli esempi di rivelazione di peptidi specifici derivanti da proteine allergeniche sono
molto più numerosi, data la già citata facilità di separazione cromatografica e di
rivelazione mediante SM di composti a peso molecolare più basso rispetto alle
proteine. In generale questi metodi presentano un problema ovvero il processo di
digestione enzimatica è una variabile non perfettamente controllabile nel sistema
alimentare, per cui se il singolo peptide può essere facilmente quantificato, la sua
corrispondenza stechiometrica con la proteina di partenza è invece difficilmente
verificabile, ragion per cui la quantificazione ottenuta può essere sottostimata.
In uno dei primi esempi pubblicati, la digestione enzimatica seguita da analisi
LC/MS/MS è stata usata per rivelare e quantificare il più importante allergene
dell’arachide Ara h 1, in una matrice modello costituita da un gelato.
24
La rivelazione di alcuni peptidi specifici ha permesso di identificare univocamente
Ara h1 e di quantificarla fino a 10 mg/kg (Shefcheck, Musser, 2004).
Gli stessi autori hanno in seguito presentato un confronto fra metodiche LC/ESI-MS,
basate su uno strumento a singolo quadrupolo , con metodiche LC/ESI-MS/MS,
basate su strumentazione a triplo quadrupolo, utilizzate per la rivelazione
dell’allergene Ara h 1 nel cioccolato. È stato dimostrato che la digestione prima
dell’estrazione fornisce una sensibilità migliore della digestione dopo estrazione,
arrivando a 20 mg/kg con uno strumento a singolo quadrupolo (Fig 10). L’uso di una
strumentazione a triplo
quadrupolo consente di
abbassare ulteriormente la
sensibilità fino a 10 mg/kg.
Infine il miglioramento dei
metodi di estrazione può
portare questo limite fino a 2
mg/kg (Shefcheck, Callahan,
Musser, 2006). L'analizzatore
Fig 10: Analizzatore di massa a quadrupolo
di massa a quadrupolo è un
tipo di analizzatore impiegato nella spettrometria di massa. Nello spettrometro di
massa l'analizzatore di massa quadrupolare è il componente dello strumento
responsabile di convogliare gli ioni del campione in esame al rivelatore, sulla base
del loro rapporto massa/carica (m/z). Un analizzatore di massa è essenzialmente un
filtro di massa capace di trasmettere solamente lo ione prescelto. Uno spettro di
massa si ottiene esplorando in sequenza il campo di massa di interesse (scansione).
Questo tipo di analizzatore è il più utilizzato negli spettrometri di massa per analisi di
routine. Ha risoluzione unitaria. Un quadrupolo è composto da quattro barre parallele
di metallo. Alle barre viene applicata una tensione continua, le barre opposte
diagonalmente hanno la tensione dello stesso segno, a questa viene sovrapposta una
tensione alternata con frequenza nell'ordine dei megahertz (radiofrequenza). Il campo
elettrico che risulta costringe gli ioni
a percorrere una traiettoria oscillante
diversa per ogni valore di m/z.
Regolando questo campo si può
selezionare il valore di m/z degli ioni
che attraversano il quadrupolo, gli
ioni con m/z superiore o inferiore al
valore prescelto saranno costretti a
Fig 11: Funzionamento di un quadrupolo
percorrere traiettorie che portano
fuori dal campo elettrico e quindi non raggiungeranno il rivelatore. Ciò consente la
selezione di un particolare ione, oppure la scansione delle m/z variando con
continuità il campo elettrico (Fig 11).
Mentre un analizzatore di massa a triplo quadrupolo è costituito da tre quadrupoli in
serie dove il primo ed il terzo quadrupolo agiscono da filtri di massa, mentre
25
il quadrupolo centrale, riempito con un gas inerte (azoto o argon), come cella di
collisione (al quadrupolo centrale è applicata una radiofrequenza la cui funzione è di
mantenere focalizzati gli ioni generati dalla rottura della molecola genitore).
Uno strumento a triplo quadrupolo, oltre alle funzionalità dello strumento a singolo
quadrupolo, ne possiede di ulteriori. È possibile operare infatti in "product ion scan",
dove il primo quadrupolo seleziona uno ione di rapporto m/z fissato, dopo la
frammentazione il terzo quadrupolo effettua una scansione su un determinato range di
massa. In questo modo è possibile dall'analisi dei frammenti avere informazioni
sull'identità di una molecola. Nella modalità "parent ion scan" invece è il terzo
quadrupolo che è sintonizzato permanentemente su un dato m/z, mentre il primo
quadrupolo lavora in scansione su un range di massa. Questa modalità permette di
individuare classi di molecole strutturalmente simili. Nella modalità "neutral loss
scan" invece, entrambi i quadrupoli lavorano in scansione, ma tra il primo ed il terzo
quadrupolo è mantenuta una differenza prefissata di m/z, in altre parole mentre il
primo quadrupolo è sintonizzato su un determinato m/z il terzo si trova a (m/z - x), ed
x è mantenuto costante durante la scansione. È possibile così individuare facilmente
classi di molecole che hanno in comune una parte della struttura. Le modalità "parent
ion scan" e "product ion scan" sono utili soprattutto per studi sul metabolismo. Una
ulteriore modalità, "single ion monitoring" (SIM) viene utilizzata per l'analisi
quantitativa nei sistemi accoppiati con la cromatografia liquida o la gas
cromatografia. In questo caso l'identità della molecola è nota a priori ed il primo
quadrupolo è fissato su di un valore determinato di m/z, mentre il terzo su quello di
un frammento. Questa modalità permette di aumentare la specificità del sistema di
rivelazione. Nel caso venga selezionato più di un frammento si parla di "multiple
reaction monitoring" (MRM).
Con una strumentazione più sofisticata, una cromatografia liquida con colonna
capillare accoppiata ad uno SM dotato di interfaccia nanoelettrospray e un
analizzatore quadrupolo-TOF (capLC/nano-ESI/Q-TOF MS/ MS), si sono
identificati, dopo digestione enzimatica, peptidi derivanti dagli allergeni dell’arachide
Ara h 1, Ara h 2, e Ara h 3. In particolare, lo studio si è occupato anche della
rivelabilità di questi peptidi in arachidi crude e tostate, al fine di trovare marcatori
peptidici utilizzabili anche in prodotti trattati. I limiti di rivelazione per i singoli
peptidi, riportati come quantità assoluta iniettata in colonna, sono stati di 7 ng per le
arachidi non tostate, 10 ng per le arachidi mediamente tostate e 40 ng per le arachidi
ad elevato grado di tostatura (Chassaigne, Norgaard, van Hengel, 2007).
Un metodo LC/ESI-MS/MS è stato anche proposto per l’analisi di digeriti triptici di
diversi estratti alimentari ai fini di rivelare, dopo estrazione e clean-up, peptidi
derivanti dalle caseine del latte. La sensibilità del metodo è stata stimata 5 mg/kg di
proteina (Weber Raymond, Ben-Rejeb, Lau, 2006). Altri esempi analoghi riportati in
letteratura hanno sostanzialmente confermato le metodologie utilizzate ed i limiti di
rivelazione. Anche l’utilizzo di tecniche di purificazione, di digestione e di analisi più
innovative, quali procedure di estrazione immunomagnetiche combinate con
digestioni triptiche assistite da microonde, seguite da analisi LC/ESI-IT-MS/MS,
26
hanno sostanzialmente confermato i livelli di sensibilità presentati in precedenza,
dell’ordine di pochi mg/kg.
Un’interessante variante, recentemente proposta, prevede la rivelazione di peptidi
provenienti da proteine allergeniche generati non da digestione triptica, bensì presenti
nell’alimento in seguito a processi naturali di proteolisi. Un metodo ESI-MS/MS
preceduto da cromatografia liquida capillare (CapLC/ESI-MS/MS) è stato proposto
per la rivelazione di peptidi derivanti dalla caseina presenti nel vino. Anche se è stato
dimostrato che il metodo consente di rivelare la presenza di caseina fino a 100 mg/l, è
chiaro che la quantità di questi peptidi non può essere facilmente ed esattamente
collegata alla quantità di caseina inizialmente presente, rendendo il metodo valido dal
solo punto di vista qualitativo o, al massimo semiquantitativo (Monaci, Losito,
Palmisano, Visconti 2010).
Considerazioni
Un riassunto dei metodi più significativi, basati sulla spettrometria di massa, per la
rivelazione delle proteine allergeniche è riportato in tabella (Fig6). Per quanto
riguarda la sensibilità del metodo, è facile constatare come, nonostante la varietà di
metodiche di preparazione del campione e di tecniche spettrometriche usate, che
vanno dalle più semplici alle più sofisticate, i limiti di rivelazione si assestino in tutti
i casi intorno a valori di pochi mg/kg. È quindi ragionevole supporre che nel caso
vengano adottate procedure standard basate sulla SM da utilizzarsi nei laboratori di
controllo, i limiti di sensibilità raggiungibili siano dello stesso ordine di grandezza.
Per quanto riguarda la specificità del metodo, la SM, grazie al suo potere
identificativo, riduce praticamente a zero la possibilità di falsi negativi e falsi positivi,
anche in campioni alimentari molto trattati (es. tostati) o in presenza di matrici
alimentari complesse.
Metodo
LC/ESI-MS
LC/ESI-MS/MS
LC/ESI-MS/MS
capLC/ESI- Q/TOF
capLC/ESI-Q/TOF
LC/ESI-IT/MS/MS
LC/ESI-MS/MS
MALDI/TOF
Matrice
succhi di frutta
gelati
cioccolato
arachidi
snacks
cereali da colazione
varie
formaggi
Proteina
Siero-proteine del latte
Ara h 1
Ara h 1
Ara h 1, 2, 3
Ara h 2
Ara h 3, 4
caseine
lisozima
Target SM
proteine intatte
peptidi
peptidi
peptidi
peptidi
peptidi
peptidi
proteina intatta
Limite di rivelazione
1 mg/l
10 mg/kg
2 mg/kg
7 - 40 ng
5 mg/kg
3 mg/kg
5 mg/kg
5 mg/kg
Fig 6: Sommatoria dei metodi basati sulla MS messi a punto per la rivelazione di
proteine allergeniche negli alimenti
27
BIBLIOGRAFIA
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