STAYFRESH, RICERCA SU IV GAMMA Iden4ficare soluzioni integrate e “pronte all’uso” aEe a migliorare la sicurezza e la qualità dei vegetali di IV gamma, mirando a risolvere alcune delle principali cri4cità della filiera produJva aEraverso un approccio mul4disciplinare. Unità opera,va UNIBO, Bolzano 3 Se7embre 2014 Responsabile: Rosalba LancioC ObieJvi generali del progeEo 1. Riduzione della conconcentrazione di cloro nelle acque di lavaggio e prolungamento della shelf life di mele (Malus communis, var. Golden Delicious) e Valerianella locusta Laterr. mediante l’impiego oli essenziali o loro componen4 2. Uso di una microflora compe44va per migliorare la shelf-‐life e la sicurezza dei prodoJ ObbieCvi specifici -‐ Valutazione degli effeJ di diversi an,microbici naturali addiziona4 in fase di dipping sulla sicurezza e sulla shelf life di mele golden delicious in rapporto all’atmosfera di confezionamento e alle condizioni di processo adoEate -‐ Isolamento, iden,ficazione e cara7erizzazione tecnologica di ba7eri laCci da usare come agen, di biocontrollo -‐ Individuazione delle soluzioni tecnologiche oCmali (agen4 an4microbici più efficaci, colture di biocontrollo più aJve e condizioni di processo più appropriate) sulla base delle prove di laboratorio -‐ Scaling up a livello aziendale (in collaborazione con SIPO srl) U6lizzo di an6microbici naturali e colture bio proteCve Sviluppo di metodi alterna6vi di sanificazione Aumento della sicurezza Miglioramento della qualità e della funzionalità PRODOTTI DI IV GAMMA Limitata shelf-‐life Mercato con enormi opportunità di crescita Fru4a e verdura componen6 importan6 di una dieta salubre ed equilibrata Veicolo di microrganismi patogeni e di tossinfezioni alimentari OLI ESSENZIALI (ANTIMICROBICI NATURALI) Gli Oli Essenziali sono un mix complesso di sostanze vola4li, caraEerizzate da un forte impaEo organoleJco e prodoEe dalle piante come metaboli4 secondari Funzione in natura Difesa contro inseJ e microrganismi AJvità collegate con l’impollinazione e la dispersione dei semi A7ualmente vengono sfru7a, nel se7ore medico, agricolo, farmaceu,co ed alimentare Aromi naturali Conservan4 alimentari alterna4vi ai prodoJ di sintesi grazie alle loro proprietà: • An4baEeriche • An4fungine • An4virali • An4ossidan4 AGENTI DI BIOCONTROLLO COLTURE PROTETTIVE BATTERI LATTICI Alimen4 Compe4zione Produzione di sostanze an4microbiche Acidi organici, baEeriocine, diace4le, acetoino, idrossiacidi Diagramma di flusso MELE Mele Goden Delicius (Melinda) Acquistate da un rivenditore locale LAVAGGIO 2 min con acqua corrente Agitazione manuale, 8 °C (Mele:acqua, 1:10 w/v) Asciugatura con carta Sbucciatura e affeEatura manuale (cubi, feJne o pezzeJ) DIPPING Immersione per 2 min in acqua corrente 1% (w/v) acido citrico e 0.5 % (w/v) acido ascorbico Agitazione manuale, 8 °C Mele:acqua, 1:10 (w/v) Asciugatura con carta Confezionamento in saccheJ di BOPP spessi 30 µm (mele:spazio di testa 1:1) stoccaggio, 4-‐6 °C TuEe le molecole testate, sole o in combinazione, ritardano in modo significa4vo lo sviluppo dei lievi4. Esanale, citral e la combinazione esanale/2-‐(E)-‐esenale risultano i più efficaci. I LAB non superano mai il livello di 5 log ufc/g, durante l’intero periodo di stoccaggio. Lievi4 log ufc/g ANTIMICROBICI NATURALI Evoluzione dei lievi4 in mele addizionate con oli essenziali e/o con compos4 bioaJvi durante lo stoccaggio a 6°C Tempo (giorni) CONTROL HEXANAL CITRAL CIT+HEX CITRUS+CARV CITRUS+CIT CITRAL+T2 HEXANAL+T2 ANTIMICROBICI NATURALI La consistenza delle feJne di mela diminuisce in tuJ i campioni in modo molto simile. Tra ques4, solo i campioni traEa4 con esanale/2-‐(E)-‐esenale mantengono valori di consistenza eleva, rispe7o al controllo durante tuEo il periodo di stoccaggio CINETICA DI IMBRUNIMENTO simile in tuJ i campioni ANTIMICROBICI NATURALI Controllo T0 Controllo T4 Controllo T7 Cit+esanale T0 Cit+esanale T4 Cit+esanale T7 L’aggiunta di citral comporta un iniziale imbrunimento dei campioni dopo due/ q u a E r o g i o r n i d i stoccaggio OTTIMIZZAZIONE DELLA FASE DI DIPPING E DI CONFEZIONAMENTO DIPPING Immersione per due min in acqua corrente, 1% (p/v) acido citrico e 0.5% (p/v) acido ascorbico Agitazione manuale 8°C à 13°C Mele:acqua, 1:10 (p/v) à 1:5 (p/v) Asciugatura con carta Confezionamento in saccheJ BOPP spessi 30 µm (mele:spazio di testa 1:1) Confezionamento in nuovi saccheJ a media permeabilità, spessi 59 µm Permeabilità alla CO2 a 22°C: 2720 cm3/m2 per giorno, per bar Permeabilità all’O2 a 22°C: 9876 cm3/m2 per giorno, per bar MAP (7% O2, 0% CO2) Mele: spazio di testa, 1:1 ANTIMICROBICI NATURALI In tuJ i campioni lo sviluppo dei lievi4 rimane soEo 5 log ufc/g durante tuJ i 35 giorni di stoccaggio. I mix compos4 da esanale/2-‐(E)-‐esenale e esanale/citral sono i più efficaci nell’inibire lo sviluppo dei lievi4. ANTIMICROBICI NATURALI Migliore ritenzione del colore e della texture, durante i 35 giorni di stoccaggio, con confezionamento in atmosfera modificata e aggiunta di 2-‐(E)-‐esenale solo o in combinazione con esanale o citral C map T0 Cit+T2ese T0 Esa+T2ese T0 C map T7 Cit+T2ese T12 Esa+T2ese T10 C map T14 Cit+T2ese T17 Esa+T2ese T21 Cit+T2ese T21 Esa+T2ese T28 C map T21 Cit+T2ese T28 Esa+T2ese T35 AGENTI DI BIOCONTROLLO Isolamento, iden6ficazione e cara4erizzazione in vitro, di potenziali agen6 di biocontrollo Isolamento di baEeri laJci da prodoJ commerciali, durante lo stoccaggio e alla fine della shelf life AGENTI DI BIOCONTROLLO 55 ceppi isola4 dalle mele e 15 isola4 da valeriana Identification L. plantarum / L. pentosus L. plantarum / L. pentosus L. plantarum / L. pentosus L. plantarum / L. pentosus L. pentosus / L. plantarum Lactobacillus plantarum L. plantarum / L. pentosus Lactobacillus plantarum L. plantarum / L. pentosus L. plantarum / L. pentosus Lactobacillus plantarum L. plantarum / L. pentosus Lactobacillus plantarum Lactococcus lactis subsp. Lactis Leuconosto mesenteroides Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides Weissella soli Weissella soli Lactobacillus plantarum Lactobacillus paracasei Lactobacillus casei/paracasei Lactobacillus casei/paracasei Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus paracasei Lactobacillus casei/paracasei Lactobacillus casei/paracasei Lactobacillus plantarum Lactobacillus casei/paracasei Lactobacillus casei/paracasei Lactobacillus plantarum/acidophilus Lactobacillus plantarum L. plantarum / L. pentosus Inhibition of indicator strainsa E.coli Salmonella Listeria ++ + + -‐ -‐ ++ + -‐ + -‐ + -‐ + + -‐ ++ -‐ -‐ ++ ++ -‐ ++ +++ +++ -‐ -‐ + ++ + + + ++ -‐ ++ + + ++ +++ ++ + -‐ + -‐ -‐ -‐ -‐ +++ + ++ -‐ -‐ ++ + + + -‐ -‐ -‐ -‐ + + +++ ++ -‐ + + -‐ + ++ +++ + +++ -‐ -‐ -‐ + +++ +++ -‐ ++ +++ -‐ -‐ -‐ ++ ++ ++ -‐ ++ +++ -‐ ++ +++ ++ + -‐ -‐ -‐ ++ -‐ -‐ -‐ + +++ +++ ++ ++ +++ -‐ +++ ++ ++ ++ +++ -‐ -‐ -‐ a simboli: -‐No alone di inibizione; +piccolo alone di inibizione (da 0.5 a 1 mm); + +alone di inibizione medio (da 1 a 2 mm); +++ampio alone di inibizione (>2mm) Mele: 33 ceppi iden,fica, (sequenziamento regione 16S rRNA) Leuconostoc mesenteroides (10 ceppi) Lactobacillus plantarum/pentosus (14 ceppi) Weissella soli (2 ceppi) Lactobacillus casei/paracasei (6 ceppi) Lactococcus lac6s (1 ceppo) AGENTI DI BIOCONTROLLO Strain CE+CA 1 CE+CA 2 CE+CA 4 CE+CA 5 CI+CE 2 CIT1 CIT2 CIT3 ESA+T2 1 ESA+T2 2 ESA1 ESA2 ESA3 M10G19 M11G8 M16B21 M16B22 M17B23 M17G20 M19B24 M19B25 M2B2 M2G1 M2G2 M2P2 M3B6 M3G4 M3G5 M5B7 M5B8 M7B16 1 M7B16 2 M8B18 V 7 V4B4 V4B5 V4B6 V7B3 V9 BATTERI LATTICI UTILIZZATI COME AGENTI DI BIOCONTROLLO SU MELE DI IV GAMMA M3B6 (Lb. casei/paracasei) CIT3 (Lb. plantarum) Protocolli di lavaggio precedentemente messi a punto Selezione dell’agente di biocontrollo più efficace e successivo uso combinato con gli an4microbici naturali seleziona4 AGENTI DI BIOCONTROLLO Inoculo dei LAB (7 log UFC/ml) e/o dei baEeri patogeni (Listeria monocytogenes e Escherichia coli, 3-‐4 log UFC/ml) nella fase di dipping BATTERI LATTICI E ANTIMICROBICI NATURALI UTILIZZATI COME AGENTI DI BIOCONTROLLO SU MELE DI IV GAMMA CIT3 (Lb. plantarum) E-‐2-‐esenale/citral 125:125 ppm E-‐2-‐esenale/esanale 125:125 ppm Inoculo dei LAB (7 log UFC/ml) e/o dei baEeri patogeni (Listeria monocytogenes e Escherichia coli, 3-‐4 log UFC/ml) e/o degli an4microbici naturali nella fase di dipping AGENTI DI BIOCONTROLLO ANTIMICROBICI NATURALI Protocolli di lavaggio precedentemente messi a punto AGENTI DI BIOCONTROLLO ANTIMICROBICI NATURALI Lactobacillus plantarum CIT3 è risultato il meglio adaEato al sistema considerato e non influenzato dalla presenza di an4microbici naturali La combinazione tra gli agen4 di biocontrollo L. plantarum CIT3 e gli an4microbici naturali seleziona4 ha comportato un aumento della cine4ca di morte di E. coli inoculata nel prodoEo AGENTI DI BIOCONTROLLO ANTIMICROBICI NATURALI L. monocytogenes ha mantenuto un livello costante durante lo stoccaggio a 6°C. Soltanto l’uso combinato della miscela 2-‐(E)-‐esenale/citral e dell’agente di biocontrollo ha comportato una riduzione della carica di L. monocytogenes durante i primi 7 giorni di stoccaggio AGENTI DI BIOCONTROLLO ANTIMICROBICI NATURALI La presenza di citral nella soluzione di dipping è la condizione più efficace nel ritardo dello spoilage microbico. Le condizioni adoEate hanno permesso un buon mantenimento del prodoEo per più di 15 giorni di stoccaggio. AGENTI DI BIOCONTROLLO ANTIMICROBICI NATURALI Uso combinato di an,microbici naturali con un ceppo di Lactococcus lac,s produ7ore di nisina per migliorare la sicurezza e la shelf life delle mele di IV gamma Screening per la selezione di un ceppo di Lc. lac6s produEore di nisina EffeJ della combinazione Lc. lac6s CBM21 + an4microbici naturali sulla qualità microbiologica di mele di IV gamma AGENTI DI BIOCONTROLLO ANTIMICROBICI NATURALI CaraEerizzazione tecnologica e valutazione dell’aJvità an4microbica del ceppo Lc. lac6s CBM21 CBM21 (Lc. lac6s) E-‐2-‐esenale/citral 125:125 ppm E-‐2-‐esenale/esanale 125:125 ppm Inoculo dei LAB(7 log UFC/ml) e/o dei baEeri patogeni (Listeria monocytogenes e Escherichia coli, 3 log UFC/ml) e/o degli an4microbici naturali nella fase di dipping AGENTI DI BIOCONTROLLO ANTIMICROBICI NATURALI Protocolli di lavaggio precedentemente messi a punto T5 T1 Odor Lc. lac6s CBM 21 ha mostrato risulta4 simili a quelli iden4fica4 con gli altri baEeri 6.00 Odor Overall 6.00 Browning 5.00 laJci 4lizza4, 5.00 in par4colare impression Overall u impression Browning su: 4.00 4.00 -‐ Shelf life 3.00 3.00 2.00 Flavor Firmness 2.00 Flavor Firmness -‐ Sicurezza 1.00 1.00 -‐ Parametri d0.00 i texture e colore 0.00 Bittiness Crispiness Acidity Juiciness Sweeting Control L. lactis CBM21 citral/2-‐(E)-‐hexenal Crispiness Acidity Juiciness Sweeting Control L. lactis CBM21 citral/2-‐(E)-‐hexenal hexanal/2-‐(E)-‐hexenal Lc. lac6s CBM 21 ha un effeEo posi4vo sulla qualità generale dopo 1 giorno di stoccaggio. L’imbrunimento dei campioni, dopo 5 giorni, è stato molto simile a quello del controllo. L’aggiunta di E-‐2-‐esenale/citral ha permesso di ridurre significa4vamente l’imbrunimento dopo 5 giorni di stoccaggio, ma nello stesso tempo ha conferito un’accezione sensoriale nega4va alle mele. Esanale/E-‐2-‐esenale sono risulta4 essere molto più compa4bili sia con l’aroma che con gli altri parametri di qualità delle mele di IV gamma AGENTI DI BIOCONTROLLO ANTIMICROBICI NATURALI hexanal/2-‐(E)-‐hexenal Bittiness SCALING UP Scelta delle condizioni: i migliori risulta, sono sta, da, da 1) USO COMBINATO LC. LACTIS E ANTIMICROBICI NATURALI (E-‐2-‐esenale/ esanale 125:125 ppm) 2) ANTIMICROBICO NATURALE UTILIZZATO SINGOLARMENTE 3) LC. LACTIS UTILIZZATO SINGOLARMENTE La prova dovrà essere ripetuta perché è stata fa4a in primavera à scarsa qualità delle mele in quanto frigoconservate • Valutazione compara4va tra i diversi campioni Lc. lac6s sopravvive durante i 20 giorni di conservazione nei campioni in cui è stato inoculato 7 Lc. lac4s CBM21 Ant.naturale + Lc. lac4s CBM21 log CFU/g 6.5 6 5.5 5 4.5 4 0 4 7 11 Tempo (giorni) 14 18 20 T0 odore 80 campione preferito Test di preferenza Controllo Lc. lac4s CBM21 60 Ant. Naturali 40 Ant.naturali+Lc. lac4s CBM21 20 colore 0 T7 odore sapore consistenza 60 Lc. lac4s CBM21 50 Ant. Naturali 40 30 campione preferito Controllo 20 Ant.naturali+Lc. lac4s CBM21 colore 10 0 sapore consisten za MECCANISMI DI RISPOSTA DEI PATOGENI E DEGLI AGENTI DI BIOCONTROLLO RISPETTO AGLI ANTIMICROBICI NATURALI Importanza applica4va à evitare meccanismi di resistenza à individuazione dei meccanismi di risposta à uso consapevole degli an,microbici naturali a livello industriale • Determinazione dei cambiamen4 nelle membrane citoplasma4che • Determinazione delle molecole vola4li rilasciate • Espressione genica • EffeEo di concentrazioni subletali di citral e E-‐2-‐esanale sulla composizione degli acidi grassi di membrana e sul rilascio di molecole vola4li da parte di L. monocytogenes, E. coli e S. enteri6dis • Studio dei cambiamen4 nell’espressione genica di E. coli e Lc. lac6s espos4 a concentrazioni subletali di citral e E-‐2-‐esenale. Determinazione dei cambiamen, nelle membrane citoplasma,che Determinazione delle molecole vola,li rilasciate Le molecole testate inducono chiare modificazioni sia al profilo degli acidi grassi di membrana che al rilascio di specifiche molecole vola4li. Evidente incremento generale di alcuni acidi grassi associa, alla membrana (acidi grassi insaturi e acidi grassi liberi) I cambiamen4 avvengono durante la crescita microbica e dipendono dalla molecola testata, dalla sua concentrazione e dal microrganismo testato à specificità di risposta. Espressione genica Studio dei cambiamen, nell’espressione genica di E. coli e Lc. lac,s espos, a concentrazioni subletali di citral e E-‐2-‐esenale. I cambiamen4 nell’espressione genica di Lc. lac6s e E. coli sono sta4 studia4 tramite microarray. Stress applicato: ½ del valore della MIC di citral, E-‐2-‐hexenal Principali classi dei geni up regola4 o down regola4 in E. coli e Lc. lac6s : Ribosomi Metabolismo degli acidi grassi Metabolismo energe4co Metabolismo e trascrizione di purine e pirimidine Proteine ipote4che Proteine associate agli stress (termico e acido), detossificazione e protezione delle cellule Proteine di trasporto Metabolismo degli amminoacidi Metabolismo secondario CONCLUSIONI • Miglioramento della shelf life e della sicurezza microbiologica di mele di IV gamma tramite l’aggiunta di due diverse miscele di an4microbici naturali (esanale/2-‐(E)-‐esenale e 2-‐(E)-‐esenale/citral) nella soluzione di dipping • Prolungamento della shelf life tramite l’oCmizzazione dei processi di lavaggio e l’uso combinato di an,microbici naturali e atmosfera modificata • Risulta4 incoraggian4 riguardo la sicurezza e il prolungamento della shelf life di mele di IV gamma tramite l’uso di agen, di biocontrollo (Lactobacillus plantarum CIT3 e Lactococcus lac6s CBM21, produEore di nisina) anche in combinazione con an,microbici naturali DA VERIFICARE: -‐ Studi successivi dovranno essere vol6 all’oCmizzazione delle modalità di inoculo degli agen6 di biocontrollo e al miglioramento dei parametri colorimetrici -‐ Studio della sopravvivenza dell’agente di biocontrollo fino al termine della shelf life e sue interazioni con la microflora contaminante (pirosequenziamento, DGGE) Gruppo di Microbiologia degli Alimen4 Campus di Scienze degli Alimen4, Università di Bologna Grazie
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