Biologia Strutturale: dai sincrotroni ai FEL Francesco Stellato I.N.F.N. – Sezione di Roma ‘Tor Vergata’ Roma, 22 aprile 2014 Luci di Sincrotrone CNR – Roma, 22 Aprile 2014 Sommario Biologia strutturale e radiazione X Sincrotroni e FEL Imaging con radiazione coerente Cristallografia seriale: dai sincrotroni ai FEL e viceversa Prospettive future Luci di Sincrotrone CNR – Roma, 22 Aprile 2014 Source Peak Brilliance Biologia strutturale e radiazione X 1E+36 MacKinnon Perutz & Kendrew Potassium Franklin, 1E+33 myoglobin channel Crick, 1E+30 Watson Bragg & Bragg DNA 1E+27 reflections Hodgkin penicillin, 1E+24 B12 von Laue 1E+21 crystal diffraction 1E+18 1E+15 Röntgen 1E+12 Kornberg 1E+09 RNA Kirz & 1E+06 polymerase Schmahl Jacobsen 1E+03 Microscopy Holography 1E+00 1880 1910 1940 1970 2000 2030 Year Luci di Sincrotrone CNR – Roma, 22 Aprile 2014 Sincrotroni e FEL -Simile brillanza media, diversa brillanza di picco 1012 fotoni in ~0.05 μm2 Frequenza impulsi FEL: 100 Hz -Diversa lunghezza degli impulsi: 10 -100 fs FEL 10-100 ps sincrotroni -Piccola lunghezza d’onda: Fino a 10 keV FELs Fino a 100 keV sincrotroni Luci di Sincrotrone CNR – Roma, 22 Aprile 2014 Diffrazione prima della distruzione Iniezione di particelle Un impulso, una misura Impulso FEL Pattern di diffrazione E’ necessario ottenere un segnale sufficiente prima che il campione si distrugga R. Neutze et al, Nature 406 (2000) Luci di Sincrotrone CNR – Roma, 22 Aprile 2014 Imaging con radiazione coerente Diffrazione prima della distruzione 1 micron Pattern di diffrazione Immagine SEM della struttura incisa su una membrana di Si3N4 Pattern di diffrazione Secondo Impulso Immagine ricostruita con risoluzione di 32 nm FLASH Primo impulso Chapman et al. Nature Physics (2006) 1 micron Luci di Sincrotrone CNR – Roma, 22 Aprile 2014 Imaging con radiazione coerente Ricostruzioni 2D – Campioni riproducibili e non Mimivirus: uno dei virus più grandi ~500 nm diametro 200 nm Ricostruzione 2D Impulso LCLS: 10 to 300 fs,1.8 keV (0.68 nm) Focalizzato a 7 μm 1016 W/cm2 Seibert et al. Nature 470 (2011) Luci di Sincrotrone CNR – Roma, 22 Aprile 2014 Imaging con radiazione coerente Ricostruzioni 3D – Campioni riproducibili Tomografia X al sincrotrone Uno (o pochi) campioni Misure da diverse angolazioni Temperatura criogenica Molti (106) campioni Misure da angolazioni casuali Temperatura ambiente Larabell et al. Mol Biol Cell (2004) J. Miao, Hodgson, Sayre, PNAS 98 (2001) Luci di Sincrotrone CNR – Roma, 22 Aprile 2014 Imaging con radiazione coerente Misure analoghe possibili a DiProI@FERMI nel prossimo futuro Yoon et al. Optics Express (2014) Luci di Sincrotrone CNR – Roma, 22 Aprile 2014 Cristallografia seriale 70000 60000 - Misura di pattern di diffrazione da singoli cristalli (tipicamente >104) 50000 40000 30000 - Indicizzazione di ciascun pattern - Media dei fattori di struttura 20000 Electron NMR 1972 1976 X-ray 10000 1980 1984 1988 1992 1996 2000 Sono necessari cristalli sufficientemente grandi 2004 2008 0 - Metodi standard (e non) per la fasazione Studio di cristalli piccoli. Studi risolti in tempo. Luci di Sincrotrone CNR – Roma, 22 Aprile 2014 Cristallografia seriale al FEL Setup sperimentale Struttura del Fotosistema I con risoluzione di 7Å (limitata dalla lunghezza d’onda del FEL) Chapman et al. Nature 470, (2011) Luci di Sincrotrone CNR – Roma, 22 Aprile 2014 Cristallografia seriale al FEL Catapsina B Proteina coinvolta nelle tripanosomiasi Struttura della forma glicosilata ignota Comparsa di cristalli aghiformi in cellule di insetto che overesprimono la proteina 10 μm Immagine SEM di alcuni cristalli purificati Luci di Sincrotrone CNR – Roma, 22 Aprile 2014 Cristallografia seriale al FEL Pattern di diffrazione di un singolo microcristallo di catapsina B Proiezione delle intensità misurate su un piano dello spazio reciproco Luci di Sincrotrone CNR – Roma, 22 Aprile 2014 Cristallografia seriale al FEL Redecke et al., Science 2013 Struttura tridimensionale della forma glicosilata della proteina Applicazioni di drug-design Luci di Sincrotrone CNR – Roma, 22 Aprile 2014 Cristallografia seriale – Sviluppi e Applicazioni Misure pump-probe risolte in tempo Aquila et al. Optics Express 470 (2011) A breve Fotosistema I e II ad alta risoluzione Lipidic Cubic Phase su GPCR Liu et al. Science (2013) Sponge phase su centri di reazione fotosintetici Johanssonn et al. Nature Methods (2012) Luci di Sincrotrone CNR – Roma, 22 Aprile 2014 Scattering & spettroscopie Emissione di raggi X (XES) Assorbimento di raggi X (XAS) Scattering a piccolo angolo (SAXS) Scattering a grande angolo (WAXS) Luci di Sincrotrone CNR – Roma, 22 Aprile 2014 Cristallografia seriale al sincrotrone La metodologia seriale ‘spinta’ può essere re-importata ai sincrotroni Riduzione del danno da radiazione Misure a temperatura ambiente Misure risolte in tempo 500 patterns da microcristalli di catapsina B a temperatura criogenica Gati et al., IUCrJ 2014 40,000 patterns di microcristalli di lisozima a temperatura ambiente Stellato et al., to be published Luci di Sincrotrone CNR – Roma, 22 Aprile 2014 Prospettive future FEL con repetition rates più elevate (XFEL) Sincrotroni con brillanza più elevata (ESRF, PETRA III) Migliori sistemi di iniezione del campione FEL con brillanza di picco più elevata Brillanze maggiori consentiranno di spingersi verso l’imaging di singola molecola ad alta risoluzione Luci di Sincrotrone CNR – Roma, 22 Aprile 2014 Prospettive future avrà una repetition rate di 27 kHz E’ necessario un hardware in grado di archiviare tipicamente 8 Mb x 106 pattern/ dataset = 8 Tb / dataset Sono necessari computer paralleli in grado di processare in tempo breve questa mole di dati. I sistemi di iniezione del campione devono essere ottimizzati in funzione della repetition rate della sorgente E’ necessario avere detector in grado di registrare pattern di diffrazione ad alta frequenza Luci di Sincrotrone CNR – Roma, 22 Aprile 2014 Grazie per l’attenzione Contatti Francesco Stellato I.N.F.N. Sezione di Roma Tor Vergata Via della Ricerca Scientifica, 1 Tel: 0039 06 7259 4284 [email protected]
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